Summary
We demonstreren hoe we een nieuw nanodeeltjesvolganalyse-instrument kunnen gebruiken om de grootteverdeling en de totale deeltjesconcentratie van extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit perigonadaal vetweefsel van muizen en menselijk plasma te schatten.
Abstract
De fysiologische en pathofysiologische rollen van extracellulaire blaasjes (EV's) zijn steeds meer erkend, waardoor het EV-veld een snel evoluerend onderzoeksgebied is. Er zijn veel verschillende methoden voor EV-isolatie, elk met verschillende voor- en nadelen die van invloed zijn op de stroomafwaartse opbrengst en zuiverheid van EV's. Het karakteriseren van de EV-prep geïsoleerd uit een bepaalde bron door een gekozen methode is dus belangrijk voor de interpretatie van downstream-resultaten en vergelijking van resultaten tussen laboratoria. Er bestaan verschillende methoden voor het bepalen van de grootte en hoeveelheid EV's, die kunnen worden gewijzigd door ziektetoestanden of als reactie op externe omstandigheden. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is een van de prominente technologieën die worden gebruikt voor high-throughput analyse van individuele EV's. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor kwantificering en groottebepaling van EV's geïsoleerd uit perigonadaal vetweefsel van muizen en menselijk plasma met behulp van een baanbrekende technologie voor NTA die grote vooruitgang in het veld vertegenwoordigt. De resultaten tonen aan dat deze methode reproduceerbare en geldige totale deeltjesconcentratie- en grootteverdelingsgegevens kan leveren voor EV's die met verschillende methoden uit verschillende bronnen zijn geïsoleerd, zoals bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie. De aanpassing van dit instrument voor NTA zal tegemoet komen aan de behoefte aan standaardisatie in NTA-methoden om de striktheid en reproduceerbaarheid in EV-onderzoek te vergroten.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn kleine (0,03-2 μm) membraangebonden blaasjes die door bijna alle celtypen worden uitgescheiden1. Ze worden vaak aangeduid als "exosomen", "microvesicles" of "apoptotische lichamen", afhankelijk van hun mechanisme van afgifte en grootte2. Hoewel aanvankelijk werd gedacht dat EV's gewoon een middel waren om afval uit de cel te verwijderen om homeostase te behouden3, weten we nu dat ze ook kunnen deelnemen aan intercellulaire communicatie via overdracht van moleculair materiaal - inclusief DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipiden en eiwitten4,5 - en dat ze belangrijke regulatoren zijn van normale fysiologie en pathologische processen1, 5,6,7,8.
Er zijn veel verschillende methoden om EV's te isoleren en te kwantificeren, die elders zijn beschreven9,10,11,12. Het gebruikte isolatieprotocol en de bron van EV's kunnen een grote invloed hebben op de ev-opbrengst en -zuiverheid. Zelfs differentiële centrifugatie, lang beschouwd als de "gouden standaard" -benadering voor exosoomisolatie, kan onderhevig zijn aan aanzienlijke variabiliteit die vervolgens van invloed is op de verkregen EV-populatie en downstream-analyses13. De verschillende methoden voor EV-isolatie en kwantificering maken het dus moeilijk om resultaten van experimenten die in de literatuur zijn gerapporteerd, te vergelijken, reproduceren en interpreteren14. Bovendien kan de afgifte van EV's worden geregeld door cellulaire omstandigheden of verschillende externe factoren. Er is gesuggereerd dat EV's een rol spelen bij het handhaven van cellulaire homeostase door cellen te beschermen tegen intracellulaire stress15, omdat verschillende studies hebben aangetoond dat cellulaire stress EV-secretie stimuleert. Er is bijvoorbeeld een verhoogde EV-afgifte gemeld na cellulaire blootstelling aan hypoxie, endoplasmatische reticulumstress, oxidatieve stress, mechanische stress, sigarettenrookextract en fijnstofluchtverontreiniging16,17,18,19,20,21,22. Ev-release is ook in vivo aangepast; muizen die werden onderworpen aan een vetrijk dieet of zestien uur vasten, lieten meer adipocyten-EV's los23. Om te onderzoeken of een specifieke behandeling of aandoening de EV-afgifte verandert, moet het aantal EV's nauwkeurig worden bepaald. Beoordeling van de EV-grootteverdeling kan ook wijzen op de overheersende subcellulaire oorsprong van EV's (bv. fusie van late endosomen/multivesiculaire lichamen met het plasmamembraan versus ontluiking van het plasmamembraan)24. Er is dus behoefte aan robuuste methoden om de totale concentratie en de grootteverdeling van de ev-prep die wordt bestudeerd nauwkeurig te meten.
Een snelle en zeer gevoelige methode voor de visualisatie en karakterisering van EV's in oplossing is nanoparticle tracking analysis (NTA). Een gedetailleerde uitleg van de principes van deze methode en vergelijking met alternatieve methoden voor de beoordeling van ev-grootte en -concentratie zijn eerder beschreven25,26,27,28. Kortom, tijdens NTA-metingen worden EV's gevisualiseerd door het licht dat wordt verstrooid wanneer ze worden bestraald met een laserstraal. Het verstrooide licht wordt door een microscoop gericht op een camera die de deeltjesbeweging registreert. De NTA-software volgt de willekeurige thermische beweging van elk deeltje, bekend als Brownse beweging, om de diffusiecoëfficiënt te bepalen die wordt gebruikt om de grootte van elk deeltje te berekenen met behulp van de Stokes-Einstein-vergelijking. NTA werd voor het eerst toegepast op het meten van EV's in een biologisch monster in 201125. Tot voor kort waren er slechts twee reguliere bedrijven die commerciële NTA-instrumentenaanboden 29 tot de introductie van de ViewSizer 3000 (hierna het deeltjesvolginstrument genoemd) die een combinatie van nieuwe hardware- en softwareoplossingen gebruikt om aanzienlijke beperkingen van andere NTA-technieken te overwinnen.
Het deeltjesvolginstrument karakteriseert nanodeeltjes in vloeibare monsters door hun Brownse beweging te analyseren en karakteriseert grotere microngrote deeltjes door zwaartekrachtbezinking te analyseren. Het unieke optische systeem van dit instrument, dat multispectrale verlichting omvat met drie laserlichtbronnen (bij 450 nm, 520 nm en 635 nm), stelt onderzoekers in staat om een breed scala aan deeltjesgroottes (bijv. Exosomen, microvesicles) tegelijkertijd te analyseren. Een schema van de instrumentopstelling is weergegeven in figuur 1.
Hier laten we zien hoe deeltjesgrootteverdeling en concentratiemetingen van geïsoleerde muizen en menselijke EV's kunnen worden uitgevoerd met behulp van een nieuw NTA-instrument.
Figuur 1: Deeltjesvolginstrument optisch systeem. Het NTA-instrument verlicht deeltjes met behulp van drie lasers met de volgende golflengten: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Video-opname van het verstrooide licht van individuele deeltjes wordt gedetecteerd en gevolgd door een digitale videocamera die 90° van de cuvette is georiënteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het werk met deze monsters werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee en de Institutional Review Board. Een schematisch overzicht van de NTA-methode is weergegeven in figuur 2.
Figuur 2: Overzicht van de NTA-methode met behulp van het deeltjesvolginstrument. Het monster wordt voorbereid en in het instrument ingebracht. De NTA-software wordt geopend, opnameparameters worden aangepast en het monster wordt gefocust. Vervolgens worden de gegevens geregistreerd, verwerkt en weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Extracellulaire blaasjesisolatie
OPMERKING: Muis perigonadaal vetweefsel EV's werden geïsoleerd zoals eerder beschreven23. Plasma-EV's werden geïsoleerd uit 1 ml menselijk plasma met behulp van het volgende protocol:
- Verzamel het plasma en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 15 minuten om cellulair vuil te verwijderen. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis.
OPMERKING: Als er nog meer vuil detecteerbaar blijft, centrifugeer het supernatant dan nog eens 10 minuten bij 12.000 x g en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. - Voeg 67 μL van het exosoomisololatie-reagens toe per 250 μL plasma. Meng goed door de buis om te draaien of te vegen.
- Incubeer op ijs rechtop gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer het exosoomisolatiemiddel/plasmamengsel gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 3.000 x g.
OPMERKING: Centrifugeren kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of 4 °C met vergelijkbare resultaten, maar 4 °C heeft de voorkeur. Na centrifugeren kunnen de EV's verschijnen als een beige of witte pellet aan de onderkant van de buis. - Aspirateer voorzichtig het supernatant af. Draai elke resterende exosoomisolatieoplossing af en verwijder alle sporen van vloeistof door aspiratie, waarbij u er goed op moet zorgen dat de neergeslagen EV's in de pellet niet worden verstoord.
- Resuspend de pellet in 200 μL buffer B (geleverd door de fabrikant). Meet en registreer de eiwitconcentratie van het monster (voor stap 2.8) met behulp van een spectrofotometer, fluorometer, Bradford-test of een andere voorkeursmethode.
2. Zuivering van geïsoleerde EV's
- Voeg 200 μL buffer A (geleverd door de fabrikant) toe aan opnieuw hangende EV's.
- Haal de zuiveringskolom eruit (meegeleverd), maak de schroefdop los en klik de onderste sluiting eraf. Plaats de kolom in een verzamelbuis.
OPMERKING: Sla de onderste sluiting op voor stap 2.7-2.9. - Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 30 s om de opslagbuffer te verwijderen.
- Gooi de doorstroming weg en plaats de kolom terug in de opvangbuis.
- Om de kolom te wassen, verwijdert u de dop en breng u 500 μL buffer B aan op de hars en centrifugeer u gedurende 30 s bij 1.000 x g. Gooi de doorstroming weg. Sla de dop voor stappen 2.7-2.9 op.
- Herhaal stap 2.4-2.5 nog één keer om de kolom te wassen.
- Sluit de onderkant van de kolom aan met de onderste sluiting (vanaf stap 2.2). Breng 100 μL buffer B aan op de hars om deze voor te bereiden op het laden van het monster.
- Voeg de volledige inhoud van stap 1.6 (of tot volume-equivalent van 4 mg totaal eiwit) toe aan de hars. Plaats de schroefdop aan de bovenkant van de kolom.
- Meng bij kamertemperatuur op een roterende shaker gedurende niet langer dan 5 minuten.
3. Monsterelutie
- Maak de schroefdop los en verwijder de bodemsluiting en breng onmiddellijk over op een microcentrifugebuis van 2 ml.
OPMERKING: Het monster begint te elueren zodra de onderste sluiting is verwijderd. Zorg ervoor dat 2 ml microcentrifugebuizen klaar zijn om eluaat te ontvangen om monsterverlies te minimaliseren. - Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 30 s om gezuiverde EV's te verkrijgen. Gooi de kolom weg.
4. Monstervoorbereiding voor analyse van het volgen van nanodeeltjes
- Gebruik een pluisvrij materiaal zoals een microvezeldoek om de werkruimte te bedekken en te voorkomen dat vezels cuvetten binnendringen.
- Draag handschoenen, plaats de cuvette op de magnetische cuvette mal en plaats vervolgens de roerstaaf in de cuvette. Behandel de cuvettes altijd met handschoenen om te voorkomen dat vingerafdrukken en vlekken op het oppervlak van de cuvette verschijnen.
- Gebruik het haakgereedschap om het inzetstuk in de cuvette te plaatsen zoals afgebeeld in figuur 3. Het is belangrijk om de oriëntatie van de insert voor later te noteren (stap 5.4).
Figuur 3: Juiste oriëntatie van het inzetstuk in het kwartscuvet. De "inkeping" van het inzetstuk moet zichtbaar zijn vanaf de voorkant van de cuvette. Dit moet in het instrument tegenover de camera worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voeg met behulp van een pipet langzaam 400-500 μL van het verdunningsmiddel of verdund monster bij kamertemperatuur toe aan het cuvet door het gat in de insert. Pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen. Vermijd het introduceren van luchtbellen.
- Bereid eerst een cuvette geladen met het gekozen verdunningswaterstof (blanco) om de deeltjesconcentratie van het verdunningswaterstof te meten. Dit moet worden gedaan voordat het monster wordt gemeten, zodat de achtergrondconcentratie van het monster kan worden gecorrigeerd.
OPMERKING: Een goede blanco (fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] in dit geval) heeft een concentratie <9 x 106 (afhankelijk van het verdunningswaterstof) en geeft 1-10 deeltjes per scherm weer in de live view(figuur 4). Aanbevolen wordt dat de werkelijke deeltjesconcentratie in het monster ten minste 3 maal de achtergrondconcentratie bedraagt. - Optioneel, voordat het monster wordt opgenomen, primeert u de cuvette met 400-500 μL van het verdunningsmiddel of verdund monster vóór de meting. Om dit te doen, laadt u 400-500 μL van het verdunde monster in de cuvette, gooit u de oplossing weg en voegt u vervolgens 400-500 μL meer van het monster toe voor de meting. Dit kan helpen bij het uitwassen van resten in de cuvette.
- Bereid eerst een cuvette geladen met het gekozen verdunningswaterstof (blanco) om de deeltjesconcentratie van het verdunningswaterstof te meten. Dit moet worden gedaan voordat het monster wordt gemeten, zodat de achtergrondconcentratie van het monster kan worden gecorrigeerd.
Figuur 4: Representatieve livestreamweergave van een verdunningswateringswater binnen het juiste concentratiebereik van een blanco. Verdun EV-preps in gefilterde (0,02 μm of 3 kDa, bij voorkeur) PBS. Een goede blanco geeft ~ 1-10 deeltjes per scherm weer in de liveweergave, wat een concentratie oplevert binnen het bereik van 105-106. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Dop de cuvette en controleer op bubbels. Tik indien nodig bubbels uit. Gebruik een pluisvrije doek om de buitenkant van de cuvette af te vegen.
5. Opstartprocedure van het deeltjesvolginstrument
- Schakel het werkstation en instrument van de computer in, wacht een paar minuten voordat u het eerste voorbeeld uitvoert en start het programma door op het softwarepictogram te klikken. Wanneer u hierom wordt gevraagd, klikt u op NTA op het scherm om nanodeeltjestraceringsanalyse uit te voeren. Begin op het tabblad Opname en klik op de verschillende softwaretabbladen(Opnemen, Proces, Plot)om er doorheen het protocol tussen te schakelen. Neem eerst het monster (verdunningsmiddel of EV-voorbereiding) op, verwerk vervolgens de opnames en plot ten slotte de resultaten.
- Volg de instructies op het scherm om alle benodigde informatie over het monster in te vullen. Controleer of alle benodigde velden zijn ingevuld en nauwkeurig zijn, d.w.z. monsternaam, beschrijving, monstervoorbereiding, verdunningsfactor [1000], doeltemperatuur (ingesteld op 22 °C) en verdunningsmiddel: selecteer verdunningsmiddel in het vervolgkeuzemenu en gebruik PBS als verdunningsmiddel voor EV's. Als u PBS selecteert in het vervolgkeuzemenu, wordt het zoutgehalte automatisch ingevuld tot 9%. Deze informatie is nodig om de dynamische viscositeit van de vloeistof te bepalen.
OPMERKING: Het kan tot 3 minuten duren voordat de temperatuur in de cuvette in evenwicht is, zelfs als de sonde al de gewenste temperatuur aangeeft (d.w.z. groene stip wordt stabiel). Monsteruitleeningen kunnen aanzienlijk variëren als de doeltemperatuur niet is ingesteld, omdat verschillen in monstertemperatuur de Brownse beweging van deeltjes sterk kunnen veranderen. - Open het deksel van het instrument en verwijder de beschermkap waar de cuvette zal worden geplaatst.
LET OP: Het deeltjesvolginstrument is gecertificeerd als een klasse 1 laserproduct (21 CFR Ch. I deel 1040), met lasers die gevaarlijk kunnen zijn en ernstig letsel kunnen veroorzaken, zoals brandwonden en/of blijvende schade aan het gezichtsvermogen. Om een ongeval of letsel te voorkomen, mag u het instrumentdeksel niet verwijderen door de bouten van de zijkant los te schroeven. Merk op dat tijdens het gebruik de laserstralen volledig zijn ingesloten, waardoor ze geen bedreiging vormen voor gebruikers. Ook is een magnetisch veiligheidsslot ingebouwd in de monsterhouder van het instrument om te voorkomen dat de lasers werken wanneer de dop van de monsterhouder wordt verwijderd. - Plaats de cuvette (uit stap 4.3) in het instrument in de juiste richting (zie figuur 5). Plaats de dop over de cuvette en sluit het deksel van het instrument. Bedien het instrument altijd met de dop op zijn plaats boven de monsterhouder. Schakel de veiligheidsvergrendelingsfunctie niet uit of probeer deze niet te omzeilen.
Figuur 5: Juiste oriëntatie van cuvette binnen deeltjesvolginstrument. De voorkant van de cuvette (met de "inkeping" van de insert zichtbaar) moet naar de camera gericht zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Schakel de camera in door op de pijl boven Streamingte klikken.
- Klik op de punthaakpijl om de recordinstellingen uit te vouwen. Stel Gain en Laser power in op waarden die geschikt zijn voor de toepassing. Zie tabel 1 (en aanvullende figuur 1)voor parameters die worden gebruikt voor NTA van kleine (100 nm) EV's.
OPMERKING: Deze geavanceerde instellingen die toegankelijk zijn door op de punthaakpijl te klikken, zijn mogelijk beveiligd met een wachtwoord. Gebruik dezelfde instellingen voor het opnemen en verwerken van het verdunningswater (blanco) als die welke worden gebruikt voor de volgende monsters. - Pas de focus aan totdat de deeltjes goed zijn scherpgesteld. De focus moet worden gedaan op relatief kleine deeltjes(figuur 6). Voor kleine EV-kwantificering (in overeenstemming met exosomen) worden de volgende opname-instellingen aanbevolen: Framesnelheid: 30 fps, Belichting: 15 ms, Roertijd: 5 s, Wachttijd: 3 s, Laservermogen - Blauw: 210 mW, Groen: 12 mW, Rood: 8 mW, Frames per video: 300 frames en Gain: 30 dB.
OPMERKING: De gebruiker kan de zoom verhogen tot 1x en / of de gain verhogen om te helpen bij het scherpstellen. Vergeet niet om deze parameters opnieuw in te stellen op aanbevolen waarden voordat u video's opneemt.
Figuur 6: Representatieve livestreamweergaven met deeltjesfocus. (A) Een voorbeeld van een livestreamweergave van deeltjes die niet scherp zijn. Deeltjes hebben een gloedachtige halo of zien er wazig uit. Pas de focus aan. (B) Een voorbeeld van een livestreamweergave van deeltjes in de juiste focus. De kleinste deeltjes zijn scherp. Begin met opnemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voer een visuele kwaliteitscontrole uit om ervoor te zorgen dat het monster op de juiste manier is verdund. Als het monster te geconcentreerd is, verwijdert u het cuvette uit het instrument en verdunt u het monster achtereenvolgens. Herhaal dit totdat het monster goed is verdund voordat u doorgaat naar stap 6.
OPMERKING: Verdun het monster niet te veel! Maak verdunningen altijd achter elkaar. De ideale blanco geeft slechts een paar deeltjes op het scherm weer (1-4) zoals weergegeven in figuur 4. Wat EV-monsters betreft, zal een correct verdund monster ongeveer 20-100 deeltjes zichtbaar hebben op het scherm, zonder gloedachtige of troebele beelden op de achtergrond (zie figuur 7 als voorbeeld). Dit moet resulteren in een optimale deeltjesconcentratie in het bereik van 5 x 106 tot 2 x 108 deeltjes per ml (niet gecorrigeerd voor verdunningsfactor).
Figuur 7: Representatieve livestreamweergaven met verschillende deeltjesverdunningen. (A) Een voorbeeld van een livestreamweergave van een monster dat te geconcentreerd is. Het opnemen van een monster dat te geconcentreerd is, levert onnauwkeurige resultaten op. (B) Een voorbeeld van een livestreamweergave van een correct verdund monster. Er zijn 60-100 deeltjes zichtbaar op het scherm en opname resulteert in een ruwe concentratie van 5 x 106- 2 x 108 deeltjes/ml. (C) Een voorbeeld van een livestreamweergave van een monster dat te verdund is. Als een monster zo verdund is, zullen er niet genoeg deeltjes worden gevolgd, waardoor de steekproefomvang wordt verlaagd en daarom zullen de resultaten statistisch ongeldig zijn. In dit geval wordt aanbevolen het aantal opgenomen video's te verhogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Acquisitie van videogegevens
- (Optioneel) Stel de zoominstelling in op 0,5x om bandbreedte te besparen en verloren frames te voorkomen.
- Begin met het opnemen van de video's door op Opnemen te klikken (zie tabel 1 voor aanbevolen opnameparameters).
OPMERKING: Standaard roert het instrument het monster gedurende 5 s, wacht het op 3 s en neemt het vervolgens op gedurende 10 s voordat dit proces wordt herhaald. Typische meettijd voor 50 video's is ~ 15 minuten om op te nemen en ~ 13 minuten om te verwerken. - Raak het instrument niet aan tijdens het opnemen van video's. Zorg ervoor dat het oppervlak van de laboratoriumbank niet trilt.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur dat het instrument op een antitrillingsplatform of -tafel wordt geplaatst om eventuele trillingsstoornissen van nabijgelegen apparatuur te verminderen die de bepaling van de beweging van nanodeeltjes verstoren. Vermijd het gebruik van centrifuges, vortexmixers of andere potentiële trillingsgenererende apparaten op dezelfde bank als het deeltjesvolginstrument. Trillingen zijn op het scherm goed zichtbaar als verlenging van meestal ronde deeltjes. Bij blootstelling aan krachtige trillingen kan het instrument een nieuwe uitlijning van optische elementen vereisen. Het instrument is niet ontworpen om door de klant te worden onderhouden of gekalibreerd; neem contact op met de fabrikant voor onderhoud, service en kalibratie. - Let op elke opgenomen video met zeer grote deeltjes die zichtbaar zijn als grote, onregelmatige witte klodders. Verwijder deze video's van verwerking in Stap 7.3.
7. Verkregen gegevens verwerken
- Wanneer er een prompt verschijnt waarin staat dat video's zijn opgenomen, klikt u op OK om de opname te voltooien. Selecteer vervolgens het tabblad Proces.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gestopt. De verwerking van verkregen gegevens kan later opnieuw worden gestart door direct naar het tabblad Proces te gaan nadat de software van het deeltjesvolginstrument is geopend en de map is opgegeven waar de opgenomen video's zijn opgeslagen. - Schakel bij het analyseren van EV's het selectievakje Automatische detectie overschrijven uitschakelen in en stel de functiediameter in op 30. Klik op Verwerken. (Zie tabel 2 voor verwerkingsinstellingen en aanvullende figuur 2 voor verwerkingsweergave). Er wordt een live distributiegrafiek weergegeven, zodat de gebruiker de verwerking in realtime kan bekijken.
- Voor exosomen, proces met detectiedrempel ingesteld op het standaard Polydisperse Sample. Verwerk de gegevens met de detectiedrempelhandleiding ingesteld op 0,8 in plaats van een standaarddrempel van 0,99 alleen voor oplossingen met zeer grote verschillen in deeltjesgroottes.
- Als video's merkbaar zeer grote deeltjes zichtbaar hadden (zie stap 6.4), navigeert u naar de map met opgenomen video's en verwijdert u de problematische video. Nadat u de lijst met videobestanden hebt bewerkt, wijzigt u het aantal opgenomen video's in andere door de gebruiker bijgehouden logboeken.
- Nadat de verwerking is voltooid, klikt u op OK. Selecteer vervolgens het tabblad Plot. Voor EV's geeft u de hoofdgrafiek weer als LogBinSilica.
OPMERKING: Hier op het tabblad Plot kan de gebruiker andere functies van de grafiek aanpassen, zoals het definiëren van het bereik van de x-as (deeltjesdiameter, nm) om het gebied voor integratie voor de geproduceerde figuur in te stellen.
8. Resultaten weergeven en interpreteren
- Als u een PDF-rapport wilt maken, klikt u op de knop Rapporteren. De meting is nu voltooid en de resultaten kunnen worden bekeken.
OPMERKING: Vergeet niet om eerst de blanco op te nemen en te verwerken, zodat de achtergrondconcentratie van volgende monsters kan worden gecorrigeerd. Als deze stap wordt vergeten, kan de blanco na monsters worden geregistreerd en kan de deeltjesconcentratie van het monster handmatig worden gecorrigeerd. - Bekijk het PDF-rapport dat de gemiddelde, mediaan en modusgrootte weergeeft, evenals de concentratie die is gecorrigeerd voor de verdunningsfactor en gecorrigeerd door de deeltjesconcentratie van het verdunningsmiddel af te trekken. De verdelingsbreedte (standaarddeviatie) wordt ook weergegeven.
OPMERKING: Er zijn maar weinig toepassingen waar een enkele waarde geschikt en representatief is. Daarom wordt aanbevolen om de volledige grootteverdeling te beschrijven en de breedte van de verdeling voor elk geanalyseerd monster te rapporteren (zoals bijvoorbeeld in tabel 3). - Noteer de volgende instrumentinstellingen die worden gebruikt om de gegevens te genereren die moeten worden vermeld bij het rapporteren van resultaten: Verdunningsmiddel, laservermogen van elke laser [mW], Exposure [ms], Gain [dB], Framesnelheid [fps], Frames per video, Aantal opgenomen video's, Verwerkingsinstelling (bijv. LogBinSilica), Integratiebereik [min nm, max nm] (aanbevolen om min in te stellen op 50 nm) en Aantal gevolgde deeltjes (wenselijk om ten minste ~ 150 deeltjes per video te analyseren; minimaal 3.750 totale tracks per monster aanbevolen om artefactuele pieken in de deeltjesgrootteverdeling te voorkomen en statistisch significante gegevens te genereren).
9. De cuvetten schoonmaken
- Reinig cuvetten handmatig tussen de monsters. Leeg eerst de cuvette.
OPMERKING: Het monster kan uit de cuvette worden teruggewonnen en opgeslagen of weggegooid. - Zodra de cuvette leeg is, reinigt u de cuvette door deze 10-15 keer af te spoelen met gedeïoniseerd (DI) water. Spoel vervolgens 3 keer met ethanol (70-100%). Zorg er bij dit voor dat u de cuvette volledig vult met oplosmiddel.
- Droog de buitenkant van de cuvette met een pluisvrije microvezeldoek. Vermijd vlekken op de oppervlakken. Droog de binnenkant van de cuvette aan de lucht of droog met behulp van een perslucht duster.
OPMERKING: Alleen lensreinigingspapier of pluisvrije microvezeldoek mag worden gebruikt om de optische oppervlakken van de cuvette af te vegen, omdat de meeste papierproducten kleine houtvezels bevatten die het oppervlak van de cuvette kunnen krassen of beschadigen. - Bereid twee glazen injectieflacons met verbrandingsoven voor: een gevuld met 70-100% ethanol en de andere met DI-water. Spoel de inzetstukken en roerstaafjes eerst in de ethanol (dan DI-water) door de insert/roerstaaf in de juiste injectieflacon met sprankelen te plaatsen en de injectieflacon krachtig te schudden. Droog de inzetstukken en roerstaafjes met pluisvrije doeken of persluchtstofzuigers.
OPMERKING: De cuvette en insert kunnen ook worden gereinigd met behulp van een ultrasoon waterbad. Om dit te doen, moet u er eerst voor zorgen dat de sonicatie-eenheid voldoende water bevat (ten minste 5 cm diepte). Plaats vervolgens de cuvette en steek in een glazen bekerglas (50 ml of groter), vul het bekerglas met alcohol tot hetzelfde niveau als het waterbad, plaats het bekerglas in het water en schakel de stroom in. Soniceer gedurende maximaal 5 minuten per keer, zodat de machine >5 minuten kan rusten tussen elke burst van 5 minuten als er langere tijden nodig zijn. - Als u klaar bent, plaatst u onmiddellijk alle gereinigde en gedroogde componenten weg voor opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vóór deze demonstratie werd de kalibratie van het instrument eerst getest om de geldigheid van de verkregen gegevens te garanderen door de grootteverdeling van polystyreenkraalstandaarden te meten. We hebben de grootteverdeling van 100 nm en 400 nm kralen getest met behulp van de standaard opnameparameters en de verwerkingsinstellingen die in dit protocol worden aanbevolen(Figuur 8).
Voor de polystyreenparelnorm van 100 nm werd een concentratie van 4,205 x10 7 deeltjes/ml gemeten. De gemiddelde grootte (standaarddeviatie, SD) was 102 (±17) nm met een variatiecoëfficiënt (CV) van 0,16. De D10/D50/D90 waarden waren 76/104/126 nm. Dit geeft aan dat het deeltjesvolginstrument nauwkeurig de grootte van de 100 nm monodisperse kralen rapporteerde. Voor de polystyreenparelstandaard van 400 nm was de concentratie 4,365 x 107 deeltjes/ml. De gemiddelde (SD) grootte was 391 (±47) nm, met een CV van 0,12. De D10/D50/D90 waarden waren 150/358/456 nm(tabel 3). Hoewel het gerapporteerde gemiddelde zeer dicht bij de ware grootte van de kralen ligt, kunnen we zien dat de instrumentinstellingen die in dit protocol worden toegepast nauwkeuriger zijn voor de kleinere deeltjes ~ 100 nm. Voor deeltjes groter dan 400 nm wordt dus voorgesteld om de laserparameters te optimaliseren. Onderzoekers moeten eerst een methode uitvoeren zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voor een schatting van de resulterende EV-grootteverdeling van een bepaalde bron en isolatiemethode voorafgaand aan NTA.
Een gemiddelde concentratie van 4,41 x 1010 deeltjes/ml werd gemeten voor het EV-monster van muizenweefsel dat voor deze demonstratie werd gebruikt. Dit monster werd geregistreerd volgens de in tabel 1 samengevatte parameters en verwerkt volgens de in tabel 2 beschrevenparameters. We tonen de impact van verschillende verdunningsfactoren in figuur 9 en rapporteren de ruwe en gecorrigeerde deeltjesconcentraties in tabel 4. De optimale verdunning voor de van muisweefsel afgeleide EV's lag tussen 1.000 en 3.000, terwijl dit voor van menselijk plasma afgeleide EV's 1.000 was, wat aangeeft dat bij het voor het eerst testen van een bepaalde biofluïde bron of EV-isolatiemethode voor NTA, seriële verdunningen moeten worden getest, zodat de optimale verdunning voor NTA-meting kan worden geïdentificeerd. We raden aan om ten minste twee verschillende verdunningen van een monster te meten en te rapporteren. We hebben ook vier extra monsters gemeten bij verschillende verdunningen op twee verschillende deeltjesvolginstrumenten. Aanvullende figuur 3 vergelijkt de precisie van het deeltjesvolginstrument in groottemetingen in vergelijking met een ander in de handel verkrijgbaar NTA-instrument. Aanvullende tabel 1 toont verder de precisie van de metingen van dit instrument, waaruit blijkt dat de deeltjesconcentratie proportioneel veranderde met de monsterverdunning, maar dat de deeltjesgroottemetingen dat niet deden.
Na verwerking kunnen de resultaten (samen met de instrument-/software-informatie, opname- en verwerkingsinstellingen en experimentele notities) worden opgeslagen in een .pdf rapport. Het histogram in dit rapport kan worden gewijzigd zoals beschreven in het protocol (paragraaf 7.4). De onbewerkte resultaten worden opgeslagen in een .dat bestand dat kan worden geëxporteerd. De opgenomen video's worden ook opgeslagen en kunnen worden gebruikt voor latere off-line verwerking en analyse. Zodra video's zijn opgenomen, kunnen de opname-instellingen echter niet met terugwerkende kracht worden gewijzigd.
De impact van het veranderen van de verschillende laserkrachten en versterking in de opname-instellingen werd aangetoond met behulp van van menselijk plasma afgeleide EV's. Dit wordt gevisualiseerd in figuur 10-12 en de kwantitatieve informatie op basis van deze beelden is weergegeven in tabel 5. Het verhogen van de versterking verhoogt de gevoeligheid van de camera, waardoor visualisatie van kleinere deeltjes mogelijk is(figuur 10),wat resulteert in een toenemende totale deeltjesconcentratie met een kleinere gemiddelde deeltjesgrootte(tabel 5). Het verhogen van de versterking boven 30 dB (onze aanbevelingen) maakt het zicht echter te korrelig, waardoor ruis de meting van echte deeltjes kan verdoezelen. Bij een camerawinst van 30 dB is het effect van het veranderen van het blauwe laservermogen weergegeven in figuur 11. Het verhogen van het blauwe laservermogen (450 nm, korte golflengte) resulteert in een grotere resolutie om kleinere deeltjes te detecteren (d.w.z. deeltjes met een grootte die consistent is met exosomen). Door de groene en rode laservermogens constant te houden op de standaardinstellingen, werd het blauwe laservermogen verhoogd van 70 mW naar 210 mW, de gerapporteerde gemiddelde deeltjesgrootte verschoven van 122 nm naar 105 nm en verhoogde de gerapporteerde totale deeltjesconcentratie van 1,1 x10 8 naar 1,7 x 108 (tabel 5).
Het effect van het verhogen van de groene en rode laserkrachten werd ook aangetoond(figuur 12). Het verhogen van het vermogen van de rode laser (650 nm, lange golflengte) verhoogde de gerapporteerde gemiddelde deeltjesgrootte van 175 naar 246 nm. De gerapporteerde totale deeltjesconcentratie daalde, maar dat komt omdat we in dit menselijke plasma EV-monster niet veel grote deeltjes aanwezig hadden, bevestigd door TEM negatieve kleuring (aanvullende figuur 4). Het verhogen van het groene laservermogen resulteerde in een afname van de gerapporteerde gemiddelde deeltjesgrootte en een toename van de gerapporteerde totale deeltjesconcentratie. Zo kan de gebruiker het vermogen van de drie lasers optimaliseren om deeltjes van verschillende groottes gevoelig te detecteren.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor kleinere blaasjes (bijv. <400 nm). Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in microvesicles van grotere afmetingen (bijv. 400-1000 nm) worden aangemoedigd om de laserparameters te optimaliseren met behulp van holle organosilica-kralen die lichtverstrooiende eigenschappen hebben die vergelijkbaar zijn met die van EV's, waardoor ze een geschiktere referentie zijn dan polystyreen- of silicakraalstandaarden30. Toch kunnen silica nanodeeltjes de beste praktische vervanger zijn totdat organosilica-normen op grotere schaal beschikbaar zijn.
Hier werd een NTA-instrument gebruikt om ev's die uit muizenweefsel zijn geïsoleerd door ultracentrifugatie en menselijk plasma met behulp van een commerciële kit met succes te kwantificeren. De effecten van het wijzigen van de NTA-parameters werden geïllustreerd en laten zien dat de parameters in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor kleine blaasjes. Het belang van de verdunningsstap werd ook weergegeven en toont aan dat het hier gedemonstreerde deeltjesvolginstrument nauwkeurig variaties in verdunningsfactoren kan detecteren. De concentratie veranderde proportioneel met meerdere verdunningen, terwijl de grootteverdeling dat niet deed. De resulterende gegevens toonden weinig technische variabiliteit. Aanpassing van dit protocol door onderzoekers die dit instrument voor NTA gebruiken, zal dus de striktheid en reproduceerbaarheid op het gebied van EV-onderzoek vergroten.
Figuur 8: Deeltjesgrootteverdelingen van monodisperse polystyreenkraalstandaarden. (A) Deeltjesgrootteverdeling van 100 nm polystyreenparelstandaard. (B) Deeltjesgrootteverdeling van 400 nm polystyreenkraalstandaard. De waarden zijn vermeld in tabel 3. Inzet toont een voorbeeld van een livestreamweergave van het eerste gemeten frame. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Ruwe totale deeltjesconcentraties per verdunningsfactor voor perigonadale adipose weefsel-EV's bij muizen. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Voor elke verdunning werden drie metingen verricht. De waarden zijn vermeld in tabel 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Visuele impact van toenemende winst. Representatieve beelden van deeltjes gemeten met standaard laserinstellingen (Blauw = 70 mW, Groen = 12 mW, Rood = 8 mW) en versterking ingesteld op (A) 18 dB, (B) 24 dB - standaard en (C) 30 dB - aanbevolen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Effect van blauwe laser op kleine deeltjes wanneer rode en groene lasers zijn ingesteld op standaardinstellingen. (A) Blauwe laser = 70 mW (standaard). (B) Blauwe laser = 210 mW (aanbevolen). Meer kleine deeltjes zijn zichtbaar en in focus wanneer het blauwe laservermogen wordt verhoogd tot 210 mW. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Visuele impact van veranderde blauwe, groene en rode laserkracht. Representatieve live schermweergaven tonen de verschillende deeltjesgroottes die worden gevisualiseerd in verschillende laserinstellingen. De resulterende NTA-waarden worden gerapporteerd in tabel 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Deeltjes | Diameter [nm] | Blauwe laser [mW] | Groene laser [mW] | Rode laser [mW] | Camera versterking [dB] | Temperatuurregeling | Verwerking | # Video's |
| Exosomen | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Ingeschakeld, ingesteld op 22 ºC | Uitgeschakelde autodetectie overschrijven | 50 |
Tabel 1: Registratieparameters voor kleine extracellulaire blaasjes (~100 nm).
| Procesbeschrijving | Detectiedrempel | Auto Detection Override uitschakelen | Functie Diameter [px] |
| Exosomen | Polydisperse Monster | Geruit | 30 |
Tabel 2: Verwerkingsparameters voor kleine extracellulaire blaasjes (~100 nm).
| Grootte van polystyreenstandaard [nm] | Integratiebereik [nm] | Gemiddelde grootte [nm] | SD-grootte [nm] | CV van grootte | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Totaal aantal tellingen |
| 100 | 50 tot 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 tot 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabel 3: NTA-resultaten van monodisperse polystyreenkraalstandaarden. Beide standaarden werden optimaal verdund, met ruwe concentraties voor de 100 nm-standaard en 400 nm-standaard van respectievelijk 4,205 x10 7 deeltjes / ml en 4,365 x 107 deeltjes / ml. D10 is het punt in de grootteverdeling waar 10% van de steekproef zich bevindt, D50 is het punt waar 50% van de steekproef zich bevindt (mediaan) en D90 is het punt waar 90% van het monster zich bevindt. SD: Standaarddeviatie; CV: Variatiecoëfficiënt.
| Verdunningsfactor | Deeltjesconcentratie, deeltjes/ml | Totale deeltjesconcentratie, deeltjes/ml |
| Rauw | Gecorrigeerd voor verdunningsfactor | |
| 1000 | 4,10E+07 | 4,10E+10 |
| 4,00E+07 | 4,00E+10 | |
| 3,70E+07 | 3,70E+10 | |
| gemiddelde (SD) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3,60E+07 | 5,40E+10 |
| 2,60E+07 | 3,80E+10 | |
| 2,90E+07 | 4,40E+10 | |
| gemiddelde (SD) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4.55E+10 (6.60E+09) |
| 2000 | 2,40e+07 | 4,80e+10 |
| 2,30e+07 | 4,60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4,00E+10 | |
| gemiddelde (SD) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1,30e+07 | 3,90E+10 | |
| 1,40E+07 | 4,20E+10 | |
| gemiddelde (SD) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4.71E+10 (9.27E+09) |
Tabel 4: NTA-resultaten van perigonadale vetweefsel-EV's bij muizen tonen reproduceerbaarheid van NTA-metingen. Ruwe NTA-deeltjesconcentraties (deeltjes/ml) gemeten op het deeltjesvolginstrument en totale deeltjesconcentratie (deeltjes/ml) gecorrigeerd voor verdunningsfactor van EV's afgeleid van muisperigonadaal vetweefsel bij verschillende verdunningen.
| Versterking [dB] | Blauwe Laser [mW] | Groene Laser [mW] | Rode Laser [mW] | Totale concentratie, deeltjes/ml (ruw) | Gemiddelde grootte [nm]* | Standaardafwijking van grootte / CV | Modale grootte | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5,90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1,00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1,70e+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1,10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1,00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2,80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4,40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1,50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9,20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| * Geïntegreerd binnen 50-1000 nm bereik | ||||||||
Tabel 5: NTA-resultaten van van menselijk plasma afgeleide EV's tonen het effect aan van het veranderen van laservermogen en -winst op grootte- en deeltjesconcentratiemetingen van menselijke EV's (1:1000 verdunning). D10 is het punt in de grootteverdeling waar 10% van de steekproef zich bevindt, D50 is het punt waar 50% van de steekproef zich bevindt (mediaan) en D90 is het punt waar 90% van het monster zich bevindt. SD: Standaarddeviatie; CV: Variatiecoëfficiënt.
Aanvullende figuur 1: Schermafbeelding van het opnamepaneel met aanbevolen opnameparameters. Krijg toegang tot geavanceerde instellingen om de cameraversteking en het laservermogen te wijzigen in de aanbevolen instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 2: Schermafbeelding van het verwerkingspaneel met aanbevolen verwerkingsinstellingen. Zorg ervoor dat 'Auto detection override uitschakelen' is aangevinkt en dat de functiediameter is ingesteld op '30'. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Deeltjesgroottemetingen over meerdere verdunningen: precisie van het deeltjesvolginstrument (ViewSizer 3000) versus vergelijkbaar commercieel NTA-instrument (NanoSight NS300). NTA van EV's geïsoleerd uit perigonadaal vetweefsel van muizen werd uitgevoerd op twee instrumenten. Voor elke muis werden drie verdunningen (1:1000, 1:500, 1:100) gemeten. Ruwe waarden voor maatregelen genomen op de ViewSizer 3000 (gedemonstreerd in dit protocol) zijn weergegeven in aanvullende tabel 1. De opname- en analyse-instellingen voor de NanoSight NS300-metingen worden weergegeven in aanvullende tabel 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 4: Representatieve negatieve-vlektransmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van van menselijk plasma afgeleide EV's. Rasters werden in beeld genomen met een transmissie-elektronenmicroscoop die werkte op 100 kV versnellende spanning. De beelden werden vastgelegd met een 2K x 2K CCD-camera. De schaalbalk geeft de vergroting bij de camera weer. Elektronenmicrofoto's tonen ronde blaasjes ~ 25 nm in diameter. 100k vergroting, schaal bar 200 nm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: ViewSizer 3000 deeltjesgrootte- en concentratiemetingen van perigonadale adiposeweefsel-EV's van muizen over meerdere verdunningen. NTA van EV's geïsoleerd uit perigonadaal vetweefsel van muizen werd uitgevoerd. Voor elke muis werden drie verdunningen (1:1000, 1:500, 1:100) gemeten. D10 is het punt in de grootteverdeling waar 10% van de steekproef zich bevindt, D50 is het punt waar 50% van de steekproef zich bevindt (mediaan) en D90 is het punt waar 90% van het monster zich bevindt. Deeltjesconcentraties worden op de achtergrond gecorrigeerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: NanoSight NS300 opname- en analyse-instellingen. Instellingen (met behulp van NTA 3.4 Build 3.4.003) gebruikt om perigonadale vetweefsel EV-monsters van muizen te meten, gerapporteerd in aanvullende figuur 3. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier demonstreren we een protocol voor NTA van EV's om de grootteverdeling van een breed scala aan deeltjesgroottes tegelijkertijd te meten en de totale EV-concentratie in een polydisperse-monster te meten. In deze studie werden perigonadaal vetweefsel van muizen en menselijk plasma gebruikt als bron van EV's. EV's geïsoleerd uit andere weefsels of biologische vloeistoffen zoals serum, urine, speeksel, moedermelk, vruchtwater en celkweeksupernatant kunnen echter ook worden gebruikt voor NTA. Metingen van polystyreenkraalstandaarden zorgden ervoor dat het instrument goed gekalibreerd was en toonden aan dat dit NTA-instrument de grootte van nanodeeltjes correct kan meten ≤400 nm. Vervolgens werden verschillende verdunningen van een EV-monster van muizenweefsel getest. Zoals te zien is in figuur 9,schaalt de gerapporteerde deeltjesconcentratie dienovereenkomstig met de verdunningsfactor, zoals verwacht, wat aantoont dat het instrument de deeltjesconcentratie bij verschillende verdunningen nauwkeurig kan detecteren met weinig variabiliteit tussen technische replicaties. Dit was echter bij het werken met deeltjesconcentraties binnen het werkbereik van het instrument (5 x 106 tot 2 x 108 deeltjes per ml); het op de juiste manier verdunn van een monster is een cruciale stap in het protocol. Correctie voor de verdunningsfactor leverde ongeveer dezelfde schatting op voor de totale deeltjesconcentratie van het monster, met een CV van 15,1 over de vier geteste verdunningen. Ook toonden verschillende metingen, herhaald op meerdere verdunningen van dezelfde monsters, de precisie in de deeltjesgrootteverdelingsbeoordelingen, aangezien deeltjesconcentraties proportioneel werden geschaald met de verdunningsfactor, maar gerapporteerde groottemetingen niet.
EV's in suspensie ondergaan willekeurige thermische beweging die bekend staat als Brownse beweging, volgens welke de diffusie van deeltjes in een vloeibare suspensie omgekeerd evenredig is met hun grootte. Deze willekeurige beweging wordt gemodelleerd door de Stokes-Einsteinvergelijking, waarbij de hydrodynamische diameter D van een bolvormig deeltje is:
Waarbij kB de constante van Boltzmann is en R de deeltjesradius. Zoals men uit de vergelijking kan opsnijden, hangt de deeltjesbeweging in suspensie ook af van de temperatuur (T) en dynamische viscositeit (η) van de vloeistof. Tijdens NTA worden EV's bestraald met gerichte laserstralen die in suspensie door de deeltjes gaan en worden gedetecteerd door de invallende verlichting afkomstig van de lasers. Het licht dat door elk afzonderlijk deeltje wordt verstrooid, wordt door een microscoop gericht op de beeldsensor van een hoge resolutie, lichtgevoelige charge-coupled device (CCD) -camera, die digitale beelden van het verstrooide licht van de deeltjes opneemt(figuur 1). De NTA-software identificeert en volgt de Brownse beweging van elk individueel deeltje om de diffusiecoëfficiënt van elk deeltje te berekenen. Dit wordt samen met de temperatuur en de viscositeit van de vloeistof die de deeltjes bevat gebruikt om de deeltjesdiameter te berekenen met behulp van de Stokes-Einstein-vergelijking. Een enkele meting kan dus twee kritieke stukjes informatie bepalen: deeltjesgrootteverdeling en totale deeltjestelling van EV's in suspensie.
Een vergelijking van NTA met andere technieken voor het detecteren en kwantificeren van EV's is elders beschreven31,32. In vergelijking met andere op lichtverstrooiing gebaseerde methoden zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS), heeft NTA hogere oplossende mogelijkheden en is het een bijzonder krachtige methode voor het analyseren van deeltjes met een gemiddelde diameter van minder dan 100 nm. In tegenstelling tot single-particle analytics zoals TEM, is NTA niet tijdrovend of technisch uitdagend en kan het een volledig monster in een relatief laag volume tegelijk fenotyperen op een semi-geautomatiseerde manier. Hoewel NTA een krachtige karakteriseringstechniek is, heeft het wel beperkingen. Ten eerste is NTA onderhevig aan gevoeligheidslimieten vanwege de sterke afname van de intensiteit van verstrooid licht met deeltjesdiameter, waardoor het verstrooide licht van zeer kleine deeltjes onder de achtergrondruis verdwijnt33. Zo heeft NTA de gevoeligheid voor EV's kleiner dan ~ 50 nm31 verminderd en resulteert dit in een overschatting van EV-groottes. Lasers met een korte golflengte zijn nodig om de kleinere deeltjes van een polydisperse monster te detecteren vanwege hun lichtverstrooiingspotentieel. Dit deeltjesvolginstrument biedt echter een verbetering van deze beperking die inherent is aan nanodeeltjesvolgtechnologie. Uitgerust met drie variabele lichtbronnen (450 nm, 520 nm, 635 nm), maakt dit systeem visualisatie van deeltjes over een breed scala aan groottes mogelijk, waardoor dit instrument een bijzonder waardevol hulpmiddel is voor NTA-analyses van polydisperse monsters, zoals een heterogene populatie van EV's. Niettemin, omdat de meeste EV-preps polydisperse van samenstelling zullen zijn en waarschijnlijk onzuiverheden bevatten, moeten onderzoekers zich ervan bewust zijn dat monsterafhankelijke detectielimieten van invloed zijn op de vorm van de totale grootteverdeling en daarom voorzichtig zijn bij het interpreteren van resultaten.
Een andere belangrijke beperking van NTA is dat het meer meet dan alleen EV's. Het NTA-instrument detecteert, meet en telt alle deeltjes die de detectielimiet overschrijden, inclusief eiwitaggregaten, lipoproteïnen, cellulair puin en verontreiniging veroorzaakt door verdunningen. De deeltjesconcentratie op de achtergrond kan echter worden gecorrigeerd door de deeltjesconcentratie van het verdunningsmiddel te meten voorafgaand aan het laden en meten van een monster. We raden aan om minimaal 0,02 μm gefilterd PBS te gebruiken en hebben een zeer lage deeltjesverontreiniging gevonden bij gebruik van 3 kDa gefilterd PBS. Bovendien is het mogelijk om NTA uit te breiden om fluorescerend gelabelde EV's te meten en te analyseren, waardoor de beperking van niet-specifieke metingen wordt overwonnen. Er zijn commerciële kits beschikbaar die specifiek en efficiënt alleen de membranen van intacte blaasjes verven, met uitzondering van membraanfragmenten, eiwitaggregaten en andere deeltjes uit de NTA-meting. De gegevens afgeleid van fluorescerende NTA vertegenwoordigen dus nauwkeuriger de werkelijke EV-concentratie en grootteverdeling. Door ev-oppervlakteantigenen selectief te taggenen, kan fluorescerende NTA ook specifieke EV's meten die zijn gelabeld met fluorescerend gelabelde antilichamen, waardoor antigeenspecifieke, biologisch relevante EV-subpopulaties kunnen worden geteld en gedimensioneerd.
Er is weinig werk verricht aan de standaardisatie van NTA-protocollen, waardoor de vergelijkbaarheid van resultaten moeilijk wordt en de reproduceerbaarheid tussen monsters, dagen, operators en laboratoria wordt belemmerd. Het deeltjesvolginstrument dat in dit protocol wordt gedemonstreerd, vereist weinig hands-on tijd. We hebben ook genoteerd welke instrumentinstellingen gebruikers moeten rapporteren om de reproduceerbaarheid van gegenereerde gegevens te vergemakkelijken. Het volgen van het geoptimaliseerde protocol dat hier is uiteengezet, zou dus moeten resulteren in standaardisatie en vergelijking van resultaten tussen laboratoria mogelijk moeten maken. Een ander voordeel van het gebruik van dit instrument is dat het monster wordt bereid in een cuvette, waardoor het instrument herhaaldelijk tussen video's kan roeren, waardoor een statistisch willekeurig monster voor elke video wordt gegarandeerd en een meer reproduceerbaar resultaat wordt opgeleverd dan andere in de handel verkrijgbare NTA-instrumenten die afhankelijk zijn van spuitpompen en stroomcellen. Ook maken de meerdere lasers het mogelijk om deeltjes met verschillende brekingsindices te detecteren, wat robuustere resultaten oplevert. Toch vereist de werking van dit deeltjesvolginstrument geen kennis van deeltjesmateriaaleigenschappen zoals de brekingsindex, waardoor metingen beter reproduceerbaar zijn voor alle operators.
EV's zijn geïdentificeerd in bijna alle geteste biovloeistoffen2,5. Effectieve isolatie van specifieke EV's (bijv. Celtype specifieke EV's) van verschillende media (bijv. Bloed, moedermelk, celkweekmedia) vormt echter een moeilijke uitdaging. Er zijn veel verschillende methoden voor EV-isolatie beschreven9. NTA kan worden uitgevoerd om de opbrengsten van EV's te vergelijken die met verschillende methoden zijn geïsoleerd en variaties in de blaasjes te identificeren die voortkomen uit verschillende isolatiemethoden. Dit is belangrijk voor de interpretatie van downstream-resultaten, omdat de functie van verschillende EV-subpopulaties momenteel onduidelijk blijft. Het nauwkeurig meten van de EV-concentratie is ook belangrijk in studies die onderzoeken of een bepaalde behandeling, aandoening of molecuul de afgifte van EV's beïnvloedt. Onze groep is bijvoorbeeld geïnteresseerd in de impact van milieublootstellingen zoals fijnstofluchtverontreiniging op ev-gehalte en -uitstoot. Om te beoordelen of een aandoening van invloed is op ev-afgifte, moet het aantal blaasjes nauwkeurig worden gekwantificeerd. Bij het gebruik van EV's als diagnostische biomarkers kan de concentratie van EV's in het monster van invloed zijn op de testresultaten. Een betrouwbare methode om de deeltjesconcentratie en grootteverdeling te bepalen is dus van cruciaal belang.
Hoe dan ook, NTA-metingen moeten vergezeld gaan van andere complementaire technieken die deeltjes onafhankelijk van de andere deeltjes in het monster kunnen meten, zoals TEM. Nieuwere technologieën zoals microfluïdische resistieve pulsdetectie (MRPS) zijn ook veelbelovend voor het dimensioneren en tellen van EV's onafhankelijk van de polydispersiteit van het monster. Verdere biochemische of proteomische analyses van EV-monsters kunnen naast de grootte- en concentratiegegevens worden gebruikt om subsets van EV's te clusteren in populaties van biologische betekenis. Kortom, het meten van geldige en reproduceerbare deeltjesconcentraties en deeltjesgrootteverdelingen is belangrijk voor het EV-veld. De ViewSizer 3000 bereikt nauwkeurige en reproduceerbare metingen van de totale EV-concentratie en EV-grootteverdeling, zelfs voor zeer polydisperse monsters, zoals hier wordt gedemonstreerd. In de toekomst hopen we verdere rigoureuze experimentele vergelijkingen van dit instrument met andere NTA-instrumenten te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaarden dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). We erkennen Jeffrey Bodycomb, Ph.D. van HORIBA Instruments Incorporated voor zijn hulp bij het kalibreren van het instrument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
