Isolering av brune adipocytter fra murine interscapular brunt fettvev for gen- og proteinuttrykksanalyse
Summary
Denne studien beskriver en ny metode for å isolere murine brune adipocytter for gen- og proteinuttrykksanalyse.
Abstract
Brunt fettvev (BAT) er ansvarlig for ikke-rystende termogenese hos pattedyr, og brune adipocytter (BA) er de funksjonelle enhetene til BAT. BA inneholder både multilokulære lipiddråper og rikelig mitokondrier, og de uttrykker frakobling av protein 1 (UCP1). BAs er kategorisert i to undertyper basert på deres opprinnelse: embryo avledet klassisk BAs (cBAs) og hvite adipocytter avledet BAs. På grunn av deres relativt lave tetthet kan BAer ikke isoleres fra BAT med tradisjonell sentrifugeringsmetode. I denne studien ble det utviklet en ny metode for å isolere BA fra mus for gen- og proteinuttrykksanalyse. I denne protokollen ble interscapular BAT fra voksne mus fordøyd med kollagenase og dispase løsning, og de dissosierte BAene ble beriket med 6% jodxanoloppløsning. Isolerte BAer ble deretter lysnet med Trizol-reagens for samtidig isolering av RNA, DNA og protein. Etter RNA-isolasjon ble den organiske fasen av lysatet brukt til proteinekstraksjon. Våre data viste at 6% jodxanolløsning effektivt beriket BA uten å forstyrre oppfølgingsgen- og proteinuttrykksstudier. Blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) er en vekstfaktor som regulerer vekst og spredning av mesenkymale celler. Sammenlignet med brunt fettvev hadde isolerte BAer signifikant høyere uttrykk for Pdgfa. Oppsummert gir denne nye metoden en plattform for å studere biologien til brune adipocytter på et enkelt celletypenivå.
Introduction
Både mus og mennesker har to typer fettvev: hvitt fettvev (WAT) og brunt fettvev (BAT)1. WAT lagrer energi i form av triglyserider i hvite adipocytter, og de brune adipocyttene (BAs) av BAT sprer kjemisk energi som varme2. Basert på deres utviklingsmessige opprinnelse, er BAs videre kategorisert i klassiske BAs (cBAs) som dannet under embryoutvikling og hvite adipocytter avledet BAs (beige / brite celler, omdannet fra hvite adipocytter under stressforhold)3. BA er multilokulære og uttrykker det termogene proteinet som kobler fra protein 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depot er et av de primære cBAs depotene i små pattedyr5, mens beige celler er spredt i WAT6.
På grunn av deres natur å spre energi, har BAs fått mye oppmerksomhet som et terapeutisk mål for å redusere fedme7. For å utnytte BAs med det formål å behandle fedme, er det viktig å forstå de molekylære mekanismene som styrer BAs funksjon, overlevelse og rekruttering. Fettvev inkludert BAT og WAT er heterogene. Bortsett fra adipocytter inneholder fettvev mange andre celletyper, som endotelceller, mesenkymale stamceller og makrofager8. Selv om genetiske verktøy for å spesifikt tømme kandidatgener hos mus BAs er tilgjengelige, for eksempel UCP1: : Cre linje9, er teknikker for rensing av BAs fra BAT eller WAT begrenset, noe som gjør det vanskelig å studere BAs på encellet type nivå. I tillegg, uten å oppnå rene BAer, vil forholdet mellom BAs og ikke-BAs ikke være klart avgrenset. For eksempel har blodplate-avledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRα) blitt brukt som en markør for udifferensierte mesenkymale celler, og det uttrykkes i endotel- og interstitielle celler av BAT. Ved kuldestresset BAT gir PDGFRα-positive stamceller opphav til nye BAs10. PDGFRα aktiveres av liganden PDGF, en vekstfaktor som regulerer vekst og spredning av mesenkymale celler11; Det er imidlertid uklart om BA påvirker oppførselen til PDGFRα-positive stamceller ved å utskille PDGF.
Nylig er det publisert en BAs-isolasjonsprotokoll, som er basert på fluorescensaktivert cellesortering (FACS)12. I denne protokollen ble 3 % bovin serumalbumin (BSA)-løsning brukt til å skille BAer fra ikke-BAer, og de berikede BAene ble ytterligere renset av FACS. Anvendelsen av denne protokollen er begrenset av kravet til FACS-prosess, som er avhengig av både utstyr og FACS-driftsopplevelser. I denne studien ble det utviklet en ny protokoll for isolering av BAer fra BAT. BAene isolert av denne protokollen kan brukes direkte til gen- og proteinuttrykksstudier. Videre tyder data fra denne studien på at BA er en stor PDGF-ressurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien ble det utviklet en ny metode for å isolere BAs for gen- og proteinuttrykksanalyse.
I en publisert BAs-isolasjonsprotokoll ble 3% BSA-løsning brukt til å berike BAs12. Likevel kunne de berikede BAene oppnådd av denne publiserte protokollen ikke brukes direkte til proteinuttrykksanalyse. Dette skyldes at den konsentrerte BSA som eksisterer i BAs-løsningen forstyrrer oppfølging av proteinekstraksjon. Når BAene som er beriket i 3% BSA-løsningen ble …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin ble støttet av National Institutes of Health HL138454-01 og Masonic Medical Research Institute midler.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
