Summary
Vi demonstrerer hvordan man bruker et nytt nanopartikkelsporingsanalyseinstrument for å estimere størrelsesfordelingen og den totale partikkelkonsentrasjonen av ekstracellulære vesikler isolert fra musperigonadal fettvev og humant plasma.
Abstract
De fysiologiske og patofysiologiske rollene til ekstracellulære vesikler (ELBILER) har blitt stadig mer anerkjent, noe som gjør EV-feltet til et raskt utviklende forskningsområde. Det er mange forskjellige metoder for EV-isolasjon, hver med klare fordeler og ulemper som påvirker nedstrømsutbyttet og renheten til elbiler. Å karakterisere EV-prep isolert fra en gitt kilde ved en valgt metode er derfor viktig for tolkning av nedstrømsresultater og sammenligning av resultater på tvers av laboratorier. Det finnes ulike metoder for å bestemme størrelsen og mengden elbiler, som kan endres av sykdomstilstander eller som svar på ytre forhold. Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) er en av de fremtredende teknologiene som brukes til høygjennomstrømningsanalyse av individuelle elbiler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av elbiler isolert fra musperigonadal fettvev og humant plasma ved hjelp av en banebrytende teknologi for NTA som representerer store fremskritt innen feltet. Resultatene viser at denne metoden kan levere reproduserbare og gyldige totale partikkelkonsentrasjons- og størrelsesfordelingsdata for elbiler isolert fra forskjellige kilder ved hjelp av forskjellige metoder, som bekreftet ved transmisjonselektronmikroskopi. Tilpasningen av dette instrumentet for NTA vil adressere behovet for standardisering i NTA-metoder for å øke strenghet og reproduserbarhet i EV-forskning.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er små (0,03-2 μm) membranbundne vesikler utskilt av nesten alle celletyper1. De blir ofte referert til som "eksosomer", "mikrovesicles" eller "apoptotiske kropper" avhengig av deres frigjøringsmekanisme og størrelse2. Mens det først ble antatt at elbiler bare var et middel til å eliminere avfall fra cellen for å opprettholde homeostase3, vet vi nå at de også kan delta i intercellulær kommunikasjon via overføring av molekylært materiale - inkludert DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipider og proteiner4,5 - og at de er viktige regulatorer for normal fysiologi samt patologiske prosesser1, 5,6,7,8.
Det finnes mange forskjellige metoder for å isolere og kvantifisere elbiler, som er beskrevet andre steder9,10,11,12. Isolasjonsprotokollen som brukes, så vel som kilden til elbiler, kan i stor grad påvirke EV-utbytte og renhet. Selv differensial sentrifugering, lenge ansett som "gullstandard" tilnærming for eksosomisolasjon, kan bli gjenstand for betydelig variasjon som senere påvirker EV-befolkningen oppnådd og nedstrøms analyser13. Dermed gjør de ulike metodene for EV-isolasjon og kvantifisering det vanskelig å sammenligne, reprodusere og tolke resultater av eksperimenter rapportert i litteraturen14. Videre kan EV-utgivelse reguleres av cellulære forhold eller ulike eksterne faktorer. Det har blitt antydet at elbiler spiller en rolle i å opprettholde cellulær homeostase ved å beskytte celler mot intracellulær stress15, som flere studier har vist at cellulær stress stimulerer EV-sekresjon. For eksempel har økt EV-frigjøring blitt rapportert etter cellulær eksponering for hypoksi, endoplasmisk retikulumspenning, oksidativt stress, mekanisk stress, sigarettrøykekstrakt og partikkelmaterialeluftforurensning 16,17,18,19,20,21,22. EV-utgivelsen har også vist seg å være modifisert in vivo; mus utsatt for et høyt fett diett eller faste i seksten timer utgitt mer adipocyte ELBILER23. For å undersøke om en bestemt behandling eller tilstand endrer EV-utslipp, må antall elbiler bestemmes nøyaktig. Vurdering av EV-størrelsesfordelingen kan også indikere den dominerende subcellulære opprinnelsen til elbiler (f.eks. sammensmelting av sen endosomer/multivesikulære legemer med plasmamembran vs. spirende plasmamembran)24. Dermed er det behov for robuste metoder for å nøyaktig måle den totale konsentrasjonen og størrelsesfordelingen til EV-prep som studeres.
En rask og svært følsom metode for visualisering og karakterisering av elbiler i løsning er nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). En detaljert forklaring av prinsippene for denne metoden og sammenligning med alternative metoder for vurdering av EV-størrelse og konsentrasjon er beskrevet tidligere25,26,27,28. Kort sagt, under NTA-måling visualiseres elbiler av lyset spredt når de bestråles med en laserstråle. Det spredte lyset er fokusert av et mikroskop på et kamera som registrerer partikkelbevegelsen. NTA-programvaren sporer den tilfeldige termiske bevegelsen til hver partikkel, kjent som Brownian bevegelse, for å bestemme diffusjonskoeffisienten som brukes til å beregne størrelsen på hver partikkel ved hjelp av Stokes-Einstein-ligningen. NTA ble først brukt på måling av elbiler i et biologisk utvalg i 201125. Inntil nylig var det bare to mainstream-selskaper som tilbyr kommersielle NTA-instrumenter29 frem til innføringen av ViewSizer 3000 (heretter referert til som partikkelsporingsinstrumentet) som bruker en kombinasjon av nye maskinvare- og programvareløsninger for å overvinne betydelige begrensninger i andre NTA-teknikker.
Partikkelsporingsinstrumentet karakteriserer nanopartikler i væskeprøver ved å analysere deres brownske bevegelse og karakteriserer større mikronstore partikler ved å analysere gravitasjonsoppgjør. Dette instrumentets unike optiske system, som inkluderer multispektral belysning med tre laserlyskilder (ved 450 nm, 520 nm og 635 nm), gjør det mulig for forskere å analysere et bredt spekter av partikkelstørrelser (f.eksoser, mikrovesicles) samtidig. Et skjema av instrumentoppsettet vises i figur 1.
Her demonstrerer vi hvordan man utfører partikkelstørrelsesfordeling og konsentrasjonsmålinger av isolert mus og menneskelige elbiler ved hjelp av et nytt NTA-instrument.
Figur 1: Optisk system for partikkelsporingsinstrument. NTA-instrumentet lyser opp partikler med tre lasere med følgende bølgelengder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videoopptak av det spredte lyset fra individuelle partikler oppdages og spores av et digitalt videokamera orientert 90° fra cuvette. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbeid med disse prøvene ble utført i samsvar med institusjonell dyrepleie- og brukskomité og institusjonelle gjennomgangsstyreretningslinjer. En skjematisk oversikt over NTA-metoden er vist i figur 2.
Figur 2: Oversikt over NTA-metoden ved hjelp av partikkelsporingsinstrumentet. Prøven fremstilles og settes inn i instrumentet. NTA-programvaren åpnes, opptaksparametere justeres, og prøven er fokusert. Deretter registreres, behandles og vises dataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Ekstracellulær vesicle isolasjon
MERK: Musperigonadale fettvevS-elbiler ble isolert som tidligere beskrevet23. Plasma-ELBILER ble isolert fra 1 ml humant plasma ved hjelp av følgende protokoll:
- Samle plasma og sentrifuge ved 3000 x g i 15 min for å fjerne cellulært rusk. Overfør supernatanten til et nytt rør.
MERK: Hvis ekstra rusk forblir påviselig, sentrifugerer du supernatanten i ytterligere 10 minutter ved 12 000 x g og overfører supernatanten til et nytt rør. - Tilsett 67 μL eksosomisolasjonsreagens per 250 μL plasma. Bland godt ved å invertere eller flikke røret.
- Inkuber på is oppreist i 30 min.
- Sentrifuger eksosomet isolasjonsreagens/plasmablanding ved 3000 x g i 10 min ved 4 °C.
MERK: Sentrifugering kan utføres ved romtemperatur eller 4 °C med lignende resultater, men 4 °C foretrekkes. Etter sentrifugering kan elbilene vises som en beige eller hvit pellets nederst på røret. - Aspirer forsiktig av supernatanten. Spinn ned eventuelle gjenværende eksosomeisolasjonsløsninger og fjern alle spor av væske ved aspirasjon, og pass på at du ikke forstyrrer de utfelte ELBIL-ene i pelletsen.
- Resuspend pellet i 200 μL buffer B (levert av produsenten). Mål og registrer prøvens proteinkonsentrasjon (for trinn 2.8) ved hjelp av et spektrofotometer, fluorometer, Bradford-analyse eller annen foretrukket metode.
2. Rensing av isolerte elbiler
- Tilsett 200 μL buffer A (levert av produsenten) for å re-suspenderte elbiler.
- Ta ut rensesøylen (følger med), løsne skruehetten og trykk av den nederste lukkingen. Plasser kolonnen i et oppsamlingsrør.
MERK: Lagre den nederste lukkingen i trinn 2.7-2.9. - Sentrifuge ved 1000 x g i 30 s for å fjerne lagringsbufferen.
- Kast gjennomstrømningen og plasser søylen tilbake i oppsamlingsrøret.
- For å vaske kolonnen, fjern hetten og påfør 500 μL buffer B på toppen av harpiksen og sentrifugen ved 1000 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen. Lagre hetten for trinn 2.7-2.9.
- Gjenta trinn 2.4-2.5 en gang til for å vaske kolonnen.
- Koble bunnen av kolonnen til den nederste lukkingen (fra trinn 2.2). Påfør 100 μL buffer B på toppen av harpiksen for å klargjøre den for prøvelasting.
- Tilsett hele innholdet fra trinn 1.6 (eller opptil volumekvivalent på 4 mg totalt protein) til harpiksen. Plasser skruehetten på toppen av søylen.
- Bland ved romtemperatur på en roterende shaker i ikke mer enn 5 min.
3. Prøve elution
- Løsne skruehetten og fjern den nederste lukkingen, og overfør straks til et 2 ml mikrosenterrør.
MERK: Prøven begynner å elute så snart den nederste lukkingen er fjernet. Pass på at 2 ml mikrosenterrør er klare til å motta eluate for å minimere prøvetap. - Sentrifuge ved 1000 x g i 30 s for å få rensede elbiler. Forkast kolonnen.
4. Prøvepreparering for nanopartikkelsporingsanalyse
- Bruk et lofritt materiale som en mikrofiberklut for å dekke arbeidsområdet og forhindre at fibre kommer inn i cuvettes.
- Bruk hansker, plasser cuvette på den magnetiske cuvette jig, og plasser deretter rørestangen i cuvette. Håndter alltid dynene med hansker for å forhindre at fingeravtrykk og flekker vises på cuvettes overflate.
- Bruk krokverktøyet til å plassere innsatsen i cuvette som vist på figur 3. Det er viktig å merke seg retningen på innsatsen for senere (trinn 5.4).
Figur 3: Riktig innsettingsretning i kvartskrovetten. "Hakket" på innsatsen skal være synlig fra forsiden av cuvette. Dette skal settes inn i instrumentet som vender mot kameraet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Bruk en pipette, tilsett sakte 400-500 μL av fortynningsmiddelet eller fortynnet prøve ved romtemperatur til cuvette gjennom hullet i innsatsen. Rør forsiktig opp og ned for å blande. Unngå å introdusere luftbobler.
- Først forberede en cuvette lastet med det valgte fortynningsmiddelet (blankt) for å måle partikkelkonsentrasjonen av fortynningsmiddelet. Dette bør gjøres før du måler prøven slik at bakgrunnskonsentrasjonen av prøven kan korrigeres.
MERK: En god blank (fosfatbufret saltvann [PBS] i dette tilfellet) vil ha en konsentrasjon <9 x 106 (avhengig av fortynningsmiddel) og vil vise 1-10 partikler per skjerm i live view (Figur 4). Det anbefales at den faktiske prøvepartikkelkonsentrasjonen er minst 3 ganger bakgrunnskonsentrasjonen. - Eventuelt, før du registrerer prøven prime cuvette med 400-500 μL av fortynningsmiddelet eller fortynnet prøven før måling. For å gjøre dette, last 400-500 μL av den fortynnede prøven inn i cuvette, kast løsningen, og tilsett deretter 400-500 μL mer av prøven for målingen. Dette kan hjelpe med å vaske ut rester i cuvette.
- Først forberede en cuvette lastet med det valgte fortynningsmiddelet (blankt) for å måle partikkelkonsentrasjonen av fortynningsmiddelet. Dette bør gjøres før du måler prøven slik at bakgrunnskonsentrasjonen av prøven kan korrigeres.
Figur 4: Representativ live stream-visning av et fortynningsmiddel innenfor riktig konsentrasjonsområde av et tomt. Fortynn EV preps i filtrert (0,02 μm eller 3 kDa, foretrukket) PBS. En god blank vil vise ~ 1-10 partikler per skjerm i live view, noe som gir en konsentrasjon innenfor området 105-106. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Cap cuvette og se etter bobler. Trykk ut bobler om nødvendig. Bruk en lofri klut til å tørke av utsiden av cuvette.
5. Oppstartsprosedyren til partikkelsporingsinstrumentet
- Slå på datamaskinens arbeidsstasjon og instrument, vent noen minutter før du kjører den første prøven, og start programmet ved å klikke på programvareikonet. Når du blir bedt om det, klikker du NTA på skjermen for å utføre Nanoparticle Tracking Analysis. Begynn i kategorien Innspilling , og klikk de ulike programvarekategoriene (Record, Process, Plot) for å bytte mellom dem gjennom protokollen. Ta opp prøven (fortynnings- eller EV-klargjøring) først, behandle deretter opptakene, og til slutt plotte resultatene.
- Følg instruksjonene på skjermen for å fylle ut all nødvendig informasjon om prøven. Kontroller at alle nødvendige felt er fullført og nøyaktige, det vil si prøvenavn, beskrivelse, prøvepreparering, fortynningsfaktor [1000], måltemperatur (satt til 22 °C) og fortynningsmiddel: Velg fortynningsmiddel fra rullegardinmenyen og bruk PBS som fortynningsmiddel for elbiler. Hvis du velger PBS fra rullegardinmenyen, fylles saltholdigheten automatisk ut til 9 %. Denne informasjonen er nødvendig for å bestemme væskens dynamiske viskositet.
MERK: Det kan ta opptil 3 minutter før temperaturen likevekter inne i cuvette selv om sonden allerede viser ønsket temperatur (dvs. grønn prikk blir stabil). Prøveavlesninger kan variere betydelig hvis måltemperaturen ikke er innstilt, da temperaturforskjeller i prøven i stor grad kan endre den brune bevegelsen av partikler. - Åpne instrumentlokket og fjern beskyttelseshetten der cuvette skal plasseres.
FORSIKTIG: Partikkelsporingsinstrumentet er sertifisert som et laserprodukt i klasse 1 (21 CFR Ch. Jeg del 1040), som inneholder lasere som kan være farlige og kan forårsake alvorlig skade som brannskader og / eller permanent skade på synet. For å unngå uhell eller personskader må du ikke fjerne instrumentdekselet ved å skru boltene ut av siden. Vær oppmerksom på at laserstrålene er helt omsluttet under drift, noe som ikke utgjør noen trussel mot brukerne. En magnetisk sikkerhetslås er også innebygd i instrumentets prøveholder for å forhindre at laserne fungerer når hetten på prøveholderen fjernes. - Plasser cuvette (fra trinn 4.3) inne i instrumentet i riktig retning (se figur 5). Sett lokket tilbake over cuvette og lukk instrumentlokket. Bruk alltid instrumentet med hetten på plass over prøveholderen. Ikke deaktiver eller forsøk å omgå sikkerhetslåsfunksjonen.
Figur 5: Riktig orientering av cuvette i partikkelsporingsinstrument. Ansiktet på cuvette (med "hakket" av innsatsen synlig) skal vende mot kameraet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Slå på kameraet ved å klikke pilen over Direkteavspilling.
- Klikk vinkeltegnpilen for å utvide postinnstillingene. Sett Forsterknings- og laserkraft til verdier som passer for programmet. Se tabell 1 (og tilleggs figur 1) for parametere som brukes for NTA for små (100 nm) elbiler.
MERK: Disse avanserte innstillingene som åpnes ved å klikke på vinkeltegnpilen, kan være passordbeskyttet. Bruk de samme innstillingene for opptak og behandling for fortynningsmiddelet (tomt) som de som brukes for de påfølgende prøvene. - Juster fokuset til partiklene er riktig fokusert. Fokusering bør gjøres på relativt små partikler (figur 6). For liten EV-kvantifisering (i samsvar med eksosomer) anbefales følgende opptaksinnstillinger: Bildefrekvens: 30 fps, Eksponering: 15 ms, Røretid: 5 s, Ventetid: 3 s, Lasereffekt - Blå: 210 mW, Grønn: 12 mW, Rød: 8 mW, Bilder per video: 300 bilder og Forsterkning: 30 dB.
MERK: Brukeren kan øke Zoom til 1x og/eller øke Gain for å hjelpe til med å fokusere. Husk å sette disse parametrene på nytt til anbefalte verdier før du spiller inn videoer.
Figur 6: Representative live stream-visninger som viser partikkelfokus. (A) Et eksempel på live stream-visning av partikler som ikke er i fokus. Partikler har glødlignende glorie eller virker uskarpe. Juster fokus. (B) Et eksempel live stream visning av partikler i riktig fokus. De minste partiklene er i fokus. Start innspillingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Utfør en visuell kvalitetskontroll for å sikre at prøven er riktig fortynnet. Hvis prøven er for konsentrert, fjerner du cuvette fra instrumentet og fortynner prøven sekvensielt. Gjenta til prøven er ordentlig fortynnet før du går videre til trinn 6.
MERK: Ikke fortynn prøven for mye! Gjør alltid fortynning sekvensielt. Det ideelle feltet viser bare noen få partikler på skjermen (1-4) som vist i figur 4. Når det gjelder EV-prøver, vil en riktig fortynnet prøve ha omtrent 20-100 partikler synlige på skjermen, uten glødlignende eller uklare bilder i bakgrunnen (se figur 7 som et eksempel). Dette bør resultere i en optimal partikkelkonsentrasjon i området 5 x 106 til 2 x 108 partikler per ml (ikke justert for fortynningsfaktor).
Figur 7: Representative live stream visninger som viser forskjellige partikkelfortynning. (A) Et eksempel live stream visning av et utvalg som er for konsentrert. Hvis du registrerer et utvalg som er for konsentrert, vil det gi unøyaktige resultater. (B) Et eksempel på live stream-visning av en riktig fortynnet prøve. Det er 60-100 partikler synlige på skjermen og opptak resulterer i en rå konsentrasjon på 5 x 106- 2 x 108 partikler / ml. (C) Et eksempel på live stream-visning av et utvalg som er for fortynnet. Hvis en prøve er så fortynnet, vil det ikke spores nok partikler, senke prøvestørrelsen og derfor vil resultatene være statistisk ugyldige. I dette tilfellet anbefales det å øke antall videoer som er spilt inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Innsamling av videodata
- (Valgfritt) Sett zoominnstillingen til 0,5x for å spare båndbredde og forhindre tapte bilder.
- Begynn å spille inn videoene ved å klikke på Record (se tabell 1 for anbefalte opptaksparametere).
MERK: Som standard rører instrumentet prøven i 5 s, venter i 3 s, og tar deretter opp i 10 s før du gjentar denne prosessen. Typisk måletid for 50 videoer er ~ 15 min å spille inn og ~ 13 min å behandle. - Ikke berør instrumentet mens du spiller inn videoer. Påse at overflaten på laboratoriebenken ikke vibrerer.
MERK: Det er foretrukket at instrumentet er satt på en antivibrasjonsplattform eller et bord for å redusere vibrasjonsforstyrrelser fra nærliggende utstyr som vil forstyrre bestemmelsen av nanopartikkelbevegelse. Unngå å bruke sentrifuger, virvelblandere eller andre potensielle vibrasjonsgenererende enheter på samme benk som partikkelsporingsinstrumentet. Vibrasjoner er lett synlige på skjermen som forlengelse av vanligvis runde partikler. Hvis instrumentet utsettes for kraftige vibrasjoner, kan det kreve omjustering av optiske elementer. Instrumentet ble ikke designet for å bli vedlikeholdt eller kalibrert av kunden; kontakt produsenten for vedlikehold, service og kalibrering. - Legg merke til alle innspilte videoer som har svært store partikler synlige som store, uregelmessige hvite blober. Fjern disse videoene fra behandling i trinn 7.3.
7. Behandle innsamvede data
- Når det vises en melding om at videoer er spilt inn, klikker du OK for å fullføre innspillingen. Velg deretter Prosess-fanen.
MERK: Protokollen kan stoppes her. Behandling av innsamlet data kan startes på nytt senere ved å gå direkte til Prosess-fanen etter å ha åpnet partikkelsporingsinstrumentets programvare og spesifisert katalogen der de innspilte videoene lagres. - Når du analyserer elbiler, merker du av for Deaktiver overstyring av automatisk gjenkjenning og setter funksjonsdiameteren til 30. Klikk Prosess. (Se tabell 2 for behandlingsinnstillinger og supplerende figur 2 for behandling av displayet). En live distribusjonsgraf vises slik at brukeren kan se behandlingen i sanntid.
- For eksosomer, prosess med deteksjonsterskel satt til standard Polydisperse Sample. Behandle dataene med Detection Threshold Manual satt til 0,8 i stedet for en standardterskel på 0,99 bare for løsninger med svært store forskjeller i partikkelstørrelser.
- Hvis noen videoer hadde merkbart veldig store partikler synlige (se trinn 6.4), naviger til katalogen over innspilte videoer og fjern den problematiske videoen. Etter å ha redigert listen over videofiler, endrer du antall innspilte videoer i andre brukerholdte logger.
- Når behandlingen er fullført, klikker du OK. Velg deretter Tegne-fanen. For elbiler viser du hoveddiagrammet som LogBinSilica.
MERK: Her i Tegne-fanen kan brukeren tilpasse andre funksjoner i grafen, for eksempel å definere rekkevidden til x-aksen (partikkeldiameter, nm) for å angi området for integrasjon for den produserte figuren.
8. Vise og tolke resultater
- Hvis du vil opprette en PDF-rapport, klikker du Rapport-knappen. Målingen er nå fullført, og resultatene kan vises.
MERK: Husk å registrere og behandle det tomme først, slik at bakgrunnskonsentrasjonen av etterfølgende prøver kan korrigeres. Hvis dette trinnet glemmes, kan det tomme registreres etter prøver og prøvepartikkelkonsentrasjonen korrigeres manuelt. - Undersøk PDF-rapporten som viser gjennomsnitts-, median- og modusstørrelsen, samt konsentrasjonen justert for fortynningsfaktoren og korrigert ved å trekke fra fortynningsmiddelets partikkelkonsentrasjon. Fordelingsbredden (standardavvik) vises også.
MERK: Det er svært få applikasjoner der en enkelt verdi er passende og representativ. Det anbefales derfor å beskrive hele størrelsesfordelingen og rapportere bredden på fordelingen for alle analyserte utvalg (som vist i tabell 3 for eksempel). - Registrer følgende instrumentinnstillinger som brukes til å generere dataene som skal oppgis ved rapportering av resultater: Fortynningsmiddel, Laserkraft for hver laser [mW], Eksponering [ms], Gain [dB], Bildefrekvens [fps], Bilder per video, Antall innspilte videoer, Behandlingsinnstilling (f.eks. LogBinSilica), Integrasjonsområde [min nm, maks nm] (anbefales å sette min til 50 nm) og Antall partikler sporet (ønskelig å analysere minst ~ 150 partikler per video; minimum 3,750 spor per prøve per prøve anbefales å unngå artefaktuelle pigger i partikkelstørrelsesfordelingen og generere statistisk signifikante data).
9. Rengjøring av cuvettes
- Rengjør cuvettes manuelt mellom prøver. Først tømmer du cuvette.
MERK: Prøven kan enten gjenopprettes fra cuvette og lagres eller kastes. - Når cuvette er tom, rengjør du cuvette ved å skylle den 10-15 ganger med avionisert (DI) vann. Skyll deretter 3 ganger med etanol (70-100%). Når du gjør dette, må du sørge for å fylle cuvette helt med løsningsmiddel.
- Tørk utsiden av cuvette med en lofri mikrofiberklut. Unngå flekker på overflatene. Lufttørk innsiden av cuvette eller tørr ved hjelp av en trykkluft duster.
MERK: Bare linserengjøringspapir eller lofri mikrofiberklut bør brukes til å tørke av de optiske overflatene på cuvette, da de fleste papirprodukter inneholder små trefibre som kan ripe eller skade cuvettes overflate. - Forbered to hetteglass med glasssculler: den ene fylt med 70-100% etanol og den andre med DI-vann. Skyll innsatsene og rørstengene i etanol først (deretter DI-vann) ved å plassere innsatsen/rørestangen i riktig scintillasjonshette hetteglass og rist hetteglasset kraftig. Tørk innsatsene og rørestengene med lofrie kluter eller trykkluftduster.
MERK: Cuvette og innsats kan også rengjøres ved hjelp av et sonikerende vannbad. For å gjøre dette må du først sørge for at sonikeringsenheten inneholder nok vann (minst 5 cm dybde). Plasser deretter cuvette og sett inn inne i et glassbeger (50 ml eller større), fyll begeret med alkohol til samme nivå som vannbadet, plasser begeret i vannet og slå på strømmen. Soniker i maksimalt 5 minutter om gangen, slik at maskinen kan hvile >5 min mellom hver 5-minutters serie hvis lengre tider er nødvendig. - Når du er ferdig, legg umiddelbart alle rensede og tørkede komponenter bort for lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før denne demonstrasjonen ble kalibreringen av instrumentet først testet for å sikre gyldigheten av de oppkjøpte dataene ved å måle størrelsesfordelingen av polystyrenperlestandarder. Vi testet størrelsesfordelingen på 100 nm og 400 nm perler ved hjelp av standard opptaksparametere og behandlingsinnstillingene som anbefales i denne protokollen (Figur 8).
For 100 nm polystyrenperlestandard ble det målt en konsentrasjon på 4,205 x 107 partikler/ml. Gjennomsnittlig (standardavvik, SD) størrelse var 102 (±17) nm med en variasjonskoeffisient (CV) på 0,16. D10/D50/D90-verdiene var 76/104/126 nm. Dette indikerer at partikkelsporingsinstrumentet nøyaktig rapporterte størrelsen på de 100 nm monodisperse perlene. For 400 nm polystyrenperlestandard var konsentrasjonen 4,365 x 107 partikler/ml. Gjennomsnittlig (SD) størrelse var 391 (±47) nm, med en CV på 0,12. D10/D50/D90-verdiene var 358.15.456 nm (tabell 3). Mens det rapporterte gjennomsnittet er svært nær den sanne størrelsen på perlene, kan vi se at instrumentinnstillingene som brukes i denne protokollen er mer nøyaktige for de mindre partiklene ~ 100 nm. For partikler større enn 400 nm foreslås det derfor å optimalisere laserparametrene. Forskeren bør først gjennomføre en metode som transmisjonselektronmikroskopi (TEM) for et estimat av den resulterende EV-størrelsesfordelingen fra en gitt kilde- og isolasjonsmetode før NTA.
En gjennomsnittlig konsentrasjon på 4,41 x 1010 partikler/ml ble målt for musevevet EV-prøven som ble brukt til denne demonstrasjonen. Dette eksemplet ble registrert etter parameterne summert i tabell 1 og behandlet etter parameterne som er beskrevet i tabell 2. Vi viser virkningen av ulike fortynningsfaktorer i figur 9 og rapporterer de rå og justerte partikkelkonsentrasjonene i tabell 4. Den optimale fortynning for musevevsavledede elbiler var mellom 1000 og 3000, mens for humane plasmaavledede elbiler var det 1000, noe som indikerer at når man først tester en gitt biofluidkilde eller EV-isolasjonsmetode for NTA, bør serielle fortynninger testes slik at den optimale fortynning for NTA-måling kan identifiseres. Vi anbefaler at du måler og rapporterer minst to forskjellige fortynninger av en prøve. Vi målte også ytterligere fire prøver ved ulike fortynninger på to distinkte partikkelsporingsinstrumenter. Supplerende figur 3 sammenligner partikkelsporingsinstrumentets presisjon i størrelsesmålinger sammenlignet med et annet kommersielt tilgjengelig NTA-instrument. Supplerende tabell 1 viser videre presisjonen til dette instrumentets målinger, og viser at partikkelkonsentrasjonen endret seg proporsjonalt med prøvefortynning, men at partikkelstørrelsesmålene ikke gjorde det.
Etter behandling kan resultatene (sammen med instrument-/programvareinformasjon, opptaks- og behandlingsinnstillinger og eksperimentelle notater) lagres i en .pdf rapport. Histogrammet som er inkludert i denne rapporten, kan endres som beskrevet i protokollen (avsnitt 7.4). Råresultatene lagres i en .dat fil som kan eksporteres. De innspilte videoene lagres også og kan brukes til senere off-line behandling og analyse. Når videoer er spilt inn, kan imidlertid ikke innspillingsinnstillingene endres i ettertid.
Effekten av å endre de ulike laserkreftene og forsterkningen i opptaksinnstillingene ble demonstrert ved hjelp av humane plasmaavledede elbiler. Dette visualiseres i figur 10-12, og den kvantitative informasjonen basert på disse bildene vises i tabell 5. Hvis du øker forsterkningen, øker kameraets følsomhet, slik at visualisering av mindre partikler (figur 10) resulterer i en økende total partikkelkonsentrasjon med en mindre gjennomsnittlig partikkelstørrelse (Tabell 5). Å øke gevinsten over 30 dB (våre anbefalinger) gjør imidlertid utsikten for kornete, slik at støy kan skjule måling av sanne partikler. Ved en kameraforsterkning på 30 dB er effekten av å endre den blå lasereffekten avbildet i figur 11. Økning av den blå lasereffekten (450 nm, kort bølgelengde) gir større oppløsning for å oppdage mindre partikler (dvs. de med en størrelse som er i samsvar med eksosomer). Ved å holde de grønne og røde laserkreftene konstant ved standardinnstillingene, økte den blå lasereffekten fra 70 mW til 210 mW den rapporterte gjennomsnittlige partikkelstørrelsen fra 122 nm til 105 nm og økte den rapporterte totale partikkelkonsentrasjonen fra 1,1 x 108 til 1,7 x 108 (Tabell 5).
Effekten av å øke de grønne og røde laserkreftene ble også demonstrert (Figur 12). Økning av kraften til den røde laseren (650 nm, lang bølgelengde) økte den rapporterte gjennomsnittlige partikkelstørrelsen fra 175 til 246 nm. Den rapporterte totale partikkelkonsentrasjonen gikk ned, men det er fordi vi i denne humane plasma-EV-prøven ikke hadde mange store partikler til stede, bekreftet av TEM-negativ farging (Supplerende figur 4). Økning av den grønne lasereffekten resulterte i en reduksjon i den rapporterte gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og en økning i rapportert total partikkelkonsentrasjon. Dermed kan brukeren optimalisere kraften til de tre laserne for å sensitivt oppdage partikler av forskjellige størrelser.
Denne protokollen er optimalisert for mindre vesikler (f.eks. <400 nm). Forskere som er interessert i mikrovesikler av større størrelser (f.eks. 400-1000 nm) oppfordres til å optimalisere laserparametrene ved hjelp av hule organosilicaperler som har lysspredningsegenskaper som ligner på elbiler, noe som gjør dem til en mer passende referanse enn polystyren- eller silikaperlestandarder30. Likevel kan silika nanopartikler være den beste praktiske erstatningen til organosilica-standarder blir mer allment tilgjengelige.
Her ble et NTA-instrument brukt til å kvantifisere elbiler isolert fra musevev ved ultracentrifugation og menneskelig plasma ved hjelp av et kommersielt sett. Effektene av å endre NTA-parametrene ble illustrert og viser at parametrene i denne protokollen er optimalisert for små vesikler. Betydningen av fortynningstrinnet ble også vist og viser at partikkelsporingsinstrumentet som er demonstrert her, nøyaktig kan oppdage variasjoner i fortynningsfaktorer. Konsentrasjonen endret seg proporsjonalt med flere fortynninger, mens størrelsesfordelingen ikke gjorde det. De resulterende dataene viste liten teknisk variasjon. Dermed vil tilpasning av denne protokollen av forskere som bruker dette instrumentet for NTA øke strenghet og reproduserbarhet innen forskningsfeltet EV.
Figur 8: Partikkelstørrelsesfordelinger av monodisperse polystyrenperlestandarder. (A) Partikkelstørrelsesfordeling av 100 nm polystyrenperlestandard. (B) Partikkelstørrelsesfordeling på 400 nm polystyrenperlestandard. Verdier rapporteres i tabell 3. Innsett viser eksempelvisning av direktesendinger av den første målte rammen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Rå totale partikkelkonsentrasjoner ved fortynningsfaktor for musperigonadale fettvevs-ELBILER. Feilfelt representerer standardavvik. Tre målinger ble tatt for hver fortynning. Verdier rapporteres i tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Visuell innvirkning av økende forsterkning. Representative bilder av partikler målt med standard laserinnstillinger (Blå = 70 mW, Grønn = 12 mW, Rød = 8 mW) og forsterkning satt til (A) 18 dB, (B) 24 dB - standard og (C) 30 dB - anbefales. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Effekt av blå laser på små partikler når røde og grønne lasere er satt til standardinnstillinger. (A) Blå laser = 70 mW (standard). (B) Blå laser = 210 mW (anbefales). Flere små partikler er synlige og i fokus når den blå laserkraften økes til 210 mW. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Visuell påvirkning av endret blå, grønn og rød lasereffekt. Representative live screen-visninger viser de forskjellige partikkelstørrelsene visualisert på tvers av forskjellige laserinnstillinger. Resulterende NTA-verdier rapporteres i tabell 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Partikler | Diameter [nm] | Blå laser [mW] | Grønn laser [mW] | Rød laser [mW] | Kameraforsterkning [dB] | Temperaturregulering | Behandling | # Videoer |
| Eksosomer | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Aktivert, satt til 22 ºC | Deaktivert overstyring av automatisk gjenkjenning | 50 |
Tabell 1: Registrere parametere for små ekstracellulære vesicles (~100 nm).
| Beskrivelse av prosess | Terskel for gjenkjenning | Deaktiver overstyring av automatisk gjenkjenning | Diameter på funksjon [px] |
| Eksosomer | Polydisperse-eksempel | Rutet | 30 |
Tabell 2: Behandlingsparametere for små ekstracellulære vesicles (~100 nm).
| Størrelse på Polystyren Standard [nm] | Integrasjonsområde [nm] | Gjennomsnittlig størrelse [nm] | SD-størrelse [nm] | CV av størrelse | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Totalt antall |
| 100 | 50 til 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 til 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabell 3: NTA-resultater av monodisperse polystyrenperlestandarder. Begge standardene ble optimalt fortynnet, med rå konsentrasjoner for 100 nm standard og 400 nm standard på henholdsvis 4.205 x 107 partikler / ml og 4.365 x 107 partikler / ml. D10 er punktet i størrelsesfordelingen der 10 % av prøven finnes, D50 er punktet der 50 % av prøven finnes (median), og D90 er punktet der 90 % av prøven finnes. SD: Standardavvik; CV: Variasjonskoeffisient.
| Fortynningsfaktor | Partikkelkonsentrasjon, partikler/ml | Total partikkelkonsentrasjon, partikler/ml |
| Rå | Justert for fortynningsfaktor | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4.10E+10 |
| 4.00E+07 | 4.00E+10 | |
| 3.70E+07 | 3.70E+10 | |
| middelverdi (SD) | 3,93E+07 (1,70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3.60E+07 | 5.40E+10 |
| 2.60E+07 | 3.80E+10 | |
| 2.90E+07 | 4.40E+10 | |
| middelverdi (SD) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4,55E+10 (6,60E+09) |
| 2000 | 2.40E+07 | 4.80E+10 |
| 2.30E+07 | 4.60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4.00E+10 | |
| middelverdi (SD) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1.30E+07 | 3.90E+10 | |
| 1.40E+07 | 4.20E+10 | |
| middelverdi (SD) | 1,57E+07 (3,09E+06) | 4.71E+10 (9,27E+09) |
Tabell 4: NTA-resultater av musperigonadale fettvev-elbiler viser reproduserbarhet av NTA-målinger. Rå NTA partikkelkonsentrasjoner (partikler/ml) målt på partikkelsporingsinstrumentet og total partikkelkonsentrasjon (partikler/ml) justert for fortynningsfaktor av elbiler avledet fra musperigonadal fettvev ved ulike fortynning.
| Vinn [dB] | Blå laser [mW] | Grønn laser [mW] | Rød laser [mW] | Total konsentrasjon, partikler/ml (rå) | Gjennomsnittlig størrelse [nm]* | Standardavvik for størrelse / CV | Modal størrelse | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1,70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1,50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integrert innenfor 50-1000 nm rekkevidde | ||||||||
Tabell 5: NTA-resultater fra humane plasmaavledede elbiler viser effekten av å endre laserkraft og forsterkning på størrelses- og partikkelkonsentrasjonsmålinger av menneskelige elbiler (1:1000 fortynning). D10 er punktet i størrelsesfordelingen der 10 % av prøven finnes, D50 er punktet der 50 % av prøven finnes (median), og D90 er punktet der 90 % av prøven finnes. SD: Standardavvik; CV: Variasjonskoeffisient.
Supplerende figur 1: Skjermbilde av opptakspanel som viser anbefalte opptaksparametere. Få tilgang til avanserte innstillinger for å endre kameraforsterkningen og laserstrømmen til anbefalte innstillinger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Skjermbilde av behandlingspanelet som viser anbefalte behandlingsinnstillinger. Kontroller at det er merket av for Deaktiver overstyring av automatisk gjenkjenning, og at diameteren for funksjonen er satt til 30. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Måling av partikkelstørrelse på tvers av flere fortynninger: Presisjonen til partikkelsporingsinstrumentet (ViewSizer 3000) vs. sammenlignbart kommersielt NTA-instrument (NanoSight NS300). NTA av elbiler isolert fra musperigonadal fettvev ble utført på to instrumenter. For hver mus ble det målt tre fortynninger (1:1000, 1:500, 1:100). Råverdier for tiltak som er truffet på ViewSizer 3000 (vist i denne protokollen) vises i Supplerende tabell 1. Opptaks- og analyseinnstillinger for NanoSight NS300-tiltakene vises i Supplerende tabell 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Representativ elektromikroskopi av negativ flekk (TEM) av humane plasmaavledede elbiler. Gitter ble avbildet med et transmisjonselektronmikroskop som opererer ved 100 kV akselererende spenning. Bilder ble tatt på et 2K x 2K CCD-kamera. Skalalinjen gjenspeiler forstørrelsen på kameraet. Elektronmikrografer viser runde vesicles ~ 25 nm i diameter. 100k forstørrelse, skala bar 200 nm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: ViewSizer 3000 partikkelstørrelse og konsentrasjonsmålinger av musperigonadale fettvev-ELBILER over flere fortynninger. NTA av elbiler isolert fra mus perigonadal fettvev ble utført. For hver mus ble det målt tre fortynninger (1:1000, 1:500, 1:100). D10 er punktet i størrelsesfordelingen der 10 % av prøven finnes, D50 er punktet der 50 % av prøven finnes (median), og D90 er punktet der 90 % av prøven finnes. Partikkelkonsentrasjoner er bakgrunnskorrigert. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2: NanoSight NS300 innstillinger for fangst og analyse. Innstillinger (ved hjelp av NTA 3.4 Build 3.4.003) som brukes til å måle musperigonadale fettvev EV-prøver rapportert i supplerende figur 3. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en protokoll for NTA av elbiler for å måle størrelsesfordelingen av et bredt spekter av partikkelstørrelser samtidig og måle total EV-konsentrasjon i en polydisperseprøve. I denne studien ble musperigonadal fettvev og humant plasma brukt som kilde til elbiler. Imidlertid kan elbiler isolert fra andre vev eller biologiske væsker som serum, urin, spytt, morsmelk, fostervann og cellekultur supernatant også brukes til NTA. Målinger av polystyrenperlestandarder sørget for at instrumentet ble riktig kalibrert og demonstrert at dette NTA-instrumentet riktig kan måle størrelsen på nanopartikler ≤400 nm. Ulike fortynninger av et musevev EV-prøve ble deretter testet. Som vist i figur 9,skaleres den rapporterte partikkelkonsentrasjonen tilsvarende med fortynningsfaktoren, som forventet, og viser at instrumentet nøyaktig kan oppdage partikkelkonsentrasjonen ved ulike fortynninger med liten variasjon mellom tekniske replikeringer. Dette var imidlertid når du arbeidet med partikkelkonsentrasjoner innenfor instrumentets arbeidsområde (5 x 106 til 2 x 108 partikler per ml); Riktig fortynning av en prøve er et kritisk trinn i protokollen. Justering for fortynningsfaktoren ga omtrent samme estimat for den totale partikkelkonsentrasjonen av prøven, med en CV på 15,1 over de fire fortynningsprøvene som ble testet. Også forskjellige tiltak, gjentatt på flere fortynninger av de samme prøvene, viste presisjonen i partikkelstørrelsesfordelingsvurderingene, da partikkelkonsentrasjoner skalert proporsjonalt med fortynningsfaktoren, men rapporterte størrelsestiltak ikke gjorde det.
Elbiler i suspensjon gjennomgår tilfeldig termisk bevegelse kjent som Brownian bevegelse, ifølge hvilken spredningen av partikler i en flytende suspensjon er omvendt proporsjonal med deres størrelse. Denne tilfeldige bevegelsen er modellert av Stokes-Einstein-ligningen, hvor den hydrodynamiske diameteren D til en sfærisk partikkel er:
Der kB er Boltzmann-konstanten og R er partikkelradiusen. Som man kan se fra ligningen, avhenger partikkelbevegelse i suspensjon også av temperaturen (T) og dynamisk viskositet (η) av væsken. Under NTA bestråles elbiler med fokuserte laserstråler som passerer gjennom partiklene i suspensjon og oppdages av hendelsesbelysningen som kommer fra laserne. Lyset spredt av hver enkelt partikkel er fokusert av et mikroskop på bildesensoren til et høyoppløselig, lysfølsomt ladekoblet enhetskamera (CCD), som tar opp digitale bilder av partiklenes spredte lys (figur 1). NTA-programvaren identifiserer og sporer brownsk bevegelse av hver enkelt partikkel for å beregne diffusjonskoeffisienten til hver partikkel. Dette brukes sammen med temperaturen og viskositeten til væsken som inneholder partiklene for å beregne partikkeldiameter ved hjelp av Stokes-Einstein-ligningen. Dermed kan en enkelt måling bestemme to kritiske informasjonsstykker: partikkelstørrelsesfordeling og totalt partikkelantall elbiler i suspensjon.
En sammenligning av NTA med andre teknikker for å oppdage og kvantifisere elbiler er beskrevet andre steder31,32. Sammenlignet med andre lysspredningsbaserte metoder som dynamisk lysspredning (DLS), har NTA høyere løsningsevner og er en spesielt kraftig metode for å analysere partikler med en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 100 nm. I motsetning til enkeltpartikkelanalyser som TEM, er NTA ikke tidkrevende eller teknisk utfordrende og kan fenotype en hel prøve i et relativt lavt volum samtidig på en halvautomatisk måte. Mens NTA er en kraftig karakteriseringsteknikk, har den begrensninger. For det første er NTA underlagt følsomhetsgrenser på grunn av den sterke nedgangen i intensiteten av spredt lysskalering med partikkeldiameter, noe som får det spredte lyset fra svært små partikler til å forsvinne under bakgrunnsstøyen33. Dermed har NTA redusert følsomheten for elbiler mindre enn ~ 50 nm31 og resulterer i en overestimering av EV-størrelser. Korte bølgelengdelasere er nødvendig for å oppdage de mindre partiklene i en polydisperseprøve på grunn av deres lysspredningspotensial. Imidlertid tilbyr dette partikkelsporingsinstrumentet en forbedring av denne begrensningen som er knyttet til nanopartikkelsporingsteknologi. Utstyrt med tre variable lyskilder (450 nm, 520 nm, 635 nm), gir dette systemet mulighet for visualisering av partikler over et bredt spekter av størrelser, noe som gjør dette instrumentet til et spesielt verdifullt verktøy for NTA-analyser av polydisperseprøver som en heterogen populasjon av elbiler. Likevel, fordi de fleste EV-preps vil være polydisperse i sammensetning og sannsynligvis inneholder urenheter, bør forskerne være klar over at utvalgsavhengige grenser for deteksjon påvirker formen på den totale størrelsesfordelingen og derfor utviser forsiktighet ved tolkning av resultater.
En annen stor begrensning ved NTA er at den måler mer enn bare elbiler. NTA-instrumentet vil oppdage, måle og telle alle partikler som overskrider deteksjonsgrensen, inkludert proteinaggregater, lipoproteiner, cellulært rusk og forurensning forårsaket av fortynningsstoffer. Partikkelkonsentrasjonen i bakgrunnen kan imidlertid korrigeres ved å måle partikkelkonsentrasjonen av fortynningsmiddelet før lasting og måling av en prøve. Vi anbefaler å bruke minst 0,02 μm filtrert PBS og har funnet svært lav partikkelforurensning ved bruk av 3 kDa filtrert PBS. Videre er det mulig å utvide NTA for å måle og analysere fluorescerende merkede elbiler, og overvinne begrensningen av ikke-spesifikk måling. Kommersielle sett er tilgjengelige som spesifikt og effektivt farger membranene til intakte vesikler, unntatt membranfragmenter, proteinaggregater og andre partikler fra NTA-målingen. Dermed representerer dataene avledet fra fluorescerende NTA mer nøyaktig den sanne EV-konsentrasjonen og størrelsesfordelingen. Gjennom selektiv merking av EV-overflateantigener kan fluorescerende NTA også måle spesifikke elbiler merket med fluorescerende merkede antistoffer, noe som muliggjør telling og størrelse av antigenspesifikke, biologisk relevante EV-subpopulasjoner.
Det har vært lite arbeid med standardisering av NTA-protokoller, noe som gjør sammenlignbarhet av resultater vanskelig og hindrer reproduserbarhet på tvers av prøver, dager, operatører og laboratorier. Partikkelsporingsinstrumentet som er demonstrert i denne protokollen krever lite praktisk tid. Vi har også merket oss hvilke instrumentinnstillinger brukerne bør rapportere for å lette reproduserbarheten av genererte data. Dermed bør det å følge den optimaliserte protokollen som er lagt frem her resultere i standardisering og muliggjøre sammenligning av resultater på tvers av laboratorier. En annen fordel med å bruke dette instrumentet er at prøven fremstilles i en cuvette, noe som gjør at instrumentet gjentatte ganger kan røre mellom videoer, sikre en statistisk tilfeldig prøve for hver video og gi et mer reproduserbart resultat enn andre kommersielt tilgjengelige NTA-instrumenter som er avhengige av sprøytepumper og strømningsceller. Også flere lasere tillater deteksjon av partikler med varierende brytningsindekser, noe som gir mer robuste resultater. Likevel krever ikke driften av dette partikkelsporingsinstrumentet kunnskap om partikkelmaterialeegenskaper som brytningsindeksen, noe som gjør målinger mer reproduserbare på tvers av operatører.
Elbiler er identifisert i nesten alle biofluider testet2,5. Effektiv isolering av spesifikke elbiler (f.eks. cellespesifikke elbiler) fra forskjellige medier (f.eks. blod, morsmelk, cellekulturmedier) er imidlertid en vanskelig utfordring. Mange forskjellige metoder for EV-isolasjon er beskrevet9. NTA kan utføres for å sammenligne utbyttet av elbiler isolert ved hjelp av ulike metoder og identifisere variasjoner i vesiklene som oppstår fra ulike isolasjonsmetoder. Dette er viktig for å tolke nedstrømsresultater, da funksjonen til ulike EV-delbefolkninger for tiden fortsatt er uklar. Nøyaktig måling av EV-konsentrasjon er også viktig i studier som undersøker om en bestemt behandling, tilstand eller molekyl påvirker EV-frigjøring. For eksempel er gruppen vår interessert i effekten av miljøeksponeringer som svevestøv luftforurensning på EV-innhold og frigjøring. For å vurdere om en tilstand påvirker EV-frigjøring, må antall vesicles kvantifiseres nøyaktig. Ved bruk av elbiler som diagnostiske biomarkører kan konsentrasjonen av elbiler i prøven påvirke analyseresultatene. Dermed er en pålitelig metode for å bestemme partikkelkonsentrasjon og størrelsesfordeling kritisk.
NTA-målinger bør uansett ledsages av andre komplementære teknikker som kan måle partikler uavhengig av de andre partiklene i prøven, for eksempel TEM. Nyere teknologier som mikrofluid resistiv pulsmåling (MRPS) er også lovende for størrelse og telling av elbiler uavhengig av studiens polydispersitet. Ytterligere biokjemiske eller proteomiske analyser av EV-prøver kan brukes i tillegg til størrelses- og konsentrasjonsdata for å klynge delsett av elbiler inn i populasjoner av biologisk betydning. Til slutt er måling av gyldige og reproduserbare partikkelkonsentrasjoner og partikkelstørrelsesfordelinger viktig for EV-feltet. ViewSizer 3000 oppnår nøyaktige og reproduserbare målinger av total EV-konsentrasjon og EV-størrelsesfordeling, selv for svært polydisperse prøver, som vist her. I fremtiden håper vi å se ytterligere strenge eksperimentelle sammenligninger av dette instrumentet med andre NTA-instrumenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærte at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Vi anerkjenner Jeffrey Bodycomb, ph.d. i HORIBA Instruments Incorporated for hans hjelp til å kalibrere instrumentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
