Summary
Denne studien beskriver en ny metode for å isolere murine brune adipocytter for gen- og proteinuttrykksanalyse.
Abstract
Brunt fettvev (BAT) er ansvarlig for ikke-rystende termogenese hos pattedyr, og brune adipocytter (BA) er de funksjonelle enhetene til BAT. BA inneholder både multilokulære lipiddråper og rikelig mitokondrier, og de uttrykker frakobling av protein 1 (UCP1). BAs er kategorisert i to undertyper basert på deres opprinnelse: embryo avledet klassisk BAs (cBAs) og hvite adipocytter avledet BAs. På grunn av deres relativt lave tetthet kan BAer ikke isoleres fra BAT med tradisjonell sentrifugeringsmetode. I denne studien ble det utviklet en ny metode for å isolere BA fra mus for gen- og proteinuttrykksanalyse. I denne protokollen ble interscapular BAT fra voksne mus fordøyd med kollagenase og dispase løsning, og de dissosierte BAene ble beriket med 6% jodxanoloppløsning. Isolerte BAer ble deretter lysnet med Trizol-reagens for samtidig isolering av RNA, DNA og protein. Etter RNA-isolasjon ble den organiske fasen av lysatet brukt til proteinekstraksjon. Våre data viste at 6% jodxanolløsning effektivt beriket BA uten å forstyrre oppfølgingsgen- og proteinuttrykksstudier. Blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) er en vekstfaktor som regulerer vekst og spredning av mesenkymale celler. Sammenlignet med brunt fettvev hadde isolerte BAer signifikant høyere uttrykk for Pdgfa. Oppsummert gir denne nye metoden en plattform for å studere biologien til brune adipocytter på et enkelt celletypenivå.
Introduction
Både mus og mennesker har to typer fettvev: hvitt fettvev (WAT) og brunt fettvev (BAT)1. WAT lagrer energi i form av triglyserider i hvite adipocytter, og de brune adipocyttene (BAs) av BAT sprer kjemisk energi som varme2. Basert på deres utviklingsmessige opprinnelse, er BAs videre kategorisert i klassiske BAs (cBAs) som dannet under embryoutvikling og hvite adipocytter avledet BAs (beige / brite celler, omdannet fra hvite adipocytter under stressforhold)3. BA er multilokulære og uttrykker det termogene proteinet som kobler fra protein 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depot er et av de primære cBAs depotene i små pattedyr5, mens beige celler er spredt i WAT6.
På grunn av deres natur å spre energi, har BAs fått mye oppmerksomhet som et terapeutisk mål for å redusere fedme7. For å utnytte BAs med det formål å behandle fedme, er det viktig å forstå de molekylære mekanismene som styrer BAs funksjon, overlevelse og rekruttering. Fettvev inkludert BAT og WAT er heterogene. Bortsett fra adipocytter inneholder fettvev mange andre celletyper, som endotelceller, mesenkymale stamceller og makrofager8. Selv om genetiske verktøy for å spesifikt tømme kandidatgener hos mus BAs er tilgjengelige, for eksempel UCP1: : Cre linje9, er teknikker for rensing av BAs fra BAT eller WAT begrenset, noe som gjør det vanskelig å studere BAs på encellet type nivå. I tillegg, uten å oppnå rene BAer, vil forholdet mellom BAs og ikke-BAs ikke være klart avgrenset. For eksempel har blodplate-avledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRα) blitt brukt som en markør for udifferensierte mesenkymale celler, og det uttrykkes i endotel- og interstitielle celler av BAT. Ved kuldestresset BAT gir PDGFRα-positive stamceller opphav til nye BAs10. PDGFRα aktiveres av liganden PDGF, en vekstfaktor som regulerer vekst og spredning av mesenkymale celler11; Det er imidlertid uklart om BA påvirker oppførselen til PDGFRα-positive stamceller ved å utskille PDGF.
Nylig er det publisert en BAs-isolasjonsprotokoll, som er basert på fluorescensaktivert cellesortering (FACS)12. I denne protokollen ble 3 % bovin serumalbumin (BSA)-løsning brukt til å skille BAer fra ikke-BAer, og de berikede BAene ble ytterligere renset av FACS. Anvendelsen av denne protokollen er begrenset av kravet til FACS-prosess, som er avhengig av både utstyr og FACS-driftsopplevelser. I denne studien ble det utviklet en ny protokoll for isolering av BAer fra BAT. BAene isolert av denne protokollen kan brukes direkte til gen- og proteinuttrykksstudier. Videre tyder data fra denne studien på at BA er en stor PDGF-ressurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble opprettholdt i patogenfrie forhold, og alle prosedyrer ble godkjent av Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 og Rosa 26tdTomato mus linje13 ble rapportert tidligere. Alle musene ble holdt i romtemperatur med en 12 timers lys / mørk syklus.
1. Klargjøring av oppløsninger og brunt fettvev (BAT)
- Forbered fordøyelsesløsning og separasjonsløsning i 15 ml sentrifugerør.
- 10 ml BT fordøyelsesløsning: Til 10 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS), tilsett 3,5 mg / ml Dispase II, 1 mg / ml kollagenase II og 10 mM CaCl2 for å lage BTA fordøyelsesløsning.
- 10 ml 12% jodxanoloppløsning (separasjonsløsning): Bland 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% jodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl 2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 6,865 ml ddH2O for å oppnå 12% jodxanol.
- Avliv en voksen mus med CO2 overdose. Kort sagt, fyll museburet med 100% CO2 med en forskyvningshastighet på 10-30% burvolum per min. 5 minutter senere, bekreft døden ved å sjekke om fraværet av synlig pust.
- Disseker dyret og samle interscapular BAT. Fjern WAT og muskellag under et stereomikroskop.
- For å få tilstrekkelig fordøyelse, kutt hver BAT-lobe i ~ 3 mm3 deler og legg dem i en ren 50 ml kolbe med en metallrørestang og 5 ml fordøyelsesløsning. Før du begynner fordøyelsen, la kolben som inneholder BAT og fordøyelsesbufferen sitte på is i 1 time.
MERK: I de følgende trinnene ble rundt 80 mg BAT brukt til isolasjon av brune adipocytter.
2. BAs isolasjonsprosedyre
- Plasser kolben på en magnetisk omrører som er innelukket i en inkubator. Sett omrøringshastigheten til henholdsvis 60 o / min og temperaturen på inkubatoren på 35 ° C. Fordøyelsen vil vare i rundt 30 min. Hvis BAT-skivene danner klumper rundt omrørerstangen under fordøyelsen, bruk en 1 ml pipettespiss for å forstyrre det aggregerte vevet.
- Plasser et 70 μm silfilter på toppen av et rent 50 ml sentrifugerør. Pipette rundt 4 ml cellesuspensjon gjennom silen. Vask silen med 4 ml 12% jodxanoloppløsning. Pipette opp og ned for å blande cellene og jodxanoloppløsningen. Overfør celleblandingen til to klare 5 ml polystyren reagensrør.
NOTAT: På slutten av fordøyelsen bør fordøyelsesløsningen være overskyet, noe som indikerer tilstrekkelig fordøyelse. Bruk fersk fordøyelsesløsning hver gang. Når den er forberedt, bør fordøyelsesløsningen brukes innen 2 timer. - Gjenta trinn 2.2 og 2.3 en gang til hvis fordøyelsen ikke er tilstrekkelig.
- La de klare polystyrenrørene som inneholder separasjonsløsningen og BAene ligge på is i 1 time. BAene vil danne et lag på toppen.
- Ta ut 20 μL av de isolerte BAene for mikroskopundersøkelse.
3. RNA og proteinisolasjon fra BAs
- Pipetter BA-laget i to 1,7 ml mikrosentrifugerør for RNA- og proteinisolering. Fjern forsiktig overdreven jodxanolløsning uten å forstyrre BAs-laget.
- Tilsett 1 ml Trizol for samtidig å isolere RNA, DNA og protein i celleoppløsningen. Bland tilstrekkelig til å lyse cellene.
- Tilsett 200 μL kloroform for å skille fasene.
- Sentrifuger røret i 9 981 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Etter sentrifugering, bruk den vandige fasen for RNA-isolasjon. I denne studien ble totalt RNA brukt til revers transkripsjon, og kvantitativ RT-PCR ble utført med Real-Time PCR. Primersekvenser er oppført i Materialtabell.
- Overfør 300 μL av den organiske fasen til et 2 ml mikrosentrifugerør.
- Til den organiske fasen, tilsett 2,5 volum 100% etanol og virvel i 10 s.
- Tilsett 200 μL 1-Bromo-3-klorpropan og virvel i 10 s.
- Tilsett 600 μL dobbelt destillert vann og virvel i 10 s.
- La den blandede løsningen stå i 10 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 9 981 x g i 10 minutter ved 4 °C. På dette trinnet vil fasene bli skilt. Proteinfasen er lokalisert i mellomlaget.
- Fjern den øverste vandige løsningen. Tilsett 1 ml 100% etanol i den gjenværende løsningen.
- Sentrifuge i 10 minutter, 9 981 x g, 4 °C. Etter sentrifugering vil proteinpelleten dannes. Kast supernatanten.
- Vask pelleten med 1 ml 100% etanol.
- Sentrifuge i 10 minutter, 9981 x g, 4 °C. Lagre pelleten og kast supernatanten.
- Lufttørk pelleten i 10 minutter ved romtemperatur.
- Mål vekten av den våte pelleten. Tilsett 1% SDS-løsning i forholdet 20 μL / mg pellet.
- Løs opp pelleten ved å sette røret i en oppvarmet shaker. Still temperaturen til 55 °C og hastigheten til 11 x g. Det tar vanligvis 5-10 minutter å oppløse proteinpelleten helt.
MERK: Konsentrasjonen av det oppløste proteinet kan måles ved BCA-analyse14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstilling av interacapular BAT for isolasjon av brune adipocytter
Isolasjonsprosessen for brune adipocytter (BAs) er avbildet i figur 1A. Hele prosessen, fra å forberede flaggermus og fordøyelses- / separasjonsløsninger for å oppnå isolerte BAer, vil ta rundt 4 timer.
Hos voksne mus finnes rikelig BAT i interscapular regionen. Denne interscapular BAT (iBAT) er dekket av muskellag og WAT (figur 1B). Før du starter fordøyelsesprosedyren, må muskellagene og WAT fjernes for å gi ut ren iBAT (figur 1C). I en publisert BAs-isolasjonsprotokoll ble hakket BAT brukt til BAs-isolasjon12. I denne studien ga fordøyelsen av 3 mm3 størrelse BAT (figur 1D) flere BA enn hakket BAT.
Separasjon av BAer fra ikke-BAer med 3% BSA-løsning
Etter iBAT-fordøyelsen ble dissosierte BAer blandet med ikke-BAer i fordøyelsesproduktet. Fordi BAs inneholder lipiddråper, er deres tetthet lavere enn ikke-BAs; BA-tettheten er imidlertid ikke lav nok til å la dem flyte effektivt til toppen av en vanlig PBS-løsning. PBS som inneholder 3% bovint serumalbumin (BSA) har blitt brukt til å skille BAs fra ikke-BAs12, som ble gjentatt i denne studien (figur 2A).
Rosa 26 tdTomato er en reporter muselinje, som uttrykker sterktdTomato (tdTom ) fluorescensprotein etter Cre-mediert rekombinasjon13. Ucp1:: Cre transgene mus uttrykker Cre recombinase i BAs9. Ucp1::Cre muselinje ble krysset med Rosa 26tdTomato mus for å genetisk merke BAs med tdTom (figur 2B). For validering av BAs isolasjonsprosedyre ble iBAT fra Ucp1::Cre;tdTom/+ mus dissosiert. De fleste cellene som var beriket i det øverste laget av BSA-løsningen var bringebærform og inneholdt multilokulære lipiddråper. Videre var de fleste av disse bringebærformede cellene tdTom-positive (figur 2C), noe som bekrefter at de var brune adipocytter.
Separasjon av BAs fra ikke-BAs med 6% jodxanol løsning
3% BSA separasjonsløsning beriket BAs. Det var uklart om disse isolerte BAene kunne brukes til gen- og proteinuttrykksanalyse. RNA og protein ble deretter ekstrahert fra de berikede BAene. RNA-ekstraksjon ble vellykket utført i henhold til standard RNA-isolasjonsprosedyre. Imidlertid fungerte standard Trizol-proteinisolasjonsprotokoll, også kjent som Guanidinium-tiocyanat-fenol-kloroformmetode (GTPC-metoden), ikke bra, noe som var kjedelig og hadde svært lavt proteinutbytte. Derfor ble en forbedret proteinisolasjonsmetode vedtatt for å ekstrahere protein fra Trizol-lysed BAs.
I denne forbedrede GTPC-protokollen ble etanol, bromklorpropan og vann brukt til å ekstrahere protein fra den organiske fase15. Etter tilsetning av etanol, bromklorpropan og vann i den organiske fasen, og etter sentrifugering, dannet proteinpellet mellom den vandige fasen og den organiske fasen (figur 3A). Proteinpellet ble deretter vasket med 100% etanol og oppløst i 1% SDS. Denne forbedrede GTPC-metoden ble brukt til å ekstrahere protein fra iBAT- og BSA-løsningsberikede BAer. Selv om BAT-proteinpelleten lett ble oppløst i 1% SDS, var hoveddelen av den isolerte BAs-proteinpelleten ikke løselig. Deretter ble det oppløste proteinet undersøkt med SDS-PAGE gel. Som vist i en Coomassie blåfarget SDS-PAGE gel (figur 3B), var et massivt proteinbånd rundt 60 kDa tilstede i de isolerte BAene, men ikke i BAT-prøvene. Fordi molekylvekten til BSA er 66 kDa, og rikelig BSA eksisterer i BAs separasjonsløsning, bør dette dominerende proteinbåndet være BSA. Disse dataene antyder at BSA fra BAs separasjonsløsning forstyrrer proteinekstraksjon.
Iodixanol er et ikke-ionisk og iso-osmotisk gradientmedium16 som har blitt mye brukt for rensing av celle17 og adenoassosiert virus (AAV). For å unngå BSA-interferens av proteinuttrykksstudier ble iodixanol brukt til å erstatte BSA i en ny BAs separasjonsløsning. 3% BSA-løsning har en tetthet på 1, 03, som er lik 6% jodxanol. I 6% jodxanoloppløsning fløt BAs til toppen på 30-60 minutter (figur 3C). BAene isolert med denne løsningen viste typisk bringebærform og inneholdt multilokulære lipiddråper (figur 3D). Proteiner ekstrahert fra disse isolerte BAene ble pent separert i SDS-PAGE gel (figur 3E).
For å verifisere om 6% iodixanol-løsningen effektivt separerte BAer fra ikke-BAs, merket vi genetisk BAene med tdTom og undersøkte cellene som ligger i den klare 6% jodixanol-løsningen. Etter å ha separert BAene fra ikke-BAer (trinn 2.4), ble 6% jodxanoloppløsningen under BAs-laget fortynnet 6 ganger med PBS og ble deretter sentrifugert ved 600 x g i 5 minutter. Etter sentrifugering ble det dannet en liten rødcellepellet på bunnen, som kan være stromale vaskulære fraksjonsceller. Som vist i figur 3 var celler fra BAs-laget tdTom-positive celler (figur 3F); Cellene som ble gjenvunnet fra pelleten var imidlertid tdTom-negative (figur 3G). I tillegg var ingen åpenbare lipiddråper synlige i tdTom negative celler. Disse dataene tyder på at vår nye protokoll effektivt kan skille BAene fra ikke-fettcellene.
Sammen viser disse dataene at isolering av BA med 3% BSA-løsning forstyrrer oppfølging av biokjemistudier og antyder at 6% jodxanoloppløsning er bedre enn 3% BSA-løsning for isolering av BA.
Gen- og proteinuttrykksanalyse med isolerte BAer.
For å validere denne nye BAs-isolasjonsprosedyren på molekylært nivå ble uttrykket av tre gener sammenlignet mellom BAT og isolerte BAer: Ucp1, Pdgfa og Pdgfra. I BAT uttrykkes Pdgfra i endotelceller og interstitielle celler, og PDGFRα-positive celler er antatte stamceller10. mRNA-nivåene av Ucp1 og Pdgfa var begge signifikant høyere i de isolerte BAene enn i BAT (figur 4A, B). Tvert imot ble mRNA av Pdgfra bare påvist i BAT (figur 4B).
PPARγ er en transkripsjonsfaktor som kontrollerer fettvevsutvikling, UCP1 er et mitokondrieprotein, og PDGFRα er et membranreseptorprotein. Disse tre proteinene representerer proteiner fordelt i forskjellige cellulære rom. Western blots ble utført for å teste om protein ekstrahert fra Trizol-lysed BAs og BAT var egnet for proteinuttrykksanalyse. UCP1 og PPARγ ble påvist i både BA og BAT (figur 4C,D), noe som bekrefter at det totale proteinet isolert fra Trizol-lysed BAs eller BAT er egnet for western blot. Videre, i samsvar med qRT-PCR-resultatene, ble UCP1-protein beriket i BA (figur 4C); mens PDGFRα bare ble påvist i BAT, men ikke i rene BAer (figur 4D). Oppsummert viser disse dataene at vår nye BAs-isolasjonsmetode er effektiv og antyder at BAer beriket med denne metoden kan brukes direkte til gen- og proteinuttrykksstudier.
Figur 1: Tilberedning av iBAT for isolering av brune adipocytter . (A) Arbeidsflyt for isolasjonsprosedyren for brune adipocytter. (B) Ventral visning av interscapular vev som inneholder BAT, WAT og muskellag. (C) Interscapular BAT (iBAT). Muskellag og WAT ved siden av iBAT ble fjernet. (D) Et representativt bilde av iBAT-stykker som brukes til isolering av brune adipocytter. B-D, skala bar = 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Separasjon av brune adipocytter fra fordøyelsesløsning. (A) Bilder av dissosierte brune adipocytter før og etter separasjon. 3 % BSA-oppløsning ble brukt til å separere brune adipocytter fra ikke-brune adipocytter. Skalabar = 1 cm. (B) Skjematisk visning av genetisk merking av brune adipocytter med tdTomato fluorescensprotein. (C) Bilder av isolerte brune adipocytter. DIC, differensial interferenskontrast. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ekstraksjon av totalt protein fra lysede brune adipocytter . (A) Separasjon av proteinfase fra den organiske fasen. (B) Coomassie farging av SDS-PAGE gel. Totalt protein ble ekstrahert fra BAT eller 3% BSA-løsning rensede brune adipocytter. BSA-proteinbånd ble indikert med en pil. (C) Brunt adipocyttlag dannet på toppen av 6% jodxanoloppløsning. Skalabar = 1 cm. (D) Brune adipocytter isolert med 6% jodxanoloppløsning. Brune adipocytter ble indikert med gule piler. Skala bar = 50 μm. (E) Coomassie farging av SDS-PAGE gel. Totalt protein ble ekstrahert fra BAT eller 6% jodixanol løsning beriket BAs. (F) Bilder av tdTom merket brune adipocytter. (G) Bilder av celler gjenvunnet fra iodixanol-løsningen under BAs-laget. F og G, skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gen- og proteinuttrykksanalyse av isolerte brune adipocytter. Brune adipocytter isolert med jodxanol-metoden ble brukt i disse gen- og proteinuttrykksstudiene. (A,B) qRT-PCR-måling av genuttrykk. mRNA-nivåene ble normalisert til 36B4. N=3. Student t test, *, P<0,01; **, P<0,01. (C) Western blotting av PPARγ og UCP1. (D) Vestlig blotting av PDGFRα. C og D, Ponceau S-farget membran ble brukt som lastekontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble det utviklet en ny metode for å isolere BAs for gen- og proteinuttrykksanalyse.
I en publisert BAs-isolasjonsprotokoll ble 3% BSA-løsning brukt til å berike BAs12. Likevel kunne de berikede BAene oppnådd av denne publiserte protokollen ikke brukes direkte til proteinuttrykksanalyse. Dette skyldes at den konsentrerte BSA som eksisterer i BAs-løsningen forstyrrer oppfølging av proteinekstraksjon. Når BAene som er beriket i 3% BSA-løsningen ble behandlet med Trizol-reagens, ville klebrige proteinaggregater dannes, hvorav de fleste ikke var løselige i GTPC-proteinekstraksjonsprosessen. I tillegg, i GTPC-proteinekstraksjonsproduktet, var det meste av proteinet BSA (figur 3B). I denne nye protokollen ble 3% BSA-separasjonsløsning erstattet med 6% jodxanol for rensing av BAer. 6% jodxanolløsning separerte effektivt BAene fra ikke-BAs, og de isolerte BAene hadde bevart morfologi (figur 3D). Bedre enn 3% BSA-løsning, 6% jodxanoloppløsning interagerte ikke proteinekstraksjon, og det ekstraherte proteinet var egnet for vestlig blotanalyse (figur 4C, D).
Fettvev inneholder store mengder lipider, og lipidforurensning i ekstraherte proteinprøver hindrer måling av proteinkonsentrasjon. Nylig har en protokoll for å fjerne lipider fra proteinekstraksjoner blitt publisert. I denne protokollen er det nødvendig med en rekke sentrifugeringer med lav temperatur, noe som er kjedelig og trenger en stor mengde utgangsmaterialer19. I den nåværende studien ble en forbedret GTPC-metode15 vedtatt for å isolere protein fra BAT. Forskjellig fra den klassiske GTPC-protokollen, brukte denne forbedrede GTPC-protokollen etanol, bromo-klorpropan og vann for å trekke ut protein ut av den organiske fasen. Våre data viste at protein isolert med denne forbedrede GTPC-metoden var kompatibel med bicichoninsyreanalyse (BCA) basert proteinkonsentrasjonsmåling.
I den nåværende BAs-isolasjonsprotokollen, før starten av enzymdissosiasjonsprosessen, ble BAT og fordøyelsesløsningsblandingen plassert på is i en time. Formålet med denne prosedyren er å redusere cellemetabolismen og genuttrykkshastigheten20, samt å la fordøyelsesenzymene effektivt perfunderes inn i det brune fettvevet.
Den nåværende studien hadde som mål å utvikle en straitforward-metode for å isolere brune adiopocytter fra interscapular BAT for genuttrykksstudie; Imidlertid kan forurensning av hvite adipocytter eksistere i de isolerte BAene. Dette skyldes at interscapular BAT noen ganger er festet av hvitt fettvev, som ikke kan fjernes helt under BAT-forberedelsestrinnet. Den gjeldende protokollen kan ikke skille BAer fra WAer basert på celletetthet. Derfor, hvis svært høy renhet er viktig, må de isolerte BAene sorteres av FACS før de analyseres.
Interscapular BAT (iBAT) inneholder rikelig med klassiske BAer som stammer fra Myf5-cellelinjen under embryonal utvikling21. Her ble iBAT brukt som et eksempel for å isolere BAer. I likhet med den publiserte protokollen12, kan vår metode også brukes til å isolere beige celler fra WAT. Likevel, for å skaffe rene beige celler fra WAT, må de beige cellene merkes med fluorescensprotein og bli beriket av FACS. Etter vår nåværende protokoll kan FACS-berikede beige celler brukes til både gen- og proteinuttrykksanalyse, noe som vil forbedre effektiviteten av biologisk materialutnyttelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Z. Lin ble støttet av National Institutes of Health HL138454-01 og Masonic Medical Research Institute midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S.
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
