Summary
Demostramos cómo utilizar un nuevo instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas para estimar la distribución del tamaño y la concentración total de partículas de vesículas extracelulares aisladas de tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano.
Abstract
Los roles fisiológicos y fisiopatológicos de las vesículas extracelulares (EV) se han vuelto cada vez más reconocidos, lo que hace que el campo EV sea un área de investigación en rápida evolución. Existen muchos métodos diferentes para el aislamiento de vehículos eléctricos, cada uno con ventajas y desventajas distintas que afectan el rendimiento y la pureza posteriores de los vehículos eléctricos. Por lo tanto, la caracterización de la preparación ev aislada de una fuente dada por un método elegido es importante para la interpretación de los resultados posteriores y la comparación de los resultados entre laboratorios. Existen varios métodos para determinar el tamaño y la cantidad de vehículos eléctricos, que pueden verse alterados por estados de enfermedad o en respuesta a afecciones externas. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es una de las tecnologías prominentes utilizadas para el análisis de alto rendimiento de vehículos eléctricos individuales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la cuantificación y determinación del tamaño de los vehículos eléctricos aislados del tejido adiposo perigonadal de ratón y el plasma humano utilizando una tecnología innovadora para NTA que representa importantes avances en el campo. Los resultados demuestran que este método puede proporcionar datos reproducibles y válidos de concentración total de partículas y distribución de tamaño para vehículos eléctricos aislados de diferentes fuentes utilizando diferentes métodos, como lo confirma la microscopía electrónica de transmisión. La adaptación de este instrumento para NTA abordará la necesidad de estandarización en los métodos de NTA para aumentar el rigor y la reproducibilidad en la investigación de EV.
Introduction
Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas (0,03-2 μm) vesículas unidas a la membrana secretadas por casi todos los tipos de células1. A menudo se les conoce como "exosomas", "microvesículas" o "cuerpos apoptóticos" dependiendo de su mecanismo de liberación y tamaño2. Si bien inicialmente se pensó que los VEHÍCULOS eléctricos eran simplemente un medio para eliminar los desechos de la célula para mantener la homeostasis3,ahora sabemos que también pueden participar en la comunicación intercelular a través de la transferencia de material molecular, incluido el ADN, el ARN (ARNm, microARN), los lípidos y las proteínas4,5, y que son importantes reguladores de la fisiología normal, así como de los procesos patológicos1, 5,6,7,8.
Hay muchos métodos diferentes para aislar y cuantificar los vehículos eléctricos, que se han descrito en otra parte9,10,11,12. El protocolo de aislamiento utilizado, así como la fuente de los vehículos eléctricos, pueden afectar en gran medida el rendimiento y la pureza de los vehículos eléctricos. Incluso la centrifugación diferencial, considerada durante mucho tiempo el enfoque "estándar de oro" para el aislamiento de exosomas, puede estar sujeta a una variabilidad sustancial que posteriormente afecta a la población de EV obtenida y a los análisis posteriores13. Por lo tanto, las diversas metodologías diferentes para el aislamiento y cuantificación de EV dificultan la comparación, reproducción e interpretación de los resultados de los experimentos reportados en la literatura14. Además, la liberación de EV puede ser regulada por condiciones celulares o varios factores externos. Se ha sugerido que los EV desempeñan un papel en el mantenimiento de la homeostasis celular al proteger a las células contra el estrés intracelular15,ya que varios estudios han demostrado que el estrés celular estimula la secreción de EV. Por ejemplo, se ha reportado un aumento de la liberación de EV después de la exposición celular a la hipoxia, el estrés del retículo endoplásmico, el estrés oxidativo, el estrés mecánico, el extracto de humo de cigarrillo y lacontaminacióndel aire por partículas16,17,18 , 19,20,21,22. También se ha demostrado que la liberación de EV se modifica in vivo; los ratones sometidos a una dieta alta en grasas o en ayunas durante dieciséis horas liberaron más vehículos eléctricos de adipocitos23. Para investigar si un tratamiento o afección específica altera la liberación de EV, el número de EV debe determinarse con precisión. La evaluación de la distribución del tamaño de ev también puede indicar el origen subcelular predominante de los EV (por ejemplo, fusión de endosomas tardíos/cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática frente a la brotación de la membrana plasmática)24. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos robustos para medir con precisión la concentración total y la distribución de tamaño de la preparación EV que se está estudiando.
Un método rápido y altamente sensible para la visualización y caracterización de vehículos eléctricos en solución es el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Una explicación detallada de los principios de este método y la comparación con métodos alternativos para la evaluación del tamaño y la concentración de EV se han descrito previamente25,26,27,28. Brevemente, durante la medición NTA, los vehículos eléctricos son visualizados por la luz dispersada cuando se irradian con un rayo láser. La luz dispersa es enfocada por un microscopio en una cámara que registra el movimiento de las partículas. El software NTA rastrea el movimiento térmico aleatorio de cada partícula, conocido como movimiento browniano, para determinar el coeficiente de difusión que se utiliza para calcular el tamaño de cada partícula utilizando la ecuación de Stokes-Einstein. NTA se aplicó por primera vez a la medición de vehículos eléctricos en una muestra biológica en 201125. Hasta hace poco, solo había dos compañías principales que ofrecían instrumentos NTA comerciales29 hasta la introducción del ViewSizer 3000 (en adelante, el instrumento de seguimiento de partículas) que utiliza una combinación de nuevas soluciones de hardware y software para superar las limitaciones significativas de otras técnicas NTA.
El instrumento de seguimiento de partículas caracteriza las nanopartículas en muestras líquidas mediante el análisis de su movimiento browniano y caracteriza partículas más grandes del tamaño de micras mediante el análisis de la sedimentación gravitacional. El sistema óptico único de este instrumento, que incluye iluminación multiespectral con tres fuentes de luz láser (a 450 nm, 520 nm y 635 nm), permite a los investigadores analizar una amplia gama de tamaños de partículas (por ejemplo, exosomas, microvesículas) simultáneamente. En la Figura 1se muestra un esquema de la configuración del instrumento.
Aquí, demostramos cómo realizar mediciones de distribución y concentración del tamaño de partícula de vehículos eléctricos aislados de ratones y humanos utilizando un nuevo instrumento NTA.
Figura 1: Sistema óptico del instrumento de seguimiento de partículas. El instrumento NTA ilumina partículas utilizando tres láseres con las siguientes longitudes de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. La grabación de video de la luz dispersa de partículas individuales es detectada y rastreada por una cámara de video digital orientada a 90 ° desde la cubeta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Todo el trabajo con estas muestras se realizó de conformidad con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y de la Junta de Revisión Institucional. En la figura 2se muestra una descripción general esquemática del método NTA.
Figura 2: Descripción general del método NTA utilizando el instrumento de seguimiento de partículas. La muestra se prepara y se inserta en el instrumento. Se abre el software NTA, se ajustan los parámetros de grabación y se enfoca la muestra. A continuación, los datos se registran, procesan y muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Aislamiento de vesículas extracelulares
NOTA: Los EVs de tejido adiposo perigonadal de ratón fueron aislados como se describió anteriormente23. Los VEHÍCULOS eléctricos plasmáticos se aislaron de 1 ml de plasma humano utilizando el siguiente protocolo:
- Recoge el plasma y la centrífuga a 3.000 x g durante 15 min para eliminar los desechos celulares. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
NOTA: Si los desechos adicionales permanecen detectables, centrifupe el sobrenadante durante 10 minutos adicionales a 12,000 x g y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. - Añadir 67 μL del reactivo de aislamiento de exosomas por 250 μL de plasma. Mezclar bien invirtiendo o moviendo el tubo.
- Incubar en hielo en posición vertical durante 30 min.
- Centrifugar la mezcla de reactivo/plasma de aislamiento de exosomas a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: La centrifugación se puede realizar a temperatura ambiente o 4 °C con resultados similares, pero se prefiere 4 °C. Después de la centrifugación, los vehículos eléctricos pueden aparecer como una bolita beige o blanca en la parte inferior del tubo. - Aspire con cuidado el sobrenadante. Haga girar cualquier solución de aislamiento de exosomas residuales y elimine todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo mucho cuidado de no perturbar los vehículos eléctricos precipitados en el pellet.
- Resuspend el pellet en 200 μL de Buffer B (proporcionado por el fabricante). Mida y registre la concentración de proteínas de la muestra (para el paso 2.8) utilizando un espectrofotómetro, fluorómetro, ensayo de Bradford u otro método preferido.
2. Purificación de vehículos eléctricos aislados
- Agregue 200 μL de búfer A (proporcionado por el fabricante) a los vehículos eléctricos res suspendidos.
- Saque la columna de purificación (provista), afloje el tapón de rosca y cierre el cierre inferior. Coloque la columna en un tubo de recolección.
NOTA: Guarde el cierre inferior para los pasos 2.7-2.9. - Centrifugar a 1.000 x g durante 30 s para eliminar el búfer de almacenamiento.
- Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna en el tubo de recogida.
- Para lavar la columna, retire la tapa y aplique 500 μL de Buffer B sobre la resina y centrífuga a 1.000 x g durante 30 s. Descarta el flujo a través. Guarde el límite para los pasos 2.7-2.9.
- Repita los pasos 2.4-2.5 una vez más para lavar la columna.
- Enchufe la parte inferior de la columna con el cierre inferior (del paso 2.2). Aplique 100 μL de Tampón B sobre la resina para prepararla para la carga de la muestra.
- Agregue todo el contenido del paso 1.6 (o hasta el volumen equivalente de 4 mg de proteína total) a la resina. Coloque el tapón de rosca en la parte superior de la columna.
- Mezclar a temperatura ambiente en un agitador giratorio durante no más de 5 min.
3. Elución de la muestra
- Afloje la tapa de rosca y retire el cierre inferior, y transfiera inmediatamente a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
NOTA: La muestra comenzará a eluyular tan pronto como se retire el cierre inferior. Asegúrese de que los tubos de microcentrífuga de 2 ml estén listos para recibir eluidos para minimizar la pérdida de muestras. - Centrifugar a 1.000 x g durante 30 s para obtener EVs purificados. Descarte la columna.
4. Preparación de muestras para el análisis de seguimiento de nanopartículas
- Use un material sin pelusa como un paño de microfibra para cubrir el espacio de trabajo y evitar que las fibras entren en las cubetas.
- Usando guantes, coloque la cubeta sobre la plantilla de cubeta magnética, luego coloque la barra de agitación en la cubeta. Siempre manipule las cubetas con guantes para evitar que aparezcan huellas dactilares y manchas en la superficie de la cubeta.
- Utilice la herramienta de gancho para colocar el inserto en la cubeta como se muestra en la Figura 3. Es importante tener en cuenta la orientación del inserto para más adelante (Paso 5.4).
Figura 3: Orientación adecuada del inserto dentro de la cubeta de cuarzo. La "muesca" del inserto debe ser visible desde la parte frontal de la cubeta. Esto debe insertarse en el instrumento frente a la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Usando una pipeta, agregue lentamente 400-500 μL de la muestra diluyente o diluida a temperatura ambiente a la cubeta a través del orificio en el inserto. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Evite introducir burbujas de aire.
- Primero prepare una cubeta cargada con el diluyente elegido (en blanco) para medir la concentración de partículas del diluyente. Esto debe hacerse antes de medir la muestra para que se pueda corregir la concentración de fondo de la muestra.
NOTA: Un buen espacio en blanco (solución salina tamponada con fosfato [PBS] en este caso) tendrá una concentración <9 x10 6 (dependiendo del diluyente) y mostrará 1-10 partículas por pantalla en la vista en vivo(Figura 4). Se recomienda que la concentración real de partículas de la muestra sea al menos 3 veces la concentración de fondo. - Opcionalmente, antes de registrar la muestra, cebar la cubeta con 400-500 μL del diluyente o la muestra diluida antes de medir. Para hacerlo, cargue 400-500 μL de la muestra diluida en la cubeta, deseche la solución y luego agregue 400-500 μL más de la muestra para la medición. Esto puede ayudar a eliminar los residuos dentro de la cubeta.
- Primero prepare una cubeta cargada con el diluyente elegido (en blanco) para medir la concentración de partículas del diluyente. Esto debe hacerse antes de medir la muestra para que se pueda corregir la concentración de fondo de la muestra.
Figura 4: Vista representativa de transmisión en vivo de un diluyente dentro del rango de concentración adecuado de un espacio en blanco. Preparaciones EV diluidas en PBS filtrado (0.02 μm o 3 kDa, preferido). Un buen espacio en blanco mostrará ~ 1-10 partículas por pantalla en la vista en vivo, produciendo una concentración dentro del rango 105-106. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Tapa la cubeta y comprueba si hay burbujas. Toca las burbujas si es necesario. Use un paño sin pelusa para limpiar las caras exteriores de la cubeta.
5. Procedimiento de arranque del instrumento de seguimiento de partículas
- Encienda la estación de trabajo y el instrumento de la computadora, espere unos minutos antes de ejecutar la primera muestra e inicie el programa haciendo clic en el icono del software. Cuando se le solicite, haga clic en NTA en la pantalla para realizar el análisis de seguimiento de nanopartículas. Comience en la pestaña Grabación y haga clic en las diversas pestañas de software(Grabar, Procesar, Trazar)para cambiar entre ellas a lo largo del protocolo. Registre la muestra (preparación de diluyente o EV) primero, luego procese las grabaciones y finalmente trace los resultados.
- Siga las instrucciones en pantalla para completar toda la información necesaria sobre la muestra. Verifique que todos los campos necesarios estén completados y sean precisos, es decir, Nombre de la muestra, Descripción, Preparación de la muestra, Factor de dilución [1000], Temperatura objetivo (Establecida en 22 ° C) y Diluyente: Seleccione el diluyente en el menú desplegable y use PBS como diluyente para los vehículos eléctricos. Al seleccionar PBS en el menú desplegable, se rellenará automáticamente la salinidad al 9%. Esta información es necesaria para determinar la viscosidad dinámica del líquido.
NOTA: La temperatura puede tardar hasta 3 minutos en equilibrarse dentro de la cubeta, incluso si la sonda ya muestra la temperatura deseada (es decir, el punto verde se vuelve estable). Las lecturas de la muestra podrían variar considerablemente si no se establece la temperatura objetivo, ya que las diferencias de temperatura de la muestra podrían alterar en gran medida el movimiento browniano de las partículas. - Abra la tapa del instrumento y retire la tapa protectora que cubre la cuvette donde se colocará la cubeta.
PRECAUCIÓN: El instrumento de seguimiento de partículas está certificado como un producto láser de Clase 1 (21 CFR Ch. I parte 1040), que contiene láseres que pueden ser peligrosos y podrían causar lesiones graves, como quemaduras y / o daños permanentes a la vista. Para evitar accidentes o lesiones, no retire la cubierta del instrumento desenroscando los pernos de un lado. Tenga en cuenta que durante la operación, los rayos láser están completamente cerrados, lo que no representa una amenaza para los usuarios. Además, un enclavamiento de seguridad magnético está integrado en el soporte de muestra del instrumento para evitar que los láseres funcionen cuando se retira la tapa del soporte de muestra. - Coloque la cubeta (del paso 4.3) dentro del instrumento en la orientación correcta (ver Figura 5). Reemplace la tapa sobre la cubeta y cierre la tapa del instrumento. Siempre opere el instrumento con la tapa en su lugar sobre el soporte de la muestra. No deshabilite ni intente eludir la función de enclavamiento de seguridad.
Figura 5: Orientación adecuada de la cubeta dentro del instrumento de seguimiento de partículas. La cara de la cubeta (con la "muesca" del inserto visible) debe estar frente a la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Encienda la cámara haciendo clic en la flecha sobre Streaming.
- Haga clic en la flecha chevron para expandir la configuración de registro. Establezca la potencia de ganancia y láser en valores apropiados para la aplicación. Consulte la Tabla 1 (y la Figura Suplementaria 1)para conocer los parámetros utilizados para el NTA de vehículos eléctricos pequeños (100 nm).
NOTA: Esta configuración avanzada a la que se accede haciendo clic en la flecha chevron puede estar protegida por contraseña. Utilice la misma configuración para el registro y procesamiento del diluyente (en blanco) que la utilizada para las muestras posteriores. - Ajuste el enfoque hasta que las partículas estén correctamente enfocadas. El enfoque debe hacerse en partículas relativamente pequeñas(Figura 6). Para la cuantificación de EV pequeños (consistente con exosomas), se recomiendan los siguientes ajustes de grabación: Velocidad de fotogramas: 30 fps, Exposición: 15 ms, Tiempo de agitación: 5 s, Tiempo de espera: 3 s, Potencia del láser - Azul: 210 mW, Verde: 12 mW, Rojo: 8 mW, Fotogramas por video: 300 cuadros y Ganancia: 30 dB.
NOTA: El usuario puede aumentar el Zoom a 1x y/o aumentar la Ganancia para ayudar con el enfoque. Recuerde restablecer estos parámetros a los valores recomendados antes de grabar videos.
Figura 6:Vistas representativas de transmisión en vivo que muestran el enfoque de partículas. (A) Un ejemplo de vista de transmisión en vivo de partículas no enfocadas. Las partículas tienen un halo similar al resplandor o aparecen borrosas. Ajustar el enfoque. (B) Un ejemplo de vista de transmisión en vivo de partículas en el enfoque adecuado. Las partículas más pequeñas están enfocadas. Comience a grabar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Realice un control de calidad visual para asegurarse de que la muestra está correctamente diluida. Si la muestra está demasiado concentrada, retire la cubeta del instrumento y diluya la muestra secuencialmente. Repita hasta que la muestra se diluya correctamente antes de continuar con el Paso 6.
NOTA: ¡No diluya demasiado la muestra! Siempre haga diluciones secuencialmente. El espacio en blanco ideal mostrará solo unas pocas partículas en la pantalla (1-4) como se muestra en la Figura 4. Con respecto a las muestras EV, una muestra adecuadamente diluida tendrá aproximadamente 20-100 partículas visibles en la pantalla, sin imágenes brillantes o turbias en el fondo (ver Figura 7 como ejemplo). Esto debería dar como resultado una concentración óptima de partículas en el rango de 5 x 106 a 2 x 108 partículas por ml (sin ajustar el factor de dilución).
Figura 7: Vistas representativas de transmisión en vivo que representan diferentes diluciones de partículas. (A) Una vista de transmisión en vivo de ejemplo de una muestra que está demasiado concentrada. Registrar una muestra que está demasiado concentrada producirá resultados inexactos. (B) Un ejemplo de vista de transmisión en vivo de una muestra correctamente diluida. Hay 60-100 partículas visibles en la pantalla y la grabación da como resultado una concentración bruta de 5 x10 6- 2 x 108 partículas / ml. (C) Un ejemplo de vista de transmisión en vivo de una muestra que está demasiado diluida. Si una muestra está tan diluida, no habrá suficientes partículas rastreadas, disminuyendo el tamaño de la muestra y, por lo tanto, los resultados serán estadísticamente inválidos. En este caso, se recomienda aumentar el número de videos grabados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Adquisición de datos de vídeo
- (Opcional) Establezca la configuración de zoom en 0.5x para ahorrar ancho de banda y evitar la pérdida de fotogramas.
- Comience a grabar los videos haciendo clic en Grabar (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de grabación recomendados).
NOTA: De forma predeterminada, el instrumento agitará la muestra durante 5 s, esperará 3 s y, a continuación, grabará durante 10 s antes de repetir este proceso. El tiempo de medición típico para 50 videos es de ~ 15 minutos para grabar y ~ 13 minutos para procesar. - No toque el instrumento mientras graba videos. Asegúrese de que la superficie del banco de laboratorio no esté vibrando.
NOTA: Es preferible que el instrumento se configure en una plataforma o mesa antivibración para reducir cualquier perturbación de vibración del equipo cercano que interfiera con la determinación del movimiento de las nanopartículas. Evite operar centrífugas, mezcladores de vórtice u otros dispositivos potenciales generadores de vibraciones en el mismo banco que el instrumento de seguimiento de partículas. Las vibraciones son fácilmente visibles en la pantalla como el alargamiento de partículas generalmente redondas. Si se expone a vibraciones vigorosas, el instrumento puede requerir la realineación de elementos ópticos. El instrumento no fue diseñado para ser reparado o calibrado por el cliente; póngase en contacto con el fabricante para el mantenimiento, el servicio y la calibración. - Tenga en cuenta cualquier video grabado que tenga partículas muy grandes visibles como manchas blancas grandes e irregulares. Elimine estos videos del procesamiento en el paso 7.3.
7. Tratar los datos adquiridos
- Cuando aparezca un mensaje que indique que se han grabado vídeos, haga clic en Aceptar para completar la grabación. A continuación, seleccione la pestaña Proceso.
NOTA: El protocolo se puede detener aquí. El procesamiento de los datos adquiridos se puede reiniciar más tarde moviéndose directamente a la pestaña Proceso después de abrir el software del instrumento de seguimiento de partículas y especificar el directorio donde se guardan los videos grabados. - Al analizar los vehículos eléctricos, marque la casilla Deshabilitar la anulación de detección automática y establezca el diámetro de la función en 30. Haga clic en Proceso. (Consulte la Tabla 2 para la configuración de procesamiento y la Figura suplementaria 2 para la visualización de procesamiento). Se mostrará un gráfico de distribución en vivo para que el usuario pueda ver el procesamiento en tiempo real.
- Para los exosomas, procese con el umbral de detección establecido en el ejemplo de polidispersopredeterminado . Procese los datos con el Manual de umbral de detección establecido en 0,8 en lugar de un umbral estándar de 0,99 solo para soluciones con diferencias muy grandes en los tamaños de partícula.
- Si algún video tenía partículas notablemente muy grandes visibles (consulte el Paso 6.4), navegue hasta el directorio de videos grabados y elimine el video problemático. Después de editar la lista de archivos de video, cambie el número de videos grabados en otros registros mantenidos por el usuario.
- Una vez finalizado el procesamiento, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione la pestaña Trazar. Para los vehículos eléctricos, muestre el gráfico principal como LogBinSilica.
NOTA: Aquí, en la pestaña Trazar, el usuario puede personalizar otras características del gráfico, como definir el rango del eje x (diámetro de partícula, nm) para establecer el área de integración de la figura producida.
8. Mostrar e interpretar los resultados
- Para crear un informe PDF, haga clic en el botón Informe. La medición ya está completa y se pueden ver los resultados.
NOTA: Recuerde registrar y procesar primero el espacio en blanco para que se pueda corregir la concentración de fondo de las muestras posteriores. Si se olvida este paso, el espacio en blanco se puede registrar después de las muestras y la concentración de partículas de la muestra se corrige manualmente. - Examine el informe PDF que muestra la media, la mediana y el tamaño del modo, así como la concentración ajustada para el factor de dilución y corregida restando la concentración de partículas del diluyente. También se muestra el ancho de distribución (desviación estándar).
NOTA: Hay muy pocas aplicaciones en las que un solo valor sea apropiado y representativo. Por lo tanto, se recomienda describir toda la distribución de tamaño e informar el ancho de la distribución para cualquier muestra analizada (como se muestra en la Tabla 3, por ejemplo). - Registre los siguientes ajustes del instrumento utilizados para generar los datos que deben indicarse al informar los resultados: Diluyente, Potencia láser de cada láser [mW], Exposición [ms], Ganancia [dB], Velocidad de fotogramas [fps], Fotogramas por video, Número de videos grabados, Configuración de procesamiento (por ejemplo, LogBinSilica), Rango de integración [min nm, max nm] (recomendado para establecer min a 50 nm) y Número de partículas rastreadas (deseable para analizar al menos ~ 150 partículas por video; mínimo 3,750 pistas totales por muestra recomendado para evitar picos artificiosos en la distribución del tamaño de partícula y generar datos estadísticamente significativos).
9. Limpieza de las cubetas
- Limpie las cubetas manualmente entre muestras. Primero, vacía la cubeta.
NOTA: La muestra se puede recuperar de la cubeta y guardar o descartar. - Una vez que la cubeta esté vacía, limpie la cubeta enjuagándola 10-15 veces con agua desionización (DI). Luego, enjuague 3 veces con etanol (70-100%). Al hacer esto, asegúrese de llenar completamente la cubeta con disolvente.
- Seque el exterior de la cubeta con un paño de microfibra sin pelusa. Evite las manchas en las superficies. Seque al aire el interior de la cubeta o séquelo con un plumero de aire comprimido.
NOTA: Solo se debe usar papel de limpieza de lentes o paño de microfibra sin pelusa para limpiar las superficies ópticas de la cubeta, ya que la mayoría de los productos de papel contienen pequeñas fibras de madera que pueden rayar o dañar la superficie de la cubeta. - Prepare dos viales de centelleo de vidrio: uno lleno de etanol 70-100% y el otro con agua DI. Enjuague los insertos y revuelva las barras en el etanol primero (luego agua DI) colocando el inserto / barra de agitación en el vial de centelleo apropiado y agitando el vial vigorosamente. Seque los insertos y revuelva las barras con paños sin pelusa o plumeros de aire comprimido.
NOTA: La cubeta y el inserto también se pueden limpiar con un baño de agua sonicante. Para hacerlo, primero asegúrese de que la unidad sonicante contenga suficiente agua (al menos 5 cm de profundidad). Luego coloque la cubeta e insértela dentro de un vaso de precipitados de vidrio (50 ml o más), llene el vaso de precipitados con alcohol al mismo nivel que el baño de agua, coloque el vaso de precipitados en el agua y encienda la alimentación. Sonicar durante un máximo de 5 minutos a la vez, lo que permite que la máquina descanse >5 minutos entre cada ráfaga de 5 minutos si se requieren tiempos más largos. - Cuando termine, coloque inmediatamente todos los componentes limpios y secos para su almacenamiento.
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Representative Results
Antes de esta demostración, la calibración del instrumento se probó por primera vez para garantizar la validez de los datos adquiridos mediante la medición de la distribución de tamaño de los estándares de perlas de poliestireno. Probamos la distribución de tamaño de cuentas de 100 nm y 400 nm utilizando los parámetros de grabación predeterminados y la configuración de procesamiento recomendada en este protocolo (Figura 8).
Para el estándar de perlas de poliestireno de 100 nm, se midió una concentración de 4.205 x10 7 partículas/ml. El tamaño medio (desviación estándar, DE) fue de 102 (±17) nm con un coeficiente de variación (CV) de 0,16. Los valores D10/D50/D90 fueron 76/104/126 nm. Esto indica que el instrumento de seguimiento de partículas informó con precisión el tamaño de las perlas monodisperse de 100 nm. Para el estándar de perlas de poliestireno de 400 nm, la concentración fue de 4,365 x 107 partículas/ml. El tamaño medio (DE) fue de 391 (±47) nm, con un CV de 0,12. Los valores D10/D50/D90 fueron 150/358/456 nm(Tabla 3). Si bien la media reportada está muy cerca del tamaño real de las cuentas, podemos ver que la configuración del instrumento aplicada en este protocolo es más precisa para las partículas más pequeñas ~ 100 nm. Por lo tanto, para partículas mayores de 400 nm, se sugiere optimizar los parámetros del láser. Los investigadores primero deben realizar un método como la microscopía electrónica de transmisión (TEM) para una estimación de la distribución del tamaño ev resultante de una fuente dada y el método de aislamiento antes de NTA.
Se midió una concentración media de 4,41 x10 10 partículas/ml para la muestra ev de tejido de ratón utilizada para esta demostración. Este ejemplo se registró siguiendo los parámetros resumidos en la Tabla 1 y se procesó siguiendo los parámetros descritos en la Tabla 2. Demostramos el impacto de varios factores de dilución en la Figura 9 e informamos las concentraciones de partículas crudas y ajustadas en la Tabla 4. La dilución óptima para los EV derivados del tejido de ratón fue de entre 1.000 y 3.000, mientras que para los EV derivados del plasma humano fue de 1.000, lo que indica que cuando se prueba por primera vez una fuente de biofluido dada o un método de aislamiento de EV para NTA, se deben probar las diluciones en serie para que se pueda identificar la dilución óptima para la medición de NTA. Recomendamos medir e informar al menos dos diluciones diferentes de una muestra. También medimos cuatro muestras adicionales en varias diluciones en dos instrumentos de seguimiento de partículas distintos. La Figura Suplementaria 3 compara la precisión del instrumento de seguimiento de partículas en las mediciones de tamaño en comparación con otro instrumento NTA disponible comercialmente. La Tabla Suplementaria 1 demuestra además la precisión de las mediciones de este instrumento, mostrando que la concentración de partículas cambió proporcionalmente con la dilución de la muestra, pero que las medidas de tamaño de partícula no lo hicieron.
Después del procesamiento, los resultados (junto con la información del instrumento / software, la configuración de grabación y procesamiento, y las notas experimentales) se pueden guardar en un informe .pdf. El histograma incluido en este informe puede modificarse como se describe en el protocolo (sección 7.4). Los resultados sin procesar se guardan en un archivo .dat que se puede exportar. Los videos grabados también se guardan y se pueden usar para el procesamiento y análisis posterior fuera de línea. Sin embargo, una vez que se graban los videos, la configuración de grabación no se puede cambiar retrospectivamente.
El impacto de alterar las diversas potencias y ganancias del láser en la configuración de grabación se demostró utilizando vehículos eléctricos derivados del plasma humano. Esto se visualiza en las Figuras 10-12 y la información cuantitativa basada en estas imágenes se muestra en la Tabla 5. El aumento de la ganancia aumenta la sensibilidad de la cámara, lo que permite la visualización de partículas más pequeñas(Figura 10),lo que resulta en un aumento de la concentración total de partículas con un tamaño de partícula promedio más pequeño(Tabla 5). Sin embargo, aumentar la ganancia por encima de 30 dB (nuestras recomendaciones) hace que la vista sea demasiado granulada, lo que permite que el ruido oscurezca la medición de partículas verdaderas. Con una ganancia de cámara de 30 dB, el efecto de alterar la potencia del láser azul se representa en la Figura 11. El aumento de la potencia del láser azul (450 nm, longitud de onda corta) da como resultado una mayor resolución para detectar partículas más pequeñas (es decir, aquellas con un tamaño consistente con los exosomas). Manteniendo constantes las potencias láser verde y roja en la configuración predeterminada, el aumento de la potencia del láser azul de 70 mW a 210 mW cambió el tamaño promedio de partícula reportado de 122 nm a 105 nm y aumentó la concentración total de partículas reportada de 1.1 x 108 a 1.7 x 108 (Tabla 5).
También se demostró el efecto de aumentar las potencias del láser verde y rojo(Figura 12). El aumento de la potencia del láser rojo (650 nm, longitud de onda larga) aumentó el tamaño promedio de partícula reportado de 175 a 246 nm. La concentración total de partículas reportada disminuyó, pero eso se debe a que en esta muestra ev de plasma humano no teníamos muchas partículas grandes presentes, confirmadas por tinción TEM negativa(Figura suplementaria 4). El aumento de la potencia del láser verde resultó en una disminución en el tamaño promedio de partícula reportado y un aumento en la concentración total de partículas reportada. Por lo tanto, el usuario puede optimizar la potencia de los tres láseres para detectar sensiblemente partículas de varios tamaños.
Este protocolo está optimizado para vesículas más pequeñas (por ejemplo, <400 nm). Se alienta a los investigadores interesados en microvesículas de tamaños más grandes (por ejemplo, 400-1000 nm) a optimizar los parámetros del láser utilizando perlas organosílicas huecas que tienen propiedades de dispersión de la luz similares a las de los vehículos eléctricos, lo que las convierte en una referencia más adecuada que los estándares de poliestireno o perlas de sílice30. Sin embargo, las nanopartículas de sílice pueden ser el mejor sustituto práctico hasta que los estándares organosílicas estén más ampliamente disponibles.
Aquí, se utilizó un instrumento NTA para cuantificar con éxito los vehículos eléctricos aislados del tejido de ratón por ultracentrifugación y plasma humano mediante el uso de un kit comercial. Los efectos de la alteración de los parámetros NTA se ilustraron y muestran que los parámetros de este protocolo están optimizados para vesículas pequeñas. También se mostró la importancia del paso de dilución y muestra que el instrumento de seguimiento de partículas demostrado aquí puede detectar con precisión las variaciones en los factores de dilución. La concentración cambió proporcionalmente con múltiples diluciones, mientras que la distribución de tamaño no lo hizo. Los datos resultantes mostraron poca variabilidad técnica. Por lo tanto, la adaptación de este protocolo por parte de los investigadores que utilizan este instrumento para NTA aumentará el rigor y la reproducibilidad en el campo de investigación de EV.
Figura 8: Distribuciones de tamaño de partícula de los estándares de perlas de poliestireno monodisperso. (A) Distribución del tamaño de partícula de 100 nm estándar de perlas de poliestireno. (B) Distribución del tamaño de partícula del estándar de perlas de poliestireno de 400 nm. Los valores se informan en la Tabla 3. El recuadro muestra una vista de transmisión en vivo de ejemplo del primer fotograma medido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Concentraciones totales brutas de partículas por factor de dilución para los EVs de tejido adiposo perigonadal de ratón. Las barras de error representan la desviación estándar. Se tomaron tres medidas para cada dilución. Los valores se informan en la Tabla 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Impacto visual del aumento de la ganancia. Imágenes representativas de partículas medidas con la configuración láser predeterminada (azul = 70 mW, verde = 12 mW, rojo = 8 mW) y ganancia establecida en (A) 18 dB, (B) 24 dB - predeterminado y (C) 30 dB - recomendado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11:Efecto del láser azul en partículas pequeñas cuando los láseres rojo y verde se establecen en la configuración predeterminada. (A) Láser azul = 70 mW (por defecto). (B) Láser azul = 210 mW (recomendado). Más partículas pequeñas son visibles y están enfocadas cuando la potencia del láser azul se incrementa a 210 mW. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12:Impacto visual de la potencia láser azul, verde y roja alterada. Las vistas representativas de la pantalla en vivo representan los diferentes tamaños de partículas visualizados en diferentes configuraciones de láser. Los valores de NTA resultantes se informan en la Tabla 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Partículas | Diámetro [nm] | Láser azul [mW] | Láser verde [mW] | Láser rojo [mW] | Ganancia de cámara [dB] | Regulación de temperatura | Tratamiento | # Videos |
| Exosomas | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Habilitado, establecido en 22 ºC | Anulación de detección automática deshabilitada | 50 |
Tabla 1: Parámetros de registro para vesículas extracelulares pequeñas (~100 nm).
| Descripción del proceso | Umbral de detección | Deshabilitar la anulación de detección automática | Diámetro de la función [px] |
| Exosomas | Muestra de polidisperso | Comprobado | 30 |
Tabla 2: Parámetros de procesamiento para vesículas extracelulares pequeñas (~100 nm).
| Tamaño del estándar de poliestireno [nm] | Rango de integración [nm] | Tamaño medio [nm] | Tamaño SD [nm] | CV de talla | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Recuentos totales |
| 100 | De 50 a 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | De 300 a 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabla 3: Resultados de NTA de los estándares de perlas de poliestireno monodisperso. Ambos estándares se diluyeron de manera óptima, con concentraciones brutas para el estándar de 100 nm y el estándar de 400 nm de 4.205 x 107 partículas / ml y 4.365 x 107 partículas / ml, respectivamente. D10 es el punto en la distribución de tamaño donde está contenido el 10% de la muestra, D50 es el punto donde está contenido el 50% de la muestra (mediana), y D90 es el punto donde está contenido el 90% de la muestra. DE: Desviación estándar; CV: Coeficiente de variación.
| Factor de dilución | Concentración de partículas, partículas/ml | Concentración total de partículas, partículas/ml |
| Crudo | Ajustado por factor de dilución | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4.10E+10 |
| 4.00E+07 | 4.00E+10 | |
| 3.70E+07 | 3.70E+10 | |
| media (DE) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3.60E+07 | 5.40E+10 |
| 2.60E+07 | 3.80E+10 | |
| 2.90E+07 | 4.40E+10 | |
| media (DE) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4.55E+10 (6.60E+09) |
| 2000 | 2.40E+07 | 4.80E+10 |
| 2.30E+07 | 4.60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4.00E+10 | |
| media (DE) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1.30E+07 | 3.90E+10 | |
| 1.40E+07 | 4.20E+10 | |
| media (DE) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4.71E+10 (9.27E+09) |
Tabla 4: Los resultados de NTA de los EVs de tejido adiposo perigonadal de ratón demuestran la reproducibilidad de las mediciones de NTA. Concentraciones brutas de partículas NTA (partículas/ml) medidas en el instrumento de seguimiento de partículas y concentración total de partículas (partículas/ml) ajustadas para el factor de dilución de los VEHÍCULOS eléctricos derivados del tejido adiposo perigonadal de ratón en varias diluciones.
| Ganancia [dB] | Láser azul [mW] | Láser verde [mW] | Láser rojo [mW] | Concentración total, partículas/ml (en bruto) | Tamaño medio [nm]* | Desviación estándar de tamaño / CV | Tamaño modal | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1.50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integrado dentro del rango de 50-1000 nm | ||||||||
Tabla 5: Los resultados de NTA de los vehículos eléctricos derivados del plasma humano demuestran el efecto de alterar la potencia y la ganancia del láser en las mediciones de tamaño y concentración de partículas de los vehículos eléctricos humanos (dilución 1:1000). D10 es el punto en la distribución de tamaño donde está contenido el 10% de la muestra, D50 es el punto donde está contenido el 50% de la muestra (mediana), y D90 es el punto donde está contenido el 90% de la muestra. DE: Desviación estándar; CV: Coeficiente de variación.
Figura suplementaria 1: Captura de pantalla del panel de grabación que muestra los parámetros de grabación recomendados. Acceda a la configuración avanzada para cambiar la ganancia de la cámara y la potencia del láser a la configuración recomendada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Captura de pantalla del panel de procesamiento que muestra la configuración de procesamiento recomendada. Asegúrese de que la opción "Deshabilitar anulación de detección automática" esté marcada y que el diámetro de la función esté establecido en "30". Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: Mediciones del tamaño de partícula en múltiples diluciones: Precisión del instrumento de seguimiento de partículas (ViewSizer 3000) frente al instrumento NTA comercial comparable (NanoSight NS300). El NTA de los vehículos eléctricos aislados del tejido adiposo perigonadal del ratón se realizó en dos instrumentos. Para cada ratón, se midieron tres diluciones (1:1000, 1:500, 1:100). Los valores brutos para las medidas tomadas en el ViewSizer 3000 (demostrado en este protocolo) se muestran en la Tabla suplementaria 1. Los ajustes de captura y análisis para las medidas de NanoSight NS300 se muestran en la Tabla suplementaria 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Microscopía electrónica de transmisión por tinción negativa (TEM) representativa de vehículos eléctricos derivados del plasma humano. Las rejillas fueron fotografiadas con un microscopio electrónico de transmisión que opera a un voltaje de aceleración de 100 kV. Las imágenes fueron capturadas en una cámara CCD 2K x 2K. La barra de escala refleja la ampliación de la cámara. Las micrografías electrónicas muestran vesículas redondas de ~ 25 nm de diámetro. Aumento de 100k, barra de escala 200 nm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: ViewSizer 3000 mediciones de tamaño de partícula y concentración de vehículos eléctricos de tejido adiposo perigonadal de ratón a través de múltiples diluciones. Se realizó NTA de EVs aislados de tejido adiposo perigonadal de ratón. Para cada ratón, se midieron tres diluciones (1:1000, 1:500, 1:100). D10 es el punto en la distribución de tamaño donde está contenido el 10% de la muestra, D50 es el punto donde está contenido el 50% de la muestra (mediana), y D90 es el punto donde está contenido el 90% de la muestra. Las concentraciones de partículas se corrigen en el fondo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria 2: Configuración de captura y análisis de NanoSight NS300. Ajustes (utilizando NTA 3.4 Build 3.4.003) utilizados para medir muestras de EV de tejido adiposo perigonadal de ratón informadas en la Figura Suplementaria 3. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Aquí, demostramos un protocolo para NTA de EV para medir la distribución de tamaño de una amplia gama de tamaños de partículas simultáneamente y medir la concentración total de EV en una muestra polidispersa. En este estudio, se utilizó tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano como fuente de vehículos eléctricos. Sin embargo, los VEHÍCULOS eléctricos aislados de otros tejidos o fluidos biológicos como suero, orina, saliva, leche materna, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular también se pueden usar para NTA. Las mediciones de los estándares de perlas de poliestireno aseguraron que el instrumento estuviera calibrado adecuadamente y demostraron que este instrumento NTA puede medir correctamente el tamaño de las nanopartículas ≤400 nm. Luego se probaron varias diluciones de una muestra EV de tejido de ratón. Como se muestra en la Figura 9,la concentración de partículas reportada escala en consecuencia con el factor de dilución, como se esperaba, lo que demuestra que el instrumento puede detectar con precisión la concentración de partículas en varias diluciones con poca variabilidad entre réplicas técnicas. Sin embargo, esto fue cuando se trabajó con concentraciones de partículas dentro del rango de trabajo del instrumento (5 x 106 a 2 x 108 partículas por ml); diluir adecuadamente una muestra es un paso crítico en el protocolo. El ajuste por el factor de dilución arrojó aproximadamente la misma estimación para la concentración total de partículas de la muestra, con un CV de 15,1 en las cuatro diluciones probadas. Además, diferentes medidas, repetidas en múltiples diluciones de las mismas muestras, mostraron la precisión en las evaluaciones de distribución del tamaño de partícula, ya que las concentraciones de partículas se escalaron proporcionalmente con el factor de dilución, pero las medidas de tamaño informadas no lo hicieron.
Los vehículos eléctricos en suspensión experimentan un movimiento térmico aleatorio conocido como movimiento browniano, según el cual la difusión de partículas en una suspensión líquida es inversamente proporcional a su tamaño. Este movimiento aleatorio es modelado por la ecuación de Stokes-Einstein, donde el diámetro hidrodinámico D de una partícula esférica es:
Donde kB es la constante de Boltzmann y R es el radio de partícula. Como se puede ver en la ecuación, el movimiento de partículas en suspensión también depende de la temperatura (T) y la viscosidad dinámica (η) del líquido. Durante la NTA, los vehículos eléctricos se irradian con rayos láser enfocados que pasan a través de las partículas en suspensión y son detectados por la iluminación incidente proveniente de los láseres. La luz dispersada por cada partícula individual es enfocada por un microscopio en el sensor de imagen de una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) de alta resolución y sensible a la luz, que registra imágenes digitales de la luz dispersa de las partículas(Figura 1). El software NTA identifica y rastrea el movimiento browniano de cada partícula individual para calcular el coeficiente de difusión de cada partícula. Esto se utiliza junto con la temperatura y la viscosidad del líquido que contiene las partículas para calcular el diámetro de las partículas utilizando la ecuación de Stokes-Einstein. Por lo tanto, una sola medición puede determinar dos piezas críticas de información: la distribución del tamaño de partícula y el recuento total de partículas de los vehículos eléctricos en suspensión.
Una comparación de NTA con otras técnicas para detectar y cuantificar los EVs se ha descrito en otra parte31,32. En comparación con otros métodos basados en la dispersión de luz, como la dispersión dinámica de luz (DLS), NTA tiene mayores capacidades de resolución y es un método particularmente poderoso para analizar partículas con un diámetro medio de menos de 100 nm. A diferencia del análisis de una sola partícula como TEM, NTA no consume mucho tiempo ni es técnicamente desafiante y puede fenotipar una muestra completa en un volumen relativamente bajo a la vez de manera semiautomatizada. Si bien NTA es una técnica de caracterización poderosa, tiene limitaciones. En primer lugar, el NTA está sujeto a límites de sensibilidad debido a la fuerte disminución de la intensidad de la escala de luz dispersa con el diámetro de las partículas, lo que hace que la luz dispersa de partículas muy pequeñas desaparezca por debajo del ruido de fondo33. Por lo tanto, NTA ha reducido la sensibilidad para vehículos eléctricos menores de ~ 50 nm31 y da como resultado una sobreestimación de los tamaños de EV. Se necesitan láseres de longitud de onda corta para detectar las partículas más pequeñas de una muestra polidispersa debido a su potencial de dispersión de la luz. Sin embargo, este instrumento de seguimiento de partículas ofrece una mejora de esta limitación inherente a la tecnología de seguimiento de nanopartículas. Equipado con tres fuentes de luz variables (450 nm, 520 nm, 635 nm), este sistema permite la visualización de partículas en una amplia gama de tamaños, lo que convierte a este instrumento en una herramienta particularmente valiosa para los análisis NTA de muestras polidispersas, como una población heterogénea de vehículos eléctricos. No obstante, debido a que la mayoría de las preparaciones para EV serán polidispersas en composición y probablemente contengan impurezas, los investigadores deben ser conscientes de que los límites de detección dependientes de la muestra afectan la forma de la distribución general del tamaño y, por lo tanto, tener cuidado al interpretar los resultados.
Otra limitación importante de NTA es que mide más que solo vehículos eléctricos. El instrumento NTA detectará, medirá y contará todas las partículas que excedan el límite de detección, incluidos los agregados de proteínas, lipoproteínas, desechos celulares y contaminación causada por diluyentes. Sin embargo, la concentración de partículas en el fondo se puede corregir midiendo la concentración de partículas del diluyente antes de cargar y medir una muestra. Recomendamos usar al menos PBS filtrado de 0.02 μm y hemos encontrado una contaminación por partículas muy baja cuando se usa PBS filtrado de 3 kDa. Además, es posible extender el NTA para medir y analizar vehículos eléctricos etiquetados fluorescentemente, superando la limitación de la medición no específica. Hay kits comerciales disponibles que tiñen específica y eficientemente las membranas de vesículas intactas solamente, excluyendo fragmentos de membrana, agregados de proteínas y otras partículas de la medición de NTA. Por lo tanto, los datos derivados de NTA fluorescente representan con mayor precisión la verdadera concentración de EV y la distribución del tamaño. A través del etiquetado selectivo de antígenos de superficie EV, el NTA fluorescente también puede medir EV específicos marcados por anticuerpos marcados fluorescentemente, lo que permite el conteo y el tamaño de subpoblaciones EV específicas de antígeno y biológicamente relevantes.
Ha habido poco trabajo en la estandarización de los protocolos NTA, lo que dificulta la comparabilidad de los resultados y dificulta la reproducibilidad entre muestras, días, operadores y laboratorios. El instrumento de seguimiento de partículas demostrado en este protocolo requiere poco tiempo práctico. También hemos observado qué configuraciones de instrumentos deben informar los usuarios para facilitar la reproducibilidad de los datos generados. Por lo tanto, seguir el protocolo optimizado establecido aquí debería resultar en la estandarización y permitir la comparación de resultados entre laboratorios. Otra ventaja de usar este instrumento es que la muestra se prepara en una cubeta, lo que permite que el instrumento se revuelva repetidamente entre videos, asegurando una muestra estadísticamente aleatoria para cada video y produciendo un resultado más reproducible que otros instrumentos NTA disponibles comercialmente que dependen de bombas de jeringa y celdas de flujo. Además, los múltiples láseres permiten la detección de partículas con índices de refracción variables, lo que produce resultados más robustos. Sin embargo, el funcionamiento de este instrumento de seguimiento de partículas no requiere el conocimiento de las propiedades del material de partículas, como el índice de refracción, lo que hace que las mediciones sean más reproducibles entre los operadores.
Los vehículos eléctricos se han identificado en casi todos los biofluidos probados2,5. Sin embargo, el aislamiento efectivo de vehículos eléctricos específicos (por ejemplo, vehículos eléctricos específicos de tipo celular) de diferentes medios (por ejemplo, sangre, leche materna, medios de cultivo celular) presenta un desafío difícil. Se han descrito muchos métodos diferentes para el aislamiento de EV9. La NTA se puede realizar para comparar los rendimientos de los vehículos eléctricos aislados utilizando diferentes métodos e identificar variaciones en las vesículas que surgen de diferentes métodos de aislamiento. Esto es importante para interpretar los resultados posteriores, ya que actualmente la función de las diferentes subpoblaciones de vehículos eléctricos sigue sin estar clara. La medición precisa de la concentración de EV también es importante en los estudios que investigan si un determinado tratamiento, condición o molécula afecta la liberación de EV. Por ejemplo, nuestro grupo está interesado en el impacto de las exposiciones ambientales, como la contaminación del aire por partículas, en el contenido y la liberación de vehículos eléctricos. Para evaluar si una condición afecta la liberación de EV, el número de vesículas debe cuantificarse con precisión. Cuando se utilizan vehículos eléctricos como biomarcadores de diagnóstico, la concentración de vehículos eléctricos en la muestra podría afectar los resultados del ensayo. Por lo tanto, un método confiable para determinar la concentración de partículas y la distribución del tamaño es crítico.
En cualquier caso, las mediciones de NTA deben ir acompañadas de otras técnicas complementarias que puedan medir partículas independientemente de las otras partículas de la muestra, como TEM. Las tecnologías más nuevas, como la detección de pulsos resistivos microfluídicos (MRPS), también son prometedoras para el dimensionamiento y el recuento de vehículos eléctricos independientemente de la polidispersidad de la muestra. Se pueden utilizar análisis bioquímicos o proteómicos adicionales de muestras de VEHÍCULOS eléctricos, además de los datos de tamaño y concentración, para agrupar subconjuntos de vehículos eléctricos en poblaciones de importancia biológica. En conclusión, medir las concentraciones de partículas válidas y reproducibles y las distribuciones de tamaño de partícula es importante para el campo EV. El ViewSizer 3000 logra mediciones precisas y reproducibles de la concentración total de EV y la distribución del tamaño de EV, incluso para muestras altamente polidispersas, como se demuestra aquí. En el futuro esperamos ver más comparaciones experimentales rigurosas de este instrumento con otros instrumentos NTA.
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Disclosures
Todos los autores declararon que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Reconocemos a Jeffrey Bodycomb, Ph.D. de HORIBA Instruments Incorporated por su ayuda en la calibración del instrumento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
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