Summary
Vi visar hur man använder ett nytt nanopartiklar spårning analys instrument för att uppskatta storleksfördelningen och den totala partikelkoncentrationen av extracellulära blåsor isolerade från mus perigonadal fettvävnad och human plasma.
Abstract
De fysiologiska och patofysiologiska rollerna hos extracellulära blåsor (EVs) har blivit alltmer erkända, vilket gör EV-fältet till ett snabbt föränderligt forskningsområde. Det finns många olika metoder för EV-isolering, var och en med distinkta fördelar och nackdelar som påverkar EVs nedströms avkastning och renhet. Att karakterisera EV-prep isolerad från en viss källa med en vald metod är därför viktigt för tolkning av resultat i efterföljande led och jämförelse av resultat mellan laboratorier. Det finns olika metoder för att bestämma storlek och mängd av EVs, som kan ändras av sjukdomstillstånd eller som svar på yttre förhållanden. Nanopartikelspårningsanalys (NTA) är en av de framstående teknikerna som används för analys av enskilda EVs med hög genomströmning. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för kvantifiering och storleksbestämning av EVs isolerade från mus perigonadal fettvävnad och human plasma med hjälp av en genombrottsteknik för NTA som representerar stora framsteg inom området. Resultaten visar att denna metod kan ge reproducerbara och giltiga totala partikelkoncentrations- och storleksfördelningsdata för EVs som isolerats från olika källor med olika metoder, vilket bekräftas av transmissionselektronmikroskopi. Anpassningen av detta instrument för NTA kommer att ta itu med behovet av standardisering i NTA-metoder för att öka stringensen och reproducerbarheten i EV-forskningen.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är små (0,03-2 μm) membranbundna blåsor utsöndras av nästan alla celltyper1. De kallas ofta "exosomer", "mikrovesicles" eller "apoptotiska kroppar" beroende på deras mekanism för frisättning och storlek2. Medan man ursprungligen trodde att EVs helt enkelt var ett sätt att eliminera avfall från cellen för att upprätthålla homeostas3, vet vi nu att de också kan delta i intercellulär kommunikation via överföring av molekylärt material - inklusive DNA, RNA (mRNA, mikroRNA), lipider ochproteiner 4,5 - och att de är viktiga regulatorer av normal fysiologi samt patologiska processer1, 5,6,7,8.
Det finns många olika metoder för att isolera och kvantifiera EVs, som har beskrivits någonannanstans 9,10,11,12. Isoleringsprotokollet som används samt källan till EVs kan i hög grad påverka EV-utbytet och renheten. Även differentiell centrifugation, som länge betraktats som "guldstandardmetoden" för exosomisolering, kan bli föremål för betydande variationer som därefter påverkar den ev-population som erhållits och nedströmsanalyser13. Således gör de olika metoderna för EV-isolering och kvantifiering det svårt att jämföra, reproducera och tolka resultat av experiment som rapporteras i litteraturen14. Dessutom kan EV-frisättning regleras av cellulära förhållanden eller olika externa faktorer. Det har föreslagits att EVs spelar en roll för att upprätthålla cellulära homeostas genom att skydda celler mot intracellulär stress15, eftersom flera studier har visat att cellulär stress stimulerar EV utsöndring. Till exempel har ökad EV-frisättning rapporterats efter cellulär exponering för hypoxi, endoplasmisk retikulumstress, oxidativ stress, mekanisk stress, cigarettrökextrakt och partiklarluftföroreningar 16,17,18,19,20,21,22. Ev-utsläpp har också visat sig vara modifierat in vivo; möss som utsätts för en fettrik kost eller fasta i sexton timmar släppte ut mer adipocyt EVs23. För att undersöka om en specifik behandling eller ett visst tillstånd förändrar ev-frisättningen måste antalet elfordon bestämmas noggrant. Bedömning av fördelningen av ev-storlek kan också ange det dominerande subcellulära ursprunget för EVs (t.ex. fusion av sena endosomer/multivesicular kroppar med plasmamembranet jämfört med spirande plasmamembranet)24. Det finns således ett behov av robusta metoder för att noggrant mäta den totala koncentrationen och storleksfördelningen av ev prep som studeras.
En snabb och mycket känslig metod för visualisering och karakterisering av EVs i lösning är nanopartikelspårningsanalys (NTA). En detaljerad förklaring av principerna för denna metod och jämförelse med alternativa metoder för bedömning av EV-storlek och koncentration har beskrivitstidigare 25,26,27,28. Kortfattat, under NTA-mätning, visualiseras EVs av ljuset som sprids när de bestrålas med en laserstråle. Det spridda ljuset fokuseras av ett mikroskop på en kamera som registrerar partikelrörelsen. NTA-programvaran spårar den slumpmässiga termiska rörelsen hos varje partikel, känd som brownsk rörelse, för att bestämma diffusionskoefficienten som används för att beräkna storleken på varje partikel med hjälp av Stokes-Einstein-ekvationen. NTA tillämpades först på mätning av elfordon i ett biologiskt prov 201125. Fram till nyligen fanns det bara två vanliga företag som erbjöd kommersiella NTA-instrument29 fram till införandet av ViewSizer 3000 (nedan kallat partikelspårningsinstrumentet) som använder en kombination av nya hårdvaru- och programvarulösningar för att övervinna betydande begränsningar av andra NTA-tekniker.
Partikelspårningsinstrumentet karakteriserar nanopartiklar i flytande prover genom att analysera deras brownska rörelse och karakteriserar större mikronstora partiklar genom att analysera gravitations sedimentering. Detta instruments unika optiska system, som inkluderar multispektrala belysning med tre laserljuskällor (vid 450 nm, 520 nm och 635 nm), gör det möjligt för forskare att analysera ett brett spektrum av partikelstorlekar (t.ex. exosomer, mikrovesicles) samtidigt. Ett schema över instrumentinställningen visas i figur 1.
Här visar vi hur man utför partikelstorleksfördelning och koncentrationsmätningar av isolerade mus- och mänskliga EVs med hjälp av ett nytt NTA-instrument.
Figur 1:Optiskt system för partikelspårningsinstrument. NTA-instrumentet lyser upp partiklar med tre lasrar med följande våglängder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videoinspelning av det spridda ljuset från enskilda partiklar detekteras och spåras av en digital videokamera orienterad 90° från cuvette. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt arbete med dessa prover utfördes i enlighet med institutional animal care and use committee och Institutional Review Board guidelines. En schematisk översikt över NTA-metoden visas i figur 2.
Figur 2: Översikt över NTA-metoden med partikelspårningsinstrumentet. Provet bereds och sätts in i instrumentet. NTA-programvaran öppnas, inspelningsparametrarna justeras och exemplet är fokuserat. Sedan registreras, bearbetas och visas data. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
1. Extracellulär vesikelisolering
OBS: Mus perigonadal fettvävnad EVs isolerades som tidigarebeskrivits 23. Plasma EVs isolerades från 1 ml human plasma med hjälp av följande protokoll:
- Samla plasma och centrifugera vid 3 000 x g i 15 minuter för att avlägsna cellulärt skräp. Överför supernaten till ett nytt rör.
OBS: Om ytterligare skräp fortfarande kan upptäckas, centrifugera supernaten i ytterligare 10 minuter vid 12 000 x g och överför supernaten till ett nytt rör. - Tillsätt 67 μL av exosomisoleringsreagenset per 250 μL plasma. Blanda väl genom att vända eller snärta på röret.
- Inkubera på is upprätt i 30 min.
- Centrifugera exosomisoleringsreagenset/plasmablandningen vid 3 000 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Centrifugation kan utföras vid rumstemperatur eller 4 °C med liknande resultat, men 4 °C föredras. Efter centrifugation kan EVs visas som en beige eller vit pellet längst ner på röret. - Aspirera försiktigt bort supernaten. Snurra ner någon rest exosomisoleringslösning och ta bort alla spår av vätska genom aspiration, var mycket noga med att inte störa de fällda EVs i pelleten.
- Återanvänd pelleten i 200 μL buffert B (tillhandahålls av tillverkaren). Mät och registrera provets proteinkoncentration (för steg 2.8) med hjälp av en spektrofotometer, fluorometer, Bradford-analys eller annan föredragen metod.
2. Rening av isolerade elbilar
- Tillsätt 200 μL buffert A (tillhandahålls av tillverkaren) för att återhänga elfordon.
- Ta ut reningskolonnen (medföljer), lossa skruvlocket och knäpp av den nedre stängningen. Placera kolonnen i ett uppsamlingsrör.
OBS: Spara den nedre stängningen för steg 2.7-2.9. - Centrifug vid 1 000 x g i 30 s för att ta bort lagringsbufferten.
- Kassera genomflödet och placera kolonnen i uppsamlingsröret igen.
- För att tvätta kolonnen, ta bort locket och applicera 500 μL buffert B ovanpå hartset och centrifugen vid 1 000 x g i 30 s. Kassera flödet. Spara locket för steg 2.7-2.9.
- Upprepa steg 2.4-2.5 en gång till för att tvätta kolonnen.
- Anslut kolumnens underkant med den nedre stängningen (från steg 2.2). Applicera 100 μL buffert B ovanpå hartset för att förbereda det för provbelastning.
- Tillsätt hela innehållet från steg 1,6 (eller upp till volymekvivalenten 4 mg totalt protein) till hartset. Placera skruvlocket på toppen av kolonnen.
- Blanda i rumstemperatur på en roterande skakapparat i högst 5 minuter.
3. Prov eluering
- Lossa skruvlocket och ta bort bottenstängningen och överför omedelbart till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Provet börjar eluera så snart den nedre stängningen har tagits bort. Se till att 2 ml mikrocentrifugrör är redo att tas emot eluat för att minimera provförlusten. - Centrifugera vid 1 000 x g i 30 s för att få rena ev. Ignorera kolumnen.
4. Provberedning för nanopartikelspårningsanalys
- Använd ett luddfritt material som en mikrofiberduk för att täcka arbetsytan och förhindra att fibrer kommer in i cuvettes.
- Bär handskar, placera cuvette på den magnetiska cuvette jiggen och placera sedan omrörningsstången i cuvette. Hantera alltid cuvettes med handskar för att förhindra att fingeravtryck och fläckar visas på cuvetettes yta.
- Använd krokverktyget för att placera insatsen i kilskriften enligt bild 3. Det är viktigt att notera skärens orientering för senare (steg 5.4).
Figur 3:Korrekt skärorientering i kvarts cuvette. Insatsens "hack" ska vara synligt från cuvettes framsida. Detta ska sättas in i instrumentet som vetter mot kameran. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Tillsätt långsamt 400-500 μL av spädningsprovet eller det utspädda provet vid rumstemperatur till cuvetten genom hålet i insatsen med hjälp av en pipett. Försiktigt pipett upp och ner för att blanda. Undvik att införa luftbubblor.
- Förbered först en cuvette laddad med det valda spädningsprovet (blankt) för att mäta spädningspartikelkoncentrationen. Detta bör göras innan provet mäts så att provets bakgrundskoncentration kan korrigeras.
OBS: Ett bra blankvatten (fosfatbuffrad saltlösning [PBS] i detta fall) kommer att ha en koncentration <9 x 106 (beroende på spädningsvärdet) och visar 1-10 partiklar per skärm i livevisningen (Figur 4). Det rekommenderas att den faktiska provpartikelkoncentrationen är minst 3 gånger bakgrundskoncentrationen. - Tillval, innan provet registrerars med 400–500 μL av spädningsprovet eller det utspädda provet innan provet mäts. För att göra det, ladda 400-500 μL av det utspädda provet i cuvette, kassera lösningen och tillsätt sedan 400-500 μL mer av provet för mätningen. Detta kan hjälpa till att tvätta ut rester i cuvette.
- Förbered först en cuvette laddad med det valda spädningsprovet (blankt) för att mäta spädningspartikelkoncentrationen. Detta bör göras innan provet mäts så att provets bakgrundskoncentration kan korrigeras.
Figur 4: Representativ live stream-vy över ett spädningsförmåga inom ett blankområde. Späd ev preps i filtrerad (0,02 μm eller 3 kDa, föredragen) PBS. Ett bra tomrum visar ~1-10 partiklar per skärm i livevisningen, vilket ger en koncentration inom intervallet 105-106. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Kapsla cuvette och kolla efter bubblor. Tryck ut bubblor om det behövs. Använd en luddfri trasa för att torka av cuvettes ytterytor.
5. Startprocedur för partikelspårningsinstrumentet
- Slå på datorns arbetsstation och instrument, vänta några minuter innan du kör det första exemplet och starta programmet genom att klicka på programvaruikonen. När du uppmanas till det klickar du på NTA på skärmen för att utföra Nanopartikelspårningsanalys. Börja på fliken Inspelning och klicka på de olika programvaruflikarna(Spela in, Bearbeta, Rita)för att växla mellan dem i hela protokollet. Spela in exemplet (spädning eller EV-förberedelse) först, bearbeta sedan inspelningarna och slutligen rita resultaten.
- Följ anvisningarna på skärmen för att fylla i all nödvändig information om provet. Kontrollera att alla nödvändiga fält är ifyllda och korrekta, dvs. Om du väljer PBS på rullgardinsmenyn fylls salthalten i automatiskt till 9 %. Denna information är nödvändig för att bestämma vätskaens dynamiska viskositet.
OBS: Det kan ta upp till 3 min för temperaturen att balansera inuti cuvette även om sonden redan visar önskad temperatur (dvs. grön punkt blir stabil). Provavläsningar kan variera avsevärt om måltemperaturen inte ställs in, eftersom provtemperaturskillnader kraftigt kan förändra partiklarnas brownska rörelse. - Öppna instrumentlocket och ta bort skyddslocket där cuvetten ska placeras.
VARNING: Partikelspårningsinstrumentet är certifierat som en klass 1-laserprodukt (21 CFR Ch. Jag del 1040), som innehåller lasrar som kan vara farliga och kan orsaka allvarliga skador som brännskador och/eller permanenta skador på synen. För att förhindra olyckor eller personskador, ta inte bort instrumentskyddet genom att skruva loss bultarna från sidan. Observera att laserstrålarna under drift är helt slutna, vilket inte utgör något hot mot användarna. Dessutom är en magnetisk säkerhetsförregling inbyggd i instrumentets provhållare för att förhindra att lasrarna fungerar när provhållarens lock tas bort. - Placera cuvette (från steg 4.3) inuti instrumentet i rätt riktning (se figur 5). Sätt tillbaka locket över cuvette och stäng instrumentlocket. Använd alltid instrumentet med locket på plats över provhållaren. Inaktivera eller försök inte kringgå säkerhetslåsfunktionen.
Figur 5:Korrekt orientering av cuvette inom partikelspårningsinstrumentet. Cuvettes ansikte (med "hacket" av insatsen synligt) ska vända sig mot kameran. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Slå på kameran genom att klicka på pilen ovanför Streaming.
- Klicka på sparrpilen om du vill expandera postinställningarna. Ställ in förstärknings- och laserkraft på värden som är lämpliga för programmet. Se tabell 1 (och kompletterande figur 1) för parametrar som används för NTA för små (100 nm) EVs.
Obs: Dessa avancerade inställningar som nås genom att klicka på sparrpilen kan vara lösenordsskyddade. Använd samma inställningar för inspelning och bearbetning för spädningsprovet (tomt) som de som används för de efterföljande exemplen. - Justera fokus tills partiklarna är ordentligt fokuserade. Fokus bör göras på relativt små partiklar (figur 6). För liten EV-kvantifiering (överensstämmer med exosomer) rekommenderas följande inspelningsinställningar: Bildhastighet: 30 fps, Exponering: 15 ms, Rör om tid: 5 s, Väntetid: 3 s, Laserkraft - Blå: 210 mW, Grön: 12 mW, Röd: 8 mW, Ramar per video: 300 bilder och Vinst: 30 dB.
OBS: Användaren kan öka Zoom till 1x och / eller öka gain för att hjälpa till med fokusering. Kom ihåg att ställa in dessa parametrar på rekommenderade värden innan du spelar in videor.
Bild 6: Representativa livestreamvyer som visar partikelfokus. Partiklar har glödliknande halo eller verkar suddiga. Justera fokus. (B) Ett exempel på live stream-vy av partiklar i rätt fokus. De minsta partiklarna är i fokus. Börja spela in. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Utför en visuell kvalitetskontroll för att säkerställa att provet är korrekt utspädt. Om provet är för koncentrerat, ta bort cuvette från instrumentet och späd provet sekventiellt. Upprepa tills provet är ordentligt utspädt innan du fortsätter till steg 6.
OBS: Späd inte provet för mycket! Gör alltid utspädningar sekventiellt. Det idealiska tomrummet visar bara några partiklar på skärmen (1-4) som visas i figur 4. När det gäller EV-prover kommer ett korrekt utspädt prov att ha ungefär 20-100 partiklar synliga på skärmen, utan glödliknande eller grumliga bilder i bakgrunden (se figur 7 som exempel). Detta bör resultera i en optimal partikelkoncentration i intervallet 5 x 106 till 2 x 108 partiklar per ml (inte justering för utspädningsfaktor).
Figur 7: Representativa livestreamvyer som visar olika partikelutspädningar. Om du registrerar ett prov som är för koncentrerat får felaktiga resultat. B)Ett exempel på live stream-vy av ett korrekt utspädt prov. Det finns 60-100 partiklar synliga på skärmen och inspelning resulterar i en rå koncentration på 5 x 106- 2 x10 8 partiklar / ml. (C) Ett exempel på live stream-vy av ett prov som är för utspädd. Om ett prov är så utspädt kommer det inte att finnas tillräckligt med partiklar spårade, vilket sänker provstorleken och därför blir resultaten statistiskt ogiltiga. I det här fallet rekommenderas att öka antalet inspelade videor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
6. Förvärv av videodata
- (Valfritt) Ställ in zoominställningen på 0,5x för att spara bandbredd och förhindra förlorade ramar.
- Börja spela in videorna genom att klicka på Spela in (se tabell 1 för rekommenderade inspelningsparametrar).
OBS: Som standard kommer instrumentet att röra om provet i 5 s, vänta i 3 s och sedan spela in i 10 s innan du upprepar denna process. Typisk mättid för 50 videor är ~ 15 min att spela in och ~ 13 min att bearbeta. - Rör inte instrumentet när du spelar in videor. Se till att laboratoriebänkens yta inte vibrerar.
OBS: Det är att föredra att instrumentet är inställt på en antivibrationsplattform eller ett bord för att minska vibrationsstörningar från närliggande utrustning som stör bestämningen av nanopartiklarnas rörelse. Undvik att använda centrifuger, virvelblandare eller andra potentiella vibrationsgenererande anordningar på samma bänk som partikelspårningsinstrumentet. Vibrationer är lätt synliga på skärmen som förlängning av vanligtvis runda partiklar. Om instrumentet utsätts för kraftiga vibrationer kan det kräva omjustering av optiska element. Instrumentet var inte konstruerat för att servas eller kalibreras av kunden. kontakta tillverkaren för underhåll, service och kalibrering. - Notera alla inspelade videor som har mycket stora partiklar synliga som stora, oregelbundna vita blobbar. Ta bort dessa videor från bearbetningen i steg 7.3.
7. Bearbeta förvärvade uppgifter
- När en fråga visas om att videor har spelats in klickar du på OK för att slutföra inspelningen. Välj sedan fliken Process.
Protokollet kan stoppas här. Bearbetning av förvärvade data kan startas om senare genom att gå direkt till fliken Process efter att partikelspårningsinstrumentets programvara har öppnats och katalogen där de inspelade videorna sparas anges. - När du analyserar EV:er markerar du kryssrutan Inaktivera åsidosättning av automatisk identifiering och ställer in funktionsdiametern på 30. Klicka på Bearbeta. (Se tabell 2 för bearbetningsinställningar och kompletterande figur 2 för bearbetning av bildskärm). Ett livedistributionsdiagram visas så att användaren kan visa bearbetningen i realtid.
- För exosomer bearbetar du med detekteringströskeln inställd på standardprovet Polydisperse. Bearbeta data med tröskelhandboken för detektion inställd på 0,8 i stället för ett standardtröskelvärde på 0,99 endast för lösningar med mycket stora skillnader i partikelstorlekar.
- Om några videor hade märkbart mycket stora partiklar synliga (se steg 6.4), navigera till katalogen med inspelade videor och ta bort den problematiska videon. När du har redigerat listan över videofiler ändrar du antalet inspelade videor i andra användarloggar.
- När bearbetningen är klar klickar du på OK. Välj sedan fliken Rita. För elfordon visar du huvuddiagrammet som LogBinSilica.
OBS: Här på fliken Rita kan användaren anpassa andra funktioner i diagrammet, till exempel definiera intervallet för x-axeln (partikeldiameter, nm) för att ställa in området för integration för den producerade figuren.
8. Visa och tolka resultat
- Om du vill skapa en PDF-rapport klickar du på knappen Rapport. Mätningen är nu klar och resultaten kan ses.
OBS: Kom ihåg att registrera och bearbeta det tomma först så att bakgrundskoncentrationen av efterföljande prover kan korrigeras. Om detta steg glöms bort kan blindprovet registreras efter prover och provpartikelkoncentrationen korrigeras manuellt. - Undersök PDF-rapporten som visar medelvärdet, medianen och lägesstorleken samt den koncentration som justerats för utspädningsfaktorn och korrigerats genom att subtrahera spädningspartikelkoncentrationen. Fördelningsbredden (standardavvikelsen) visas också.
OBS: Det finns mycket få applikationer där ett enda värde är lämpligt och representativt. Det rekommenderas därför att beskriva hela storleksfördelningen och rapportera bredden på fördelningen för alla analyserade prover (till exempel i tabell 3). - Registrera följande instrumentinställningar som används för att generera de data som ska anges vid rapportering av resultat: Diluent, Lasereffekt för varje laser [mW], Exponering [ms], Förstärkning [dB], Bildhastighet [fps], Bildrutor per video, Antal inspelade videor, Bearbetningsinställning (t.ex. LogBinSilica), Integrationsområde [min nm, max nm] (rekommenderas att ställa in min till 50 nm) och Antal spårade partiklar (önskvärt att analysera minst ~ 150 partiklar per video; minst 3 750 totala spår per prov rekommenderas för att undvika artefaktiska spikar i partikelstorleksfördelningen och generera statistiskt signifikanta data).
9. Rengöring av cuvettes
- Rengör cuvettes manuellt mellan proverna. Töm först cuvette.
OBS: Provet kan antingen återvinnas från cuvette och sparas eller kasseras. - När cuvette är tom, rengör cuvette genom att skölja den 10-15 gånger med avjoniserat (DI) vatten. Skölj sedan 3 gånger med etanol (70-100%). När du gör detta, se till att helt fylla cuvette med lösningsmedel.
- Torka utsidan av cuvette med en luddfri mikrofiberduk. Undvik fläckar på ytorna. Lufttorka insidan av cuvette eller torka med en tryckluftsdubbe.
OBS: Endast linsrengöringspapper eller luddfri mikrofiberduk bör användas för att torka av cuvettes optiska ytor, eftersom de flesta pappersprodukter innehåller små träfibrer som kan repa eller skada cuvettes yta. - Förbered två glasscintillationsflaskor: en fylld med 70-100% etanol och den andra med DI-vatten. Skölj skären och rör om stängerna i etanolen först (sedan DI-vatten) genom att placera insatsen/omrörningsstången i lämplig scintillationsflaska och skaka injektionsflaskan kraftigt. Torka skären och rör om stängerna med luddfria dukar eller tryckluftsstoft.
OBS: Cuvette och skär kan också rengöras med hjälp av ett ultraljudsvattenbad. För att göra det, se först till att ultraljudsbehandlingsenheten innehåller tillräckligt med vatten (minst 5 cm djup). Placera sedan cuvette och sätt in inuti en glasbägare (50 ml eller större), fyll bägaren med alkohol till samma nivå som vattenbadet, placera bägaren i vattnet och slå på strömmen. Ultraljudsbehandling i högst 5 minuter åt gången, så att maskinen kan vila >5 min mellan varje 5-minuters burst om längre tider krävs. - När du är klar, lägg omedelbart bort alla rengjorda och torkade komponenter för lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före denna demonstration testades instrumentets kalibrering först för att säkerställa giltigheten av de förvärvade uppgifterna genom att mäta storleksfördelningen av polystyrenpärlor. Vi testade storleksfördelningen av 100 nm och 400 nm pärlor med standardinspelningsparametrarna och de bearbetningsinställningar som rekommenderas i detta protokoll (figur 8).
För 100 nm polystyrenpärla mättes en koncentration på 4,205 x10 7 partiklar/ml. Medelvärdet (standardavvikelse, SD) storlek var 102 (±17) nm med en variationskoefficient (CV) på 0,16. D10/D50/D90-värdena var 76/104/126 nm. Detta indikerar att partikelspårningsinstrumentet noggrant rapporterade storleken på de 100 nm monodisperse pärlor. För standarden 400 nm polystyrenpärlor var koncentrationen 4,365 x 107 partiklar/ml. Medelstorleken (SD) var 391 (±47) nm, med ett CV på 0,12. D10/D50/D90-värdena var 150/358/456 nm (tabell 3). Medan det rapporterade medelvärdet ligger mycket nära pärlornas verkliga storlek, kan vi se att de instrumentinställningar som tillämpas i detta protokoll är mer exakta för de mindre partiklarna ~ 100 nm. Således föreslås för partiklar större än 400 nm, optimering av laserparametrarna. Forskare bör först genomföra en metod som transmissionselektronmikroskopi (TEM) för en uppskattning av den ev-storleksfördelning som följer av en viss källa och isoleringsmetod före NTA.
En genomsnittlig koncentration på 4,41 x 1010 partiklar/ml uppmättes för det EV-prov av musvävnad som användes för denna demonstration. Det här exemplet registrerades enligt de parametrar som sammanfattades i tabell 1 och bearbetades enligt de parametrar som beskrivs i tabell 2. Vi visar effekten av olika utspädningsfaktorer i figur 9 och rapporterar de råa och justerade partikelkoncentrationerna i tabell 4. Den optimala utspädningen för de musvävnadsbaserade EVs var mellan 1 000 och 3 000 medan det för humana plasma-härledda EVs var 1 000, vilket indikerar att vid första testningen av en given biofluidkälla eller EV-isoleringsmetod för NTA bör seriell utspädning testas så att optimal utspädning för NTA-mätning kan identifieras. Vi rekommenderar att du mäter och rapporterar minst två olika utspädningar av ett prov. Vi mätte också ytterligare fyra prover vid olika utspädningar på två distinkta partikelspårningsinstrument. Kompletterande figur 3 jämför partikelspårningsinstrumentets precision i storleksmätningar jämfört med ett annat kommersiellt tillgängligt NTA-instrument. Kompletterande tabell 1 visar vidare precisionen i detta instruments mätningar, som visar att partikelkoncentrationen förändrades proportionellt med provutspädningen, men att partikelstorleksåtgärderna inte gjorde det.
Efter bearbetningen kan resultaten (tillsammans med instrument-/programvaruinformation, inspelnings- och bearbetningsinställningar och experimentella anteckningar) sparas i en .pdf rapport. Det histogram som ingår i denna rapport kan ändras enligt beskrivningen i protokollet (avsnitt 7.4). De råa resultaten sparas i .dat en fil som kan exporteras. De inspelade videorna sparas också och kan användas för senare off-line bearbetning och analys. Men när videor har spelats in kan inspelningsinställningarna inte ändras retroaktivt.
Effekten av att ändra de olika laserkrafterna och vinsten i inspelningsinställningarna visades med hjälp av mänskliga plasma härledda EVs. Detta visualiseras i figurerna 10-12 och den kvantitativa informationen som baseras på dessa bilder visas i tabell 5. Ökad förstärkning ökar kamerans känslighet, vilket möjliggör visualisering av mindre partiklar (figur 10) vilket resulterar i en ökande total partikelkoncentration med en mindre genomsnittlig partikelstorlek (tabell 5). Men att öka vinsten över 30 dB (våra rekommendationer) gör utsikten för kornig, vilket gör att buller kan dölja mätning av sanna partiklar. Vid en kameravinst på 30 dB avbildas effekten av att ändra den blå lasereffekten i figur 11. Att öka den blå lasereffekten (450 nm, kort våglängd) resulterar i större upplösning för att upptäcka mindre partiklar (dvs. de med en storlek som överensstämmer med exosomer). Genom att hålla den gröna och röda lasern konstant vid standardinställningarna, öka den blå lasereffekten från 70 mW till 210 mW, skiftade den rapporterade genomsnittliga partikelstorleken från 122 nm till 105 nm och ökade den rapporterade totala partikelkoncentrationen från 1,1 x 108 till 1,7 x 108 (tabell 5).
Effekten av att öka de gröna och röda laserkrafterna visades också (figur 12). Genom att öka kraften hos den röda lasern (650 nm, lång våglängd) ökade den rapporterade genomsnittliga partikelstorleken från 175 till 246 nm. Den rapporterade totala partikelkoncentrationen minskade, men det beror på att vi i detta mänskliga plasma EV-prov inte hade många stora partiklar närvarande, bekräftade av TEM negativ färgning (Kompletterande figur 4). En ökning av den gröna lasereffekten resulterade i en minskning av den rapporterade genomsnittliga partikelstorleken och en ökning av den rapporterade totala partikelkoncentrationen. Således kan användaren optimera kraften hos de tre lasrarna för att känsligt upptäcka partiklar av olika storlekar.
Detta protokoll är optimerat för mindre vesiklar (t.ex. <400 nm). Forskare som är intresserade av mikrovesicles av större storlekar (t.ex. 400-1000 nm) uppmuntras att optimera laserparametrarna med ihåliga organosilica pärlor som har ljusspridningsegenskaper som liknar EVs vilket gör dem till en lämpligare referens än polystyren eller kiseldioxidpärlorstandarder 30. Ändå kan kiseldioxidnanopartiklar vara det bästa praktiska substitutet tills organosilica-standarder blir mer allmänt tillgängliga.
Här användes ett NTA-instrument för att framgångsrikt kvantifiera EVs isolerade från musvävnad genom ultracentrifugation och mänsklig plasma med hjälp av ett kommersiellt kit. Effekterna av att ändra NTA-parametrarna illustrerades och visar att parametrarna i det här protokollet är optimerade för små blåsor. Utspädningsstegets betydelse visades också och visar att partikelspårningsinstrumentet som demonstreras här kan korrekt upptäcka variationer i utspädningsfaktorer. Koncentrationen ändrades proportionellt med flera utspädningar, medan storleksfördelningen inte gjorde det. De resulterande uppgifterna visade liten teknisk variabilitet. Således kommer anpassning av detta protokoll av forskare som använder detta instrument för NTA att öka noggrannheten och reproducerbarheten inom EV-forskningsområdet.
Figur 8:Partikelstorleksfördelningar av monodisperse polystyrenpärlor. (A) Partikelstorleksfördelning på 100 nm polystyrenpärlastandard. B)Partikelstorleksfördelning på 400 nm polystyrenpärlastandard. Värden rapporteras i tabell 3. Inset visar exempel på livestream-vy av den första uppmätta bildrutan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9:Råa totala partikelkoncentrationer efter utspädningsfaktor för musperigonadal fettvävnad EVs. Felstaplar representerar standardavvikelse. Tre mätningar gjordes för varje utspädning. Värden rapporteras i tabell 4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10: Visuell effekt av ökande vinst. Representativa bilder av partiklar uppmätta med standardlaserinställningar (Blå = 70 mW, Grön = 12 mW, Röd = 8 mW) och förstärkning inställd på (A) 18 dB, (B) 24 dB - standard och (C) 30 dB - rekommenderas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11:Blå laserns effekt på små partiklar när röda och gröna lasrar är inställda på standardinställningar. (A) Blå laser = 70 mW (standard). (B) Blå laser = 210 mW (rekommenderas). Fler små partiklar syns och i fokus när den blå lasereffekten ökas till 210 mW. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 12:Visuell påverkan av förändrad blå, grön och röd lasereffekt. Representativa liveskärmsvyer visar de olika partikelstorlekarna som visualiserats över olika laserinställningar. Resulterande NTA-värden rapporteras i tabell 5. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Partiklar | Diameter [nm] | Blå laser [mW] | Grön laser [mW] | Röd laser [mW] | Kameraökning [dB] | Temperaturreglering | Bearbetning | # Videor |
| Exosomer | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Aktiverad, inställd på 22 ºC | Åsidosättning av inaktiverad automatisk identifiering | 50 |
Tabell 1: Inspelningsparametrar för små extracellulära blåsor (~100 nm).
| Beskrivning av processen | Tröskelvärde för identifiering | Inaktivera åsidosättning av automatisk identifiering | Funktionsdiameter [px] |
| Exosomer | Polydisperse prov | Rutig | 30 |
Tabell 2: Bearbetningsparametrar för små extracellulära blåsor (~100 nm).
| Polystyrenstandardens storlek [nm] | Integrationsområde [nm] | Medelstorlek [nm] | SD-storlek [nm] | CV av storlek | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Totalt antal |
| 100 | 50 till 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 till 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabell 3: NTA-resultat av monodisperse polystyrenpärlor. Båda standarderna späddes optimalt ut, med råa koncentrationer för 100 nm-standarden och 400 nm-standarden på 4,205 x10 7 partiklar/ml respektive 4,365 x10 7 partiklar/ml. D10 är den punkt i storleksfördelningen där 10 % av provet ingår, D50 är den punkt där 50 % av provet ingår (median) och D90 är den punkt där 90 % av provet ingår. SD: Standardavvikelse; CV: Variationskoefficient.
| Utspädningsfaktorn | Partikelkoncentration, partiklar/ml | Total partikelkoncentration, partiklar/ml |
| Rå | Justerat för utspädningsfaktor | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4.10E+10 |
| 4.00E+07 | 4.00E+10 | |
| 3.70E+07 | 3.70E+10 | |
| medelvärde (SD) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3.60E+07 | 5.40E+10 |
| 2.60E+07 | 3.80E+10 | |
| 2.90E+07 | 4.40E+10 | |
| medelvärde (SD) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4.55E+10 (6.60E+09) |
| 2000 | 2.40E+07 | 4.80E+10 |
| 2.30E+07 | 4.60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4.00E+10 | |
| medelvärde (SD) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1.30E+07 | 3.90E+10 | |
| 1.40E+07 | 4.20E+10 | |
| medelvärde (SD) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4.71E+10 (9.27E+09) |
Tabell 4: NTA-resultat av musperigonadal fettvävnad EVs visar reproducerbarhet av NTA mätningar. Obehandlade NTA-partikelkoncentrationer (partiklar/ml) uppmätta på partikelspårningsinstrumentet och total partikelkoncentration (partiklar/ml) justerade för utspädningsfaktor för EVs som härrör från musperigonadal fettvävnad vid olika utspädningar.
| Vinst [dB] | Blå laser [mW] | Grön laser [mW] | Röd laser [mW] | Total koncentration, partiklar/ml (rå) | Genomsnittlig storlek [nm]* | Standardavvikelse av storlek / CV | Modal storlek | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1.50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integrerad inom 50-1000 nm räckvidd | ||||||||
Tabell 5: NTA-resultaten av EVs som härrör från human plasma visar effekten av att ändra lasereffekt och öka på storleks- och partikelkoncentrationsmätningar av mänskliga EVs (1:1000 utspädning). D10 är den punkt i storleksfördelningen där 10 % av provet ingår, D50 är den punkt där 50 % av provet ingår (median) och D90 är den punkt där 90 % av provet ingår. SD: Standardavvikelse; CV: Variationskoefficient.
Kompletterande bild 1: Skärmbild av inspelningspanelen som visar rekommenderade inspelningsparametrar. Få tillgång till avancerade inställningar för att ändra kameraförströkning och laserkraft till rekommenderade inställningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande bild 2: Skärmbild av bearbetningspanelen som visar rekommenderade bearbetningsinställningar. Kontrollera att "Inaktivera åsidosättning av automatisk identifiering" är markerat och att funktionsdiametern är inställd på "30". Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Partikelstorleksmätningar över flera utspädningar: Precision hos partikelspårningsinstrumentet (ViewSizer 3000) jämfört med jämförbart kommersiellt NTA-instrument (NanoSight NS300). NTA av EVs isolerade från mus perigonadal fettvävnad utfördes på två instrument. För varje mus mättes tre utspädningar (1:1000, 1:500, 1:100). Råvärden för åtgärder som vidtagits på ViewSizer 3000 (visas i detta protokoll) visas i kompletterande tabell 1. Insamlings- och analysinställningar för NanoSight NS300-måtten visas i kompletterande tabell 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Representativ elektronmikroskopi med negativ fläcköverföring (TEM) av humana plasmabaserade EVs. Galler avbildades med ett transmissionselektronmikroskop som arbetar vid 100 kV accelererande spänning. Bilder togs på en 2K x 2K CCD-kamera. Skalstrecket återspeglar förstoringen vid kameran. Elektronmikrografer visar runda blåsor ~25 nm i diameter. 100k förstoring, skalstång 200 nm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggs tabell 1: ViewSizer 3000 partikelstorlek och koncentrationsmätningar av mus perigonadal fettvävnad EVs över flera utspädningar. NTA av EVs isolerade från mus perigonadal fettvävnad utfördes. För varje mus mättes tre utspädningar (1:1000, 1:500, 1:100). D10 är den punkt i storleksfördelningen där 10 % av provet ingår, D50 är den punkt där 50 % av provet ingår (median) och D90 är den punkt där 90 % av provet ingår. Partikelkoncentrationerna är bakgrundskorrigerade. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 2: NanoSight NS300 fångst- och analysinställningar. Inställningar (med NTA 3.4 Bygg 3.4.003) som används för att mäta musperigonadal fettvävnad EV prover rapporterade i kompletterande figur 3. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här demonstrerar vi ett protokoll för NTA av EVs för att mäta storleksfördelningen av ett brett spektrum av partikelstorlekar samtidigt och mäta den totala EV-koncentrationen i ett polydisperseprov. I denna studie användes mus perigonadal fettvävnad och human plasma som källa till EVs. EVs som isolerats från andra vävnader eller biologiska vätskor som serum, urin, saliv, bröstmjölk, fostervatten och cellodlingsmetatanter kan dock också användas för NTA. Mätningar av polystyrenpärlor säkerställde att instrumentet var korrekt kalibrerat och visade att detta NTA-instrument korrekt kan mäta storleken på nanopartiklar ≤400 nm. Olika utspädningar av en mus vävnad EV prov testades sedan. Som visas i figur 9skalar den rapporterade partikelkoncentrationen i enlighet därmed med utspädningsfaktorn, som förväntat, vilket visar att instrumentet exakt kan upptäcka partikelkoncentrationen vid olika utspädningar med liten variation mellan tekniska replikat. Detta var dock vid arbete med partikelkoncentrationer inom instrumentets arbetsområde (5 x 106 till 2 x 108 partiklar per ml). att späda ut ett prov på lämpligt sätt är ett kritiskt steg i protokollet. Justeringen för utspädningsfaktorn gav ungefär samma uppskattning för provets totala partikelkoncentration, med ett CV på 15,1 över de fyra testade utspädningarna. Olika mått, som upprepades på flera utspädningar av samma prover, visade också precisionen i partikelstorleksfördelningsbedömningarna, eftersom partikelkoncentrationerna skalades proportionellt med utspädningsfaktorn men rapporterade storleksåtgärder inte gjorde det.
EVs i suspension genomgår slumpmässig termisk rörelse som kallas brownsk rörelse, enligt vilken diffusionen av partiklar i en flytande suspension är omvänt proportionell mot deras storlek. Denna slumpmässiga rörelse modelleras av Stokes-Einstein-ekvationen, där den hydrodynamiska diametern D av en sfärisk partikel är:
Där kB är Boltzmann konstant och R är partikelradien. Som man kan se av ekvationen beror partikelrörelser i suspension också påvätskantemperatur ( T )och dynamisk viskositet ( η) av vätskan. Under NTA bestrålas elbilar med fokuserade laserstrålar som passerar genom partiklarna i suspension och detekteras av incidentbelysningen som kommer från lasrarna. Ljuset som sprids av varje enskild partikel är fokuserat av ett mikroskop på bildsensorn på en högupplöst, ljuskänslig laddningsankparad enhet (CCD) kamera, som registrerar digitala bilder av partiklarnas spridda ljus (Figur 1). NTA-programvaran identifierar och spårar den brownska rörelsen hos varje enskild partikel för att beräkna diffusionskoefficienten för varje partikel. Detta används tillsammans med temperaturen och viskositeten hos vätskan som innehåller partiklarna för att beräkna partikeldiameter med hjälp av Stokes-Einstein-ekvationen. Således kan en enda mätning bestämma två kritiska bitar av information: partikelstorleksfördelning och totalt partikelantal av EVs i suspension.
En jämförelse mellan NTA och andra tekniker för att upptäcka och kvantifiera elfordon har beskrivits någonannanstans 31,32. Jämfört med andra ljusspridningsbaserade metoder som DLS (Dynamic Light Scattering) har NTA högre lösningskapacitet och är en särskilt kraftfull metod för att analysera partiklar med en medeldiameter på mindre än 100 nm. Till skillnad från enpartikelanalys som TEM är NTA inte tidskrävande eller tekniskt utmanande och kan fenotypa ett helt prov på en relativt låg volym på en gång på ett halvautomatiskt sätt. Även om NTA är en kraftfull karakteriseringsteknik har den begränsningar. För det första är NTA föremål för känslighetsgränser på grund av den kraftiga minskningen av intensiteten av spridd ljusskalning med partikeldiameter, vilket gör att det spridda ljuset från mycket små partiklar försvinner under bakgrundsljudet33. NTA har därmed minskat känsligheten för elbilar som är mindre än ~50 nm31 och resulterar i en överskattning av EV-storlekar. Kortvågiga lasrar behövs för att upptäcka de mindre partiklarna i ett polydisperseprov på grund av deras ljusspridningspotential. Detta partikelspårningsinstrument erbjuder dock en förbättring av denna begränsning som är inneboende i nanopartikelspårningstekniken. Utrustad med tre variabla ljuskällor (450 nm, 520 nm, 635 nm) möjliggör detta system visualisering av partiklar över ett brett spektrum av storlekar, vilket gör detta instrument till ett särskilt värdefullt verktyg för NTA-analyser av polydisperseprover som en heterogen population av EVs. Eftersom de flesta EV-preps kommer att vara polydisperse i sammansättning och sannolikt innehåller föroreningar, bör forskare dock vara medvetna om att provberoende gränser för detektion påverkar formen på den totala storleksfördelningen och därför är försiktiga vid tolkning av resultat.
En annan stor begränsning av NTA är att den mäter mer än bara elbilar. NTA-instrumentet kommer att upptäcka, mäta och räkna alla partiklar som överskrider detektionsgränsen, inklusive proteinaggregat, lipoproteiner, cellulärt skräp och förorening orsakad av spädning. Partikelkoncentrationen i bakgrunden kan dock korrigeras genom att partikelkoncentrationen av spädningspunkten mäts före lastning och mätning av ett prov. Vi rekommenderar att du använder minst 0,02 μm filtrerad PBS och har hittat mycket låg partikelförorening vid användning av 3 kDa filtrerad PBS. Dessutom är det möjligt att utvidga NTA för att mäta och analysera fluorescerande märkta EVs, vilket övervinner begränsningen av icke-specifik mätning. Kommersiella satser finns tillgängliga som specifikt och effektivt färgar membranen av intakta blåsor endast, exklusive membranfragment, proteinaggregat och andra partiklar från NTA-mätningen. De uppgifter som härrör från fluorescerande NTA representerar således mer exakt den verkliga ev-koncentrationen och storleksfördelningen. Genom att selektivt märka EV-ytantigener kan fluorescerande NTA också mäta specifika EVs märkta med fluorescerande märkta antikroppar, vilket möjliggör räkning och storlek av antigenspecifika, biologiskt relevanta EV-subpopulationer.
Det har inte gjorts mycket arbete med standardisering av NTA-protokoll, vilket har försvårat resultatens jämförbarhet och hindrat reproducerbarheten mellan prover, dagar, operatörer och laboratorier. Partikelspårningsinstrumentet som demonstreras i detta protokoll kräver lite praktisk tid. Vi har också noterat vilka instrumentinställningar användarna bör rapportera för att underlätta reproducerbarheten av genererade data. Att följa det optimerade protokollet som anges här bör därför resultera i standardisering och möjliggöra jämförelse av resultat mellan laboratorier. En annan fördel med att använda detta instrument är att provet framställs i en cuvette, vilket gör det möjligt för instrumentet att upprepade gånger röra mellan videor, säkerställa ett statistiskt slumpmässigt prov för varje video och ge ett mer reproducerbart resultat än andra kommersiellt tillgängliga NTA-instrument som förlitar sig på sprutpumpar och flödesceller. Dessutom möjliggör de flera lasrarna detektering av partiklar med varierande brytningsindex, vilket ger mer robusta resultat. Men driften av detta partikelspårningsinstrument kräver inte kunskap om partikelmaterialegenskaper som brytningsindexet, vilket gör mätningarna mer reproducerbara för alla operatörer.
Elfordon har identifierats i nästan alla biofluider som testats2,5. En effektiv isolering av specifika EVs (t.ex. cellspecifika elbilar) från olika medier (t.ex. blod, bröstmjölk, cellkulturmedier) utgör dock en svår utmaning. Många olika metoder för EV-isolering har beskrivits9. NTA kan utföras för att jämföra utbyten av EVs isolerade med olika metoder och identifiera variationer i de vesiklar som uppstår från olika isoleringsmetoder. Detta är viktigt för tolkningen av resultat i senare led, eftersom det för närvarande fortfarande är oklart hur olika delpopulationer av elbilar fungerar. Noggrann mätning av EV-koncentration är också viktigt i studier som undersöker om en viss behandling, tillstånd eller molekyl påverkar EV-frisättningen. Vår grupp är till exempel intresserad av miljöexponeringars inverkan såsom partiklars luftföroreningar på EV-innehåll och utsläpp. För att bedöma om ett tillstånd påverkar ev-frisättningen måste antalet blåsor kvantifieras korrekt. Vid användning av elfordon som diagnostiska biomarkörer kan koncentrationen av elfordon i provet påverka analysresultaten. Således är en tillförlitlig metod för att bestämma partikelkoncentration och storleksfördelning avgörande.
Oavsett bör NTA-mätningar åtföljas av andra kompletterande tekniker som kan mäta partiklar oberoende av de andra partiklarna i provet, såsom TEM. Nyare tekniker som mikrofluidisk resistiv pulsavkänning (MRPS) är också lovande för storleks- och räkning av EVs oberoende av provet polydispersitet. Ytterligare biokemiska eller proteomiska analyser av EV-prover kan användas utöver storleks- och koncentrationsdata till klusterundergrupper av EVs i populationer av biologisk betydelse. Sammanfattningsvis är det viktigt för EV-fältet att mäta giltiga och reproducerbara partikelkoncentrationer och partikelstorleksfördelningar. ViewSizer 3000 uppnår exakta och reproducerbara mätningar av den totala EV-koncentrationen och EV-storleksfördelningen, även för mycket polydisperseprover, vilket visas här. I framtiden hoppas vi få se ytterligare rigorösa experimentella jämförelser av detta instrument med andra NTA-instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarade att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Vi bekräftar Jeffrey Bodycomb, ph.d. av HORIBA Instruments Incorporated för hans hjälp med att kalibrera instrumentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
