Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking

Summary

We presenteren een protocol voor de karakterisering van beweeglijkheid en gedrag van een populatie van honderd micron- tot millimetergrote cellen met behulp van brightfield-microscopie en celtracking. Deze test onthult dat Stentor coeruleus door vier gedragsmatig verschillende fasen gaat bij het regenereren van een verloren oraal apparaat.

Abstract

Stentor coeruleus is een bekend modelorganisme voor de studie van eencellige regeneratie. Transcriptomische analyse van individuele cellen onthulde honderden genen - veel niet geassocieerd met het orale apparaat (OA) - die differentieel gereguleerd zijn in fasen tijdens het regeneratieproces. Er werd verondersteld dat deze systemische reorganisatie en mobilisatie van cellulaire middelen naar de groei van een nieuwe artrose zal leiden tot waarneembare veranderingen in beweging en gedrag die in de tijd overeenkomen met de fasen van differentiële genexpressie. De morfologische complexiteit van S. coeruleus maakte echter de ontwikkeling van een test noodzakelijk om de statistieken en de tijdschaal vast te leggen. Een aangepast script werd gebruikt om cellen in korte video's te volgen en statistieken werden samengesteld over een grote populatie (N ~ 100). Bij verlies van de OA verliest S. coeruleus aanvankelijk het vermogen tot gerichte beweging; dan vanaf ~ 4 uur, vertoont het een aanzienlijke daling van de snelheid tot ~ 8 uur. Deze test biedt een nuttig hulpmiddel voor de screening van motiliteitsfenotypen en kan worden aangepast voor het onderzoek van andere organismen.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) is een bekend modelorganisme dat is gebruikt om eencellige regeneratie te bestuderen vanwege zijn grote omvang, vermogen om verschillende microchirurgische technieken te weerstaan en het gemak van kweken in een laboratoriumomgeving ^1,2,3. Vroege regeneratiestudies richtten zich op het grootste en meest morfologisch onderscheidende kenmerk in Stentor - de OA - die volledig wordt afgeworpen op chemische shock ^4,5,6. De novo vervanging van een verloren artrose begint met de opkomst van een nieuwe membraanllarband - een reeks trilharen die geleidelijk naar de voorste van de cel verschuiven voordat ze een functionele artrose vormen gedurende acht morfologische stadia³. Deze stadia zijn sequentieel waargenomen, ongeacht de temperatuur, en vormen een universeel referentiepunt voor bijna alle onderzoeken⁵.

Mechanistische analyse van Stentor-regeneratie vereist hulpmiddelen voor het meten van de timing van regeneratie die robuust en eenvoudig genoeg zijn om op meerdere monsters te worden toegepast als onderdeel van een chemisch of moleculair scherm. De standaardmethode voor het uitvoeren van een celgebaseerde test is beeldvorming, in dit geval het in beeld brengen van de vorming van nieuwe artrose tijdens regeneratie. Dergelijke op beeldvorming gebaseerde testen zijn echter het meest effectief wanneer de regenererende structuur verschillende moleculaire componenten bevat die als markers kunnen worden gebruikt, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd in een fluorescentiebeeld. In het geval van de Stentor OA zijn de bekende componenten (trilharen, basale lichamen) ook aanwezig op de rest van het celoppervlak; daarom kan het erkennen van het herstel van de OA niet worden bereikt door simpelweg te zoeken naar de aan- of afwezigheid van een component.

Integendeel, een vorm van vormherkenning zou nodig zijn om een artrose te detecteren, en dit is potentieel zeer uitdagend gezien het feit dat Stentor-cellen vaak van vorm veranderen via een snel contractiel proces. Dit artikel presenteert een alternatieve test voor regeneratie die afhankelijk is van de beweeglijke activiteit van het lichaam en OA-trilharen. Naarmate de OA regenereert, ondergaan de nieuw gevormde trilharen reproduceerbare veranderingen in positie en activiteit, die op hun beurt de zwemmotiliteit van de cel beïnvloeden. Door de beweeglijkheid te analyseren, is het mogelijk om een test uit te voeren voor "functionele regeneratie" die regeneratie kwantificeert door de functie van de geregenereerde structuren te kwantificeren. Eerdere analyse van de stentoriële functie tijdens de regeneratie maakte gebruik van deeltjesbeeld velocimetrie, gecombineerd met tracerparels toegevoegd aan de externe media, om veranderingen in het stromingspatroon in verschillende stadia van regeneratie waar te nemen⁷; deze aanpak vereist echter een moeizame beeldvorming van individuele cellen en hun bijbehorende stroomvelden, één voor één.

Door de beweging van de cel zelf te gebruiken als een proxy voor door trilharen gegenereerde stroom, zou het mogelijk zijn om grotere aantallen cellen parallel te analyseren, met behulp van beeldvormingssystemen met lage resolutie die compatibel zijn met screeningplatforms met hoge doorvoer. Deze test kan in principe worden gebruikt om ontwikkeling en functionele regeneratie in andere zwemmende organismen te bestuderen op een schaal van honderden micron tot millimeters. Sectie 1 van het protocol beschrijft de constructie van een multiwell-monsterdia, die een high-throughput beeldvorming van een populatie cellen over maximaal een hele dag mogelijk maakt. Er worden details gegeven over hoe u kunt aanpassen voor gebruik met andere celtypen. Sectie 2 van het protocol heeft betrekking op het verzamelen van videogegevens voor deze test, die kan worden uitgevoerd op een dissectiemicroscoop met een digitale spiegelreflexcamera met één lens. Sectie 3 van het protocol biedt een overzicht van celtracking en celsnelheidsberekening met behulp van MATLAB-code (aanvullende informatie). In hoofdstuk 4 van het protocol wordt uitgelegd hoe de numerieke resultaten kunnen worden omgezet in plots zoals weergegeven in figuur 1C-F en figuur 2C voor eenvoudige interpretatie van de resultaten.

Protocol

OPMERKING: Een populatie van ongeveer honderd S. coeruleuscellen werd gekweekt in overeenstemming met een eerder gepubliceerd JoVE-protocol⁸.

1. Monstervoorbereiding

1. Snijd een stuk van 250 μm dik siliconen afstandsblad (Table of Materials) iets kleiner in zowel hoogte als breedte dan een microscoopglaasje. Maak met behulp van een 5/16"-perforator cirkelvormige putten. Houd er rekening mee dat u voldoende ruimte tussen naburige putten laat om een goede afdichting te garanderen.
   OPMERKING: Een ruimte van 3 mm tussen naburige putten bleek voldoende te zijn. Met oefening kunnen tien putten op een enkele monsterglijbaan worden geplaatst.
2. Start regeneratie van artrose door de cellen gedurende 2 minuten in 10% sucrose of 2% ureum te incuberen (figuur 1A). Was vervolgens drie keer met vers medium⁸. Pipetteer voorzichtig ongeveer tien Stentor in elke put. Pas op dat u het monstervolume zo goed mogelijk afstemt op het putvolume.
   OPMERKING: Voor de hier gebruikte putafmetingen werd 12,5 μL monster in elke put gepipetteerd.
3. Sluit de putten door voorzichtig een stuk dekglas (zie Materiaaltabel) over de putten te laten zakken vanaf één rand. Gebruik een smal en enigszins flexibel voorwerp, zoals een pipetpunt van 10 μL, om op het afdekglas te drukken waar het contact maakt met het siliconenvel, om een goede afdichting te garanderen.

2. Zichtbaar licht microscopie time-lapse

1. Plaats het monster op het microscoopstadium en stel de vergroting in op het laagst beschikbare, zodat er een goed in het frame in zijn geheel past.
   OPMERKING: Een 1,6x camera-adapter en 1x vergroting op het objectief werden gebruikt op de microscoop voor dit protocol.
2. Begin met time-lapse. Verkrijg een video van 10 s met 30 frames per seconde van elke put op elk tijdstip. Als u een microscoopopopstelling met een gemotoriseerde X-Y-fase gebruikt, automatiseert u de hele time-lapse. Zorg er anders voor dat er op elk tijdstip een gebruiker aanwezig is om het voorbeeld handmatig te vertalen naar het opnemen van elke put.
   OPMERKING: Vermijd het monster verlicht te laten wanneer het niet wordt afgebeeld om verwarming en verdamping te voorkomen. De monstervolumes zijn klein en verdamping zal leiden tot luchtbellen.
3. Sla films op als TIFF, MOV of AVI.
   OPMERKING: Dit zijn de meest voorkomende niet-gepatenteerde videobestandstypen. Afhankelijk van de specifieke microscoopsoftware kunnen de video's standaard worden opgeslagen in een eigen bestandstype, maar kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar een van de bovengenoemde bestandstypen.
4. Gebruik een conversiefactor van pixel naar millimeter voor fysieke schaal en voer een kalibratie uit of gebruik de bekende pixelgrootte van de gebruikte camera. Als u wilt kalibreren, krijgt u een duidelijk beeld van een kalibratiedia of een duidelijke liniaal met dezelfde vergrotingsinstellingen als de video's. Gebruik een willekeurig programma voor het weergeven van afbeeldingen om het aantal pixels te tellen tussen markeringen van een bekende fysieke afstand.
   OPMERKING: Als de afbeelding van een liniaal bijvoorbeeld de markering van 1 mm en 2 mm laat zien die door 100 pixels moeten worden gescheiden, is de conversiefactor 1 mm per 100 pixels. Als u deze factor wilt afleiden uit de pixelgrootte van de camera, vermenigvuldigt u de pixelgrootte van de camera met de vergroting. Als de gebruikte camera bijvoorbeeld 3,45 μm pixels heeft en de gebruikte vergroting 1,6x was, is de conversie 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm per 1 pixel.

3. Cel tracking

1. Download de twee scripts, TrackCells.m en CleanTraces.m, naar een gemakkelijk te onthouden locatie op de computer. Als de gegevensvideo's nog niet op deze computer staan, brengt u ze over naar deze computer.
   OPMERKING: De gegevensvideo's en de scripts hoeven zich niet in dezelfde map te bevinden.
2. Organiseer gegevensvideo's in mappen, één voor elk tijdstip. Gebruik eerst het script TrackCells.m om geautomatiseerde celtracking uit te voeren in de gegevensvideo's. Open TrackCells.m en voer het script uit.
3. Kies Toevoegen aan pad als daarom wordt gevraagd door een pop-upvenster., wat meestal alleen gebeurt wanneer het script voor de eerste keer wordt uitgevoerd vanuit een bepaalde map. Wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u Een of meer gegevensvideo's om tracking te starten, navigeert u naar de gegevensvideo's (sectie 2). Selecteer meerdere videobestanden met shift-click, control-click of door de linkermuisknop ingedrukt te houden terwijl u over de bestanden beweegt om ze te markeren.
4. Eenmaal tevreden met de lijst met bestanden in het vak Bestandsnaam: onderaan het promptvenster, klikt u op Openen. Voer eerst een testrun uit op één video om te controleren of alle parameters correct zijn ingesteld (zie onderstaande discussie).
   OPMERKING: Dit script maakt nu een map voor elk gekozen videobestand. Het schrijft vervolgens in deze map elk frame van de video als een .jpg bestand en een bestand met de naam position_estimates.mat, dat alle sporen bevat die in de video zijn gevonden. Afhankelijk van de grootte van de video's, het aantal video's en de snelheid van de computer, kan het uren duren voordat dit script wordt uitgevoerd.

4. Traceer verificatie

1. Controleer of de in sectie 3 beschreven stappen correct zijn gevolgd door te controleren of er geen foutberichten zijn voordat u doorgaat. Gebruik het script CleanTraces.m om afwijkende of valse sporen handmatig te weigeren. Open CleanTraces.m in het MATLAB-editorvenster door te dubbelklikken op het bestand.
2. Bij de prompt Selecteer gegevensmapuitvoer door TrackCells.m. Het heeft dezelfde naam als het videobestand, navigeer naar een van de mappen die zijn gemaakt zoals beschreven in sectie 3. Kies slechts één map.
   OPMERKING: Dit script geeft de sporen nu één voor één weer in een pop-upvenster. Ze zijn bedekt met het frame van de video waar het spoor begint, in groen, en het frame van de video waar het spoor eindigt, in magenta. Daarom moet een geldig spoor een groene cel en een magentacel verbinden.
3. Wanneer u hierom wordt gevraagd, voert u 1 in om het spoor te behouden en 0 om het spoor te weigeren. Druk op Enter om door te gaan naar de volgende tracering.
   OPMERKING: Nieuwe sporen blijven worden weergegeven totdat er geen sporen meer zijn of de eerste zestig zijn getoond. Wanneer dit proces is voltooid, maakt het script automatisch een map met de naam CLEAN TRACES voor het opslaan van de uitvoer en geeft het alle resterende sporen weer bovenop het eerste frame van de video (figuur 1B). Deze afbeelding wordt automatisch opgeslagen als LabeledTraces.png voor toekomstig gebruik. Alle sporen die de gebruiker had gekozen om te bewaren, worden opgeslagen in het bestand clean_traces.mat.
4. Voltooi deze stap voor alle video's in één keer voordat u doorgaat.
   OPMERKING: Voor de gegevens in dit manuscript werd één video verkregen voor elke put op elk tijdstip, voor een totaal van tien video's per tijdspunt.

5. Datavisualisatie

OPMERKING: Om de beweeglijkheid van de gehele celpopulatie over verschillende tijdspunten visueel te vergelijken, werden alle sporen uit sectie 4 vertaald om te beginnen bij de oorsprong en één radiale verplaatsing versus tijdplot te creëren voor elk tijdspunt (figuur 1C-F, zie aanvullende figuur S1 voor alle tijdspunten).

1. Begin met het downloaden van het script met de titel SpaghettiPlots.m. Open en voer het script uit. Wanneer een vensterbestandsbrowservenster verschijnt met de prompt Selecteer tijdmap met putgegevens (clean_traces.mat) om in grafiek te worden weergegeven, navigeert u naar de map van een van de tijdstippen. Merk op dat deze map een map moet bevatten voor elk van de geanalyseerde video's.
2. Wanneer u wordt gevraagd kalibratie: Wat is het aantal pixels per millimeter?, typt u de kalibratiewaarde in stap 2.4 en drukt u op Enter.
   OPMERKING: Het script combineert nu de sporen van alle geanalyseerde video's op dit moment in één plot (figuur 1C-F). Zwakke stippelcirkels in het plot duiden op radiale verplaatsingen van 1, 2, 3 en 4 mm.
3. Pas de assen van de plot indien nodig aan door regel 55 van het script te wijzigen, die standaard is ingesteld op rr = 4 voor het opnemen van een straal van maximaal 4 mm. Sla de plot op.

Representative Results

Het doel van deze test is om de geleidelijke verandering van bewegingspatronen en gefaseerde toename van bewegingssnelheid van cellen binnen een grote (N ~ 100) regenererende Stentorpopulatie te kwantificeren. Om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken, genereert de aangepaste code in dit protocol twee soorten plots: een overlay van alle celbewegingssporen in een reeks videogegevens (figuur 1C-F en figuur S1) en een plot van zwemsnelheid per uur sinds het begin van de regeneratie (figuur 2C). Een populatie Stentor, die normaal regenereert, moet een gestage overgang vertonen van richtingloos zwemmen naar gericht zwemmen (figuur 1G). Hoewel elke cel deze overgang volledig ondergaat tijdens het OA-regeneratieproces van ~ 8 uur, vereist variatie tussen individuen dat naar de beweging van een grote populatie in totaal wordt gekeken om trends duidelijk te maken.

Figuur 1C-F toont de collectieve beweeglijkheid van dezelfde populatie Stentorcellen op 2, 3, 7 en 8 h in het OA-regeneratieproces. Deze plots tonen zowel de verwachte toename van het aantal beweeglijke individuen (aantal zichtbare sporen) als de viervoudige toename van het bereik van de meest beweeglijke cellen binnen de populatie (radiale verplaatsing). Het is belangrijk op te merken dat assen verschillen tussen de verschillende panelen van figuur 1C-F, waarbij 1 mm (uur 2), 2 mm (uur 3 en 7) en 4 mm (uur 8) het meest geschikt zijn om de beweging weer te geven. Bij 2 uur - het vroegste tijdstip - bewegen geen cellen meer dan 1 mm tijdens de 10 s-video, terwijl bij 9 uur veel cellen meer dan 5 mm doorkruisten gedurende dezelfde tijdsduur. Aanvullende figuur S1 biedt deze plots voor de volledige time-lapse, met identieke assen die in alle percelen worden gebruikt om een duidelijker beeld te geven van de verwachte toename van de beweeglijkheid in een succesvol experiment.

Er is één kanttekening bij de interpretatie van deze voorbeeldreeks van plots. De snelst zwemmende cellen konden in de video over de put zwemmen, vooral als ze (toevallig) dicht bij de rand begonnen; zo zijn ze beperkt in het volledig zwemmen in een rechte lijn, en hun bewegingsbereik, zoals op deze manier gevisualiseerd, zal kleiner lijken. Hoewel dit elke poging om de afstand die door de cellen wordt afgelegd te kwantificeren bemoeilijkt, verandert dit niets aan de kwalitatieve trend dat het bewegingsbereik gedurende ten minste 8 uur toeneemt. Dit komt overeen met de bekende morfologische regeneratietijdlijn (figuur 2A)³.

Om populatiestatistieken samen te stellen, werden de gevolgde cellen ingedeeld in drie verschillende categorieën: niet-beweeglijk zonder zichtbare holdfast, niet-beweeglijk met zichtbare holdfast en beweeglijk. Deze gedragscategorieën werden eerder gedefinieerd door Tartaar, maar nooit gekwantificeerd voor hun prevalentie in de loop van de tijd³. Figuur 2B toont een gestapeld histogram dat relatieve celtellingen in deze categorieën samenvat als functie van uren in regeneratie. Op alle tijdstippen was meer dan de helft van de celpopulatie niet waarneembaar beweeglijk. Bovendien werd op latere tijdstippen een aanzienlijk aantal van de cellen gevonden in kolonies met zichtbare holdfasts, wat sterk suggereert dat ze de omgeving hadden verkend en bij voorkeur in de buurt van anderen van hun soort hadden gehecht. Een voorbeeld hiervan is te zien in de laatste inzet van figuur 2C.

Deze test maakt statistische vergelijking van zwemsnelheden mogelijk tijdens elke fase van motiliteitsherstel. De gemiddelde en de standaarddeviatie voor de gegevens in figuur 2C worden hieronder samengevat (tabel 1). Zodra deze statistische grootheden zijn geëxtraheerd door celtracering, kan de beweging die wordt getoond door de populatie van cellen in de verschillende fasen rigoureus worden vergeleken met behulp van de ongepaarde t-test. Als concreet voorbeeld, voor de getoonde gegevens, wordt de t-statistiek die de zwemsnelheden in fase 1 en fase 2 vergelijkt, berekend door:

waarbij x₁ en x₂ de gemiddelde snelheid tijdens respectievelijk fase 1 en 2 aangeven; s₁ en s₂ geven de standaardafwijkingen van de snelheid aan tijdens respectievelijk fase 1 en 2; n₁ en n₂ en geven het aantal sporen aan dat tijdens respectievelijk fase 1 en 2 is geëxtraheerd. De resulterende t-statistiek t₁₂ kan vervolgens worden vertaald in een p-waarde voor hypothesetesten. Voor de gegevens in figuur 2C zijn de overgangen van fase 1 naar fase 2 (p < 0,1%) en van fase 2 naar fase 3 (p < 0,1%) statistisch significant, terwijl de overgang van fase 3 naar fase 4 (p > 20%) dat niet is. Het is belangrijk op te merken dat de neiging van de cellen om zich tijdens fase 4 in kleine kolonies te vestigen (figuur 2B, inzet), zoals blijkt uit de onbewerkte video's, een voorbeeld is van gedragsverschillen die niet goed worden vastgelegd door het meten van zwemsnelheden alleen. Dit verklaart de grote standaarddeviatie gemeten tijdens fase 4 (0,26 mm/s), die op zijn beurt heeft bijgedragen aan een lagere t-statistiek bij vergelijking met fase 3.

Figuur 1: Celtracering onthult geleidelijk herstel van gericht zwemmen. (A) Sucroseschok induceert Stentor coeruleus om membraanllarband af te werpen. (B) Voorbeeld van het volgen van het resultaat van regenererende cellen in een 10 s video met gestreepte cirkels die luchtbellen in de put aangeven. (C-F) Overlay van alle trajecten op 2 h, 3 h, 7 h en 8 h. Tijden werden afgerond op het dichtstbijzijnde uur tijdens het verzamelen van gegevens. Gestippelde cirkels geven radiale verplaatsingen van één millimeter aan. (G) Celmotiliteit evolueert van richtingloos zwemmen gekenmerkt door korte cirkelvormige trajecten naar gericht zwemmen gekenmerkt door lange sinusoïdale trajecten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Beweeglijke subpopulatie toont vier verschillende fasen van gedrag door OA-regeneratie. (A) Morfologie van Stentor-regeneratie . (B) Genormaliseerde tellingen van cellen op elk moment die (blauw) niet beweeglijk waren, zonder zichtbare holdfast; (oranje) niet beweeglijk, met zichtbare holdfast; (groen) beweeglijk. Meerdere datasets die verschillende subsets van uren omvatten, werden gecombineerd voor dit cijfer, dus het totale aantal cellen per uur varieerde van 57 tot meer dan 376. Legenda toont representatieve cellen onder elke categorie zoals gevisualiseerd door valse kleur, in magenta en groen. (C) Boxplot van zwemsnelheid; vakken strekken zich uit van kwartielwaarden van Q1 tot Q3 op elk moment met een mediaanwaarde die in het groen wordt aangegeven. De scatter overlays zijn de gemiddelde snelheid van elke beweeglijke cel. Inzet vertoont representatief populatiegedrag tijdens elk van de vier fasen. Afkortingen: OA = oral apparatus; Q1 = eerste kwartiel; Q3 = derde kwartiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Motiliteitsanalyse als een fenotype screening tool vereist grote aantallen cellen. (A, B) Tracking resultaten van twee putten op 12 h. (C, D) Tracking resultaten van dezelfde twee putten op 18 h. Stentor cellen vertonen een voorkeur om te hechten in clusters, waarbij sommige putten zich uren eerder in kolonies vestigen dan andere. Gestreepte gebieden duiden op luchtbellen in de put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	Gemiddelde (mm/s)	Standaarddeviatie (mm/s)
Fase 1	0.14	0.24
Fase 2	0.06	0.13
Fase 3	0.16	0.16
Fase 4	0.15	0.26

Tabel 1: Vergelijking van zwemsnelheden tijdens elke fase van motiliteitsherstel.

Aanvullende figuur S1: Populatiezwempatronen door regeneratie en verder. (A-M) Beweging van Stentor coeruleuscellen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 en 18 uur, respectievelijk, na het begin van de regeneratie van orale apparaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video's 1-3: Voorbeeld microscopievideo's van S. coeruleus voor foutopsporing in scripts. Sectie 5 van het protocol kan worden uitgevoerd op deze set van drie gegevensvideo's voor een snelle bevestiging dat de scripts correct worden uitgevoerd. Daarnaast bieden deze video's een concreet voorbeeld van contrast- en resolutievereisten voor de datavideo's. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestanden: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Er bestaan momenteel veel algoritmen voor het volgen van deeltjes en cellen, sommige volledig gratis. Kosten en gebruiksvriendelijkheid zijn vaak afwegingen die compromissen vereisen. Bovendien zijn veel van de bestaande celvolgprogramma's ontworpen om de langzame kruipbeweging van weefselkweekcellen te volgen, in plaats van de snelle zwembeweging van Stentor, die tijdens het zwemmen roteert en plotselinge richtingsveranderingen kan ondergaan. Na het testen van veel van deze opties, is het hier gepresenteerde protocol bedoeld als een one-stop-oplossing om helemaal van data-acquisitie naar datavisualisatie te gaan met alleen goedkope apparatuur en een enkel wetenschappelijk softwarepakket (Table of Materials). Dit is met name van belang voor onderzoekslaboratoria bij onderwijsgerichte instellingen of biofysische onderwijslaboratoria waar de meeste benodigde apparatuur al beschikbaar is, omdat het de drempel verlaagt voor studenten om hun eigen vragen te stellen en binnen een kort tijdsbestek tot kwantitatieve resultaten te komen.

De methode die in dit manuscript wordt gepresenteerd, kan worden aangepast om de beweeglijkheid van een populatie organismen kwantitatief te karakteriseren op de schaal van honderd micron tot millimetergrootte. Toepassing op kleinere of grotere organismen vereist wijzigingen in de manier waarop de videogegevens moeten worden verkregen. Zoals toegepast op een populatie van regenererende S. coeruleus hier, leverde dit protocol een tijdlijn op voor het functionele herstel van motiliteit in de celpopulatie, wat een aanvulling vormt op wat momenteel bekend is over de transcriptionele tijdlijn. Het is bijvoorbeeld bekend van RNA-sequencing dat de synthese van genen die coderen voor ciliaire motiliteitseiwitten pas enkele uren na het regeneratieproces plaatsvindt, lang na de vorming van de trilharen zelf ^9,10. De statistisch significante daling van de beweeglijkheid van uren 0-3 (fase 1) tot uur 4 (fase 2) die hierboven is aangetoond, komt overeen met deze vertraging in de expressie van ciliaire motiliteitsfactoren in vergelijking met de expressie van genen die betrokken zijn bij ciliaire assemblage. Er was tot op heden geen transcriptomische studie van Stentor-regeneratie uitgevoerd na uur negen, dus er is weinig bekend over de genomische activiteit. Het ontbreken van statistisch significant verschil tussen uren 8-10 (fase 3) en uren 11+ (fase 4) suggereert dat de cellen tegen die tijd volledig zijn geregenereerd en dat weinig genen die relevant zijn voor celmotiliteit differentieel moeten worden gereguleerd na uur 9.

Twee belangrijke beperkingen van deze methode zijn het falen om geclusterde en / of aanrakende cellen te volgen en het onvermogen om complexere aspecten van beweging te kwantificeren dan zwemsnelheden of trajecten. Alle algoritmen voor het volgen van deeltjes/cellen hebben moeite met het volgen van cellen die tijdelijk visueel worden belemmerd door een andere cel, en wanneer meerdere cellen meerdere frames in de buurt doorbrengen; het hier opgenomen script is geen uitzondering. Gelukkig kan de frequentie van de eerste effectief worden verminderd door simpelweg het aantal cellen in een put te beperken, zoals besproken in de volgende paragraaf. Specifiek voor de hier onderzochte S. coeruleuspopulatie zorgde hun voorkeur om zich in kolonies te vestigen (figuur 3) ervoor dat sommige van deze cellen niet door het script werden geïdentificeerd. Omdat al deze cellen echter weinig tot geen beweging vertonen, worden de statistieken over de beweeglijke celpopulatie niet beïnvloed. Bovendien zijn video's waarin meerdere cellen aan tracking ontsnappen gemakkelijk te identificeren en handmatig uit te sluiten van verdere analyse. Met betrekking tot de kwantificering van complexe aspecten van beweging, suggereert de overgang van richtingloos naar gericht zwemmen in supplementale figuur S1 kwantitatieve veranderingen in de tijdcorrelatie van richting, gemiddelde versnelling en mogelijk andere meetbare waarden. Snelheid en bereik, de enige hoeveelheden die in dit protocol worden geanalyseerd, vertegenwoordigen slechts een klein aspect van beweging.

Ten slotte zijn enkele onderdelen van het protocol van bijzonder belang of van bijzonder belang voor praktisch gebruik. Montage van de multiwell monsterglaasjes met dunne siliconenvellen, zoals beschreven in protocol sectie 1, vereist oefening. Het is gemakkelijk om lekken of luchtbellen in ten minste één put te brengen terwijl het monster wordt afgesloten met het afdekglas. De putten kunnen worden verdeeld over meerdere monsterdia's om het gebruik van kleiner afdekglas mogelijk te maken, wat het proces gemakkelijker (en fouten minder duur) zal maken. Hoewel de hier gepresenteerde test kan worden gebruikt om de beweeglijkheidspatronen van een celpopulatie op een enkel tijdstip te karakteriseren, wordt het hier gedemonstreerd als een hulpmiddel om motiliteitspatronen van een enkele populatie over een lange time-lapse (meer dan 10 uur) te vergelijken. Zoals bij elke lange time-lapse is verdamping van een nat monster onvermijdelijk. Verdamping kan worden geminimaliseerd door een veilige afdichting van de siliconen afstandhouder in de beeldkamer naar zowel de glasplaat als de coverslip. Als u dit niet doet, zullen er putten in elkaar lekken of luchtbellen zich in de putten vormen. Voor onderzoekers die niet bekend zijn met het gebruik van siliconen afstandhouders, moet gepasteuriseerd bronwater of een ander schoon medium in elke put worden gepipetteerd om voor gebruik op lekkage te testen. De afmetingen van de monsterputten zijn allemaal gekozen om goed te werken voor S. coeruleus, die ongeveer 1 mm groot zijn. Dit omvat de dikte van de siliconen spacer (gekozen om de onderzochte S. coeruleus-cellen te beperken tot een tweedimensionaal vlak), een diameter van 5/16 " en 10 cellen per put. Deze getallen moeten worden aangepast bij het aanpassen van dit protocol voor andere celtypen.

Verschillende parameters in het TrackCells.m-script kunnen worden aangepast om automatische celidentificatie en traceervalidatie te optimaliseren. Met de parameters MinCellArea en MaxCellArea (regels 15 en 16 van het script) kan de gebruiker het acceptabele bereik van grootten voor een cel in vierkante pixels instellen. Welke waarden het beste zijn, hangt af van veel details van het experiment, waaronder celgrootte, camerapixelgrootte, vergroting en of er objecten zijn die verkeerd kunnen worden geïdentificeerd als cellen, bijvoorbeeld luchtbellen. De standaardwaarden van 300 en 1500 waren optimaal voor de exacte apparatuur en instellingen in het protocol. Nadat MinCellArea en MaxCellArea zijn geoptimaliseerd, stemt u de parameter Threshold (Lijn 17) af om het beeldcontrast te wijzigen. Wanneer ze onjuist zijn ingesteld, worden de celcontouren slecht geïdentificeerd of helemaal gemist, waardoor de juiste tracking wordt belemmerd. Als geen enkele waarde van Threshold goed werkt voor correct bijhouden, probeer het dan met een video met een hoger contrast of die meer scherp is. Regel 218 van het script, bad_trks = find(strk_trks > 20); is verantwoordelijk voor het te vaak weggooien van sporen die afwijken van de voorspelde beweging (via Kalman filter). Zoals het is, heeft het script deze drempel voor te veel ingesteld op 20. Verlaag dit gehele getal tot 1 om sporen agressiever te verwijderen. Verhoog de waarde om minder agressief weg te gooien. Een groot deel van TrackCells.m is overgenomen van de multi-object tracking tutorial die vrij toegankelijk is op http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, waar de lezer naar kon verwijzen voor meer details. Aanvullende video's 1-3 zijn voorbeeldgegevensvideo's voor een testrun van de scripts.

Het vermogen van S. coeruleus om een verloren artrose volledig te regenereren is meer dan een eeuw geleden voor het eerst waargenomen, maar er blijven veel open vragen over het herstel van motiliteit en gedragstoestanden. Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om de combinatie van brightfield imaging, geautomatiseerde celidentificatie en tracking en datavisualisatie die de auteurs gebruikten om de beweeglijkheid van een populatie van regenererende Stentor kwantitatief te karakteriseren. Deze workflow is breed toepasbaar op het onderzoek naar motiliteit in het algemeen, en de meegeleverde scripts en protocollen kunnen gemakkelijk worden overgenomen om te werken met andere biologische systemen van vergelijkbare grootte en snelheid, bijvoorbeeld andere ciliaten zoals Paramecium en Blepharisma. Bovendien vergroot het veranderen van de beeldkamer (bijvoorbeeld met behulp van droge putten of putten van verschillende grootte in combinatie met verschillende beeldvergroting) de toepasbaarheid van deze workflow aanzienlijk. De huidige gereedschapskist voor Stentor bevat chirurgische dissectie, osmotische shock, RNAi, DNA/RNA-analyse en kleine molecuulremmers⁶. De hier gepresenteerde high-throughput methode voor het kwantificeren van motiliteit voegt een complementaire mate van karakterisering toe en zal in toekomstige werkzaamheden worden gebruikt om motiliteitsfenotypen te onderzoeken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m