Summary
نحن نبين كيفية استخدام أداة جديدة لتحليل تتبع الجسيمات النانوية لتقدير توزيع الحجم والتركيز الكلي للجسيمات الحويصلات خارج الخلية المعزولة عن الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس والبلازما البشرية.
Abstract
أصبحت الأدوار الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لل الحويصلات خارج الخلية (EVs) معترف بها بشكل متزايد ، مما يجعل مجال EV مجالا سريعا من مجالات البحث. هناك العديد من الطرق المختلفة لعزل EV ، ولكل منها مزايا وعيوب متميزة تؤثر على العائد النهائي ونقاء المركبات الكهربائية. وبالتالي، فإن توصيف الإعدادية EV معزولة عن مصدر معين من قبل طريقة مختارة مهم لتفسير نتائج المصب ومقارنة النتائج عبر المختبرات. توجد طرق مختلفة لتحديد حجم وكمية المركبات الكهربائية، والتي يمكن تغييرها من قبل حالات المرض أو استجابة للظروف الخارجية. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) هي واحدة من التقنيات البارزة المستخدمة لتحليل الإنتاجية العالية للمركبات الكهربائية الفردية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للقياس الكمي وتحديد حجم المركبات الكهربائية المعزولة عن الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس والبلازما البشرية باستخدام تكنولوجيا اختراق لNTA تمثل التقدم الكبير في هذا المجال. وتبين النتائج أن هذه الطريقة يمكن أن توفر تركيز الجسيمات الكلي القابل للاستنساخ والصالح وبيانات توزيع الحجم للمركبات الكهربائية المعزولة عن مصادر مختلفة باستخدام أساليب مختلفة، كما أكد ذلك المجهر الإلكتروني الإرسال. تكييف هذا الصك لNTA سوف تلبي الحاجة إلى توحيد في أساليب NTA لزيادة الدقة والتكرار في البحوث EV.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) صغيرة (0.03-2 ميكرومتر) الحويصلات المرتبطة بالغشاء التي تفرزها جميع أنواع الخلايا تقريبا1. وغالبا ما يشار إليها باسم "exosomes" ، "microvesicles" ، أو "الهيئات المبرمج" اعتمادا على آلية الإفراج عنها وحجم2. في حين كان يعتقد في البداية أن المركبات الكهربائية كانت مجرد وسيلة للقضاء على النفايات من الخلية للحفاظ على التوازن3، ونحن نعلم الآن أنها يمكن أن تشارك أيضا في الاتصالات بين الخلايا عن طريق نقل المواد الجزيئية -- بما في ذلك الحمض النووي ، الجيش الملكي النيبالي (ميرنا ، ميكرورنا) ، والدهون ، والبروتينات4،5 -- وأنها هي المنظمين المهمين لعلم وظائف الأعضاء الطبيعية ، فضلا عن العمليات المرضية1، 5،6،7،8.
هناك العديد من الطرق المختلفة لعزل وقياس المركبات الكهربائية، والتي تم وصفها في مكان آخر9،10،11،12. بروتوكول العزل المستخدمة وكذلك مصدر المركبات الكهربائية يمكن أن تؤثر بشكل كبير EV الغلة والنقاء. وحتى الطرد المركزي التفاضلي، الذي طالما اعتبر نهج "المعيار الذهبي" للعزلة الخارجية، يمكن أن يخضع لتباين كبير يؤثر في وقت لاحق على السكان EV التي تم الحصول عليها وتحليلات المصب13. وهكذا، فإن مختلف المنهجيات المختلفة لعزل EV وتحديد كمي تجعل من الصعب مقارنة واستنساخ وتفسير نتائج التجارب المبلغ عنها في الأدب14. وعلاوة على ذلك، يمكن تنظيم إطلاق EV من خلال الظروف الخلوية أو عوامل خارجية مختلفة. وقد اقترح أن المركبات الكهربائية تلعب دورا في الحفاظ على التوازن الخلوي من خلال حماية الخلايا ضد الإجهاد داخل الخلايا15, كما أظهرت العديد من الدراسات أن الإجهاد الخلوي يحفز إفراز EV. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن زيادة إطلاق EV بعد التعرض الخلوي لنقص الأكسيجة، والإجهاد الشبكي بطانة الرحم، والإجهاد التأكسدي، والإجهاد الميكانيكي، ومستخلص دخان السجائر، وتلوث الهواء الجسيمات16،17،18،19،20،21،22. كما تبين أن إطلاق EV قد تم تعديله في الجسم الحي؛ الفئران التي تعرضت لنظام غذائي عالي الدهون أو الصيام لمدة ستة عشر ساعة صدر أكثر المركبات EVsadipocyte 23. للتحقيق فيما إذا كان علاج أو حالة معينة يغير إطلاق EV، يجب تحديد عدد المركبات الكهربائية بدقة. تقييم توزيع حجم EV قد تشير أيضا إلى الأصل شبه الخلوي السائد من المركبات الكهربائية (على سبيل المثال، الانصهار من الأجسام الاندوسومات المتأخرة / متعددة المركبات مع غشاء البلازما مقابل الناشئة من غشاء البلازما)24. وبالتالي، هناك حاجة إلى أساليب قوية لقياس بدقة التركيز الكلي وتوزيع حجم الإعدادية EV التي تجري دراستها.
طريقة سريعة وحساسة للغاية لتصور وتوصيف المركبات الكهربائية في الحل هو تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). وقد وصف شرح مفصل لمبادئ هذه الطريقة والمقارنة مع الطرق البديلة لتقييم حجم EV والتركيز سابقا25،26،27،28. باختصار، أثناء قياس NTA، يتم تصور المركبات الكهربائية بواسطة الضوء المتناثر عندما يتم تشعيعها بشعاع ليزر. يركز الضوء المتناثر بواسطة المجهر على الكاميرا التي تسجل حركة الجسيمات. يتتبع برنامج NTA الحركة الحرارية العشوائية لكل جسيم ، والمعروفة باسم الحركة البراونية ، لتحديد معامل الانتشار الذي يستخدم لحساب حجم كل جسيم باستخدام معادلة ستوكس آينشتاين. تم تطبيق NTA لأول مرة على قياس المركبات الكهربائية في عينة بيولوجية في عام 201125. حتى وقت قريب، كان هناك سوى شركتين التيار الرئيسي التي تقدم أدوات NTA التجارية29 حتى إدخال ViewSizer 3000 (يشار إليها فيما بعد باسم أداة تتبع الجسيمات) الذي يستخدم مزيجا من الأجهزة الجديدة وحلول البرمجيات للتغلب على قيود كبيرة من تقنيات NTA الأخرى.
تميز أداة تتبع الجسيمات الجسيمات النانوية في العينات السائلة من خلال تحليل حركتها البراونية وتميز جزيئات أكبر بحجم ميكرون من خلال تحليل استقرار الجاذبية. يسمح النظام البصري الفريد لهذا الجهاز، والذي يتضمن إضاءة متعددة الأطياف مع ثلاثة مصادر ضوء ليزر (عند 450 نانومتر و520 نانومتر و635 نانومتر)، للباحثين بتحليل مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات (على سبيل المثال، إكسوسومات، ميكروفيسيكليس) في وقت واحد. يظهر تخطيطي لإعداد الأداة في الشكل 1.
هنا، ونحن نبين كيفية تنفيذ توزيع حجم الجسيمات وقياسات تركيز الماوس المعزولة والمركبات الكهربائية البشرية باستخدام أداة NTA جديدة.
الشكل 1: نظام بصري أداة تتبع الجسيمات. تضيء أداة NTA الجسيمات باستخدام ثلاثة أشعة ليزر ذات أطوال موجية تالية: 450 نانومتر، 520 نانومتر، 635 نانومتر. يتم الكشف عن تسجيل الفيديو للضوء المتناثر من الجسيمات الفردية وتتبعها بواسطة كاميرا فيديو رقمية موجهة 90 درجة من cuvette. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم تنفيذ جميع الأعمال مع هذه العينات وفقا للجنة المؤسسية للعناية بالحيوانات واستخدامها والمبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية. يتم تصوير نظرة عامة تخطيطية لطريقة NTA في الشكل 2.
الشكل 2:نظرة عامة على طريقة NTA باستخدام أداة تتبع الجسيمات. يتم إعداد العينة وإدراجها في الصك. يتم فتح برنامج NTA، ويتم ضبط معلمات التسجيل، ويتم تركيز العينة. ثم يتم تسجيل البيانات ومعالجتها وعرضها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. عزل الحويكل خارج الخلية
ملاحظة: تم عزل الماوس perigonadal الأنسجة الدهنية EVs كما وصف سابقا23. تم عزل البلازما EVs من 1 مل من البلازما البشرية باستخدام البروتوكول التالي:
- جمع البلازما والطرد المركزي في 3000 س غ لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. نقل supernatant إلى أنبوب جديد.
ملاحظة: إذا بقي الحطام الإضافي قابلا للكشف، قم بالطرد المركزي للناتنات الفائق لمدة 10 دقائق إضافية عند 12,000 × ز ونقل الناطور إلى أنبوب جديد. - أضف 67 ميكرولتر من كاشف العزل exosome لكل 250 ميكرولتر من البلازما. مزيج جيدا عن طريق عكس أو النقر على الأنبوب.
- احتضان على الجليد تستقيم لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي كواشف العزلة إكسوسوم / خليط البلازما في 3000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إجراء الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية مع نتائج مماثلة، ولكن يفضل 4 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، قد تظهر المركبات الكهربائية كبيليه بيج أو أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب. - يستنشق بعناية قبالة supernatant. تدور أسفل أي حل العزل exosome المتبقية وإزالة جميع آثار السوائل عن طريق الطموح، مع الحرص الشديد على عدم تعكير صفو المركبات الكهربائية عجلت في بيليه.
- Resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت B (التي تقدمها الشركة المصنعة). قياس وتسجيل تركيز البروتين العينة (للخطوة 2.8) باستخدام مطياف، مقياس الفلور، برادفورد المقايسة، أو طريقة أخرى مفضلة.
2. تنقية المركبات الكهربائية المعزولة
- إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (التي توفرها الشركة المصنعة) إلى إعادة تعليق المركبات الكهربائية.
- إخراج العمود تنقية (المقدمة)، وتخفيف الغطاء المسمار، والمفاجئة قبالة إغلاق القاع. ضع العمود في أنبوب تجميع.
ملاحظة: حفظ إغلاق أسفل للخطوات 2.7-2.9. - جهاز طرد مركزي 1000 x g لمدة 30 s لإزالة المخزن المؤقت للتخزين.
- تجاهل التدفق من خلال ووضع العمود مرة أخرى في أنبوب جمع.
- لغسل العمود، قم بإزالة الغطاء وتطبيق 500 ميكرولتر من العازلة B فوق الراتنج والطرد المركزي عند 1000 × غرام لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال. حفظ الغطاء للخطوات 2.7-2.9.
- كرر الخطوات 2.4-2.5 مرة أخرى لغسل العمود.
- قم بتوصيل الجزء السفلي من العمود بإغلاق أسفل (من الخطوة 2.2). تطبيق 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت B على رأس الراتنج لإعداده لتحميل العينة.
- إضافة المحتوى بأكمله من الخطوة 1.6 (أو ما يعادل حجم 4 ملغ من البروتين الكلي) إلى الراتنج. ضع الغطاء المسماري في أعلى العمود.
- تخلط في درجة حرارة الغرفة على شاكر الدورية لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
3. عينة elution
- تخفيف الغطاء المسمار وإزالة إغلاق القاع، ونقل فورا إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل.
ملاحظة: سيبدأ النموذج إلى elute بمجرد إزالة إغلاق أسفل. يرجى التأكد من أن أنبوبي الطرد المركزي الدقيق 2 مل جاهزان لاستقبال اليوات لتقليل فقدان العينة. - جهاز طرد مركزي 1000 x g لمدة 30 s للحصول على المركبات الكهربائية النقية. تجاهل العمود.
4. إعداد عينة لتحليل تتبع الجسيمات النانوية
- استخدم مادة خالية من الوبر مثل قطعة قماش من الألياف الدقيقة لتغطية مساحة العمل ومنع الألياف من دخول اللحاف.
- ارتداء القفازات، ووضع cuvette على الرقصة cuvette المغناطيسي، ثم وضع شريط اثارة في cuvette. تعامل دائما مع اللحافات باستخدام قفازات لمنع ظهور بصمات الأصابع واللطخات على سطح cuvette.
- استخدام أداة هوك لوضع إدراج في cuvette كما هو مبين في الشكل 3. من المهم ملاحظة اتجاه الإدراج للأحدث (الخطوة 5.4).
الشكل 3: التوجه السليم لإدراج داخل كوفيت الكوارتز. يجب أن يكون "درجة" الإدراج مرئيا من الجزء الأمامي من cuvette. وينبغي إدراج هذا في الصك التي تواجه الكاميرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- باستخدام ماصة، إضافة ببطء 400-500 ميكرولتر من عينة مخففة أو مخففة في درجة حرارة الغرفة إلى cuvette من خلال ثقب في إدراج. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
- أولا إعداد cuvette محملة بالعزلة المختارة (فارغة) لقياس تركيز الجسيمات من الذوبان. وينبغي أن يتم ذلك قبل قياس العينة بحيث يمكن تصحيح تركيز الخلفية للعينة.
ملاحظة: فارغة جيدة (الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة [PBS] في هذه الحالة) سيكون لها تركيز <9 × 106 (اعتمادا على مخفف) وسوف تعرض 1-10 جزيئات لكل شاشة في عرض حية(الشكل 4). من المستحسن أن يكون تركيز الجسيمات العينة الفعلية على الأقل 3 أضعاف تركيز الخلفية. - اختياريا، قبل تسجيل رئيس العينة cuvette مع 400-500 ميكرولتر من عينة مخففة أو مخففة قبل القياس. للقيام بذلك، قم بتحميل 400-500 ميكرولتر من العينة المخففة في الكوفيت، وتجاهل المحلول، ثم أضف 400-500 ميكرولتر أكثر من العينة للقياس. وهذا قد يساعد في غسل المخلفات داخل الكوفيت.
- أولا إعداد cuvette محملة بالعزلة المختارة (فارغة) لقياس تركيز الجسيمات من الذوبان. وينبغي أن يتم ذلك قبل قياس العينة بحيث يمكن تصحيح تركيز الخلفية للعينة.
الشكل 4:عرض البث المباشر التمثيلي للمزهول داخل نطاق التركيز المناسب للفراغ. تمييع EV preps في تصفية (0.02 ميكرومتر أو 3 كيلودا، المفضل) برنامج تلفزيوني. وهناك فارغة جيدة عرض ~ 1-10 الجسيمات لكل شاشة في عرض حية، مما أسفر عن تركيز داخل النطاق 105-106. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بوضع غطاء للكوفيت وتحقق من وجود فقاعات. اضغط على الفقاعات إذا لزم الأمر. استخدام قطعة قماش خالية من الوبر لمسح الوجوه الخارجية للcuvette.
5. بدء إجراءات أداة تتبع الجسيمات
- تشغيل محطة عمل الكمبيوتر وجهاز، انتظر بضع دقائق قبل تشغيل العينة الأولى وبدء تشغيل البرنامج بالنقر على رمز البرنامج. عند مطالبتك بذلك، انقر فوق NTA على الشاشة لإجراء تحليل تتبع الجسيمات النانوية. تبدأ في تسجيل علامة التبويب وانقر على علامات التبويب البرامج المختلفة(سجل، عملية، مؤامرة)للتبديل بينهما في جميع أنحاء البروتوكول. تسجيل العينة (ثنائي أو EV الإعدادية) أولا، ثم معالجة التسجيلات، وأخيرا رسم النتائج.
- اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لملء جميع المعلومات اللازمة حول العينة. تأكد من اكتمال جميع الحقول الضرورية ودقتها، أي اسم العينة والوصف وإعداد العينة وعامل التخفيف [1000] ودرجة الحرارة المستهدفة (تعيين إلى 22 درجة مئوية) وDiluent: حدد مخفف من القائمة المنسدلة واستخدم PBS كمخفف للمركبات الكهربائية. اختيار برنامج تلفزيوني من القائمة المنسدلة سوف لصناعة السيارات في ملء الملوحة إلى 9٪. هذه المعلومات ضرورية لتحديد اللزوجة الديناميكية للسائل.
ملاحظة: يمكن أن يستغرق الأمر ما يصل إلى 3 دقائق حتى تستقر درجة الحرارة داخل الكوفيت حتى لو أظهر المسبار بالفعل درجة الحرارة المطلوبة (أي أن النقطة الخضراء تصبح مستقرة). يمكن أن تختلف قراءات العينة بشكل كبير إذا لم يتم تعيين درجة الحرارة المستهدفة ، حيث يمكن أن تغير اختلافات درجة حرارة العينة بشكل كبير الحركة البراونية للجسيمات. - افتح غطاء الجهاز وأزل الغطاء الواقي حيث سيتم وضع الكوفيت.
تنبيه: تم اعتماد أداة تتبع الجسيمات كمنتج ليزر من الفئة 1 (21 CFR Ch. أنا جزء 1040)، التي تحتوي على أشعة الليزر التي يمكن أن تكون خطرة ويمكن أن تسبب إصابات خطيرة مثل الحروق و / أو ضرر دائم للبصر. لمنع وقوع حادث أو إصابة، لا تقم بإزالة غطاء الجهاز عن طريق فك البراغي من الجانب. لاحظ أنه أثناء التشغيل ، تكون أشعة الليزر مغلقة تماما ، مما لا يشكل تهديدا للمستخدمين. كما يتم تضمين قفل أمان مغناطيسي في حامل عينة الجهاز لمنع أشعة الليزر من العمل عند إزالة غطاء حامل العينة. - ضع الكوفيت (من الخطوة 4.3) داخل الجهاز في الاتجاه الصحيح (انظر الشكل 5). استبدال الغطاء على cuvette وإغلاق غطاء الصك. دائما تشغيل الصك مع الغطاء في مكان على حامل العينة. لا تقم بتعطيل ميزة الأمان المتشابك أو محاولة التحايل عليها.
الشكل 5:التوجه السليم للكوفيت داخل أداة تتبع الجسيمات. وجه cuvette (مع "درجة" إدراج مرئية) يجب أن تواجه الكاميرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بتشغيل الكاميرا بالنقر فوق السهم الموجود أعلى البث.
- انقر فوق سهم شيفرون لتوسيع إعدادات السجل. تعيين قوة Gain و Laser إلى القيم المناسبة للتطبيق. انظر الجدول 1 (والشكل التكميلي 1)للاطلاع على المعلمات المستخدمة في المركبات الكهربائية الصغيرة (100 نانومتر).
ملاحظة: قد تكون هذه الإعدادات المتقدمة الوصول إليها بالنقر فوق السهم chevron محمية بكلمة مرور. استخدم نفس الإعدادات لتسجيل ومعالجة الفواصل (فارغة) مثل تلك المستخدمة للعينات اللاحقة. - ضبط التركيز حتى يتم تركيز الجسيمات بشكل صحيح. وينبغي التركيز على الجسيمات الصغيرة نسبيا(الشكل 6). بالنسبة للقياس الكمي EV الصغير (بما يتفق مع exosomes) ، يوصى بإعدادات التسجيل التالية: معدل الإطار: 30 إطارا في الثانية ، التعرض: 15 مللي ثانية ، وقت التقليب: 5 ثانية ، وقت الانتظار: 3 ثانية ، طاقة الليزر - الأزرق: 210 ميجاوات ، الأخضر: 12 مللي واط ، الأحمر: 8 ملليواط ، الإطارات لكل فيديو: 300 إطار ، والكسب: 30 ديسيبل.
ملاحظة: يمكن للمستخدم زيادة تكبير/تصغير إلى 1x و/أو زيادة كسب للمساعدة في التركيز. تذكر إعادة تعيين هذه المعلمات إلى القيم الموصى بها قبل تسجيل مقاطع الفيديو.
الشكل 6: ممثل وجهات النظر البث المباشر تظهر تركيز الجسيمات. (أ) مثال عرض البث المباشر للجسيمات ليست في التركيز. الجسيمات لديها هالة تشبه توهج أو تبدو ضبابية. ضبط التركيز. (ب) مثال على عرض البث المباشر للجسيمات في التركيز المناسب. أصغر الجسيمات هي في التركيز. بدء التسجيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إجراء فحص جودة مرئية للتأكد من أن العينة مخففة بشكل صحيح. إذا كانت العينة مركزة جدا، قم بإزالة الكوفيت من الجهاز وتمييع العينة بشكل متسلسل. كرر حتى يتم تخفيف العينة بشكل صحيح قبل المتابعة إلى الخطوة 6.
ملاحظة: لا تخفف العينة أكثر من ذلك! دائما جعل التخفيفات بالتسلسل. سوف فارغة مثالية عرض سوى عدد قليل من الجسيمات على الشاشة (1-4) كما هو مبين في الشكل 4. وفيما يتعلق بعينات EV، سيكون لعينة مخففة بشكل صحيح ما يقرب من 20-100 جسيم مرئية على الشاشة، مع عدم وجود صور تشبه توهج أو غائم في الخلفية (انظر الشكل 7 كمثال). وينبغي أن يؤدي ذلك إلى تركيز الجسيمات الأمثل في نطاق 5 × 106 إلى 2 × 108 جزيئات لكل مل (عدم التكيف مع عامل التخفيف).
الشكل 7: مناظر البث المباشر التمثيلية التي تصور تخفيفات الجسيمات المختلفة. (A)مثال على عرض البث المباشر لعينة مركزة للغاية. تسجيل عينة مركزة جدا سوف تسفر عن نتائج غير دقيقة. (ب) مثال على عرض البث المباشر لعينة مخففة بشكل صحيح. هناك 60-100 جزيئات مرئية على الشاشة وتسجيل النتائج في تركيز الخام من 5 × 106- 2 × 108 جزيئات / مل. (ج)مثال على عرض البث المباشر لعينة مخففة للغاية. إذا كانت العينة هي هذا التخفيف ، فلن يكون هناك ما يكفي من الجسيمات التي تم تعقبها ، مما يقلل من حجم العينة ، وبالتالي ، فإن النتائج ستكون غير صالحة إحصائيا. في هذه الحالة، ينصح بزيادة عدد مقاطع الفيديو المسجلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. الحصول على بيانات الفيديو
- (اختياري) تعيين إعداد التكبير/التصغير إلى 0.5x لحفظ عرض النطاق الترددي ومنع الإطارات المفقودة.
- ابدأ تسجيل مقاطع الفيديو بالنقر على سجل (انظر الجدول 1 للحصول على معلمات التسجيل الموصى بها).
ملاحظة: افتراضيا، الأداة سوف يحرك العينة لمدة 5 s، انتظر 3 s، ثم قم بتسجيل لمدة 10 s قبل تكرار هذه العملية. وقت القياس النموذجي لمقاطع الفيديو 50 هو ~ 15 دقيقة للتسجيل و ~ 13 دقيقة للمعالجة. - لا تلمس الجهاز أثناء تسجيل مقاطع الفيديو. تأكد من أن سطح مقاعد البدلاء المختبر لا يهتز.
ملاحظة: يفضل أن يتم تعيين الأداة على منصة أو طاولة مضادة للاهتزاز لتقليل أي اضطرابات اهتزاز من المعدات القريبة التي ستتداخل مع تحديد حركة الجسيمات النانوية. تجنب تشغيل أجهزة الطرد المركزي أو خلاطات الدوامات أو غيرها من الأجهزة المحتملة لتوليد الاهتزاز على نفس مقاعد البدلاء مثل أداة تتبع الجسيمات. الاهتزازات مرئية بسهولة على الشاشة كما استطالة الجسيمات المستديرة عادة. إذا تعرضت لاهتزازات قوية، قد تتطلب الأداة إعادة تنظيم العناصر البصرية. لم يتم تصميم الأداة ليتم خدمتها أو معايرة من قبل العميل؛ اتصل بالشركة المصنعة للصيانة والخدمة والمعايرة. - لاحظ أي فيديو مسجل يحتوي على جزيئات كبيرة جدا مرئية مثل النقط البيضاء الكبيرة وغير المنتظمة. إزالة مقاطع الفيديو هذه من المعالجة في الخطوة 7.3.
7. معالجة البيانات المكتسبة
- عندما تظهر مطالبة تفيد بأنه تم تسجيل مقاطع الفيديو، انقر فوق موافق لإكمال التسجيل. ثم حدد علامة التبويب عملية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا. يمكن إعادة تشغيل معالجة البيانات المكتسبة لاحقا بالانتقال مباشرة إلى علامة التبويب Process بعد فتح برنامج أداة تتبع الجسيمات وتحديد الدليل الذي يتم حفظ مقاطع الفيديو المسجلة فيه. - عند تحليل المركبات الكهربائية، حدد المربع تعطيل تجاوز الكشف التلقائي وتعيين قطر الميزة إلى 30. انقر فوق عملية. (انظر الجدول 2 للاطلاع على إعدادات المعالجة والشكل التكميلي 2 لعرض المعالجة). سيتم عرض رسم بياني للتوزيع المباشر بحيث يمكن للمستخدم عرض المعالجة في الوقت الفعلي.
- بالنسبة للاكسوسومات، قم بمعالجة مع تعيين عتبة الكشف إلى نموذج Polydisperseالافتراضي . معالجة البيانات مع دليل عتبة الكشف تعيين إلى 0.8 بدلا من عتبة قياسية من 0.99 فقط للحلول مع اختلافات كبيرة جدا في أحجام الجسيمات.
- إذا كان لأي مقاطع فيديو جزيئات كبيرة جدا مرئية بشكل ملحوظ (انظر الخطوة 6.4) ، فانتقل إلى دليل مقاطع الفيديو المسجلة وأزل الفيديو الإشكالي. بعد تحرير قائمة ملفات الفيديو، قم بتغيير عدد مقاطع الفيديو المسجلة في سجلات أخرى يحتفظ بها المستخدم.
- بعد اكتمال المعالجة، انقر فوق موافق. ثم حدد علامة التبويب رسم. بالنسبة للمركبات الكهربائية، اعرض المخطط الرئيسي على أنه LogBinSilica.
ملاحظة: هنا في علامة التبويب رسم، يمكن للمستخدم تخصيص ميزات أخرى من الرسم البياني، مثل تحديد نطاق محور س (قطر الجسيمات، نانومتر) لتعيين منطقة للتكامل للشخصية المنتجة.
8. عرض وتفسير النتائج
- لإنشاء تقرير PDF، انقر فوق الزر تقرير. وقد اكتمل القياس الآن، ويمكن الاطلاع على النتائج.
ملاحظة: تذكر لتسجيل ومعالجة فارغة أولا بحيث يمكن تصحيح تركيز الخلفية من العينات اللاحقة. إذا تم نسيان هذه الخطوة، يمكن تسجيل الفراغ بعد العينات وتصحيح تركيز الجسيمات العينة يدويا. - فحص تقرير PDF الذي يعرض متوسط ومتوسط وحجم الوضع وكذلك التركيز المعدل لعامل التخفيف وتصحيحه عن طريق طرح تركيز الجسيمات في الذوبان. كما يظهر عرض التوزيع (الانحراف المعياري).
ملاحظة: هناك تطبيقات قليلة جدا حيث قيمة مفردة مناسبة وممثل. وبالتالي، يوصى بوصف توزيع الحجم بالكامل والإبلاغ عن عرض التوزيع لأي عينة تم تحليلها (كما هو موضح في الجدول 3 على سبيل المثال). - تسجيل إعدادات الأداة التالية المستخدمة لإنشاء البيانات التي يجب ذكرها عند الإبلاغ عن النتائج: Diluent، قوة الليزر لكل ليزر [mW]، التعرض [ms]، Gain [dB]، معدل الإطار [fps]، الإطارات لكل فيديو، عدد مقاطع الفيديو المسجلة، إعداد المعالجة (على سبيل المثال، LogBinSilica)، نطاق التكامل [min nm، max nm] (يوصى بتعيين الحد الأدنى إلى 50 نانومتر) وعدد الجسيمات المتعقبة (من المستحسن تحليل ما لا يقل عن ~ 150 جسيما لكل فيديو؛ الحد الأدنى 3,750 المسارات الإجمالية لكل عينة يوصى بتجنب الارتفاعات الملموسة في توزيع حجم الجسيمات وتوليد بيانات ذات دلالة إحصائية).
9. تنظيف cuvettes
- تنظيف cuvettes يدويا بين العينات. أولا، إفراغ ال(كوفيت)
ملاحظة: يمكن استرداد العينة من cuvette وحفظها أو تجاهلها. - مرة واحدة في cuvette فارغة، وتنظيف cuvette عن طريق الشطف 10-15 مرات مع المياه دي المؤينة (DI). ثم، شطف 3 مرات مع الإيثانول (70-100٪). عند القيام بذلك، تأكد من ملء cuvette بالكامل مع المذيبات.
- جفف الجزء الخارجي من الكوفيت بقطعة قماش خالية من الألياف الدقيقة. تجنب اللطخات على الأسطح. الهواء الجاف داخل cuvette أو الجافة باستخدام منفضة الهواء المضغوط.
ملاحظة: يجب استخدام ورق تنظيف العدسة أو قماش الألياف الدقيقة الخالي من الوبر فقط لمسح الأسطح البصرية للكوفيت ، حيث تحتوي معظم المنتجات الورقية على ألياف خشبية صغيرة قد تخدش سطح cuvette أو تلحق به الضرر. - إعداد قنينتين التألق الزجاج: واحدة مليئة 70-100٪ الإيثانول والآخر مع المياه DI. شطف إدراج واثارة القضبان في الإيثانول أولا (ثم DI المياه) عن طريق وضع إدراج / اثارة شريط في قارورة التلألؤ المناسبة ويهز القارورة بقوة. جفف العوارض وحرك القضبان باستخدام أقمشة خالية من الوبر أو منافض الهواء المضغوطة.
ملاحظة: يمكن أيضا تنظيف cuvette وإدراج باستخدام حمام مائي sonicating. للقيام بذلك، تأكد أولا وحدة sonicating يحتوي على ما يكفي من الماء (على الأقل 5 سم عمق). ثم ضع الكوفيت وأدخله داخل كوب زجاجي (50 مل أو أكبر) ، واملأ الكأس بالكحول إلى نفس مستوى حمام الماء ، وضع الكأس في الماء ، والتبديل على الطاقة. Sonicate لمدة أقصاها 5 دقائق في وقت واحد، مما يسمح للجهاز للراحة >5 دقيقة بين كل انفجار 5 دقائق إذا لزم الأمر أوقات أطول. - عند الانتهاء، وضع على الفور جميع المكونات النظيفة والمجففة بعيدا للتخزين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل هذا العرض التوضيحي، تم اختبار معايرة الجهاز لأول مرة لضمان صحة البيانات المكتسبة من خلال قياس توزيع حجم معايير حبة البوليسترين. اختبرنا حجم توزيع 100 نانومتر و 400 نانومتر الخرز باستخدام معلمات التسجيل الافتراضية وإعدادات المعالجة الموصى بها في هذا البروتوكول(الشكل 8).
بالنسبة لمعيار حبة البوليسترين 100 نانومتر، تم قياس تركيز 4.205 ×10 7 جزيئات/مل. وكان متوسط (الانحراف المعياري، SD) حجم 102 (±17) نانومتر مع معامل الاختلاف (CV) من 0.16. وكانت قيم D10/D50/D90 76/104/126 نانومتر. وهذا يشير إلى أن أداة تتبع الجسيمات أبلغت بدقة عن حجم حبات أحادية التشتت 100 نانومتر. بالنسبة لمعيار حبة البوليسترين 400 نانومتر، كان التركيز 4.365 × 107 جزيئات/مل. وكان متوسط (SD) حجم 391 (±47) نانومتر، مع السيرة الذاتية من 0.12. وكانت قيم D10/D50/D90 150/358/456 نانومتر(الجدول 3). في حين أن المتوسط المبلغ عنه قريب جدا من الحجم الحقيقي للخرزات ، يمكننا أن نرى أن إعدادات الجهاز المطبقة في هذا البروتوكول هي أكثر دقة للجسيمات الصغيرة ~ 100 نانومتر. وهكذا، بالنسبة للجسيمات أكبر من 400 نانومتر، ويقترح تحسين المعلمات الليزر. يجب على الباحثين أولا إجراء طريقة مثل المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM) لتقدير توزيع حجم EV الناتج من مصدر معين وطريقة العزل قبل NTA.
تم قياس متوسط تركيز 4.41 × 1010 جزيئات / مل لعينة EV أنسجة الماوس المستخدمة في هذا العرض التوضيحي. تم تسجيل هذه العينة بعد المعلمات الملخصة في الجدول 1 ومعالجتها باتباع المعلمات الموضحة في الجدول 2. ونبين تأثير عوامل التخفيف المختلفة في الشكل 9 ونبلغ عن تركيزات الجسيمات الخام والمعدل في الجدول 4. وكان التخفيف الأمثل للمركبات الكهربائية المشتقة من أنسجة الماوس يتراوح بين 000 1 و 000 3 في حين أنه بالنسبة للمركبات الكهربائية المشتقة من البلازما البشرية كان 000 1، مما يشير إلى أنه عند إجراء أول اختبار لمصدر معين من مصادر الفلوت البيولوجي أو طريقة عزل EV ل NTA، ينبغي اختبار التمييعات التسلسلية بحيث يمكن تحديد التخفيف الأمثل لقياس NTA. نوصي بقياس والإبلاغ عن اثنين على الأقل من التخفيفات المختلفة للعينة. كما قمنا بقياس أربع عينات إضافية في تخفيفات مختلفة على جهازين متميزين لتتبع الجسيمات. يقارن الشكل التكميلي 3 دقة أداة تتبع الجسيمات في قياسات الحجم مقارنة بأداة NTA أخرى متاحة تجاريا. ويبين الجدول التكميلي 1 كذلك دقة قياسات هذا الصك، ويبين أن تركيز الجسيمات تغير بشكل متناسب مع تخفيف العينة، ولكن مقاييس حجم الجسيمات لم تتغير.
بعد المعالجة، يمكن حفظ النتائج (جنبا إلى جنب مع معلومات الأداة / البرنامج، وإعدادات التسجيل والمعالجة، والملاحظات التجريبية) في تقرير .pdf. ويمكن تعديل الرسم البياني الوارد في هذا التقرير كما هو موضح في البروتوكول (القسم 7-4). يتم حفظ النتائج الأولية في ملف .dat يمكن تصديرها. يتم حفظ مقاطع الفيديو المسجلة أيضا ويمكن استخدامها للمعالجة والتحليل خارج الخط في وقت لاحق. ومع ذلك، بمجرد تسجيل مقاطع الفيديو، لا يمكن تغيير إعدادات التسجيل بأثر رجعي.
وقد تجلى تأثير تغيير مختلف قوى الليزر والكسب في إعدادات التسجيل باستخدام المركبات الكهربائية المشتقة من البلازما البشرية. ويظهر هذا في الشكلين 10 و12، وترد المعلومات الكمية المستندة إلى هذه الصور في الجدول 5. زيادة الكسب يزيد من حساسية الكاميرا، مما يسمح التصور من الجسيمات الصغيرة (الشكل 10) مما أدى إلى زيادة تركيز الجسيمات الكلي مع أصغر متوسط حجم الجسيمات (الجدول 5). ومع ذلك ، فإن زيادة الكسب فوق 30 ديسيبل (توصياتنا) يجعل المنظر محببا للغاية ، مما يسمح للضوضاء بحجب قياس الجسيمات الحقيقية. في كسب الكاميرا من 30 ديسيبل، ويصور تأثير تغيير قوة الليزر الأزرق في الشكل 11. تؤدي زيادة طاقة الليزر الأزرق (450 نانومتر، الطول الموجي القصير) إلى دقة أكبر للكشف عن الجسيمات الأصغر (أي تلك التي لها حجم يتفق مع الإكسوسومات). عقد القوى الليزر الأخضر والأحمر ثابت في الإعدادات الافتراضية، وزيادة قوة الليزر الأزرق من 70 كيلوواط إلى 210 كيلوواط تحول متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنها من 122 نانومتر إلى 105 نانومتر وزيادة تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنها من 1.1 × 108 إلى 1.7 × 108 (الجدول 5).
كما أظهر تأثير زيادة قوى الليزر الخضراء والحمراء(الشكل 12). زيادة قوة الليزر الأحمر (650 نانومتر، الطول الموجي الطويل) زيادة متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنها من 175 إلى 246 نانومتر. انخفض تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنها، ولكن ذلك لأن في هذه العينة EV البلازما البشرية لم يكن لدينا العديد من الجسيمات الكبيرة الموجودة، وأكد من قبل TEM السلبية تلطيخ (الشكل التكميلي 4). أدت زيادة طاقة الليزر الخضراء إلى انخفاض في متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنه وزيادة في تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنه. وهكذا، يمكن للمستخدم تحسين قوة الليزر الثلاثة للكشف عن الجسيمات بحساسية من مختلف الأحجام.
تم تحسين هذا البروتوكول لل الحويصلات الصغيرة (على سبيل المثال، <400 نانومتر). يتم تشجيع الباحثين المهتمين في microvesicles من أحجام أكبر (على سبيل المثال، 400-1000 نانومتر) لتحسين المعلمات الليزر باستخدام الخرز organosilica جوفاء التي لها خصائص الإضاءة المتناثرة مماثلة لتلك التي من المركبات الكهربائية مما يجعلها مرجعا أكثر ملاءمة من البوليسترين أو السيليكا معايير حبة30. ومع ذلك قد تكون الجسيمات النانوية السيليكا أفضل بديل عملي حتى تصبح معايير الفوسيليكا متاحة على نطاق أوسع.
هنا، تم استخدام أداة NTA لقياس المركبات الكهربائية المعزولة عن أنسجة الماوس عن طريق الطرد الفائق والبلازما البشرية بنجاح باستخدام مجموعة تجارية. تم توضيح آثار تغيير معلمات NTA وتبين أن المعلمات في هذا البروتوكول محسنة لل الحويصلات الصغيرة. كما تم عرض أهمية خطوة التخفيف وتبين أن أداة تتبع الجسيمات المعروضة هنا يمكن أن تكشف بدقة عن الاختلافات في عوامل التخفيف. تغير التركيز بشكل متناسب مع تخفيفات متعددة ، في حين أن توزيع الحجم لم يتغير. وأظهرت البيانات الناتجة عن ذلك تباينا تقنيا ضئيلا. وبالتالي، فإن تكييف هذا البروتوكول من قبل الباحثين الذين يستخدمون هذا الصك لNTA سيزيد من الدقة والقابلية للاستنساخ في مجال أبحاث EV.
الشكل 8: توزيع حجم الجسيمات من معايير حبة البوليسترين monodisperse. (أ) توزيع حجم الجسيمات من 100 نانومتر البوليسترين حبة القياسية. (ب) توزيع حجم الجسيمات من 400 نانومتر البوليسترين حبة القياسية. يتم الإبلاغ عن القيم في الجدول 3. يعرض Inset مثال عرض البث المباشر للإطار المقاس الأول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9:تركيزات الجسيمات الإجمالية الخام حسب عامل التخفيف للمركبات الكهربائية للأنسجة الدهنية perigonadal الماوس. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم أخذ ثلاثة قياسات لكل تخفيف. يتم الإبلاغ عن القيم في الجدول 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: التأثير البصري لزيادة الكسب. صور تمثيلية للجسيمات التي تقاس بإعدادات الليزر الافتراضية (الأزرق = 70 كيلوواط، الأخضر = 12 كيلوواط، الأحمر = 8 كيلوواط) وكسب تعيين إلى (A) 18 ديسيبل، (ب) 24 ديسيبل - الافتراضي، و (C) 30 ديسيبل - الموصى بها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11:تأثير الليزر الأزرق على الجسيمات الصغيرة عندما يتم تعيين الليزر الأحمر والأخضر إلى الإعدادات الافتراضية. (أ) ليزر أزرق = 70 كيلوواط (افتراضي). (B) ليزر أزرق = 210 كيلوواط (مستحسن). المزيد من الجسيمات الصغيرة مرئية وفي بؤرة التركيز عندما يتم زيادة طاقة الليزر الزرقاء إلى 210 كيلوواط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: التأثير البصري لطاقة الليزر المتغيرة الزرقاء والخضراء والحمراء. تصور طرق عرض الشاشة المباشرة التمثيلية أحجام الجسيمات المختلفة المرئية عبر إعدادات الليزر المختلفة. يتم الإبلاغ عن قيم NTA الناتجة في الجدول 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجسيمات | القطر [نانومتر] | ليزر أزرق [mW] | ليزر أخضر [mW] | ليزر أحمر [mW] | كسب الكاميرا [dB] | تنظيم درجة الحرارة | تجهيز | # فيديو |
| إكسوسومات | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | ممكن، تعيين إلى 22 درجة مئوية | تجاوز الكشف التلقائي المعطل | 50 |
الجدول 1: تسجيل المعلمات الحويصلات خارج الخلية الصغيرة (~ 100 نانومتر).
| وصف العملية | عتبة الكشف | تعطيل تجاوز الكشف التلقائي | قطر الميزة [px] |
| إكسوسومات | عينة متعددة التخصصات | التحقق | 30 |
الجدول 2: معالجة معلمات الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (~ 100 نانومتر).
| حجم البوليسترين القياسية [نانومتر] | نطاق التكامل [نانومتر] | متوسط الحجم [نانومتر] | حجم SD [نانومتر] | السيرة الذاتية للحجم | D10 [نانومتر] | D50 [نانومتر] | D90 [نانومتر] | إجمالي عدد الأصوات |
| 100 | من 50 إلى 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 إلى 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
الجدول 3: نتائج NTA لمعايير حبة البوليسترين أحادية التشتت. وتم تخفيف كلا المعيارين على النحو الأمثل، مع تركيزات خام لمعيار 100 نانومتر و400 نانومتر قياسية من 4.205 × 107 جزيئات/مل و4.365 × 107 جزيئات/مل، على التوالي. D10 هو النقطة في توزيع الحجم حيث يتم تضمين 10٪ من العينة، D50 هي النقطة التي يتم فيها احتواء 50٪ من العينة (متوسط)، وD90 هي النقطة التي يتم فيها احتواء 90٪ من العينة. SD: الانحراف المعياري; السيرة الذاتية: معامل الاختلاف.
| عامل التخفيف | تركيز الجسيمات، الجسيمات/مل | مجموع تركيز الجسيمات، والجسيمات / مل |
| نيء | معدلة لعوامل التخفيف | |
| 1000 | 4.10E +07 | 4.10E +10 |
| 4.00E +07 | 4.00E +10 | |
| 3.70E +07 | 3.70E +10 | |
| المتوسط (SD) | 3.93E + 07 (1.70E + 06) | 3.93E +10 (1.70E +09) |
| 1500 | 3.60E +07 | 5.40E +10 |
| 2.60E +07 | 3.80E +10 | |
| 2.90E +07 | 4.40E +10 | |
| المتوسط (SD) | 3.03E + 07 (4.19E + 06) | 4.55E +10 (6.60E +09) |
| 2000 | 2.40E +07 | 4.80E +10 |
| 2.30E +07 | 4.60E +10 | |
| 2.00E +07 | 4.00E +10 | |
| المتوسط (SD) | 2.23E + 07 (1.70E + 06) | 4.46E +10 (3.40E +09) |
| 3000 | 2.00E +07 | 6.00E +10 |
| 1.30E +07 | 3.90E +10 | |
| 1.40E +07 | 4.20E +10 | |
| المتوسط (SD) | 1.57E + 07 (3.09E + 06) | 4.71E +10 (9.27E +09) |
الجدول 4: نتائج NTA من الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس EVs تثبت استنساخ قياسات NTA. تركيزات الجسيمات الخام NTA (الجسيمات / مل) تقاس على أداة تتبع الجسيمات والتركيز الكلي للجسيمات (الجسيمات / مل) تعديلها لعوامل التخفيف من المركبات الكهربائية المستمدة من الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس في تخفيفات مختلفة.
| كسب [dB] | ليزر أزرق [mW] | ليزر أخضر [mW] | ليزر أحمر [mW] | مجموع التركيز، والجسيمات / مل (الخام) | متوسط الحجم [نانومتر]* | الانحراف المعياري للحجم / السيرة الذاتية | حجم مشروط | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90E +07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E +08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E +08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E +08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E +08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E +07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80E +07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E +07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1.50E +07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E +06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| * متكاملة ضمن نطاق 50-1000 نانومتر | ||||||||
الجدول 5: تظهر نتائج NTA للمركبات الكهربائية المشتقة من البلازما البشرية تأثير تغيير قوة الليزر والكسب على قياسات تركيز الحجم والجسيمات للمركبات الكهربائية البشرية (1:1000 تمييع). D10 هو النقطة في توزيع الحجم حيث يتم تضمين 10٪ من العينة، D50 هي النقطة التي يتم فيها احتواء 50٪ من العينة (متوسط)، وD90 هي النقطة التي يتم فيها احتواء 90٪ من العينة. SD: الانحراف المعياري; السيرة الذاتية: معامل الاختلاف.
الشكل التكميلي 1: لقطة شاشة للوحة تسجيل تصور معلمات التسجيل الموصى بها. الوصول إلى الإعدادات المتقدمة لتغيير زيادة الكاميرا وطاقة الليزر إلى الإعدادات الموصى بها. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: لقطة شاشة للوحة المعالجة التي تصور إعدادات المعالجة الموصى بها. تأكد من التحقق من "تعطيل تجاوز الكشف التلقائي" وتعيين "قطر الميزة" إلى "30". الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: قياسات حجم الجسيمات عبر تخفيفات متعددة: دقة أداة تتبع الجسيمات (ViewSizer 3000) مقابل أداة NTA التجارية القابلة للمقارنة (NanoSight NS300). تم إجراء NTA من المركبات الكهربائية المعزولة من الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس على جهازين. لكل فأر، تم قياس ثلاثة مخففات (1:1000، 1:500، 1:100). القيم الخام للتدابير المتخذة على ViewSizer 3000 (موضحة في هذا البروتوكول) موضحة في الجدول التكميلي 1. يتم عرض إعدادات التقاط وتحليل لتدابير NanoSight NS300 في الجدول التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: المجهر الإلكتروني التمثيلي السلبي للبقعة (TEM) للمركبات الكهربائية المشتقة من البلازما البشرية. تم تصوير الشبكات بمجهر إلكترون ناقل الحركة يعمل بجهد متسارع 100 كيلو فولت. تم التقاط الصور على كاميرا 2K × 2K CCD. يعكس شريط المقياس التكبير في الكاميرا. تظهر الصور المجهرية الإلكترونية الحويصلات المستديرة ~ 25 نانومتر في القطر. 100k التكبير، شريط مقياس 200 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: ViewSizer 3000 حجم الجسيمات وقياسات تركيز الماوس perigonadal الأنسجة الدهنية EVs عبر تخفيفات متعددة. تم إجراء NTA من المركبات الكهربائية المعزولة من الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس. لكل فأر، تم قياس ثلاثة مخففات (1:1000، 1:500، 1:100). D10 هو النقطة في توزيع الحجم حيث يتم تضمين 10٪ من العينة، D50 هي النقطة التي يتم فيها احتواء 50٪ من العينة (متوسط)، وD90 هي النقطة التي يتم فيها احتواء 90٪ من العينة. يتم تصحيح تركيزات الجسيمات في الخلفية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول التكميلي 2: إعدادات التقاط NS300 NanoSight وتحليلها. الإعدادات (باستخدام NTA 3.4 بناء 3.4.003) المستخدمة لقياس عينات EV الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس ذكرت في الشكل التكميلي 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، ونحن نثبت بروتوكول لNTA من المركبات الكهربائية لقياس توزيع حجم مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات في وقت واحد وقياس تركيز EV الكلي في عينة متعددة الأضلاع. في هذه الدراسة، استخدمت الأنسجة الدهنية بيريغودال الماوس والبلازما البشرية كمصدر للمركبات الكهربائية. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام المركبات الكهربائية المعزولة عن الأنسجة الأخرى أو السوائل البيولوجية مثل المصل والبول واللعاب وحليب الثدي والسائل السلوي وخلايا NTA. وقد ضمنت قياسات معايير حبة البوليسترين أن الأداة قد تم معايرتها بشكل صحيح وأظهرت أن أداة NTA هذه يمكنها قياس حجم الجسيمات النانوية بشكل صحيح ≤400 نانومتر. ثم تم اختبار تمييع مختلف من عينة EV أنسجة الماوس. وكما هو مبين في الشكل 9،فإن تركيز الجسيمات المبلغ عنه يتدرج وفقا لذلك مع عامل التخفيف، كما هو متوقع، مما يدل على أن الأداة يمكن أن تكشف بدقة تركيز الجسيمات في مختلف التخفيفات مع تباين ضئيل بين التكرارات التقنية. غير أن ذلك كان عند العمل مع تركيزات الجسيمات داخل نطاق عمل الأداة (5 × 106 إلى 2 × 108 جزيئات لكل مل)؛ إن تخفيف العينة بشكل مناسب هو خطوة حاسمة في البروتوكول. وأسفر التكيف مع عامل التخفيف عن نفس التقدير تقريبا لإجمالي تركيز الجسيمات في العينة، مع السيرة الذاتية البالغة 15.1 في جميع أنحاء التخفيفات الأربعة التي تم اختبارها. كما أظهرت التدابير المختلفة، التي تكررت على تخفيفات متعددة لنفس العينات، الدقة في تقييمات توزيع حجم الجسيمات، حيث تم قياس تركيزات الجسيمات بشكل متناسب مع عامل التخفيف ولكن مقاييس الحجم المبلغ عنها لم تفعل ذلك.
تخضع المركبات الكهربائية المعلقة لحركة حرارية عشوائية تعرف باسم الحركة البراونية ، والتي بموجبها يتناسب انتشار الجسيمات في التعليق السائل عكسيا مع حجمها. تم تصميم هذه الحركة العشوائية من خلال معادلة ستوكس آينشتاين ، حيث القطر الهيدروديناميكي D للجسيمات الكروية هو:
حيث KB هو ثابت بولتزمان و R هو نصف قطر الجسيمات. كما يمكن للمرء أن يرى من المعادلة، وحركة الجسيمات في تعليق يعتمد أيضا على درجة الحرارة (T) واللزوجة الديناميكية (η) من السائل. خلال NTA، يتم تشعيع المركبات الكهربائية مع أشعة الليزر المركزة التي تمر عبر الجسيمات في التعليق ويتم الكشف عنها من خلال إضاءة الحادث القادمة من أشعة الليزر. ويتركز الضوء المتناثر بواسطة كل جسيم على حدة بواسطة المجهر على مستشعر الصورة الخاص بكاميرا جهاز عالي الدقة وحساس للضوء مقترن بالشحن (CCD)، والتي تسجل الصور الرقمية للضوء المتناثر للجسيمات(الشكل 1). يحدد برنامج NTA الحركة البراونية لكل جسيم على حدة ويتتبعها لحساب معامل الانتشار لكل جسيم. يتم استخدام هذا جنبا إلى جنب مع درجة الحرارة و لزوجة السائل الذي يحتوي على الجسيمات لحساب قطر الجسيمات باستخدام معادلة ستوكس آينشتاين. وبالتالي، يمكن لقياس واحد تحديد قطعتين حرجتين من المعلومات: توزيع حجم الجسيمات وإجمالي عدد الجسيمات من المركبات الكهربائية في التعليق.
وقد وصفت مقارنة بين NTA وتقنيات أخرى للكشف عن المركبات الكهربائية وقياسها في مكان آخر31،32. بالمقارنة مع غيرها من الأساليب القائمة على تشتت الضوء مثل تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، تتمتع NTA بقدرات حل أعلى وهي طريقة قوية بشكل خاص لتحليل الجسيمات التي يقل متوسط قطرها عن 100 نانومتر. على عكس تحليلات الجسيمات المفردة مثل TEM ، فإن NTA ليست مضيعة للوقت أو صعبة من الناحية الفنية ويمكن أن تقوم بنمط عينة كاملة بحجم منخفض نسبيا في وقت واحد بطريقة شبه آلية. في حين أن NTA هي تقنية توصيف قوية ، إلا أن لها قيودا. أولا، يخضع NTA لحدود الحساسية بسبب الانخفاض القوي في كثافة تحجيم الضوء المتناثر بقطر الجسيمات، مما يتسبب في اختفاء الضوء المتناثر للجسيمات الصغيرة جدا تحت ضجيج الخلفية33. وبالتالي خفضت NTA الحساسية للمركبات الكهربائية أصغر من ~ 50 نانومتر31 ويؤدي إلى المبالغة في تقدير أحجام EV. هناك حاجة إلى الليزر الطول الموجي القصير للكشف عن جزيئات أصغر من عينة متعددة الأضلاع بسبب إمكاناتها تشتت الضوء. ومع ذلك ، فإن أداة تتبع الجسيمات هذه تقدم تحسنا لهذا القيد المتأصل في تكنولوجيا تتبع الجسيمات النانوية. مجهزة ثلاثة مصادر ضوء متغير (450 نانومتر، 520 نانومتر، 635 نانومتر)، وهذا النظام يسمح لتصور الجسيمات على مدى مجموعة واسعة من الأحجام، مما يجعل هذا الصك أداة قيمة بشكل خاص لتحليلات NTA من عينات متعددة التخصصات مثل مجموعة غير متجانسة من المركبات الكهربائية. ومع ذلك ، لأن معظم الإعدادية EV ستكون متعددة الأضلاع في التكوين وتحتوي على الأرجح على الشوائب ، يجب على الباحثين أن يدركوا أن الحدود المعتمدة على العينات للكشف تؤثر على شكل التوزيع الإجمالي للحجم وبالتالي توخي الحذر عند تفسير النتائج.
وهناك قيد رئيسي آخر على NTA هو أنه يقيس أكثر من مجرد المركبات الكهربائية. ستقوم أداة NTA بالكشف عن جميع الجسيمات التي تتجاوز حد الكشف وقياسها وإحصاءها، بما في ذلك مجاميع البروتين والبروتينات الدهنية والحطام الخلوي والتلوث الناجم عن المعادن. ومع ذلك، يمكن تصحيح تركيز الجسيمات في الخلفية لقياس تركيز الجسيمات من الذوبان قبل تحميل وقياس العينة. نوصي باستخدام ما لا يقل عن 0.02 ميكرومتر PBS المصفاة ووجدت تلوث الجسيمات منخفضة جدا عند استخدام 3 كيلودا PBS تصفيتها. وعلاوة على ذلك، من الممكن توسيع نطاق NTA لقياس وتحليل المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية، والتغلب على قيود القياس غير المحدد. تتوفر مجموعات تجارية تصبغ أغشية الحويصلات السليمة بشكل محدد وفعال فقط ، باستثناء شظايا الأغشية ومجاميع البروتين والجسيمات الأخرى من قياس NTA. وبالتالي، فإن البيانات المستمدة من الفلورسنت NTA تمثل بدقة أكبر تركيز EV الحقيقي وتوزيع الحجم. من خلال وضع علامات انتقائية على مستضدات EV السطحية ، يمكن ل NTA الفلورية أيضا قياس المركبات الكهربائية المحددة المسماة بالأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت ، مما يسمح بحساب وتحجيم الخلايا الفرعية EV الخاصة بالمضاد والمهم بيولوجيا.
لم يكن هناك سوى القليل من العمل على توحيد بروتوكولات NTA ، مما يجعل قابلية مقارنة النتائج صعبة ويعوق إمكانية إعادة الإنتاج عبر العينات والأيام والمشغلين والمختبرات. تتطلب أداة تتبع الجسيمات التي تم توضيحها في هذا البروتوكول القليل من التدريب العملي في الوقت المحدد. كما لاحظنا إعدادات الأجهزة التي ينبغي للمستخدمين الإبلاغ عنها لتسهيل استنساخ البيانات المولدة. وبالتالي، فإن اتباع البروتوكول الأمثل المنصوص عليه هنا ينبغي أن يؤدي إلى توحيد المعايير وتمكين مقارنة النتائج عبر المختبرات. ميزة أخرى لاستخدام هذه الأداة هي أن يتم إعداد العينة في cuvette ، مما يسمح للأداة بالإثارة مرارا وتكرارا بين مقاطع الفيديو ، مما يضمن عينة عشوائية إحصائيا لكل فيديو ويسفر عن نتيجة أكثر قابلية للاستنساخ من أدوات NTA الأخرى المتاحة تجاريا التي تعتمد على مضخات الحقن وخلايا التدفق. كما تسمح أشعة الليزر المتعددة بالكشف عن الجسيمات ذات المؤشرات الانكسارية المختلفة، مما يؤدي إلى نتائج أكثر قوة. ومع ذلك، فإن تشغيل أداة تتبع الجسيمات هذه لا يتطلب معرفة خصائص مواد الجسيمات مثل مؤشر الانكسار، مما يجعل القياسات أكثر قابلية للاستنساخ عبر المشغلين.
وقد تم التعرف على المركبات الكهربائية في ما يقرب من جميع المركبات الحيوية اختبار2،5. ومع ذلك، فإن العزل الفعال لمركبات كهربائية محددة (مثل المركبات الكهربائية الخاصة من نوع الخلية) عن الوسائط المختلفة (مثل الدم وحليب الثدي ووسائط زراعة الخلايا) يمثل تحديا صعبا. وقد وصفت العديد من الطرق المختلفة لعزل EV9. يمكن إجراء NTA لمقارنة غلة المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام أساليب مختلفة وتحديد الاختلافات في الحويصلات التي تنشأ عن طرق العزل المختلفة. وهذا أمر مهم لتفسير النتائج النهائية، حيث أن وظيفة الخلايا الفرعية EV المختلفة لا تزال غير واضحة في الوقت الحالي. قياس تركيز EV بدقة مهم أيضا في الدراسات التي تحقق فيما إذا كان علاج معين أو حالة أو جزيء يؤثر على إطلاق EV. على سبيل المثال، تهتم مجموعتنا بتأثير التعرض البيئي مثل تلوث الهواء بالجسيمات على محتوى EV وإطلاقه. من أجل تقييم ما إذا كانت حالة تؤثر على إطلاق EV ، يجب تحديد عدد الحويصلات بدقة. عند استخدام المركبات الكهربائية كمؤشرات بيولوجية تشخيصية، يمكن أن يؤثر تركيز المركبات الكهربائية في العينة على نتائج الفحص. وبالتالي، فإن طريقة موثوقة لتحديد تركيز الجسيمات وتوزيع الحجم أمر بالغ الأهمية.
وبغض النظر عن ذلك، ينبغي أن تكون قياسات NTA مصحوبة بتقنيات تكميلية أخرى يمكنها قياس الجسيمات بشكل مستقل عن الجسيمات الأخرى في العينة، مثل TEM. كما أن التكنولوجيات الأحدث مثل استشعار النبض المقاوم للميكروفلويدي (MRPS) واعدة أيضا بتحجيم وإحصاء المركبات الكهربائية بغض النظر عن تعدد أضلاع العينة. ويمكن استخدام المزيد من التحليلات البيوكيميائية أو البروتيوميكية لعينات EV بالإضافة إلى بيانات الحجم والتركيز لمجموعات فرعية من المركبات الكهربائية في مجموعات ذات أهمية بيولوجية. وفي الختام، فإن قياس تركيزات الجسيمات الصحيحة والصالحة للاستنساخ وتوزيعات حجم الجسيمات أمر مهم لحقل EV. يحقق ViewSizer 3000 قياسات دقيقة وقابلة للاستنساخ لإجمالي تركيز EV وتوزيع حجم EV ، حتى بالنسبة للعينات متعددة التخصصات للغاية ، كما هو موضح هنا. ونأمل في المستقبل أن نرى المزيد من المقارنات التجريبية الصارمة لهذا الصك مع أدوات NTA الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (ES030973-01A1، R01ES025225، R01DK066525، P30DK026687، P30DK063608). ونحن نعترف جيفري Bodycomb، دكتوراه من هوريبا الصكوك المدمجة لمساعدته في معايرة الصك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
