Análise dos padrões de motilidade do Stentor durante e após a regeneração do aparelho oral usando rastreamento celular

Summary

Apresentamos um protocolo para a caracterização da motilidade e comportamento de uma população de cem células de tamanho mícnico a milímetro usando microscopia de campo brilhante e rastreamento celular. Este ensaio revela que Stentor coeruleus transita por quatro fases comportamentalmente distintas ao regenerar um aparelho oral perdido.

Abstract

Stentor coeruleus é um organismo modelo bem conhecido para o estudo da regeneração unicelular. A análise transcriômica de células individuais revelou centenas de genes — muitos não associados ao aparelho oral (OA) — que são regulados diferencialmente em fases ao longo do processo de regeneração. Foi a hipótese de que essa reorganização sistêmica e mobilização de recursos celulares para o crescimento de um novo OA levará a mudanças observáveis de movimento e comportamento correspondentes no tempo às fases da expressão genética diferencial. No entanto, a complexidade morfológica de S. coeruleus exigiu o desenvolvimento de um ensaio para capturar as estatísticas e a escala de tempo. Um script personalizado foi usado para rastrear células em vídeos curtos, e as estatísticas foram compiladas sobre uma grande população (N ~100). Após a perda do OA, S. coeruleus inicialmente perde a capacidade de movimento direcionado; em seguida, a partir de ~4 h, ele exibe uma queda significativa na velocidade até ~8 h. Este ensaio fornece uma ferramenta útil para a triagem de fenótipos de motilidade e pode ser adaptado para a investigação de outros organismos.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) é um organismo modelo bem conhecido que tem sido usado para estudar a regeneração unicelular devido ao seu grande tamanho, capacidade de suportar várias técnicas microcirúrgicas e facilidade de cultivo em um ambiente de laboratório ^1,2,3. Os primeiros estudos de regeneração concentraram-se na maior e mais morfologicamente distinta característica em Stentor — o OA — que é completamente derramado após choque químico ^4,5,6. A substituição de novo de um OA perdido começa com o surgimento de uma nova faixa membranalar — uma matriz de cílios que gradualmente se deslocam para o anterior da célula antes de formar um OA funcional ao longo de oito estágios morfológicos³. Esses estágios têm sido observados sequencialmente, independentemente da temperatura, e fornecem um ponto de referência universal para quase todos os estudos⁵.

A análise mecanicista da regeneração de Stentor requer ferramentas para medir o tempo de regeneração que são robustas e simples o suficiente para serem aplicadas a múltiplas amostras como parte de uma tela química ou molecular. O método padrão para a realização de um ensaio baseado em células é a imagem, neste caso, de imagem da formação de novo OA durante a regeneração. No entanto, tais ensaios baseados em imagens são mais eficazes quando a estrutura regeneradora contém componentes moleculares distintos que podem ser usados como marcadores, de modo que eles seriam facilmente detectados em uma imagem de fluorescência. No caso do Stentor OA, os componentes conhecidos (cílios, corpos basais) também estão presentes no resto da superfície celular; portanto, reconhecer a restauração do OA não pode ser alcançado simplesmente procurando a presença ou ausência de um componente.

Em vez disso, alguma forma de reconhecimento de forma seria necessária para detectar um OA, e isso é potencialmente muito desafiador dado o fato de que as células Stentor muitas vezes mudam de forma através de um processo de contração rápida. Este artigo apresenta um ensaio alternativo para a regeneração que se baseia na atividade motil do corpo e da OA cilia. À medida que o OA se regenera, os cílios recém-formados sofrem mudanças reprodutíveis de posição e atividade, o que, por sua vez, afeta a motilidade de natação da célula. Analisando a motilidade, é possível realizar um ensaio para a "regeneração funcional" que quantifica a regeneração quantificando a função das estruturas regeneradas. Análise prévia da função ciliária de Stentor durante a regeneração usou velocimetria de imagem de partículas, combinada com contas de rastreador adicionadas à mídia externa, para observar mudanças no padrão de fluxo em diferentes estágios de regeneração⁷; no entanto, essa abordagem requer imagens laboriosas de células individuais e seus campos de fluxo associados, um de cada vez.

Usando o movimento da própria célula como um proxy para o fluxo gerado por cílios, seria possível analisar um número maior de células em paralelo, usando sistemas de imagem de baixa resolução compatíveis com plataformas de triagem de alto rendimento. Este ensaio pode, em princípio, ser usado para estudar o desenvolvimento e a regeneração funcional em outros organismos de natação nas centenas de mícrons a milímetros de tamanho. A seção 1 do protocolo descreve a construção de um slide de amostra de vários poços, que permite imagens de alto rendimento de uma população de células ao longo de um dia inteiro. Detalhes são fornecidos sobre como ajustar para uso com outros tipos de células. A seção 2 do protocolo abrange a aquisição de dados de vídeo para este ensaio, que pode ser realizado em um microscópio de dissecção com uma câmera reflexo de lente única digital. A seção 3 do protocolo fornece um passo-a-passo do rastreamento celular e cálculo da velocidade celular usando o código MATLAB (Informações Suplementares). A seção 4 do protocolo explica como transformar os resultados numéricos em parcelas como mostrado na Figura 1C-F e Figura 2C para fácil interpretação dos resultados.

Protocol

NOTA: Uma população de aproximadamente cem células S. coeruleus foram cultivadas de acordo com um protocolo JoVE publicado anteriormente⁸.

1. Preparação da amostra

1. Corte um pedaço de 250 μm de espessura da folha espaçadora de silicone (Tabela de Materiais) ligeiramente menor em altura e largura do que um slide de microscópio. Usando um furo de 5/16", crie poços circulares. Tenha cuidado de deixar espaço suficiente entre os poços vizinhos para garantir um bom selo.
   NOTA: Um espaço de 3 mm entre os poços vizinhos foi suficiente. Com a prática, dez poços podem ser colocados em um único slide de amostra.
2. Iniciar a regeneração de OA incubando as células em 10% de sacarose ou 2% de ureia por 2 min (Figura 1A). Em seguida, lave três vezes com meio^{fresco 8}. Pipeta suavemente aproximadamente dez Stentor em cada poço. Tenha cuidado em combinar o volume da amostra com o volume do poço o mais próximo possível.
   NOTA: Para as dimensões do poço utilizadas aqui, 12,5 μL de amostra foram pipetos em cada poço.
3. Feche os poços baixando suavemente um pedaço de vidro de cobertura (ver Tabela de Materiais) sobre os poços a partir de uma borda. Use um objeto estreito e ligeiramente flexível, como uma ponta de pipeta de 10 μL, para pressionar a tampa onde entra em contato com a folha de silicone, para garantir uma boa vedação.

2. Microscopia de luz visível lapso de tempo

1. Coloque a amostra no estágio do microscópio e coloque a ampliação para o mais baixo disponível, de tal forma que se encaixe em quadro em sua totalidade.
   NOTA: Um adaptador de câmera de 1,6x e uma ampliação de 1x no objetivo foram utilizados no microscópio para este protocolo.
2. Comece o lapso de tempo. Adquira um vídeo de 10 s a 30 quadros por segundo de cada poço em cada ponto de tempo. Se usar uma configuração de microscópio com um estágio X-Y motorizado, automatize todo o lapso de tempo. Caso contrário, certifique-se de que um usuário esteja presente em cada ponto de tempo para traduzir manualmente a amostra para gravar cada poço.
   NOTA: Evite deixar a amostra iluminada quando não estiver por imagem para evitar aquecimento e evaporação. Os volumes amostrais são pequenos, e a evaporação levará a bolhas de ar.
3. Salve filmes como TIFF, MOV ou AVI.
   NOTA: Estes são os tipos de arquivos de vídeo não proprietários mais comuns. Dependendo do software de microscópio específico, os vídeos podem ser salvos por padrão para um tipo de arquivo proprietário, mas podem ser exportados para um dos tipos de arquivo supracitados.
4. Use um fator de conversão pixel a milímetro para escala física e realize uma calibração ou use o tamanho de pixel conhecido da câmera usada. Para calibrar, adquira uma imagem clara de um slide de calibração ou uma régua clara nas mesmas configurações de ampliação que os vídeos. Usando qualquer programa de visualização de imagens, conte o número de pixels entre marcas de uma distância física conhecida.
   NOTA: Por exemplo, se a imagem de uma régua mostrar a marca de 1 mm e a marca de 2 mm a ser separada por 100 pixels, o fator de conversão é de 1 mm por 100 pixels. Alternativamente, para derivar esse fator do tamanho do pixel da câmera, basta multiplicar o tamanho do pixel da câmera pela ampliação. Por exemplo, se a câmera usada tem 3,45 μm pixels, e a ampliação usada foi de 1,6x, então a conversão é de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm por 1 pixel.

3. Rastreamento de células

1. Baixe os dois scripts, TrackCells.m e CleanTraces.m, para um local fácil de lembrar no computador. Se os vídeos de dados ainda não estiverem neste computador, transfira-os para este computador.
   NOTA: Os vídeos de dados e os scripts não precisam estar na mesma pasta.
2. Organize vídeos de dados em pastas, um para cada ponto de tempo. Use o script TrackCells.m primeiro para executar o rastreamento automatizado de células nos vídeos de dados. Abra TrackCells.m e execute o script.
3. Escolha Adicionar ao caminho se solicitado por uma janela pop-up., o que normalmente só acontecerá quando o script for executado pela primeira vez a partir de uma determinada pasta. Quando solicitado, selecione um ou mais vídeos de dados para iniciar o rastreamento, navegue até os vídeos de dados (seção 2). Selecione vários arquivos de vídeo usando shift-click, control-click ou segurando o botão do mouse esquerdo enquanto se move sobre os arquivos para realizá-los.
4. Uma vez satisfeito com a lista de arquivos no nome do arquivo: caixa na parte inferior da janela prompt, clique em Abrir. Realize um teste executado em um vídeo primeiro para confirmar que todos os parâmetros estão definidos corretamente (veja a discussão abaixo).
   NOTA: Este script agora criará uma pasta para cada arquivo de vídeo escolhido. Em seguida, ele escreverá nesta pasta cada quadro do vídeo como um arquivo .jpg e um arquivo chamado position_estimates.mat, que contém todos os traços encontrados no vídeo. Dependendo do tamanho dos vídeos, do número de vídeos e da velocidade do computador, este script pode levar horas para ser executado.

4. Verificação de rastreamento

1. Verifique se as etapas descritas na seção 3 foram seguidas corretamente verificando se não há mensagens de erro antes de prosseguir. Use o script CleanTraces.m para rejeitar manualmente traços anômalos ou falsos. Abra o CleanTraces.m na janela do editor MATLAB clicando duas vezes no arquivo.
2. No prompt Selecione a saída da pasta de dados pelo TrackCells.m. Ele terá o mesmo nome do arquivo de vídeo, navegará até uma das pastas criadas conforme descrito na seção 3. Escolha apenas uma pasta.
   NOTA: Este script agora exibirá os traços um por um em uma janela pop-up. Eles são sobrepostos na moldura do vídeo onde o traço começa, em verde, e o quadro do vídeo onde o traço termina, em magenta. Portanto, um traço válido deve ligar uma célula verde e uma célula magenta.
3. Quando solicitado, entre 1 para manter o rastro e 0 para rejeitar o rastro. Pressione Enter para passar para o próximo traço.
   NOTA: Novos traços continuarão a ser exibidos até que não haja mais vestígios, ou os primeiros sessenta tenham sido mostrados. Quando esse processo estiver concluído, o script criará automaticamente uma pasta chamada CLEAN TRACES para salvar as saídas e exibirá todos os vestígios restantes na parte superior do primeiro quadro do vídeo (Figura 1B). Esta imagem é salva automaticamente como LabeledTraces.png para referência futura. Todos os traços que o usuário optou por manter serão salvos no arquivo clean_traces.mat.
4. Complete esta etapa para todos os vídeos em um momento antes de continuar.
   NOTA: Para os dados deste manuscrito, um vídeo foi adquirido para cada poço em cada ponto de tempo, para um total de dez vídeos por ponto de tempo.

5. Visualização de dados

NOTA: Para comparar visualmente a motilidade de toda a população celular em diferentes pontos de tempo, todos os traços da seção 4 foram traduzidos para começar na origem e criar um deslocamento radial versus um período de tempo para cada ponto de tempo (Figura 1C-F, ver Figura Suplementar S1 para todos os pontos de tempo).

1. Comece baixando o roteiro intitulado SpaghettiPlots.m. Abra e execute o roteiro. Quando uma janela do navegador de arquivo de janela aparecer com a pasta de tempo select prompt contendo dados de poços (clean_traces.mat) para gráfico, navegue até a pasta de um dos pontos de tempo. Observe que esta pasta deve conter dentro dela uma pasta para cada um dos vídeos analisados.
2. Quando solicitado Calibração: Qual é o número de pixels por milímetro?, digite o valor de calibração encontrado na etapa 2.4 e pressione Enter.
   NOTA: O script agora combinará os traços de todos os vídeos analisados neste momento em um único plot (Figura 1C-F). Círculos pontilhados fracos na trama indicam deslocamentos radiais de 1, 2, 3 e 4 mm.
3. Ajuste os eixos da trama conforme necessário alterando a linha 55 do script, que por padrão, é definido como rr = 4 para incluir um raio de até 4 mm. Guarde o enredo.

Representative Results

O objetivo deste ensaio é quantificar a mudança gradual dos padrões de movimento e o aumento gradual da velocidade de movimento das células dentro de uma grande (N ~100) regenerando a população de Stentor. Para auxiliar a interpretação dos resultados, o código personalizado incluído neste protocolo gera dois tipos de parcelas: uma sobreposição de todos os traços de movimento celular em um conjunto de dados de vídeo (Figura 1C-F e Figura S1), e um gráfico de velocidade de natação por hora desde o início da regeneração (Figura 2C). Uma população de Stentor, que está se regenerando normalmente, deve demonstrar uma transição constante da natação sem direção para a natação dirigida (Figura 1G). Enquanto cada célula passa por essa transição na íntegra durante o processo de regeneração de OA que abrange ~8 h, a variação entre os indivíduos requer olhar para o movimento de uma grande população em conjunto para que as tendências se tornem claras.

A Figura 1C-F mostra a motilidade coletiva da mesma população de células Stentor em 2, 3, 7 e 8 h no processo de regeneração de OA. Essas parcelas mostram tanto o aumento esperado no número de indivíduos motile (número de vestígios visíveis) quanto o aumento de quatro vezes na faixa das células mais motil dentro da população (deslocamento radial). É importante notar que os eixos são diferentes entre os diferentes painéis da Figura 1C-F, com 1 mm (Hora 2), 2 mm (Horas 3 e 7) e 4 mm (Hora 8) escolhidos como mais apropriados para mostrar o movimento. A 2h — o ponto de tempo mais antigo — nenhuma célula se move mais de 1 mm durante o vídeo dos anos 10, enquanto às 9h, muitas células atravessaram mais de 5 mm durante o mesmo período de tempo. A Figura Suplementar S1 fornece essas parcelas para o lapso de tempo completo, com eixos idênticos usados em todas as parcelas para dar uma visão mais clara do esperado aumento da motilidade em um experimento bem sucedido.

Há uma ressalva à interpretação desta série de enredos de exemplo. As células de natação mais rápidas foram capazes de nadar através do poço dentro do vídeo, especialmente se (por acaso) eles começaram perto da borda; assim, eles são restritos de nadar inteiramente em linha reta, e sua amplitude de movimento, como visualizado desta forma, parecerá menor. Embora isso complica qualquer tentativa de quantificar a distância percorrida pelas células, não altera a tendência qualitativa de que a faixa de movimento aumenta ao longo de pelo menos 8 h. Isso é consistente com o cronograma de regeneração morfológica conhecido (Figura 2A)³.

Para compilar estatísticas populacionais, as células rastreadas foram classificadas em três categorias distintas: não-motile sem holdfast visível, não-motile com holdfast visível e motile. Essas categorias de comportamento foram previamente definidas pelo tártaro, mas nunca quantificadas por sua prevalência ao longo do tempo³. A Figura 2B mostra um histograma empilhado resumindo contagens de células relativas nessas categorias em função de horas de regeneração. Em todos os pontos de tempo, mais da metade da população celular não era observavelmente motile. Além disso, em tempos posteriores, um número significativo de células foram encontradas em colônias com ressume visíveis, sugerindo fortemente que tinham explorado o ambiente e preferencialmente ligados perto de outros de sua espécie. Um exemplo disso pode ser visto no início final da Figura 2C.

Este ensaio permite a comparação estatística das velocidades de natação durante cada fase de recuperação da motilidade. A média e o desvio padrão para os dados apresentados na Figura 2C são resumidos abaixo (Tabela 1). Uma vez que essas quantidades estatísticas tenham sido extraídas pelo rastreamento celular, o movimento exibido pela população de células nas diferentes fases pode ser rigorosamente comparado usando o teste t não pago. Como exemplo concreto, para os dados apresentados, a estatística t comparando as velocidades de natação na Fase 1 e Fase 2 é calculada por:

onde x₁ e x₂ denotam a velocidade média durante as Fases 1 e 2, respectivamente; s₁ e s₂ denotam os desvios padrão da velocidade durante as Fases 1 e 2, respectivamente; n₁ e n₂ e denotar o número de vestígios extraídos durante as Fases 1 e 2, respectivamente. A t-statistic t₁₂ resultante pode então ser traduzida em um valor p para testes de hipóteses. Para os dados apresentados na Figura 2C, as transições da Fase 1 para a Fase 2 (p < 0,1%) e da Fase 2 para a Fase 3 (p < 0,1%) são estatisticamente significantes, enquanto a transição da Fase 3 para a Fase 4 (p > 20%) não é. É importante notar que a tendência para que as células se instalem em pequenas colônias durante a Fase 4 (Figura 2B, inset), como é evidente nos vídeos crus, é um exemplo de diferença comportamental não bem capturada apenas pela medição das velocidades de natação. Isso explica o grande desvio padrão medido durante a Fase 4 (0,26 mm/s), que, por sua vez, contribuiu para uma menor estatística t ao compará-la com a Fase 3.

Figura 1: O rastreamento celular revela a recuperação gradual da natação dirigida. (A) O choque de sacarose induz Stentor coeruleus a derramar banda de membrana. (B) Exemplo de rastreamento de células regeneradoras em um vídeo de 10 s com círculos listrados indicando bolhas de ar no poço. (C-F) Sobreposição de todas as trajetórias às 2h, 3h, 7h e 8h. Os tempos foram arredondados para a hora mais próxima durante a compilação de dados. Círculos pontilhados indicam deslocamentos radiais de um milímetro. (G) A motilidade celular evolui da natação sem direção caracterizada por trajetórias circulares curtas à natação dirigida caracterizada por longas trajetórias sinusoidais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A subpopulação motil demonstra quatro fases distintas de comportamento através da regeneração de OA. (A) Morfologia da regeneração de Stentor . (B) Contagem normalizada de células em cada momento que não eram (azuis) não motile, sem ressarente visível; (laranja) não motil, com ressarem visível; Motile (verde). Vários conjuntos de dados que abrangem diferentes subconjuntos de horas foram combinados para este número, de modo que a contagem total de células por hora variou de 57 a mais de 376. A lenda mostra células representativas em cada categoria como visualizadas por cor falsa, em magenta e verde. (C) Boxplot de velocidade de natação; as caixas estendem-se do quartil do 1º trimestre ao 3º trimestre em cada momento com valor mediano indicado em verde. As sobreposições de dispersão são a velocidade média de cada célula motile. O Inset apresenta comportamento populacional representativo durante cada uma das quatro fases. Abreviaturas: OA = aparelho oral; Q1 = primeiro quartil; Q3 = terceiro quartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise de motilidade como ferramenta de triagem de fenótipos requer um grande número de células. (A, B) O rastreamento resulta de dois poços a 12 h. (C, D) Os resultados de rastreamento dos mesmos dois poços às 18 h. As células stentor apresentam preferência para anexar em clusters, com alguns poços se instalando em colônias horas antes de outros. Áreas listradas indicam bolhas de ar no poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Média (mm/s)	Desvio padrão (mm/s)
Fase 1	0.14	0.24
Fase 2	0.06	0.13
Fase 3	0.16	0.16
Fase 4	0.15	0.26

Tabela 1: Comparação das velocidades de natação durante cada fase de recuperação da motilidade.

Figura Suplementar S1: Padrões populacionais de natação através da regeneração e além. (A-M) Movimento das células coeruleus Stentor 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 e 18 h, respectivamente, após o início da regeneração do aparelho oral. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Vídeos suplementares 1-3: Exemplo de vídeos de microscopia de S. coeruleus para depuração de script. A seção 5 do protocolo pode ser realizada neste conjunto de três vídeos de dados para uma confirmação rápida de que os scripts estão sendo executados corretamente. Além disso, esses vídeos fornecem um exemplo concreto de requisitos de contraste e resolução para os vídeos de dados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivos Suplementares: Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

Muitos algoritmos de rastreamento de partículas e células existem atualmente, alguns totalmente livres. Custo e simpatia do usuário são muitas vezes trocas que requerem compromisso. Além disso, muitos dos programas de rastreamento celular existentes são projetados para rastrear o movimento lento de rastreamento das células da cultura tecidual, em vez do movimento de natação rápida de Stentor, que gira durante a natação e pode sofrer mudanças repentinas de direção. Depois de testar muitas dessas opções, o protocolo aqui apresentado pretende ser uma solução única para ir desde a aquisição de dados até a visualização de dados usando apenas equipamentos de baixo custo e um único pacote de software científico (Tabela de Materiais). Isso é de particular interesse para laboratórios de pesquisa em instituições focadas em ensino ou laboratórios de ensino de biofísica onde a maioria dos equipamentos necessários já está disponível, pois reduz a barreira para que os alunos façam suas próprias perguntas e cheguem a resultados quantitativos em um curto espaço de tempo.

O método apresentado neste manuscrito pode ser adaptado para caracterizar quantitativamente a motilidade de uma população de organismos na escala de tamanho de cem mícrons a milímetros. A aplicação a organismos menores ou maiores exigirá alterações na forma como os dados de vídeo devem ser adquiridos. Conforme aplicado a uma população de S. coeruleus regenerado aqui, este protocolo deu um cronograma para a recuperação funcional da motilidade em toda a população celular, o que complementa o que se sabe atualmente sobre o cronograma transcricional. Por exemplo, é sabido pelo sequenciamento do RNA que a síntese de genes codificando proteínas de motilidade ciliar não ocorre até várias horas após o processo de regeneração, muito tempo após a formação da própria cílio ^9,10. A queda estatisticamente significativa da motilidade das horas 0-3 (Fase 1) para a hora 4 (Fase 2) demonstrada acima é consistente com essa defasagem na expressão de fatores de motilidade ciliar em comparação com a expressão dos genes envolvidos na montagem ciliar. Nenhum estudo transcriômico da regeneração de Stentor até agora havia sido realizado além da hora nove, então pouco se sabe sobre a atividade genômica. A falta de diferença estatisticamente significativa entre as horas 8-10 (Fase 3) e as horas 11+ (Fase 4) sugere que as células se regeneraram totalmente a essa altura, e poucos genes relevantes para a motilidade celular devem ser regulados diferencialmente além da hora 9.

Duas limitações principais para este método são sua falha em rastrear células agrupadas e/ou tocantes, e sua incapacidade de quantificar aspectos mais complexos do movimento do que velocidades de natação ou trajetórias. Todos os algoritmos de rastreamento de partículas/células têm dificuldade em seguir células que são temporariamente obstruídas visualmente por outra célula, e quando várias células gastam vários quadros nas proximidades; o script incluído aqui não é uma exceção. Felizmente, a frequência do primeiro pode ser efetivamente reduzida simplesmente limitando o número de células colocadas dentro de uma bem como discutidas no próximo parágrafo. Especificamente para a população de S. coeruleus aqui investigada, sua preferência de se estabelecer em colônias (Figura 3) fez com que algumas dessas células não fossem identificadas pelo roteiro. No entanto, como todas essas células exibem pouco ou nenhum movimento, as estatísticas sobre a população de células motile não são afetadas. Além disso, vídeos em que várias células escapam do rastreamento são fáceis de identificar e excluir manualmente de análises posteriores. Quanto à quantificação de aspectos complexos do movimento, a transição da natação sem direção para a natação dirigida vista na Figura Suplementar S1 sugere mudanças quantitativas na correlação temporal de direção, aceleração média e potencialmente outros mensuráveis. Velocidade e alcance, as únicas quantidades analisadas neste protocolo, representam apenas um pequeno aspecto do movimento.

Por fim, algumas partes do protocolo são de particular importância ou consequência no uso prático. A montagem dos slides de amostra de vários poços com folhas finas de silicone, conforme descrito na seção 1 do protocolo, requer prática. É fácil introduzir vazamentos ou bolhas de ar em pelo menos um poço enquanto sela a amostra com a tampa. Os poços podem ser divididos em vários slides de amostra para permitir o uso de vidro de cobertura menor, o que tornará o processo mais fácil (e erros menos caros). Embora o ensaio aqui apresentado possa ser usado para caracterizar os padrões de motilidade de uma população celular em um único ponto de tempo, ele é demonstrado aqui como uma ferramenta para comparar padrões de motilidade de uma única população ao longo de um longo lapso de tempo (mais de 10 h). Como em qualquer longo lapso de tempo, a evaporação de uma amostra molhada é inevitável. A evaporação pode ser minimizada por uma vedação segura do espaçador de silicone na câmara de imagem tanto para o slide de vidro quanto para o deslizamento de tampa. O não cumprimento disso resultará em poços vazando uns nos outros ou bolhas de ar se formando dentro dos poços. Para pesquisadores que não estão familiarizados com o uso de espaçadores de silicone, a água pasteurizada da mola ou outro meio limpo deve ser tubo em cada poço para testar o vazamento antes do uso. As dimensões dos poços amostrais foram todas escolhidas para funcionar bem para S. coeruleus, que têm aproximadamente 1 mm de tamanho. Isso inclui a espessura do espaçador de silicone (escolhido para restringir as células S. coeruleus sob investigação a um plano bidimensional), 5/16" de diâmetro e 10 células por poço. Esses números devem ser ajustados ao adaptar este protocolo para outros tipos de células.

Vários parâmetros no script TrackCells.m podem ser ajustados para otimizar a identificação automática de células e validação de rastreamento. Os parâmetros MinCellArea e MaxCellArea (linhas 15 e 16 do script) permitem ao usuário definir a gama aceitável de tamanhos para uma célula em pixels quadrados. Quais são os valores que melhor dependem de muitos detalhes do experimento, incluindo tamanho da célula, tamanho do pixel da câmera, ampliação e se há objetos que podem ser identificados erroneamente como células, por exemplo, bolhas de ar. Os valores padrão de 300 e 1500 foram ideais para os equipamentos exatos e configurações fornecidas no protocolo. Depois que o MinCellArea e o MaxCellArea foram otimizados, sintonize o parâmetro Limiar (Linha 17) para alterar o contraste de imagem. Quando definidos incorretamente, os contornos da célula serão mal identificados ou perdidos completamente, dificultando o rastreamento correto. Se nenhum valor de Threshold funciona bem para o rastreamento correto, tente com um vídeo com maior contraste ou que esteja mais em foco. A linha 218 do script, bad_trks = find(strk_trks > 20); é responsável por descartar traços que se desviam do movimento previsto (via filtro Kalman) muitas vezes. Como é, o script tem esse limite para muitos definidos em 20. Diminua esse valor inteiro até 1 para descartar traços de forma mais agressiva. Aumente o valor para descartar menos agressivamente. Grande parte do TrackCells.m foi adotado a partir do tutorial de rastreamento multi-objeto livremente acessível em http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, a qual o leitor poderia se referir para obter mais detalhes. Vídeos suplementares 1-3 são vídeos de exemplo para um teste dos scripts.

A capacidade de S. coeruleus de regenerar totalmente um OA perdido foi observada pela primeira vez há mais de um século, mas muitas questões abertas permanecem sobre a recuperação da motilidade e estados comportamentais. O protocolo aqui apresentado visa desmistificar a combinação de imagens de campo brilhante, identificação e rastreamento automatizado de células e visualização de dados que os autores utilizaram para caracterizar quantitativamente a motilidade de uma população de Stentor regenerador. Este fluxo de trabalho é amplamente aplicável à investigação da motilidade em geral, e os scripts e protocolos incluídos podem ser prontamente adotados para trabalhar com outros sistemas biológicos de tamanho e velocidade semelhantes, por exemplo, outros cílios como Paramecium e Blepharisma. Além disso, a alteração da câmara de imagem (por exemplo, usando poços secos ou poços de tamanho diferentes, juntamente com diferentes ampliações de imagem) expande consideravelmente a aplicabilidade deste fluxo de trabalho. O kit de ferramentas atual para Stentor inclui dissecção cirúrgica, choque osmótico, RNAi, análise de DNA/RNA e inibidores de pequenas moléculas⁶. O método de alta produtividade de quantificar a motilidade aqui apresentado adiciona um grau complementar de caracterização e será utilizado em trabalhos futuros para investigar fenótipos de motilidade.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m