Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular

Summary

Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.

Abstract

Stentor coeruleus es un organismo modelo bien conocido para el estudio de la regeneración unicelular. El análisis transcriptómico de células individuales reveló cientos de genes, muchos no asociados con el aparato oral (OA), que están regulados diferencialmente en fases a lo largo del proceso de regeneración. Se planteó la hipótesis de que esta reorganización sistémica y movilización de recursos celulares hacia el crecimiento de una nueva OA conducirá a cambios observables en el movimiento y el comportamiento correspondientes en el tiempo a las fases de expresión génica diferencial. Sin embargo, la complejidad morfológica de S. coeruleus requirió el desarrollo de un ensayo para capturar las estadísticas y la escala de tiempo. Se utilizó un script personalizado para rastrear celdas en videos cortos, y se compilaron estadísticas sobre una gran población (N ~ 100). Tras la pérdida de la OA, S. coeruleus inicialmente pierde la capacidad de movimiento dirigido; luego, a partir de ~ 4 h, exhibe una caída significativa en la velocidad hasta ~ 8 h. Este ensayo proporciona una herramienta útil para el cribado de fenotipos de motilidad y puede ser adaptado para la investigación de otros organismos.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) es un organismo modelo bien conocido que se ha utilizado para estudiar la regeneración unicelular debido a su gran tamaño, capacidad para soportar varias técnicas microquirúrgicas y facilidad de cultivo en un entorno de laboratorio ^1,2,3. Los primeros estudios de regeneración se centraron en la característica más grande y morfológicamente distinta de Stentor, la OA, que se elimina por completo tras el choque químico ^4,5,6. El reemplazo de novo de una OA perdida comienza con la aparición de una nueva banda de membranalar, una serie de cilios que se desplazan gradualmente hacia la parte anterior de la célula antes de formar una OA funcional durante ocho etapas morfológicas³. Estas etapas se han observado secuencialmente, independientemente de la temperatura, y proporcionan un punto de referencia universal para casi todos los estudios⁵.

El análisis mecanicista de la regeneración del stentor requiere herramientas para medir el momento de la regeneración que sean lo suficientemente robustas y simples como para aplicarse a múltiples muestras como parte de una pantalla química o molecular. El método estándar para realizar un ensayo basado en células es la obtención de imágenes, en este caso, la obtención de imágenes de la formación de nueva OA durante la regeneración. Sin embargo, tales ensayos basados en imágenes son más efectivos cuando la estructura regeneradora contiene distintos componentes moleculares que se pueden usar como marcadores, de modo que se detecten fácilmente en una imagen de fluorescencia. En el caso del Stentor OA, los componentes conocidos (cilios, cuerpos basales) también están presentes en el resto de la superficie celular; por lo tanto, reconocer la restauración de la OA no puede lograrse simplemente buscando la presencia o ausencia de un componente.

Más bien, se requeriría alguna forma de reconocimiento de forma para detectar una OA, y esto es potencialmente muy desafiante dado el hecho de que las células stentor a menudo cambian de forma a través de un proceso contráctil rápido. Este artículo presenta un ensayo alternativo para la regeneración que se basa en la actividad móvil del cuerpo y los cilios de OA. A medida que la OA se regenera, los cilios recién formados experimentan cambios reproducibles en la posición y la actividad, lo que a su vez, afecta la motilidad de natación de la célula. Mediante el análisis de la motilidad, es posible realizar un ensayo de "regeneración funcional" que cuantifica la regeneración cuantificando la función de las estructuras regeneradas. El análisis previo de la función ciliar del stentor durante la regeneración utilizó la velocimetría de imagen de partículas, combinada con perlas trazadoras agregadas a los medios externos, para observar cambios en el patrón de flujo en diferentes etapas de la regeneración⁷; sin embargo, este enfoque requiere imágenes laboriosas de células individuales y sus campos de flujo asociados, uno a la vez.

Al utilizar el movimiento de la propia célula como un proxy para el flujo generado por los cilios, sería posible analizar un mayor número de células en paralelo, utilizando sistemas de imágenes de baja resolución compatibles con plataformas de detección de alto rendimiento. Este ensayo puede, en principio, ser utilizado para estudiar el desarrollo y la regeneración funcional en otros organismos nadadores en la escala de tamaño de cientos de micras a milímetros. La sección 1 del protocolo describe la construcción de un portaobjetos de muestra de múltiples pozos, que permite obtener imágenes de alto rendimiento de una población de células durante un día entero. Se proporcionan detalles sobre cómo ajustar para su uso con otros tipos de células. La sección 2 del protocolo cubre la adquisición de datos de video para este ensayo, que se puede lograr en un microscopio de disección con una cámara réflex digital de lente única. La sección 3 del protocolo proporciona un recorrido por el seguimiento de celdas y el cálculo de la velocidad de las celdas utilizando el código MATLAB (Información complementaria). La Sección 4 del protocolo explica cómo convertir los resultados numéricos en gráficos como se muestra en la Figura 1C-F y la Figura 2C para facilitar la interpretación de los resultados.

Protocol

NOTA: Se cultivó una población de aproximadamente cien células de S. coeruleus de acuerdo con un protocolo JoVE⁸ publicado anteriormente.

1. Preparación de la muestra

1. Corte un trozo de lámina espaciadora de silicona de 250 μm de espesor (Tabla de materiales) ligeramente más pequeña en altura y anchura que un portaobjetos de microscopio. Usando un taladro de 5/16", cree pozos circulares. Tenga en cuenta dejar suficiente espacio entre los pozos vecinos para garantizar un buen sellado.
   NOTA: Se encontró que un espacio de 3 mm entre los pozos vecinos era suficiente. Con la práctica, se pueden colocar diez pozos en un solo tobogán de muestra.
2. Iniciar la regeneración de la OA incubando las células en sacarosa al 10% o 2% de urea durante 2 min (Figura 1A). Luego, lavar tres veces con medio fresco⁸. Pipetee suavemente aproximadamente diez Stentor en cada pozo. Tenga cuidado de hacer coincidir el volumen de la muestra con el volumen del pozo lo más cerca posible.
   NOTA: Para las dimensiones del pozo utilizadas aquí, se canalizaron 12,5 μL de muestra en cada pozo.
3. Cierre los pozos bajando suavemente un trozo de vidrio de cubierta (consulte la Tabla de materiales) sobre los pozos a partir de un borde. Use un objeto estrecho y ligeramente flexible, como una punta de pipeta de 10 μL, para presionar hacia abajo sobre el vidrio de la cubierta donde entra en contacto con la lámina de silicona, para garantizar un buen sellado.

2. Microscopía de luz visible time-lapse

1. Coloque la muestra en el escenario del microscopio y ajuste el aumento al más bajo disponible, de modo que uno quepa bien en el marco en su totalidad.
   NOTA: Un adaptador de cámara de 1.6x y un aumento de 1x en el objetivo se utilizaron en el microscopio para este protocolo.
2. Comience el lapso de tiempo. Adquiere un video de 10 s a 30 cuadros por segundo de cada pozo en cada punto de tiempo. Si utiliza una configuración de microscopio con una etapa X-Y motorizada, automatice todo el lapso de tiempo. De lo contrario, asegúrese de que un usuario esté presente en cada punto de tiempo para traducir manualmente la muestra para registrar cada pozo.
   NOTA: Evite dejar la muestra iluminada cuando no esté tomando imágenes para evitar el calentamiento y la evaporación. Los volúmenes de muestra son pequeños y la evaporación dará lugar a burbujas de aire.
3. Guarde películas como TIFF, MOV o AVI.
   NOTA: Estos son los tipos de archivos de video no propietarios más comunes. Dependiendo del software de microscopio específico, los videos pueden guardarse de forma predeterminada en un tipo de archivo propietario, pero luego se pueden exportar a uno de los tipos de archivo mencionados anteriormente.
4. Utilice un factor de conversión de píxel a milímetro para la escala física y realice una calibración o utilice el tamaño de píxel conocido de la cámara utilizada. Para calibrar, adquiera una imagen clara de una diapositiva de calibración o una regla clara con la misma configuración de ampliación que los vídeos. Usando cualquier programa de visualización de imágenes, cuente el número de píxeles entre marcas de una distancia física conocida.
   NOTA: Por ejemplo, si la imagen de una regla muestra la marca de 1 mm y la marca de 2 mm separadas por 100 píxeles, el factor de conversión es de 1 mm por cada 100 píxeles. Alternativamente, para derivar este factor del tamaño del píxel de la cámara, simplemente multiplique el tamaño del píxel de la cámara por el aumento. Por ejemplo, si la cámara utilizada tiene píxeles de 3,45 μm y la ampliación utilizada fue de 1,6x, entonces la conversión es de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm por 1 píxel.

3. Seguimiento celular

1. Descargue los dos scripts, TrackCells.m y CleanTraces.m, en una ubicación fácil de recordar en el equipo. Si los videos de datos aún no están en esta computadora, transfiéralos a esta computadora.
   NOTA: Los vídeos de datos y los scripts no necesitan estar en la misma carpeta.
2. Organice los videos de datos en carpetas, una para cada punto de tiempo. Utilice primero el script TrackCells.m para realizar el seguimiento automatizado de celdas en los vídeos de datos. Abra TrackCells.m y ejecute el script.
3. Elija Agregar a la ruta de acceso si se lo solicita una ventana emergente, lo que normalmente solo ocurrirá cuando el script se ejecute por primera vez desde una carpeta determinada. Cuando se le solicite, seleccione uno o más videos de datos para iniciar el seguimiento, navegue hasta los videos de datos (sección 2). Seleccione varios archivos de vídeo pulsando mayús y clic, control y clic, o manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras se mueve sobre los archivos para resaltarlos.
4. Una vez satisfecho con la lista de archivos en el cuadro Nombre de archivo: en la parte inferior de la ventana de solicitud, haga clic en Abrir. Realice una prueba en un video primero para confirmar que todos los parámetros están configurados correctamente (consulte la discusión a continuación).
   NOTA: Este script ahora creará una carpeta para cada archivo de video elegido. Luego escribirá en esta carpeta cada fotograma del video como un archivo .jpg y un archivo llamado position_estimates.mat, que contiene todos los rastros encontrados en el video. Dependiendo del tamaño de los videos, la cantidad de videos y la velocidad de la computadora, este script puede tardar horas en ejecutarse.

4. Verificación de trazas

1. Compruebe que los pasos descritos en la sección 3 se siguieron correctamente comprobando que no hay mensajes de error antes de continuar. Utilice el script CleanTraces.m para rechazar manualmente los rastros anómalos o falsos. Abra CleanTraces.m en la ventana del editor de MATLAB haciendo doble clic en el archivo.
2. En el símbolo del sistema Seleccione la salida de la carpeta de datos mediante TrackCells.m. Tendrá el mismo nombre que el archivo de vídeo, navegue hasta una de las carpetas creadas como se describe en la sección 3. Elija solo una carpeta.
   NOTA: Este script ahora mostrará los seguimientos uno por uno en una ventana emergente. Se superponen en el fotograma del vídeo donde comienza la traza, en verde, y en el fotograma del vídeo donde termina la traza, en magenta. Por lo tanto, un rastro válido debe vincular una célula verde y una célula magenta.
3. Cuando se le solicite, escriba 1 para mantener el seguimiento y 0 para rechazar el seguimiento. Pulse Intro para pasar al siguiente seguimiento.
   NOTA: Los nuevos rastros continuarán mostrándose hasta que no haya más rastros o se hayan mostrado los primeros sesenta. Cuando se complete este proceso, el script creará automáticamente una carpeta llamada CLEAN TRACES para guardar los resultados y mostrar todos los rastros restantes en la parte superior del primer fotograma del video (Figura 1B). Esta imagen se guarda automáticamente como LabeledTraces.png para futuras referencias. Todos los rastros que el usuario había elegido conservar se guardarán en el archivo clean_traces.mat.
4. Complete este paso para todos los videos en un punto de tiempo antes de continuar.
   NOTA: Para los datos de este manuscrito, se adquirió un video por cada pozo en cada punto de tiempo, para un total de diez videos por punto de tiempo.

5. Visualización de datos

NOTA: Para comparar visualmente la motilidad de toda la población celular a través de diferentes puntos de tiempo, todos los rastros de la sección 4 se tradujeron para comenzar en el origen y crear un desplazamiento radial versus un diagrama de tiempo para cada punto de tiempo (Figura 1C-F, ver Figura suplementaria S1 para todos los puntos de tiempo).

1. Comience descargando el script titulado SpaghettiPlots.m. Abra y ejecute el script. Cuando aparezca una ventana del explorador de archivos de ventana con el mensaje Seleccione la carpeta de tiempo que contiene datos de pozo (clean_traces.mat) para graficar, navegue a la carpeta de uno de los puntos de tiempo. Tenga en cuenta que esta carpeta debe contener dentro de ella una carpeta para cada uno de los videos analizados.
2. Cuando se le solicite Calibración: ¿Cuál es el número de píxeles por milímetro?, escriba el valor de calibración que se encuentra en el paso 2.4 y presione Entrar.
   NOTA: El script ahora combinará los rastros de todos los videos analizados en este punto de tiempo en una sola gráfica (Figura 1C-F). Los círculos punteados débiles en la gráfica indican desplazamientos radiales de 1, 2, 3 y 4 mm.
3. Ajuste los ejes de la gráfica según sea necesario cambiando la línea 55 del script, que de forma predeterminada se establece en rr = 4 para incluir un radio de hasta 4 mm. Guarda la parcela.

Representative Results

El objetivo de este ensayo es cuantificar el cambio gradual de los patrones de movimiento y el aumento gradual de la velocidad de movimiento de las células dentro de una gran población de stentores regeneradores (N ~ 100). Para facilitar la interpretación de los resultados, el código personalizado incluido en este protocolo genera dos tipos de gráficos: una superposición de todos los rastros de movimiento celular en un conjunto de datos de video (Figura 1C-F y Figura S1), y un gráfico de velocidad de natación por hora desde el inicio de la regeneración (Figura 2C). Una población de Stentor, que se está regenerando normalmente, debe demostrar una transición constante de la natación sin dirección a la natación dirigida (Figura 1G). Si bien cada célula experimenta esta transición en su totalidad durante el proceso de regeneración de OA que abarca ~ 8 h, la variación entre individuos requiere observar el movimiento de una gran población en conjunto para que las tendencias se aclaren.

La Figura 1C-F muestra la motilidad colectiva de la misma población de células de Stentor a las 2, 3, 7 y 8 h en el proceso de regeneración de OA. Estas gráficas muestran tanto el aumento esperado en el número de individuos móviles (número de rastros visibles) como el aumento de cuatro veces en el rango de las células más móviles dentro de la población (desplazamiento radial). Es importante tener en cuenta que los ejes son diferentes entre los diferentes paneles de la Figura 1C-F, con 1 mm (Hora 2), 2 mm (Horas 3 y 7) y 4 mm (Hora 8) elegidos como más apropiados para mostrar el movimiento. A las 2 h, el punto de tiempo más temprano, ninguna célula se mueve más de 1 mm durante el video de 10 s, mientras que a las 9 h, muchas células atravesaron más de 5 mm durante el mismo período de tiempo. La Figura Suplementaria S1 proporciona estas gráficas para el lapso de tiempo completo, con ejes idénticos utilizados en todas las gráficas para dar una visión más clara del aumento esperado de la motilidad en un experimento exitoso.

Hay una advertencia a la interpretación de esta serie de tramas de ejemplo. Las células de natación más rápidas pudieron nadar a través del pozo dentro del video, especialmente si (por casualidad) comenzaron cerca del borde; por lo tanto, se les restringe nadar completamente en línea recta, y su rango de movimiento, como se visualiza de esta manera, parecerá más pequeño. Si bien esto complica cualquier intento de cuantificar la distancia recorrida por las células, no altera la tendencia cualitativa de que el rango de movimiento aumenta durante al menos 8 h. Esto es consistente con la línea de tiempo de regeneración morfológica conocida (Figura 2A)³.

Para compilar estadísticas de población, las células rastreadas se clasificaron en tres categorías distintas: no móviles sin retención visible, no móviles con retención visible y móviles. Estas categorías de comportamiento fueron previamente definidas por Tartar, pero nunca cuantificadas por su prevalencia a lo largo del tiempo³. La Figura 2B muestra un histograma apilado que resume los recuentos relativos de células en estas categorías en función de las horas de regeneración. En todos los momentos, más de la mitad de la población celular no era observablemente móvil. Además, en épocas posteriores, un número significativo de las células se encontraron en colonias con retenciones visibles, lo que sugiere fuertemente que habían explorado el medio ambiente y se habían unido preferentemente cerca de otras de su tipo. Un ejemplo de esto se puede ver en el recuadro final de la Figura 2C.

Este ensayo permite la comparación estadística de las velocidades de natación durante cada fase de la recuperación de la motilidad. La media y la desviación estándar de los datos presentados en la Figura 2C se resumen a continuación (Tabla 1). Una vez que estas cantidades estadísticas han sido extraídas por seguimiento celular, el movimiento exhibido por la población de células en las diferentes fases se puede comparar rigurosamente utilizando la prueba t no apareada. Como ejemplo concreto, para los datos mostrados, la estadística t que compara las velocidades de natación en la Fase 1 y la Fase 2 se calcula mediante:

donde x₁ y x₂ denotan la velocidad media durante las fases 1 y 2, respectivamente; s₁ y s₂ denotan las desviaciones típicas de la velocidad durante las fases 1 y 2, respectivamente; n₁ y n ₂ y denotan el número de trazas extraídas durante las fases 1 y 2, respectivamente. El t-estadístico resultante t₁₂ se puede traducir en un valor p para la prueba de hipótesis. Para los datos mostrados en la Figura 2C, las transiciones de la Fase 1 a la Fase 2 (p < 0,1%) y de la Fase 2 a la Fase 3 (p < 0,1%) son estadísticamente significativas, mientras que la transición de la Fase 3 a la Fase 4 (p > 20%) no lo es. Es importante tener en cuenta que la tendencia de las células a asentarse en pequeñas colonias durante la Fase 4 (Figura 2B, recuadro), como es evidente en los videos en bruto, es un ejemplo de diferencia de comportamiento no bien capturada solo por la medición de las velocidades de natación. Esto explica la gran desviación estándar medida durante la Fase 4 (0,26 mm/s), que a su vez, contribuyó a una estadística t más baja al compararla con la Fase 3.

Figura 1: El seguimiento celular revela una recuperación gradual de la natación dirigida. (A) El choque de sacarosa induce a Stentor coeruleus a desprenderse de la banda de membrana. (B) Ejemplo de resultado de seguimiento de células regeneradoras en un video de 10 s con círculos rayados que indican burbujas de aire en el pozo. (C-F) Superposición de todas las trayectorias a 2 h, 3 h, 7 h y 8 h. Los tiempos se redondearon a la hora más cercana durante la compilación de datos. Los círculos punteados indican desplazamientos radiales de un milímetro. (G) La motilidad celular evoluciona de la natación sin dirección caracterizada por trayectorias circulares cortas a la natación dirigida caracterizada por trayectorias sinusoidales largas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La subpoblación móvil demuestra cuatro fases distintas de comportamiento a través de la regeneración de OA. (A) Morfología de la regeneración del estentor . (B) Recuentos normalizados de células en cada momento que no eran (azules) móviles, sin retención visible; (naranja) no móvil, con sujeción visible; (verde) móvil. Se combinaron múltiples conjuntos de datos que abarcan diferentes subconjuntos de horas para esta figura, por lo que el recuento total de células por hora varió de 57 a más de 376. La leyenda muestra celdas representativas debajo de cada categoría visualizadas por color falso, en magenta y verde. (C) Boxplot de velocidad de natación; los cuadros se extienden de los valores del cuartil Q1 a Q3 en cada momento con el valor medio indicado en verde. Las superposiciones de dispersión son la velocidad promedio de cada celda móvil. El recuadro muestra el comportamiento representativo de la población durante cada una de las cuatro fases. Abreviaturas: OA = aparato oral; Q1 = primer cuartil; Q3 = tercer cuartil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El análisis de la motilidad como herramienta de detección de fenotipos requiere un gran número de células. (A, B) Resultados de seguimiento de dos pozos a las 12 h. (C, D) Resultados de seguimiento de los mismos dos pozos a las 18 h. Las células de Stentor muestran una preferencia por adherirse en grupos, con algunos pozos asentándose en colonias horas antes que otros. Las áreas rayadas indican burbujas de aire en el pozo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Media (mm/s)	Desviación estándar (mm/s)
Fase 1	0.14	0.24
Fase 2	0.06	0.13
Fase 3	0.16	0.16
Fase 4	0.15	0.26

Tabla 1: Comparación de las velocidades de natación durante cada fase de recuperación de la motilidad.

Figura suplementaria S1: Patrones de natación de la población a través de la regeneración y más allá. (A-M) Movimiento de las células de Stentor coeruleus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 y 18 h, respectivamente, después del inicio de la regeneración del aparato oral. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Videos suplementarios 1-3: Ejemplos de videos microscopía de S. coeruleus para la depuración de scripts. La sección 5 del protocolo se puede realizar en este conjunto de tres videos de datos para una confirmación rápida de que los scripts se están ejecutando correctamente. Además, estos videos proporcionan un ejemplo concreto de los requisitos de contraste y resolución para los videos de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos complementarios: Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Actualmente existen muchos algoritmos de seguimiento de partículas y células, algunos completamente gratuitos. El costo y la facilidad de uso a menudo son compensaciones que requieren compromiso. Además, muchos de los programas de seguimiento celular existentes están diseñados para rastrear el movimiento lento de rastreo de las células de cultivo de tejidos, en lugar del movimiento de natación rápida de Stentor, que gira mientras nada y puede sufrir cambios repentinos de dirección. Después de probar muchas de estas opciones, el protocolo presentado aquí pretende ser una solución integral para ir desde la adquisición de datos hasta la visualización de datos utilizando solo equipos de bajo costo y un solo paquete de software científico (Tabla de materiales). Esto es de particular interés para los laboratorios de investigación en instituciones centradas en la enseñanza o laboratorios de enseñanza de biofísica donde la mayoría del equipo necesario ya está disponible, ya que reduce la barrera para que los estudiantes hagan sus propias preguntas y lleguen a resultados cuantitativos en un corto período de tiempo.

El método presentado en este manuscrito se puede adaptar para caracterizar cuantitativamente la motilidad de una población de organismos en la escala de tamaño de cien micras a milímetros. La aplicación a organismos más pequeños o más grandes requerirá cambios en la forma en que se deben adquirir los datos de video. Como se aplica a una población de S. coeruleus regeneradora aquí, este protocolo produjo una línea de tiempo para la recuperación funcional de la motilidad en toda la población celular, que complementa lo que se sabe actualmente sobre la línea de tiempo transcripcional. Por ejemplo, se sabe por secuenciación de ARN que la síntesis de genes que codifican proteínas de motilidad ciliar no tiene lugar hasta varias horas después del proceso de regeneración, mucho después de la formación de los^propios cilios ^9,10. La caída estadísticamente significativa en la motilidad de las horas 0-3 (Fase 1) a la hora 4 (Fase 2) demostrada anteriormente es consistente con este retraso en la expresión de los factores de motilidad ciliar en comparación con la expresión de genes involucrados en el ensamblaje ciliar. Hasta la fecha no se había llevado a cabo ningún estudio transcriptómico de la regeneración de Stentor más allá de la hora nueve, por lo que se sabe poco sobre la actividad genómica. La falta de diferencia estadísticamente significativa entre las horas 8-10 (Fase 3) y las horas 11+ (Fase 4) sugiere que las células se han regenerado completamente en este momento, y pocos genes relevantes para la motilidad celular deben regularse diferencialmente más allá de la hora 9.

Dos limitaciones principales de este método son su incapacidad para rastrear células agrupadas y / o que tocan, y su incapacidad para cuantificar aspectos más complejos del movimiento que las velocidades o trayectorias de natación. Todos los algoritmos de seguimiento de partículas/células tienen dificultades para seguir a las células que están temporalmente obstruidas visualmente por otra célula, y cuando varias células pasan varios fotogramas muy cerca; el script incluido aquí no es una excepción. Afortunadamente, la frecuencia de la primera se puede reducir efectivamente simplemente limitando el número de células colocadas dentro de una, como se discutió en el siguiente párrafo. Específicamente para la población de S. coeruleus investigada aquí, su preferencia por establecerse en colonias (Figura 3) causó que algunas de estas células no fueran identificadas por el guión. Sin embargo, como todas estas células exhiben poco o ningún movimiento, las estadísticas sobre la población de células móviles no se ven afectadas. Además, los videos donde múltiples celdas eluden el seguimiento son fáciles de identificar y excluir manualmente de análisis posteriores. Con respecto a la cuantificación de aspectos complejos del movimiento, la transición de la natación sin dirección a la dirigida que se ve en la Figura Suplementaria S1 sugiere cambios cuantitativos en la correlación temporal de la dirección, la aceleración promedio y potencialmente otros mensurables. La velocidad y el alcance, las únicas cantidades analizadas en este protocolo, representan solo un pequeño aspecto del movimiento.

Por último, algunas partes del protocolo son de particular importancia o consecuencia en el uso práctico. El montaje de las diapositivas de muestra multipocillo con láminas delgadas de silicona, como se describe en la sección 1 del protocolo, requiere práctica. Es fácil introducir fugas o burbujas de aire en al menos un pozo mientras se sella la muestra con la cubierta. Los pozos se pueden dividir en múltiples diapositivas de muestra para permitir el uso de vidrio de cubierta más pequeño, lo que facilitará el proceso (y los errores serán menos costosos). Aunque el ensayo presentado aquí se puede utilizar para caracterizar los patrones de motilidad de una población celular en un solo punto de tiempo, se demuestra aquí como una herramienta para comparar los patrones de motilidad de una sola población durante un lapso de tiempo largo (más de 10 h). Al igual que con cualquier lapso de tiempo largo, la evaporación de una muestra húmeda es inevitable. La evaporación se puede minimizar mediante un sello seguro del espaciador de silicona en la cámara de imágenes tanto para el portaobjetos de vidrio como para la cubierta. Si no se hace esto, los pozos se filtrarán entre sí o se formarán burbujas de aire dentro de los pozos. Para los investigadores que no están familiarizados con el uso de espaciadores de silicona, el agua de manantial pasteurizada u otro medio limpio debe canalizarse en cada pozo para probar si hay fugas antes de su uso. Las dimensiones de los pozos de muestra fueron elegidas para trabajar bien para S. coeruleus, que tienen aproximadamente 1 mm de tamaño. Esto incluye el grosor del espaciador de silicona (elegido para restringir las células de S. coeruleus bajo investigación a un plano bidimensional), 5/16 " de diámetro y 10 células por pozo. Estos números deben ajustarse al adaptar este protocolo para otros tipos de células.

Se pueden ajustar varios parámetros del script TrackCells.m para optimizar la identificación automática de celdas y la validación de trazas. Los parámetros MinCellArea y MaxCellArea (líneas 15 y 16 del script) permiten al usuario establecer el rango aceptable de tamaños para una celda en píxeles cuadrados. Los valores que son mejores dependen de muchos detalles del experimento, incluido el tamaño de la celda, el tamaño del píxel de la cámara, la ampliación y si hay objetos que podrían identificarse erróneamente como células, por ejemplo, burbujas de aire. Los valores predeterminados de 300 y 1500 eran óptimos para el equipo exacto y la configuración proporcionada en el protocolo. Una vez optimizados MinCellArea y MaxCellArea , ajuste el parámetro Threshold (línea 17) para cambiar el contraste de la imagen. Cuando se establecen incorrectamente, los contornos de las celdas se identificarán mal o se perderán por completo, lo que dificultará el seguimiento correcto. Si ningún valor de Threshold funciona bien para el seguimiento correcto, pruebe con un video con mayor contraste o que esté más enfocado. La línea 218 del script, bad_trks = find(strk_trks > 20); es responsable de descartar rastros que se desvían del movimiento predicho (a través del filtro Kalman) demasiadas veces. Tal como está, el script tiene este umbral para demasiados establecido en 20. Disminuya este valor entero hasta 1 para descartar los rastros de manera más agresiva. Aumentar el valor para descartar de forma menos agresiva. Gran parte de TrackCells.m se adoptó del tutorial de seguimiento de objetos múltiples de libre acceso en http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html, al que el lector podría consultar para obtener más detalles. Los videos suplementarios 1-3 son videos de datos de ejemplo para una prueba de los scripts.

La capacidad de S. coeruleus para regenerar completamente una OA perdida se observó por primera vez hace más de un siglo, sin embargo, quedan muchas preguntas abiertas con respecto a la recuperación de la motilidad y los estados de comportamiento. El protocolo presentado aquí está destinado a desmitificar la combinación de imágenes de campo brillante, identificación y seguimiento automatizado de células y visualización de datos que los autores emplearon para caracterizar cuantitativamente la motilidad de una población de Stentor regenerador. Este flujo de trabajo es ampliamente aplicable a la investigación de la motilidad en general, y los scripts y protocolos incluidos se pueden adoptar fácilmente para trabajar con otros sistemas biológicos de tamaño y velocidad similares, por ejemplo, otros ciliados como Paramecium y Blepharisma. Además, cambiar la cámara de imágenes (por ejemplo, usar pozos secos o pozos de diferentes tamaños junto con diferentes aumentos de imágenes) amplía en gran medida la aplicabilidad de este flujo de trabajo. El kit de herramientas actual para Stentor incluye disección quirúrgica, shock osmótico, ARNi, análisis de ADN/ARN e inhibidores de moléculas pequeñas⁶. El método de alto rendimiento para cuantificar la motilidad presentado aquí agrega un grado complementario de caracterización y se utilizará en futuros trabajos para investigar fenotipos de motilidad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m