Analys av motilitetsmönster av stentor under och efter oral apparatregenerering med hjälp av cellspårning

Summary

Vi presenterar ett protokoll för karakterisering av rörlighet och beteende hos en population av hundra mikron- till millimeterstora celler med hjälp av ljusfältmikroskopi och cellspårning. Denna analys avslöjar att Stentor coeruleus övergår genom fyra beteendemässigt distinkta faser när man regenererar en förlorad oral apparat.

Abstract

Stentor coeruleus är en välkänd modellorganism för studier av encellig regenerering. Transkriptomisk analys av enskilda celler avslöjade hundratals gener - många som inte är associerade med den orala apparaten (OA) - som regleras differentiellt i faser under hela regenereringsprocessen. Det antogs att denna systemiska omorganisation och mobilisering av cellulära resurser mot tillväxt av en ny OA kommer att leda till observerbara förändringar i rörelse och beteende som i tid motsvarar faserna av differentiellt genuttryck. Den morfologiska komplexiteten hos S. coeruleus krävde emellertid utvecklingen av en analys för att fånga statistiken och tidsskalan. Ett anpassat skript användes för att spåra celler i korta videor, och statistik sammanställdes över en stor befolkning (N ~ 100). Vid förlust av OA förlorar S. coeruleus initialt förmågan till riktad rörelse; sedan börjar vid ~ 4 h, uppvisar den en betydande hastighetsminskning fram till ~ 8 h. Denna analys ger ett användbart verktyg för screening av motilitetsfenotyper och kan anpassas för undersökning av andra organismer.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) är en välkänd modellorganism som har använts för att studera encellig regenerering på grund av dess stora storlek, förmåga att motstå flera mikrokirurgiska tekniker och lätthet att odla i laboratoriemiljö ^1,2,3. Tidiga regenereringsstudier fokuserade på den största och mest morfologiskt distinkta egenskapen hos Stentor - OA - som kastas helt på kemisk chock ^4,5,6. De novo-ersättning av en förlorad OA börjar med framväxten av ett nytt membranllarband - en uppsättning cilia som gradvis skiftar mot cellens främre del innan den bildar en funktionell OA över åtta morfologiska steg³. Dessa steg har observerats sekventiellt, oavsett temperatur, och ger en universell referenspunkt för nästan alla studier⁵.

Mekanistisk analys av Stentor-regenerering kräver verktyg för att mäta tidpunkten för regenerering som är robusta och enkla nog att appliceras på flera prover som en del av en kemisk eller molekylär skärm. Standardmetoden för att utföra en cellbaserad analys är avbildning, i detta fall avbildning av bildandet av ny OA under regenerering. Sådana avbildningsbaserade analyser är dock mest effektiva när den regenererande strukturen innehåller distinkta molekylära komponenter som kan användas som markörer, så att de lätt skulle detekteras i en fluorescensbild. När det gäller Stentor OA är de kända komponenterna (cilia, basala kroppar) också närvarande på resten av cellytan; Därför kan erkännande av återställandet av OA inte uppnås helt enkelt genom att leta efter närvaron eller frånvaron av en komponent.

Snarare skulle någon form av formigenkänning krävas för att detektera en OA, och detta är potentiellt mycket utmanande med tanke på att Stentorceller ofta ändrar form via en snabb kontraktil process. Detta papper presenterar en alternativ analys för regenerering som är beroende av kroppens rörliga aktivitet och OA-cilia. När OA regenererar genomgår de nybildade cilia reproducerbara förändringar i position och aktivitet, vilket i sin tur påverkar cellens simmotilitet. Genom att analysera rörlighet är det möjligt att utföra en analys för "funktionell regenerering" som kvantifierar regenerering genom att kvantifiera funktionen hos de regenererade strukturerna. Tidigare analys av Stentor ciliary funktion under regenerering använde partikelbildvelocimetri, i kombination med spårpärlor som tillsattes till det externa mediet, för att observera förändringar i flödesmönster vid olika stadier av regenerering⁷; detta tillvägagångssätt kräver dock mödosam avbildning av enskilda celler och deras associerade flödesfält, en i taget.

Genom att använda själva cellens rörelse som en proxy för cilia-genererat flöde skulle det vara möjligt att analysera ett större antal celler parallellt med hjälp av lågupplösta bildsystem som är kompatibla med screeningplattformar med hög genomströmning. Denna analys kan i princip användas för att studera utveckling och funktionell regenerering i andra simmande organismer i hundratals mikron till millimeter skala. Avsnitt 1 i protokollet beskriver konstruktionen av en flerbrunnsprovglas, vilket möjliggör avbildning med hög genomströmning av en population av celler under upp till en hel dag. Detaljer finns för hur du justerar för användning med andra celltyper. Avsnitt 2 i protokollet täcker insamling av videodata för denna analys, vilket kan åstadkommas på ett dissektionsmikroskop med en digital reflexkamera med en lins. Avsnitt 3 i protokollet ger en genomgång av cellspårning och cellhastighetsberäkning med MATLAB-kod (kompletterande information). Avsnitt 4 i protokollet förklarar hur man omvandlar de numeriska resultaten till diagram som visas i figur 1C-F och figur 2C för enkel tolkning av resultaten.

Protocol

OBS: En population av cirka hundra S. coeruleus-celler odlades i enlighet med ett tidigare publicerat JoVE-protokoll⁸.

1. Beredning av prover

1. Skär en bit 250 μm tjock silikondistansplåt (Materialtabell) något mindre i både höjd och bredd än ett mikroskopglas. Använd en 5/16 " hålslagning, skapa cirkulära brunnar. Var uppmärksam på att lämna tillräckligt med utrymme mellan angränsande brunnar för att säkerställa en bra tätning.
   OBS: Ett utrymme på 3 mm mellan angränsande brunnar visade sig vara tillräckligt. Med övning kan tio brunnar placeras på en enda provslip.
2. Initiera regenerering av OA genom att inkubera cellerna i 10% sackaros eller 2% urea i 2 min (figur 1A). Tvätta sedan tre gånger med färskt medium⁸. Pipettera försiktigt cirka tio Stentor i varje brunn. Var försiktig med att matcha provvolymen till brunnsvolymen så nära som möjligt.
   OBS: För de brunnsdimensioner som används här pipetterades 12,5 μL prov i varje brunn.
3. Stäng brunnarna genom att försiktigt sänka en bit täckglas (se materialtabell) över brunnarna med början från ena kanten. Använd ett smalt och något flexibelt föremål, till exempel en 10 μL pipettspets, för att trycka ner täckglaset där det kommer i kontakt med silikonplåten för att säkerställa en bra tätning.

2. Synligt ljus mikroskopi tidsfördröjning

1. Placera provet på mikroskopsteget och ställ in förstoringen till den lägsta tillgängliga så att en brunn passar i ramen i sin helhet.
   OBS: En 1,6x kameraadapter och 1x förstoring på målet användes på mikroskopet för detta protokoll.
2. Börja tidsfördröjningen. Skaffa en 10 s video med 30 bilder per sekund av varje brunn vid varje tidpunkt. Om du använder en mikroskopinställning med ett motoriserat XY-steg, automatisera hela tidsfördröjningen. Annars ser du till att en användare är närvarande vid varje tidpunkt för att manuellt översätta provet för att registrera varje brunn.
   OBS: Undvik att lämna provet upplyst när det inte avbildas för att undvika uppvärmning och avdunstning. Provvolymerna är små och avdunstning leder till luftbubblor.
3. Spara filmer som TIFF, MOV eller AVI.
   Obs: Dessa är de vanligaste icke-proprietära videofiltyperna. Beroende på den specifika mikroskopprogramvaran kan videorna sparas som standard till en proprietär filtyp, men kan sedan exporteras till en av de ovan nämnda filtyperna.
4. Använd en pixel till millimeter konverteringsfaktor för fysisk skala och utför en kalibrering eller använd känd pixelstorlek från den kamera som används. För att kalibrera, skaffa en tydlig bild av en kalibreringsbild eller en tydlig linjal med samma förstoringsinställningar som videorna. Använd valfritt bildvisningsprogram och räkna antalet pixlar mellan märken med ett känt fysiskt avstånd.
   Om bilden av en linjal till exempel visar 1 mm-märket och 2 mm-märket som ska separeras med 100 pixlar, är omvandlingsfaktorn 1 mm per 100 pixlar. Alternativt, för att härleda denna faktor från kamerans pixelstorlek, multiplicerar du helt enkelt kamerans pixelstorlek med förstoringen. Till exempel, om den använda kameran har 3,45 μm pixlar och förstoringen som användes var 1,6x, är omvandlingen 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm per 1 pixel.

3. Cell spårning

1. Ladda ner de två skripten, TrackCells.m och CleanTraces.m, till en plats som är lätt att komma ihåg på datorn. Om datavideorna inte redan finns på den här datorn, överför dem till den här datorn.
   DATAVIDEORNA och skripten behöver inte finnas i samma mapp.
2. Organisera datavideor i mappar, en för varje tidpunkt. Använd skriptet TrackCells.m först för att utföra automatiserad cellspårning i datavideorna. Öppna TrackCells.m och kör skriptet.
3. Välj Lägg till i sökväg om du uppmanas av ett popup-fönster., vilket vanligtvis bara händer när skriptet körs för första gången från en viss mapp. När du uppmanas till det väljer du en eller flera datavideor för att initiera spårning och navigerar till datavideorna (avsnitt 2). Välj flera videofiler genom att skift-klicka, ctrl-klicka eller genom att hålla ned vänster musknapp medan du flyttar över filerna för att markera dem.
4. När du är nöjd med listan över filer i filnamn: rutan längst ner i snabbfönstret klickar du på Öppna. Utför en testkörning på en video först för att bekräfta att alla parametrar är korrekt inställda (se diskussionen nedan).
   OBS: Detta skript skapar nu en mapp för varje vald videofil. Den kommer sedan att skriva in i den här mappen varje bildruta i videon som en .jpg fil och en fil med namnet position_estimates.mat, som innehåller alla spår som finns i videon. Beroende på storleken på videorna, antalet videor och datorns hastighet kan det här skriptet ta timmar att köra.

4. Spårningskontroll

1. Kontrollera att stegen som beskrivs i avsnitt 3 följdes korrekt genom att kontrollera att det inte finns några felmeddelanden innan du fortsätter. Använd CleanTraces.m-skriptet för att manuellt avvisa avvikande eller falska spårningar. Öppna CleanTraces.m i MATLAB-redigeringsfönstret genom att dubbelklicka på filen.
2. Vid prompten Välj datamapputdata från TrackCells.m. Den kommer att ha samma namn som videofilen, navigera till en av mapparna som skapats enligt beskrivningen i avsnitt 3. Välj bara en mapp.
   DET här skriptet visar nu spåren en efter en i ett popup-fönster. De är överlagrade på videobilden där spårningen börjar, i grönt och bildrutan för videon där spårningen slutar, i magenta. Därför bör ett giltigt spår länka en grön cell och en magentacell.
3. När du uppmanas till det anger du 1 för att behålla spårningen och 0 för att avvisa spårningen. Tryck på Retur för att gå vidare till nästa spårning.
   NYA spårningar fortsätter att visas tills det antingen inte finns fler spår eller tills de första sextio har visats. När den här processen är klar skapar skriptet automatiskt en mapp med namnet CLEAN TRACES för att spara utdata och visa alla återstående spår ovanpå den första bildrutan i videon (bild 1B). Den här bilden sparas automatiskt som LabeledTraces.png för framtida referens. Alla spår som användaren valt att behålla sparas i filen clean_traces.mat.
4. Slutför det här steget för alla videor på en gång innan du fortsätter.
   OBS: För data i detta manuskript förvärvades en video för varje brunn vid varje tidpunkt, för totalt tio videor per tidpunkt.

5. Visualisering av data

OBS: För att visuellt jämföra rörligheten hos hela cellpopulationen över olika tidpunkter översattes alla spår från avsnitt 4 för att börja vid origo och skapa en radiell förskjutning kontra tidsdiagram för varje tidpunkt (figur 1C-F, se kompletterande figur S1 för alla tidpunkter).

1. Börja med att ladda ner manuset med titeln SpaghettiPlots.m. Öppna och kör skriptet. När ett webbläsarfönster för fönsterfil dyker upp med prompten Välj tidsmapp som innehåller brunnsdata (clean_traces.mat) till graf, navigera till mappen för en av tidpunkterna. Observera att den här mappen ska innehålla en mapp för var och en av de analyserade videorna.
2. När du uppmanas till Kalibrering: Vad är antalet pixlar per millimeter?, skriv in kalibreringsvärdet i steg 2.4 och tryck på Retur.
   SKRIPTET kommer nu att kombinera spåren från alla analyserade videor vid denna tidpunkt till ett enda diagram (figur 1C-F). Svaga prickade cirklar i diagrammet indikerar radiella förskjutningar på 1, 2, 3 och 4 mm.
3. Justera axlarna på tomten efter behov genom att ändra rad 55 i skriptet, som som standard är inställt på rr = 4 för att inkludera en radie på upp till 4 mm. Spara tomten.

Representative Results

Målet med denna analys är att kvantifiera den gradvisa förändringen av rörelsemönster och fasad ökning av rörelsehastigheten från celler inom en stor (N ~ 100) regenererande Stentor-population. För att underlätta tolkningen av resultaten genererar den anpassade koden som ingår i detta protokoll två typer av diagram: ett överlägg av alla cellrörelsespår i en uppsättning videodata (figur 1C-F och figur S1) och ett diagram med simhastighet per timme sedan regenereringens början (figur 2C). En population av Stentor, som regenererar normalt, bör visa en stadig övergång från riktningslös simning till riktad simning (figur 1G). Medan varje cell genomgår denna övergång i sin helhet under OA-regenereringsprocessen som sträcker sig över ~ 8 timmar, kräver variation mellan individer att man tittar på rörelsen hos en stor befolkning totalt sett för att trender ska bli tydliga.

Figur 1C-F visar den kollektiva rörligheten hos samma population av Stentorceller vid 2, 3, 7 och 8 h in i OA-regenereringsprocessen. Dessa diagram visar både den förväntade ökningen av antalet rörliga individer (antal synliga spår) och den fyrfaldiga ökningen av intervallet för de mest rörliga cellerna inom befolkningen (radiell förskjutning). Det är viktigt att notera att axlarna skiljer sig åt mellan de olika panelerna i figur 1C-F, med 1 mm (timme 2), 2 mm (timmar 3 och 7) och 4 mm (timme 8) valda som mest lämpliga för att visa upp rörelsen. Vid 2 h - den tidigaste tidpunkten - rör sig inga celler mer än 1 mm under 10 s-videon, medan vid 9 h passerade många celler mer än 5 mm under samma tid. Kompletterande figur S1 ger dessa diagram för hela tidsfördröjningen, med identiska axlar som används över alla tomter för att ge en tydligare bild av den förväntade ökningen av rörlighet i ett framgångsrikt experiment.

Det finns en varning för tolkningen av denna exempelserie av tomter. De snabbaste simcellerna kunde simma över brunnen i videon, särskilt om de (av en slump) började nära kanten; således är de begränsade från att simma helt i en rak linje, och deras rörelseområde, som visualiseras på detta sätt, kommer att se mindre ut. Även om detta komplicerar alla försök att kvantifiera avståndet som cellerna reser, förändrar det inte den kvalitativa trenden att rörelseområdet ökar över minst 8 timmar. Detta överensstämmer med den kända morfologiska regenereringstidslinjen (figur 2A)³.

För att sammanställa befolkningsstatistik klassificerades de spårade cellerna i tre distinkta kategorier: icke-rörliga utan synlig hållfast, icke-rörliga med synliga hållfasta och rörliga. Dessa kategorier av beteende definierades tidigare av Tartar, men kvantifierades aldrig för deras prevalens över tid³. Figur 2B visar ett staplat histogram som sammanfattar relativa cellantal i dessa kategorier som en funktion av timmar till regenerering. Vid alla tidpunkter var över hälften av cellpopulationen inte observerbart rörlig. Dessutom hittades vid senare tillfällen ett betydande antal av cellerna i kolonier med synliga hållfasta, vilket starkt tyder på att de hade utforskat miljön och företrädesvis fäst nära andra av deras slag. Ett exempel på detta kan ses i det sista indraget i figur 2C.

Denna analys möjliggör statistisk jämförelse av simhastigheter under varje fas av rörlighetsåterhämtning. Medelvärdet och standardavvikelsen för data som presenteras i figur 2C sammanfattas nedan (tabell 1). När dessa statistiska storheter har extraherats genom cellspårning kan rörelsen som uppvisas av cellpopulationen i de olika faserna jämföras noggrant med hjälp av det oparade t-testet. Som ett konkret exempel, för de visade uppgifterna, beräknas t-statistiken som jämför simhastigheterna i fas 1 och fas 2 med:

där x₁ och x₂ anger medelhastigheten under fas 1 respektive 2, s₁ och s₂ betecknar standardavvikelserna för hastigheten under fas 1 respektive 2; n₁ och n₂ och betecknar antalet spår som extraherats under fas 1 respektive 2. Den resulterande t-statistiken t₁₂ kan sedan översättas till ett p-värde för hypotesprövning. För de data som visas i figur 2C är övergångarna från fas 1 till fas 2 (p < 0,1 %) och från fas 2 till fas 3 (p < 0,1 %) statistiskt signifikanta, medan övergången från fas 3 till fas 4 (p > 20 %) inte är det. Det är viktigt att notera att tendensen för cellerna att bosätta sig i små kolonier under fas 4 (figur 2B, infälld), vilket framgår av de råa videorna, är ett exempel på beteendeskillnad som inte fångas väl genom mätning av simhastigheter ensam. Detta förklarar den stora standardavvikelsen som uppmättes under fas 4 (0,26 mm/s), vilket i sin tur bidrog till en lägre t-statistik när man jämförde den med fas 3.

Figur 1: Cellspårning avslöjar gradvis återhämtning av riktad simning. (B) Exempel på spårningsresultat av regenerering av celler i en 10 s-video med randiga cirklar som indikerar luftbubblor i brunnen. (C-F) Överlagring av alla banor vid 2 h, 3 h, 7 h och 8 h. Tiderna avrundades till närmaste timme vid sammanställningen av data. Prickade cirklar indikerar radiella förskjutningar på en millimeter. (G) Cellmotilitet utvecklas från riktningslös simning som kännetecknas av korta cirkulära banor till riktad simning som kännetecknas av långa sinusformade banor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Motil subpopulation visar fyra distinkta faser av beteende genom OA-regenerering. (B) Normaliserade antal celler vid varje tidpunkt som var (blå) inte rörliga, utan synligt fasthållning; (orange) inte rörlig, med synligt fasthållning; (grön) rörlig. Flera datauppsättningar som sträcker sig över olika delmängder av timmar kombinerades för den här siffran, så det totala cellantalet per timme varierade från 57 till över 376. Förklaring visar representativa celler under varje kategori som visualiseras av falsk färg, i magenta och grönt. C) Boxplot av simhastighet; rutorna sträcker sig från Q1 till Q3 kvartilvärden vid varje tidpunkt med medianvärdet angivet i grönt. Spridningsöverläggen är medelhastigheten för varje rörlig cell. Infällt visar representativt befolkningsbeteende under var och en av de fyra faserna. Förkortningar: OA = oral apparat; Q1 = första kvartilen; Q3 = tredje kvartilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Motilitetsanalys som fenotypscreeningsverktyg kräver ett stort antal celler. (A, B) Spårningsresultat från två brunnar vid 12 h. (C, D) Spårningsresultat från samma två brunnar vid 18 h. Stentorceller visar en preferens att fästa i kluster, med vissa brunnar som sätter sig i kolonier timmar tidigare än andra. Randiga områden indikerar luftbubblor i brunnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

	Medelvärde (mm/s)	Standardavvikelse (mm/s)
Fas 1	0.14	0.24
Fas 2	0.06	0.13
Fas 3	0.16	0.16
Fas 4	0.15	0.26

Tabell 1: Jämförelse av simhastigheter under varje fas av rörlighetsåterhämtning.

Kompletterande figur S1: Befolkningens simmönster genom regenerering och därefter. (A-M) Rörelse av Stentor coeruleus celler 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 respektive 18 h efter initiering av oral apparatregenerering. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande videor 1-3: Exempel på mikroskopivideor av S. coeruleus för felsökning av skript. Avsnitt 5 i protokollet kan utföras på denna uppsättning av tre datavideor för en snabb bekräftelse på att skripten körs korrekt. Dessutom ger dessa videor ett konkret exempel på kontrast- och upplösningskrav för datavideorna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande filer: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Många partikel- och cellspårningsalgoritmer finns för närvarande, vissa helt gratis. Kostnad och användarvänlighet är ofta avvägningar som kräver kompromisser. Dessutom är många av de befintliga cellspårningsprogrammen utformade för att spåra långsam kryprörelse av vävnadsodlingsceller, snarare än Stentors snabba simrörelse, som roterar medan du simmar och kan genomgå plötsliga riktningsförändringar. Efter att ha testat många av dessa alternativ är protokollet som presenteras här avsett att vara en enda lösning för att gå hela vägen från datainsamling till datavisualisering med endast billig utrustning och ett enda vetenskapligt programvarupaket (Materialtabell). Detta är av särskilt intresse för forskningslaboratorier vid undervisningsfokuserade institutioner eller biofysikundervisningslaboratorier där det mesta av den utrustning som behövs redan finns tillgänglig, eftersom det sänker tröskeln för studenter att ställa sina egna frågor och komma fram till kvantitativa resultat inom en kort tidsram.

Metoden som presenteras i detta manuskript kan anpassas för att kvantitativt karakterisera rörligheten hos en population av organismer i hundra mikron till millimeterstorleksskala. Tillämpning på mindre eller större organismer kommer att kräva ändringar i hur videodata måste förvärvas. Som tillämpas på en population av regenererande S. coeruleus här, gav detta protokoll en tidslinje för funktionell återhämtning av rörlighet över cellpopulationen, vilket kompletterar det som för närvarande är känt om den transkriptionella tidslinjen. Det är till exempel känt från RNA-sekvensering att syntes av gener som kodar för ciliära motilitetsproteiner inte äger rum förrän flera timmar in i regenereringsprocessen, långt efter bildandet av själva cilia ^9,10. Den statistiskt signifikanta minskningen av rörligheten från timmarna 0-3 (fas 1) till timme 4 (fas 2) som demonstrerats ovan överensstämmer med denna fördröjning i uttryck av ciliära motilitetsfaktorer jämfört med uttrycket av gener som är involverade i ciliär sammansättning. Ingen transkriptomisk studie av Stentor-regenerering hittills hade utförts efter timme nio, så lite är känt om den genomiska aktiviteten. Bristen på statistiskt signifikant skillnad mellan timmar 8-10 (fas 3) och timmar 11+ (fas 4) tyder på att cellerna har regenererats helt vid denna tidpunkt, och få gener som är relevanta för cellmotilitet bör regleras differentiellt bortom timme 9.

Två stora begränsningar för denna metod är dess misslyckande med att spåra klustrade och / eller vidrörande celler och dess oförmåga att kvantifiera mer komplexa aspekter av rörelse än simhastigheter eller banor. Alla partikel- / cellspårningsalgoritmer har svårt att följa celler som tillfälligt hindras visuellt av en annan cell och när flera celler spenderar flera ramar i närheten; skriptet som ingår här är inget undantag. Lyckligtvis kan frekvensen av den förra effektivt minskas helt enkelt genom att begränsa antalet celler som placeras inuti en brunn som diskuteras i nästa stycke. Specifikt för S. coeruleus-populationen som undersöktes här orsakade deras preferens att bosätta sig i kolonier (figur 3) att några av dessa celler inte identifierades av skriptet. Men eftersom alla dessa celler uppvisar liten eller ingen rörelse påverkas inte statistiken över den rörliga cellpopulationen. Dessutom är videor där flera celler undviker spårning enkla att identifiera och manuellt utesluta från vidare analys. När det gäller kvantifieringen av komplexa aspekter av rörelse föreslår övergången från riktningslös till riktad simning som ses i kompletterande figur S1 kvantitativa förändringar i tidskorrelationen för riktning, genomsnittlig acceleration och potentiellt andra mätbara. Hastighet och räckvidd, de enda kvantiteterna som analyseras i detta protokoll, representerar endast en liten aspekt av rörelse.

Slutligen är några delar av protokollet av särskild betydelse eller konsekvens i praktisk användning. Montering av flerbrunnsprovglasen med tunna silikonplåtar, som beskrivs i protokollavsnitt 1, kräver övning. Det är lätt att införa läckor eller luftbubblor i minst en brunn medan du tätar provet med täckglaset. Brunnarna kan delas upp över flera provglas för att möjliggöra användning av mindre täckglas, vilket gör processen enklare (och misstag billigare). Även om analysen som presenteras här kan användas för att karakterisera motilitetsmönstren hos en cellpopulation vid en enda tidpunkt, demonstreras den här som ett verktyg för att jämföra rörlighetsmönster för en enda population under en lång tidsfördröjning (över 10 h). Som med alla långa tidsfördröjningar är avdunstning av ett vått prov oundvikligt. Avdunstningen kan minimeras genom en säker tätning av silikondistansen i bildkammaren till både glasskivan och täckglaset. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i att brunnar läcker in i varandra eller luftbubblor bildas inuti brunnarna. För forskare som inte känner till användningen av silikondistanser bör pastöriserat källvatten eller annat rent medium pipetteras i varje brunn för att testa läckage före användning. Måtten på provbrunnarna valdes alla för att fungera bra för S. coeruleus, som är cirka 1 mm stora. Detta inkluderar silikondistanstjocklek (vald för att begränsa S. coeruleus-cellerna som undersöks till ett tvådimensionellt plan), 5/16 "diameter och 10 celler per brunn. Dessa siffror bör justeras när du anpassar detta protokoll för andra celltyper.

Flera parametrar i TrackCells.m-skriptet kan justeras för att optimera automatisk cellidentifiering och spårningsvalidering. Parametrarna MinCellArea och MaxCellArea (raderna 15 och 16 i skriptet) tillåter användaren att ställa in det acceptabla storleksintervallet för en cell i fyrkantiga pixlar. Vilka värden som är bäst beror på många detaljer i experimentet, inklusive cellstorlek, kamerapixelstorlek, förstoring och om det finns objekt som kan felidentifieras som celler, till exempel luftbubblor. Standardvärdena 300 och 1500 var optimala för den exakta utrustningen och inställningarna i protokollet. När MinCellArea och MaxCellArea har optimerats justerar du parametern Threshold (Rad 17) för att ändra bildkontrasten. När de är felaktigt inställda kommer cellkonturerna att vara dåligt identifierade eller missas helt och hållet, vilket hindrar korrekt spårning. Om inget värde på Tröskelvärde fungerar bra för korrekt spårning kan du prova med en video med högre kontrast eller som är mer i fokus. Rad 218 i skriptet, bad_trks = find(strk_trks > 20); är ansvarig för att kassera spår som avviker från den förutsagda rörelsen (via Kalman-filter) för många gånger. Som det är har skriptet denna tröskel för för många inställda på 20. Minska det här heltalsvärdet till så långt som 1 om du vill ta bort spår mer aggressivt. Öka värdet för att kassera mindre aggressivt. Mycket av TrackCells.m antogs från handledningen för spårning av flera objekt som är fritt tillgänglig på http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, som läsaren kan hänvisa till för mer information. Kompletterande videor 1-3 är exempeldatavideor för en testkörning av skripten.

S. coeruleus förmåga att helt regenerera en förlorad OA har först observerats för över ett sekel sedan, men många öppna frågor kvarstår angående återhämtning av rörlighet och beteendetillstånd. Protokollet som presenteras här är avsett att avmystifiera kombinationen av ljusfältsavbildning, automatiserad cellidentifiering och spårning och datavisualisering som författarna använde för att kvantitativt karakterisera rörligheten hos en population av regenererande Stentor. Detta arbetsflöde är i stort sett tillämpligt på undersökningen av rörlighet i allmänhet, och de skript och protokoll som ingår kan lätt antas för att arbeta med andra biologiska system av liknande storlek och hastighet, till exempel andra ciliater som Paramecium och Blepharisma. Dessutom, byte av bildkammare (t.ex. användning av torra brunnar eller brunnar av olika storlek i kombination med olika bildförstoring) utökar användbarheten av detta arbetsflöde kraftigt. Den nuvarande verktygslådan för Stentor inkluderar kirurgisk dissektion, osmotisk chock, RNAi, DNA / RNA-analys och småmolekylära hämmare⁶. High-throughput-metoden för kvantifiering av motilitet som presenteras här lägger till en kompletterande grad av karakterisering och kommer att användas i framtida arbete för att undersöka motilitetsfenotyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m