Summary
Wir zeigen, wie man ein neuartiges Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument verwendet, um die Größenverteilung und Gesamtpartikelkonzentration von extrazellulären Vesikeln abzuschätzen, die aus dem periigonadalen Fettgewebe der Maus und dem menschlichen Plasma isoliert wurden.
Abstract
Die physiologischen und pathophysiologischen Rollen extrazellulärer Vesikel (EVs) werden zunehmend anerkannt, was das EV-Feld zu einem sich schnell entwickelnden Forschungsgebiet macht. Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die jeweils unterschiedliche Vor- und Nachteile haben, die sich auf die nachgelagerte Ausbeute und Reinheit von Elektrofahrzeugen auswirken. Daher ist die Charakterisierung der EV-Vorbereitung, die aus einer bestimmten Quelle durch eine gewählte Methode isoliert wurde, wichtig für die Interpretation der nachgelagerten Ergebnisse und den Vergleich der Ergebnisse zwischen Labors. Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung der Größe und Menge von Elektrofahrzeugen, die durch Krankheitszustände oder als Reaktion auf äußere Bedingungen verändert werden können. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist eine der führenden Technologien für die Hochdurchsatzanalyse einzelner Elektrofahrzeuge. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung und Größenbestimmung von EVs, die aus periguronadalem Fettgewebe und menschlichem Plasma der Maus isoliert wurden, wobei eine bahnbrechende Technologie für NTA verwendet wurde, die große Fortschritte auf diesem Gebiet darstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode reproduzierbare und valide Daten zur Gesamtpartikelkonzentration und -größenverteilung für EVs liefern kann, die mit verschiedenen Methoden aus verschiedenen Quellen isoliert wurden, wie durch die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Anpassung dieses Instruments an NTA wird die Notwendigkeit einer Standardisierung von NTA-Methoden adressieren, um die Strenge und Reproduzierbarkeit in der EV-Forschung zu erhöhen.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine (0,03-2 μm) membrangebundene Vesikel, die von fast allen Zelltypen abgesondert werden1. Sie werden oft als "Exosomen", "Mikrovesikel" oder "apoptotische Körper" bezeichnet, abhängig von ihrem Freisetzungsmechanismus und ihrer Größe2. Während man anfangs dachte, dass EVs nur ein Mittel sind, um Abfälle aus der Zelle zu entfernen, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 3,wissen wir jetzt, dass sie auch an der interzellulären Kommunikation durch Transfer von molekularem Material - einschließlich DNA, RNA (mRNA, microRNA), Lipiden und Proteinen4,5 - teilnehmen können und dass sie wichtige Regulatoren der normalen Physiologie sowie pathologischer Prozesse sind1. 5,6,7,8.
Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung und Quantifizierung von EVs, die an anderer Stelle beschrieben wurden9,10,11,12. Das verwendete Isolationsprotokoll sowie die Quelle von Elektrofahrzeugen können die EV-Ausbeute und -Reinheit stark beeinflussen. Selbst die differentielle Zentrifugation, die lange als "Goldstandard" -Ansatz für die Exosomenisolierung galt, kann einer erheblichen Variabilität unterliegen, die sich anschließend auf die erhaltene EV-Population und die nachgelagerten Analysen auswirkt13. Daher erschweren die verschiedenen Methoden zur Isolierung und Quantifizierung von Elektrofahrzeugen den Vergleich, die Reproduktion und die Interpretation der Ergebnisse von Experimenten, die in der Literaturberichtet wurden 14. Darüber hinaus kann die EV-Freisetzung durch zelluläre Bedingungen oder verschiedene externe Faktoren reguliert werden. Es wurde vorgeschlagen, dass EVs eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase spielen, indem sie Zellen vor intrazellulärem Stressschützen 15, da mehrere Studien gezeigt haben, dass zellulärer Stress die EV-Sekretion stimuliert. Zum Beispiel wurde eine erhöhte EV-Freisetzung nach zellulärer Exposition gegenüber Hypoxie, endoplasmatischem Retikulumstress, oxidativem Stress, mechanischem Stress, Zigarettenrauchextrakt und Feinstaubluftverschmutzung berichtet16,17,18,19,20,21,22. Es wurde auch gezeigt, dass die EV-Freisetzung in vivo modifiziert wurde; Mäuse, die sechzehn Stunden lang einer fettreichen Diät oder einem Fasten unterzogen wurden, setzten mehr Adipozyten-EVsfrei 23. Um zu untersuchen, ob eine bestimmte Behandlung oder bedingung die Ev-Freisetzung verändert, muss die Anzahl der EVs genau bestimmt werden. Die Beurteilung der EV-Größenverteilung kann auch auf den vorherrschenden subzellulären Ursprung von EVs hinweisen (z. B. Fusion von späten Endosomen / multivesikulären Körpern mit der Plasmamembran vs. Knospung der Plasmamembran)24. Daher besteht ein Bedarf an robusten Methoden, um die Gesamtkonzentration und die Größenverteilung des untersuchten EV-Preps genau zu messen.
Eine schnelle und hochempfindliche Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Lösung ist die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Eine detaillierte Erläuterung der Prinzipien dieser Methode und der Vergleich mit alternativen Methoden zur Beurteilung der EV-Größe und -Konzentration wurden zuvor beschrieben25,26,27,28. Kurz gesagt, während der NTA-Messung werden EVs durch das Licht visualisiert, das gestreut wird, wenn sie mit einem Laserstrahl bestrahlt werden. Das Streulicht wird von einem Mikroskop auf eine Kamera fokussiert, die die Partikelbewegung aufzeichnet. Die NTA-Software verfolgt die zufällige thermische Bewegung jedes Teilchens, bekannt als Brownsche Bewegung, um den Diffusionskoeffizienten zu bestimmen, der verwendet wird, um die Größe jedes Teilchens mit der Stokes-Einstein-Gleichung zu berechnen. NTA wurde erstmals 2011 zur Messung von Elektrofahrzeugen in einer biologischen Probe angewendet25. Bis vor kurzem gab es nur zwei Mainstream-Unternehmen, die kommerzielle NTA-Instrumente29 anboten, bis zur Einführung des ViewSizer 3000 (im Folgenden als Partikelverfolgungsinstrument bezeichnet), das eine Kombination aus neuartigen Hardware- und Softwarelösungen verwendet, um erhebliche Einschränkungen anderer NTA-Techniken zu überwinden.
Das Partikelverfolgungsinstrument charakterisiert Nanopartikel in flüssigen Proben durch Analyse ihrer Brownschen Bewegung und charakterisiert größere mikrometergroße Partikel durch Analyse der Gravitationsablagerung. Das einzigartige optische System dieses Instruments, das eine multispektrale Beleuchtung mit drei Laserlichtquellen (bei 450 nm, 520 nm und 635 nm) umfasst, ermöglicht es den Forschern, eine Vielzahl von Partikelgrößen (z. B. Exosomen, Mikrovesikel) gleichzeitig zu analysieren. Ein Schema des Geräteaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.
Hier zeigen wir, wie man Partikelgrößenverteilungs- und Konzentrationsmessungen von isolierten Maus- und Human-EVs mit einem neuartigen NTA-Instrument durchführt.
Abbildung 1:Optisches System des Partikelverfolgungsinstruments. Das NTA-Instrument beleuchtet Partikel mit drei Lasern mit folgenden Wellenlängen: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Die Videoaufzeichnung des Streulichts einzelner Partikel wird von einer digitalen Videokamera, die 90° von der Küvette ausgerichtet ist, detektiert und verfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Protocol
Alle Arbeiten mit diesen Proben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und des Institutional Review Board durchgeführt. Eine schematische Übersicht über die NTA-Methode ist in Abbildung 2dargestellt.
Abbildung 2: Überblick über die NTA-Methode mit dem Partikelverfolgungsinstrument. Die Probe wird vorbereitet und in das Instrument eingelegt. Die NTA-Software wird geöffnet, die Aufnahmeparameter werden angepasst und die Probe wird fokussiert. Anschließend werden die Daten erfasst, verarbeitet und angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Extrazelluläre Vesikelisolation
HINWEIS: Maus periigonadale Fettgewebe EVs wurden wie zuvor beschrieben isoliert23. Plasma-EVs wurden aus 1 ml menschlichem Plasma mit dem folgenden Protokoll isoliert:
- Sammeln Sie das Plasma und die Zentrifuge bei 3.000 x g für 15 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr.
HINWEIS: Wenn zusätzliche Ablagerungen nachweisbar bleiben, zentrifugieren Sie den Überstand für weitere 10 minuten bei 12.000 x g und übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. - Pro 250 μL Plasma werden 67 μL des Exosomen-Isolationsreagens hinzugefügt. Mischen Sie gut, indem Sie die Röhre invertieren oder streichen.
- Auf Eis aufrecht für 30 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie das Exosom-Isolationsreagenz/Plasma-Gemisch bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C.
HINWEIS: Die Zentrifugation kann bei Raumtemperatur oder 4 °C mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt werden, aber 4 °C wird bevorzugt. Nach der Zentrifugation können die EVs als beige oder weißes Pellet am Boden des Rohrs erscheinen. - Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Spinnen Sie alle verbleibenden Exosomen-Isolationslösungen herunter und entfernen Sie alle Flüssigkeitsspuren durch Aspiration, wobei Sie sehr darauf achten, die gefällten EVs im Pellet nicht zu stören.
- Das Pellet wird in 200 μL Puffer B (vom Hersteller bereitgestellt) wieder aufgebraucht. Messen und aufzeichnen Sie die Proteinkonzentration der Probe (für Schritt 2.8) mit einem Spektralphotometer, Fluorometer, Bradford-Assay oder einer anderen bevorzugten Methode.
2. Reinigung isolierter Elektrofahrzeuge
- Fügen Sie 200 μL Puffer A (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) zu wieder suspendierten Elektrofahrzeugen hinzu.
- Nehmen Sie die Reinigungssäule (im Lieferumfang enthalten) heraus, lösen Sie den Schraubverschluss und schnappen Sie den Bodenverschluss ab. Legen Sie die Säule in ein Auffangrohr.
HINWEIS: Speichern Sie den unteren Verschluss für die Schritte 2.7-2.9. - Zentrifuge bei 1.000 x g für 30 s, um den Speicherpuffer zu entfernen.
- Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in das Auffangrohr ein.
- Um die Säule zu waschen, entfernen Sie die Kappe und tragen Sie 500 μL Puffer B auf das Harz und die Zentrifuge bei 1.000 x g für 30 s auf. Verwerfen Sie den Durchfluss. Speichern Sie die Obergrenze für die Schritte 2.7-2.9.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5 noch einmal, um die Säule zu waschen.
- Stecken Sie die Unterseite der Säule mit dem unteren Verschluss (ab Schritt 2.2). Tragen Sie 100 μL Puffer B auf das Harz auf, um es für die Probenbeladung vorzubereiten.
- Fügen Sie den gesamten Inhalt aus Schritt 1.6 (oder bis zu einem Volumenäquivalent von 4 mg Gesamtprotein) zum Harz hinzu. Setzen Sie den Schraubverschluss auf die Oberseite der Säule.
- Bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Shaker für nicht mehr als 5 min mischen.
3. Probenelution
- Lösen Sie den Schraubverschluss und entfernen Sie den Bodenverschluss und geben Sie ihn sofort in ein 2-ml-Mikrozentrifugenrohr über.
HINWEIS: Die Probe beginnt zu eluieren, sobald der Bodenverschluss entfernt wird. Bitte stellen Sie sicher, dass 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen bereit sind, Eluat zu erhalten, um den Probenverlust zu minimieren. - Zentrifuge bei 1.000 x g für 30 s, um gereinigte EVs zu erhalten. Verwerfen Sie die Spalte.
4. Probenvorbereitung für die Nanopartikel-Tracking-Analyse
- Verwenden Sie ein fusselfreies Material wie ein Mikrofasertuch, um den Arbeitsbereich abzudecken und zu verhindern, dass Fasern in Küvetten gelangen.
- Legen Sie die Küvette mit Handschuhen auf die magnetische Küvettenvorrichtung und legen Sie dann die Rührstange in die Küvette. Behandeln Sie die Küvetten immer mit Handschuhen, um zu verhindern, dass Fingerabdrücke und Flecken auf der Oberfläche der Küvette erscheinen.
- Verwenden Sie das Hakenwerkzeug, um den Einsatz in die Küvette einzulegen, wie in Abbildung 3dargestellt. Es ist wichtig, die Ausrichtung des Einsatzes für später zu beachten (Schritt 5.4).
Abbildung 3: Richtige Ausrichtung des Einsatzes innerhalb der Quarzküvette. Die "Notch" des Einsatzes sollte von der Vorderseite der Küvette sichtbar sein. Dieser sollte in das der Kamera zugewandte Instrument eingesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Mit einer Pipette langsam 400-500 μL des Verdünnungsmittels oder der verdünnten Probe bei Raumtemperatur durch das Loch im Einsatz in die Küvette geben. Vorsichtig auf und ab pipetten, um zu mischen. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen.
- Bereiten Sie zunächst eine Küvette vor, die mit dem gewählten Verdünnungssstoff (Rohling) beladen ist, um die Partikelkonzentration des Verdünnungssstoffs zu messen. Dies sollte vor der Messung der Probe erfolgen, damit die Hintergrundkonzentration der Probe korrigiert werden kann.
HINWEIS: Ein guter Rohling (in diesem Fall phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS]) hat eine Konzentration <9 x10 6 (abhängig vom Verdünnungssalstoff) und zeigt 1-10 Partikel pro Bildschirm in der Live-Ansicht an (Abbildung 4). Es wird empfohlen, dass die tatsächliche Probenpartikelkonzentration mindestens das 3-fache der Hintergrundkonzentration beträgt. - Optional wird vor der Aufzeichnung der Probenprimierung die Küvette mit 400-500 μL der Verdünnungs- oder verdünnten Probe vor der Messung aufgezäßt. Laden Sie dazu 400-500 μL der verdünnten Probe in die Küvette, entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie dann 400-500 μL mehr von der Probe für die Messung hinzu. Dies kann beim Auswaschen von Rückständen in der Küvette helfen.
- Bereiten Sie zunächst eine Küvette vor, die mit dem gewählten Verdünnungssstoff (Rohling) beladen ist, um die Partikelkonzentration des Verdünnungssstoffs zu messen. Dies sollte vor der Messung der Probe erfolgen, damit die Hintergrundkonzentration der Probe korrigiert werden kann.
Abbildung 4: Repräsentative Live-Stream-Ansicht eines Verdünnungssstoffs im richtigen Konzentrationsbereich eines Rohlings. Verdünnen Sie EV-Preps in gefilterten (0,02 μm oder 3 kDa, bevorzugt) PBS. Ein guter Rohling zeigt ~ 1-10 Partikel pro Bildschirm in der Live-Ansicht an, was eine Konzentration im Bereich von 105-106ergibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Verschließen Sie die Küvette und prüfen Sie auf Blasen. Tippen Sie bei Bedarf Blasen aus. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Außenflächen der Küvette abzuwischen.
5. Inbetriebnahme des Partikelverfolgungsinstruments
- Schalten Sie die Computerarbeitsstation und das Instrument ein, warten Sie einige Minuten, bevor Sie das erste Beispiel ausführen, und starten Sie das Programm, indem Sie auf das Softwaresymbol klicken. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie auf dem Bildschirm auf NTA, um die Nanopartikel-Tracking-Analyse durchzuführen. Beginnen Sie auf der Registerkarte Aufzeichnung und klicken Sie auf die verschiedenen Softwareregisterkarten (Aufzeichnung, Prozess, Plot), um zwischen ihnen im gesamten Protokoll zu wechseln. Nehmen Sie zuerst die Probe (Verdünnungssalm oder EV-Vorbereitung) auf, verarbeiten Sie dann die Aufnahmen und zeichnen Sie schließlich die Ergebnisse auf.
- Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um alle erforderlichen Informationen über die Probe auszufüllen. Überprüfen Sie, ob alle erforderlichen Felder ausgefüllt und korrekt sind, z. B. Probenname, Beschreibung, Probenvorbereitung, Verdünnungsfaktor [1000], Zieltemperatur (auf 22 °C eingestellt) und Verdünnungsmittel: Wählen Sie Verdünnungsmittel aus dem Dropdown-Menü aus und verwenden Sie PBS als Verdünnungsmittel für Elektrofahrzeuge. Wenn Sie PBS aus dem Dropdown-Menü auswählen, wird der Salzgehalt automatisch auf 9% aufgefüllt. Diese Informationen sind notwendig, um die dynamische Viskosität der Flüssigkeit zu bestimmen.
HINWEIS: Es kann bis zu 3 Minuten dauern, bis sich die Temperatur in der Küvette ausgleicht, auch wenn die Sonde bereits die gewünschte Temperatur anzeigt (dh der grüne Punkt wird stabil). Die Probenauslesungen können erheblich variieren, wenn die Zieltemperatur nicht eingestellt wird, da Die Temperaturunterschiede der Proben die Brownsche Bewegung der Partikel stark verändern können. - Öffnen Sie den Instrumentendeckel und entfernen Sie die Schutzkappe, auf der die Küvette platziert wird.
ACHTUNG: Das Partikelverfolgungsinstrument ist als Laserprodukt der Klasse 1 (21 CFR Ch. I Teil 1040), die Laser enthalten, die gefährlich sein können und schwere Verletzungen wie Verbrennungen und / oder dauerhafte Schäden des Sehvermögens verursachen können. Um Unfälle oder Verletzungen zu vermeiden, entfernen Sie die Instrumentenabdeckung nicht, indem Sie die Schrauben von der Seite abschrauben. Beachten Sie, dass die Laserstrahlen während des Betriebs vollständig eingeschlossen sind und keine Gefahr für den Benutzer darstellen. Außerdem ist eine magnetische Sicherheitsverriegelung in den Probenhalter des Instruments integriert, um zu verhindern, dass die Laser funktionieren, wenn die Kappe des Probenhalters entfernt wird. - Legen Sie die Küvette (ab Schritt 4.3) in der richtigen Ausrichtung in das Gerät (siehe Abbildung 5). Setzen Sie die Kappe über die Küvette und schließen Sie den Instrumentendeckel. Bedienen Sie das Instrument immer mit der Kappe über dem Probenhalter. Deaktivieren Sie die Sicherheitsverriegelungsfunktion nicht und versuchen Sie nicht, sie zu umgehen.
Abbildung 5: Richtige Ausrichtung der Küvette im Partikelverfolgungsinstrument. Das Gesicht der Küvette (mit der "Notch" des Einsatzes sichtbar) sollte der Kamera zugewandt sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Schalten Sie die Kamera ein, indem Sie auf den Pfeil über Streamingklicken.
- Klicken Sie auf den Chevron-Pfeil, um die Datensatzeinstellungen zu erweitern. Stellen Sie Verstärkung und Laserleistung auf die für die Anwendung geeigneten Werte ein. Siehe Tabelle 1 (und ergänzende Abbildung 1)für Parameter, die für NTA von kleinen (100 nm) EVs verwendet werden.
HINWEIS: Diese erweiterten Einstellungen, auf die Sie durch Klicken auf den Chevron-Pfeil zugreifen, sind möglicherweise kennwortgeschützt. Verwenden Sie für die Aufzeichnung und Verarbeitung des Verdünnungsmittels (Leer) die gleichen Einstellungen wie für die nachfolgenden Proben. - Stellen Sie den Fokus ein, bis die Partikel richtig fokussiert sind. Die Fokussierung sollte auf relativ kleinen Partikeln erfolgen (Abbildung 6). Für kleine EV-Quantifizierungen (konsistent mit Exosomen) werden die folgenden Aufnahmeeinstellungen empfohlen: Bildrate: 30 fps, Belichtung: 15 ms, Rührzeit: 5 s, Wartezeit: 3 s, Laserleistung - Blau: 210 mW, Grün: 12 mW, Rot: 8 mW, Bilder pro Video: 300 Bilder und Verstärkung: 30 dB.
HINWEIS: Der Benutzer kann den Zoom auf das 1-fache erhöhen und/oder die Verstärkung erhöhen, um die Fokussierung zu unterstützen. Denken Sie daran, diese Parameter vor dem Aufnehmen von Videos auf empfohlene Werte zurückzustellen.
Abbildung 6: Repräsentative Livestream-Ansichten mit Partikelfokus. (A) Ein Beispiel für eine Livestream-Ansicht von Partikeln, die nicht im Fokus sind. Partikel haben einen glühenden Halo oder erscheinen verschwommen. Passen Sie den Fokus an. (B) Ein Beispiel für eine Livestream-Ansicht von Partikeln im richtigen Fokus. Die kleinsten Partikel sind im Fokus. Beginnen Sie mit der Aufnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Führen Sie eine visuelle Qualitätsprüfung durch, um sicherzustellen, dass die Probe ordnungsgemäß verdünnt wird. Wenn die Probe zu konzentriert ist, entfernen Sie die Küvette aus dem Instrument und verdünnen Sie die Probe nacheinander. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Probe ordnungsgemäß verdünnt ist, bevor Sie mit Schritt 6 fortfahren.
HINWEIS: Verdünnen Sie die Probe nicht zu viel! Verdünnungen immer nacheinander vornehmen. Das ideale Leerzeichen zeigt nur wenige Partikel auf dem Bildschirm (1-4) an, wie in Abbildung 4 dargestellt. In Bezug auf EV-Proben sind in einer ordnungsgemäß verdünnten Probe etwa 20-100 Partikel auf dem Bildschirm sichtbar, ohne glühende oder trübe Bilder im Hintergrund (siehe Abbildung 7 als Beispiel). Dies sollte zu einer optimalen Partikelkonzentration im Bereich von 5 x 106 bis 2 x 108 Partikeln pro ml führen (ohne Anpassung an den Verdünnungsfaktor).
Abbildung 7: Repräsentative Livestream-Ansichten, die verschiedene Partikelverdünnungen darstellen. (A) Eine Beispiel-Livestream-Ansicht einer zu konzentrierten Probe. Die Aufzeichnung einer zu konzentrierten Probe führt zu ungenauen Ergebnissen. (B) Eine Beispiel-Livestream-Ansicht einer ordnungsgemäß verdünnten Probe. Es sind 60-100 Partikel auf dem Bildschirm sichtbar und die Aufnahme ergibt eine Rohkonzentration von 5 x 106- 2 x 108 Partikeln / ml. (C) Eine Beispiel-Livestream-Ansicht einer zu verdünnten Probe. Wenn eine Probe so verdünnt ist, werden nicht genügend Partikel verfolgt, was die Probengröße verringert und daher die Ergebnisse statistisch ungültig sind. In diesem Fall wird empfohlen, die Anzahl der aufgenommenen Videos zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Videodatenerfassung
- (Optional) Stellen Sie die Zoomeinstellung auf 0,5x ein, um Bandbreite zu sparen und verlorene Frames zu vermeiden.
- Beginnen Sie mit der Aufnahme der Videos, indem Sie auf Aufnahme klicken (siehe Tabelle 1 für empfohlene Aufnahmeparameter).
HINWEIS: Standardmäßig rührt das Instrument die Probe für 5 s, wartet 3 s und zeichnet dann für 10 s auf, bevor dieser Vorgang wiederholt wird. Die typische Messzeit für 50 Videos beträgt ~ 15 minuten für die Aufnahme und ~ 13 minuten für die Verarbeitung. - Berühren Sie das Instrument nicht, während Sie Videos aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Labortischs nicht vibriert.
HINWEIS: Es wird bevorzugt, dass das Instrument auf einer Anti-Vibrationsplattform oder einem Tisch aufgestellt wird, um Vibrationsstörungen von nahe gelegenen Geräten zu reduzieren, die die Bestimmung der Nanopartikelbewegung stören. Vermeiden Sie den Betrieb von Zentrifugen, Wirbelmischern oder anderen potenziell schwingungserzeugenden Geräten auf demselben Prüfstand wie das Partikelverfolgungsinstrument. Vibrationen sind auf dem Bildschirm als Dehnung von meist runden Partikeln gut sichtbar. Wenn das Instrument starken Vibrationen ausgesetzt ist, kann eine Neuausrichtung der optischen Elemente erforderlich sein. Das Gerät wurde nicht für die Gewartete oder Kalibrierung durch den Kunden entwickelt; Wenden Sie sich für Wartung, Service und Kalibrierung an den Hersteller. - Notieren Sie sich jedes aufgezeichnete Video mit sehr großen Partikeln, die als große, unregelmäßige weiße Blobs sichtbar sind. Entfernen Sie diese Videos aus der Verarbeitung in Schritt 7.3.
7. Erfasste Daten verarbeiten
- Wenn eine Eingabeaufforderung angezeigt wird, dass Videos aufgezeichnet wurden, klicken Sie auf OK, um die Aufnahme abzuschließen. Wählen Sie dann die Registerkarte Prozess.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden. Die Verarbeitung der erfassten Daten kann später neu gestartet werden, indem Sie direkt auf die Registerkarte Prozess wechseln, nachdem Sie die Software des Partikelverfolgungsinstruments geöffnet und das Verzeichnis angegeben haben, in dem die aufgezeichneten Videos gespeichert werden. - Aktivieren Sie bei der Analyse von EVs das Kontrollkästchen Automatische Erkennungsüberschreibung deaktivieren und legen Sie den Feature-Durchmesser auf 30fest. Klicken Sie auf Verarbeiten. (Siehe Tabelle 2 für Verarbeitungseinstellungen und ergänzende Abbildung 2 für die Verarbeitungsanzeige). Ein Live-Verteilungsdiagramm wird angezeigt, sodass der Benutzer die Verarbeitung in Echtzeit anzeigen kann.
- Für Exosomen ist der Nachweisschwellenwert auf die Standard-Polydisperse Probefestgelegt. Verarbeiten Sie die Daten mit einem Detection Threshold Manual, der auf 0,8 anstelle eines Standardschwellenwerts von 0,99 eingestellt ist, nur für Lösungen mit sehr großen Unterschieden in der Partikelgröße.
- Wenn bei Videos auffällig sehr große Partikel sichtbar waren (siehe Schritt 6.4), navigieren Sie zum Verzeichnis der aufgenommenen Videos und entfernen Sie das problematische Video. Nachdem Sie die Liste der Videodateien bearbeitet haben, ändern Sie die Anzahl der aufgezeichneten Videos in anderen vom Benutzer geführten Protokollen.
- Klicken Sie nach Abschluss der Verarbeitung auf OK. Wählen Sie dann die Registerkarte Plot aus. Zeigen Sie für EVs das Hauptdiagramm als LogBinSilicaan.
HINWEIS: Hier auf der Registerkarte Diagramm kann der Benutzer andere Funktionen des Diagramms anpassen, z. B. den Bereich der x-Achse (Partikeldurchmesser, nm) definieren, um den Bereich für die Integration für die erzeugte Figur festzulegen.
8. Ergebnisse anzeigen und interpretieren
- Um einen PDF-Bericht zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht. Die Messung ist nun abgeschlossen und die Ergebnisse können eingesehen werden.
HINWEIS: Denken Sie daran, den Rohling zuerst aufzuzeichnen und zu verarbeiten, damit die Hintergrundkonzentration der nachfolgenden Proben korrigiert werden kann. Wird dieser Schritt vergessen, kann der Rohling nach Proben erfasst und die Probenpartikelkonzentration manuell korrigiert werden. - Untersuchen Sie den PDF-Bericht, der den Mittelwert, den Median und die Modusgröße sowie die konzentration anzeigt, die für den Verdünnungsfaktor angepasst und durch Subtrahieren der Partikelkonzentration des Verdünnungsmittels korrigiert wurde. Die Verteilungsbreite (Standardabweichung) wird ebenfalls angezeigt.
HINWEIS: Es gibt nur sehr wenige Anwendungen, bei denen ein einzelner Wert angemessen und repräsentativ ist. Daher wird empfohlen, die gesamte Größenverteilung zu beschreiben und die Breite der Verteilung für jede analysierte Probe zu melden (wie z. B. in Tabelle 3 gezeigt). - Zeichnen Sie die folgenden Geräteeinstellungen auf, die zur Generierung der Daten verwendet werden, die bei der Meldung der Ergebnisse angegeben werden sollten: Verdünnung, Laserleistung jedes Lasers [mW], Belichtung [ms], Verstärkung [dB], Bildrate [fps], Frames pro Video, Anzahl der aufgenommenen Videos, Verarbeitungseinstellung (z. B. LogBinSilica), Integrationsbereich [min nm, max nm] (empfohlen, min bis 50 nm einzustellen) und Anzahl der verfolgten Partikel (wünschenswert, um mindestens ~ 150 Partikel pro Video zu analysieren; mindestens 3.750 Gesamtspuren pro Probe empfohlen, um künstliche Spitzen in der Partikelgrößenverteilung zu vermeiden und statistisch signifikante Daten zu generieren).
9. Reinigung der Küvetten
- Reinigen Sie küvetten manuell zwischen den Proben. Leeren Sie zuerst die Küvette.
HINWEIS: Die Probe kann entweder aus der Küvette geborgen und gespeichert oder entsorgt werden. - Sobald die Küvette leer ist, reinigen Sie die Küvette, indem Sie sie 10-15 Mal mit deionisiertem (DI) Wasser spülen. Dann 3 mal mit Ethanol abspülen (70-100%). Achten Sie dabei darauf, die Küvette vollständig mit Lösungsmittel zu füllen.
- Trocknen Sie die Außenseite der Küvette mit einem fusselfreien Mikrofasertuch. Vermeiden Sie Flecken auf den Oberflächen. Trocknen Sie die Innenseite der Küvette an der Luft oder trocknen Sie sie mit einem Druckluftstaubwedel.
HINWEIS: Zum Abwischen der optischen Oberflächen der Küvette sollten nur Linsenreinigungspapier oder fusselfreies Mikrofasertuch verwendet werden, da die meisten Papierprodukte kleine Holzfasern enthalten, die die Oberfläche der Küvette zerkratzen oder beschädigen können. - Bereiten Sie zwei Glasszintillationsfläschchen vor: eine mit 70-100% Ethanol und die andere mit DI-Wasser. Spülen Sie die Einsätze und Rührstäbe zuerst im Ethanol (dann DI-Wasser) aus, indem Sie den Einlege-/Rührstab in die entsprechende Szintillationsfläschchen geben und die Durchstechflasche kräftig schütteln. Trocknen Sie die Einsätze und Rührstangen mit fusselfreien Tüchern oder Druckluftstaubtüchern.
HINWEIS: Die Küvette und der Einsatz können auch mit einem Beschallungswasserbad gereinigt werden. Stellen Sie dazu zunächst sicher, dass die Beschallungseinheit genügend Wasser enthält (mindestens 5 cm Tiefe). Dann legen Sie die Küvette und setzen Sie sie in ein Glasbecherglas (50 ml oder größer) ein, füllen Sie das Becherglas mit Alkohol auf dem gleichen Niveau wie das Wasserbad, legen Sie das Becherglas in das Wasser und schalten Sie die Stromversorgung ein. Beschallen Sie maximal 5 Minuten auf einmal, so dass die Maschine zwischen jedem 5-minütigen Burst >5 Minuten ruhen kann, wenn längere Zeiten erforderlich sind. - Wenn Sie fertig sind, legen Sie sofort alle gereinigten und getrockneten Komponenten zur Lagerung weg.
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Representative Results
Vor dieser Demonstration wurde zunächst die Kalibrierung des Instruments getestet, um die Gültigkeit der erfassten Daten durch Messung der Größenverteilung von Polystyrolperlenstandards sicherzustellen. Wir haben die Größenverteilung von 100 nm und 400 nm Perlen mit den Standardaufzeichnungsparametern und den in diesem Protokoll empfohlenen Verarbeitungseinstellungen getestet (Abbildung 8).
Für den 100 nm Polystyrolperlenstandard wurde eine Konzentration von 4,205 x 107 Partikeln/ml gemessen. Die mittlere Größe (Standardabweichung, SD) betrug 102 (±17) nm mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 0,16. Die D10/D50/D90-Werte lagen bei 76/104/126 nm. Dies deutet darauf hin, dass das Partikelverfolgungsinstrument die Größe der monodispersen 100 nm-Perlen genau gemeldet hat. Für den 400 nm Polystyrolperlenstandard betrug die Konzentration 4,365 x 107 Partikel/ml. Die mittlere Größe (SD) betrug 391 (±47) nm mit einem CV von 0,12. Die D10/D50/D90-Werte lagen bei 150/358/456 nm (Tabelle 3). Während der gemeldete Mittelwert der wahren Größe der Perlen sehr nahe kommt, können wir sehen, dass die in diesem Protokoll angewendeten Instrumenteneinstellungen für die kleineren Partikel ~ 100 nm genauer sind. Daher wird für Partikel größer als 400 nm eine Optimierung der Laserparameter vorgeschlagen. Forscher sollten zunächst eine Methode wie die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchführen, um die resultierende EV-Größenverteilung aus einer bestimmten Quelle und Isolationsmethode vor NTA abzuschätzen.
Für die für diese Demonstration verwendete Mausgewebe-EV-Probe wurde eine mittlere Konzentration von4,41 x 10 10 Partikeln/ml gemessen. Diese Stichprobe wurde nach den in Tabelle 1 zusammengefassten Parametern aufgezeichnet und nach den in Tabelle 2beschriebenen Parametern verarbeitet. Wir zeigen die Auswirkungen verschiedener Verdünnungsfaktoren in Abbildung 9 und berichten die Roh- und angepassten Partikelkonzentrationen in Tabelle 4. Die optimale Verdünnung für die aus Mausgewebe gewonnenen EVs lag zwischen 1.000 und 3.000, während sie für aus menschlichem Plasma gewonnene EVs 1.000 betrug, was darauf hindeutet, dass beim ersten Testen einer bestimmten Biofluidquelle oder EV-Isolationsmethode für NTA serielle Verdünnungen getestet werden sollten, damit die optimale Verdünnung für die NTA-Messung identifiziert werden kann. Wir empfehlen, mindestens zwei verschiedene Verdünnungen einer Probe zu messen und zu melden. Wir haben auch vier zusätzliche Proben bei verschiedenen Verdünnungen auf zwei verschiedenen Partikelverfolgungsinstrumenten gemessen. Die ergänzende Abbildung 3 vergleicht die Genauigkeit der Partikelverfolgungsinstrumente bei den Größenmessungen im Vergleich zu einem anderen kommerziell erhältlichen NTA-Instrument. Die ergänzende Tabelle 1 zeigt ferner die Genauigkeit der Messungen dieses Instruments und zeigt, dass sich die Partikelkonzentration proportional zur Probenverdünnung änderte, die Partikelgrößenmessungen jedoch nicht.
Nach der Verarbeitung können die Ergebnisse (zusammen mit den Instrumenten-/Softwareinformationen, den Aufnahme- und Verarbeitungseinstellungen und den experimentellen Notizen) in einem .pdf Bericht gespeichert werden. Das in diesem Bericht enthaltene Histogramm kann wie im Protokoll (Abschnitt 7.4) beschrieben geändert werden. Die Rohergebnisse werden in einer .dat Datei gespeichert, die exportiert werden kann. Die aufgenommenen Videos werden ebenfalls gespeichert und können für die spätere Offline-Verarbeitung und -Analyse verwendet werden. Sobald Videos aufgenommen wurden, können die Aufnahmeeinstellungen jedoch nicht nachträglich geändert werden.
Die Auswirkungen der Veränderung der verschiedenen Laserleistungen und -verstärkungen in den Aufnahmeeinstellungen wurden mit aus menschlichem Plasma abgeleiteten EVs demonstriert. Dies ist in den Abbildungen 10-12 visualisiert und die quantitativen Informationen, die auf diesen Bildern basieren, sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Erhöhung der Verstärkung erhöht die Empfindlichkeit der Kamera und ermöglicht die Visualisierung kleinerer Partikel (Abbildung 10), was zu einer steigenden Gesamtpartikelkonzentration mit einer kleineren durchschnittlichen Partikelgröße führt (Tabelle 5). Die Erhöhung der Verstärkung über 30 dB (unsere Empfehlungen) macht die Ansicht jedoch zu körnig, so dass Rauschen die Messung von echten Partikeln verdeckt. Bei einer Kameraverstärkung von 30 dB ist der Effekt der Veränderung der blauen Laserleistung in Abbildung 11dargestellt. Die Erhöhung der Leistung des blauen Lasers (450 nm, kurze Wellenlänge) führt zu einer höheren Auflösung, um kleinere Partikel (d. H. Solche mit einer Größe, die mit Exosomen übereinstimmt) zu erkennen. Wenn die grünen und roten Laserleistungen bei den Standardeinstellungen konstant gehalten und die blaue Laserleistung von 70 mW auf 210 mW erhöht wurde, wurde die gemeldete durchschnittliche Partikelgröße von 122 nm auf 105 nm verschoben und die gemeldete Gesamtpartikelkonzentration von 1,1 x 108 auf 1,7 x 108 erhöht(Tabelle 5).
Der Effekt der Erhöhung der grünen und roten Laserleistungen wurde ebenfalls gezeigt (Abbildung 12). Die Erhöhung der Leistung des roten Lasers (650 nm, lange Wellenlänge) erhöhte die berichtete durchschnittliche Partikelgröße von 175 auf 246 nm. Die berichtete Gesamtpartikelkonzentration nahm ab, aber das liegt daran, dass in dieser menschlichen Plasma-EV-Probe nicht viele große Partikel vorhanden waren, bestätigt durch TEM-negative Färbung (Ergänzende Abbildung 4). Die Erhöhung der grünen Laserleistung führte zu einer Abnahme der gemeldeten durchschnittlichen Partikelgröße und einer Erhöhung der gemeldeten Gesamtpartikelkonzentration. So kann der Anwender die Leistung der drei Laser optimieren, um Partikel unterschiedlicher Größe empfindlich zu detektieren.
Dieses Protokoll ist für kleinere Vesikel (z. B. <400 nm) optimiert. Forscher, die an Mikrovesikeln größerer Größe (z. B. 400-1000 nm) interessiert sind, werden ermutigt, die Laserparameter mit hohlen Organosilica-Perlen zu optimieren, die ähnliche lichtstreuende Eigenschaften wie EVs haben, was sie zu einer geeigneteren Referenz als Polystyrol- oder Kieselsäureperlenstandards macht30. Kieselsäure-Nanopartikel könnten jedoch der beste praktische Ersatz sein, bis Organosilica-Standards breiter verfügbar werden.
Hier wurde ein NTA-Instrument verwendet, um EVs, die aus Mausgewebe durch Ultrazentrifugation und menschlichem Plasma mit einem kommerziellen Kit isoliert wurden, erfolgreich zu quantifizieren. Die Auswirkungen der Änderung der NTA-Parameter wurden veranschaulicht und zeigen, dass die Parameter in diesem Protokoll für kleine Vesikel optimiert sind. Die Bedeutung des Verdünnungsschritts wurde ebenfalls aufgezeigt und zeigt, dass das hier demonstrierte Partikelverfolgungsinstrument Variationen der Verdünnungsfaktoren genau erkennen kann. Die Konzentration änderte sich proportional mit mehreren Verdünnungen, während die Größenverteilung dies nicht tat. Die resultierenden Daten zeigten geringe technische Variabilität. Daher wird die Anpassung dieses Protokolls durch Forscher, die dieses Instrument für NTA verwenden, die Strenge und Reproduzierbarkeit im EV-Forschungsbereich erhöhen.
Abbildung 8: Partikelgrößenverteilungen von monodispersen Polystyrolperlenstandards. (A) Partikelgrößenverteilung von 100 nm Polystyrolperlenstandard. (B) Partikelgrößenverteilung von 400 nm Polystyrolperlenstandard. Die Werte sind in Tabelle 3 angegeben. Inset zeigt beispielsweise die Livestream-Ansicht des ersten gemessenen Frames. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Rohe Gesamtpartikelkonzentrationen nach Verdünnungsfaktor für periguonadale Fettgewebe-EVs der Maus. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Für jede Verdünnung wurden drei Messungen durchgeführt. Die Werte sind in Tabelle 4 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Visuelle Auswirkungen der zunehmenden Verstärkung. Repräsentative Bilder von Partikeln, die mit Standard-Lasereinstellungen (Blau = 70 mW, Grün = 12 mW, Rot = 8 mW) und Verstärkung gemessen wurden (A) 18 dB, (B) 24 dB - Standard und (C) 30 dB - empfohlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Wirkung des blauen Lasers auf kleine Partikel, wenn rote und grüne Laser auf die Standardeinstellungen eingestellt sind. (A) Blauer Laser = 70 mW (Standard). (B) Blauer Laser = 210 mW (empfohlen). Mehr kleine Partikel sind sichtbar und im Fokus, wenn die blaue Laserleistung auf 210 mW erhöht wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12:Visuelle Auswirkungen der veränderten blauen, grünen und roten Laserleistung. Repräsentative Live-Screen-Ansichten zeigen die unterschiedlichen Partikelgrößen, die über verschiedene Lasereinstellungen visualisiert werden. Die resultierenden NTA-Werte sind in Tabelle 5 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Teilchen | Durchmesser [nm] | Blauer Laser [mW] | Grüner Laser [mW] | Roter Laser [mW] | Kameraverstärkung [dB] | Temperaturregelung | Verarbeitung | # Videos |
| Exosomen | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Aktiviert, auf 22 ºC eingestellt | Automatische Erkennung außer Kraft gesetzt | 50 |
Tabelle 1: Aufzeichnungsparameter für kleine extrazelluläre Vesikel (~100 nm).
| Prozessbeschreibung | Erkennungsschwellenwert | Automatische Erkennung außer Kraft setzen | Feature-Durchmesser [px] |
| Exosomen | Polydisperse Probe | Geprüft | 30 |
Tabelle 2: Verarbeitungsparameter für kleine extrazelluläre Vesikel (~100 nm).
| Größe des Polystyrol-Standards [nm] | Integrationsbereich [nm] | Mittlere Größe [nm] | SD-Größe [nm] | Lebenslauf der Größe | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Gesamtzahlen |
| 100 | 50 bis 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 bis 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabelle 3: NTA-Ergebnisse von monodispersen Polystyrolperlenstandards. Beide Standards wurden optimal verdünnt, mit Rohkonzentrationen für den 100 nm Standard und 400 nm Standard von 4.205 x 107 Partikel/ml bzw. 4.365 x 107 Partikel/ml. D10 ist der Punkt in der Größenverteilung, an dem 10% der Probe enthalten sind, D50 ist der Punkt, an dem 50% der Probe enthalten sind (Median), und D90 ist der Punkt, an dem 90% der Probe enthalten sind. SD: Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient.
| Verdünnungsfaktor | Partikelkonzentration, Partikel/ml | Gesamtpartikelkonzentration, Partikel/ml |
| Roh | Bereinigt um Verdünnungsfaktor | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4,10E+10 |
| 4.00E+07 | 4,00E+10 | |
| 3,70E+07 | 3,70E+10 | |
| Mittelwert (SD) | 3,93E+07 (1,70E+06) | 3,93E+10 (1,70E+09) |
| 1500 | 3,60E+07 | 5,40E+10 |
| 2,60E+07 | 3,80E+10 | |
| 2,90E+07 | 4,40E+10 | |
| Mittelwert (SD) | 3,03E+07 (4,19E+06) | 4,55E+10 (6,60E+09) |
| 2000 | 2,40E+07 | 4,80E+10 |
| 2.30E+07 | 4,60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4,00E+10 | |
| Mittelwert (SD) | 2,23E+07 (1,70E+06) | 4,46E+10 (3,40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6,00E+10 |
| 1,30E+07 | 3,90E+10 | |
| 1,40E+07 | 4,20E+10 | |
| Mittelwert (SD) | 1,57E+07 (3,09E+06) | 4,71E+10 (9,27E+09) |
Tabelle 4: NTA-Ergebnisse von perinonadalen Fettgewebe-EVs der Maus zeigen die Reproduzierbarkeit von NTA-Messungen. Rohe NTA-Partikelkonzentrationen (Partikel/ml), gemessen am Partikelverfolgungsinstrument und Gesamtpartikelkonzentration (Partikel/ml), angepasst um den Verdünnungsfaktor von EVs, die aus periguronadalem Fettgewebe der Maus in verschiedenen Verdünnungen gewonnen werden.
| Verstärkung [dB] | Blauer Laser [mW] | Grüner Laser [mW] | Roter Laser [mW] | Gesamtkonzentration, Partikel/ml (roh) | Durchschnittliche Größe [nm]* | Standardabweichung der Größe / CV | Modale Größe | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5,90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1,00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1,70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1,10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1,00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2,80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4,40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1,50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integriert im Bereich von 50-1000 nm | ||||||||
Tabelle 5: NTA-Ergebnisse von aus menschlichem Plasma gewonnenen EVs zeigen den Effekt der Veränderung der Laserleistung und -zunahme auf Größen- und Partikelkonzentrationsmessungen von menschlichen EVs (1:1000 Verdünnung). D10 ist der Punkt in der Größenverteilung, an dem 10% der Probe enthalten sind, D50 ist der Punkt, an dem 50% der Probe enthalten sind (Median), und D90 ist der Punkt, an dem 90% der Probe enthalten sind. SD: Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient.
Ergänzende Abbildung 1: Screenshot des Aufzeichnungsfensters mit den empfohlenen Aufzeichnungsparametern. Greifen Sie auf erweiterte Einstellungen zu, um die Kameraverstärkung und die Laserleistung auf die empfohlenen Einstellungen zu ändern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Screenshot des Verarbeitungsfensters mit den empfohlenen Verarbeitungseinstellungen. Stellen Sie sicher, dass "Automatische Erkennungsüberschreibung deaktivieren" aktiviert ist und der Funktionsdurchmesser auf "30" festgelegt ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Partikelgrößenmessungen über mehrere Verdünnungen: Präzision des Partikelverfolgungsinstruments (ViewSizer 3000) im Vergleich zu vergleichbaren kommerziellen NTA-Instrumenten (NanoSight NS300). NTA von EVs, die aus periguronadalem Fettgewebe der Maus isoliert wurden, wurde an zwei Instrumenten durchgeführt. Für jede Maus wurden drei Verdünnungen (1:1000, 1:500, 1:100) gemessen. Rohwerte für Maßnahmen, die auf dem ViewSizer 3000 durchgeführt wurden (in diesem Protokoll dargestellt), sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Die Erfassungs- und Analyseeinstellungen für die NanoSight NS300-Messgrößen sind in der ergänzenden Tabelle 2 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Repräsentative Negativ-Fleck-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von menschlichen Plasma-abgeleiteten EVs. Die Gitter wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop abgebildet, das mit einer Beschleunigungsspannung von 100 kV arbeitet. Die Bilder wurden mit einer 2K x 2K CCD-Kamera aufgenommen. Die Maßstabsleiste spiegelt die Vergrößerung an der Kamera wider. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen runde Vesikel ~25 nm im Durchmesser. 100k Vergrößerung, Maßstabsbalken 200 nm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: ViewSizer 3000 Partikelgrößen- und Konzentrationsmessungen von periguronadalen Fettgewebe-EVs der Maus über mehrere Verdünnungen. NTA von EVs, die aus dem periguronadalen Fettgewebe der Maus isoliert wurden, wurde durchgeführt. Für jede Maus wurden drei Verdünnungen (1:1000, 1:500, 1:100) gemessen. D10 ist der Punkt in der Größenverteilung, an dem 10% der Probe enthalten sind, D50 ist der Punkt, an dem 50% der Probe enthalten sind (Median), und D90 ist der Punkt, an dem 90% der Probe enthalten sind. Die Partikelkonzentrationen werden im Hintergrund korrigiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: NanoSight NS300 Erfassungs- und Analyseeinstellungen. Einstellungen (unter Verwendung von NTA 3.4 Build 3.4.003) zur Messung von periguronadalen Fettgewebe-EV-Proben von Mäusen, die in Der ergänzenden Abbildung 3 beschrieben sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hier demonstrieren wir ein Protokoll für NTA von Elektrofahrzeugen, um die Größenverteilung eines breiten Spektrums von Partikelgrößen gleichzeitig zu messen und die Gesamtkonzentration von Elektrofahrzeugen in einer polydispersen Probe zu messen. In dieser Studie wurden periguronadales Fettgewebe und menschliches Plasma der Maus als Quelle für EVs verwendet. EVs, die aus anderen Geweben oder biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Urin, Speichel, Muttermilch, Fruchtwasser und Zellkulturüberstand isoliert wurden, können jedoch auch für NTA verwendet werden. Messungen von Polystyrolperlenstandards stellten sicher, dass das Gerät ordnungsgemäß kalibriert wurde und zeigten, dass dieses NTA-Instrument die Größe von Nanopartikeln ≤400 nm korrekt messen kann. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen einer Mausgewebe-EV-Probe getestet. Wie in Abbildung 9gezeigt, skaliert die gemeldete Partikelkonzentration wie erwartet entsprechend mit dem Verdünnungsfaktor, was zeigt, dass das Gerät die Partikelkonzentration bei verschiedenen Verdünnungen mit geringer Variabilität zwischen technischen Replikaten genau detektieren kann. Dies geschah jedoch bei der Arbeit mit Partikelkonzentrationen innerhalb des Arbeitsbereichs des Instruments (5 x 106 bis 2 x 108 Partikel pro ml); Die angemessene Verdünnung einer Probe ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Die Bereinigung um den Verdünnungsfaktor ergab ungefähr die gleiche Schätzung für die Gesamtpartikelkonzentration der Probe mit einem CV von 15,1 über die vier getesteten Verdünnungen. Auch verschiedene Messungen, die bei mehreren Verdünnungen derselben Proben wiederholt wurden, zeigten die Genauigkeit der Partikelgrößenverteilungsbewertungen, da die Partikelkonzentrationen proportional zum Verdünnungsfaktor skaliert wurden, die berichteten Größenmaße jedoch nicht.
EVs in Suspension durchlaufen eine zufällige thermische Bewegung, die als Brownsche Bewegung bekannt ist, nach der die Diffusion von Partikeln in einer flüssigen Suspension umgekehrt proportional zu ihrer Größe ist. Diese zufällige Bewegung wird durch die Stokes-Einstein-Gleichung modelliert, wobei der hydrodynamische Durchmesser D eines sphärischen Teilchens ist:
Dabei ist kB die Boltzmann-Konstante und R der Teilchenradius. Wie man der Gleichung entnehmen kann, hängt die Partikelbewegung in Suspension auch von der Temperatur (T) und der dynamischen Viskosität (η) der Flüssigkeit ab. Während der NTA werden EVs mit fokussierten Laserstrahlen bestrahlt, die die Partikel in Suspension passieren und durch die einfallende Beleuchtung der Laser erkannt werden. Das von jedem einzelnen Teilchen gestreute Licht wird von einem Mikroskop auf den Bildsensor einer hochauflösenden, lichtempfindlichen CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) fokussiert, die digitale Bilder des Streulichts der Partikel aufzeichnet (Abbildung 1). Die NTA-Software identifiziert und verfolgt die Brownsche Bewegung jedes einzelnen Partikels, um den Diffusionskoeffizienten jedes Partikels zu berechnen. Dies wird zusammen mit der Temperatur und der Viskosität der Flüssigkeit, die die Partikel enthält, verwendet, um den Partikeldurchmesser mit der Stokes-Einstein-Gleichung zu berechnen. So kann eine einzige Messung zwei kritische Informationen bestimmen: die Partikelgrößenverteilung und die Gesamtpartikelanzahl von Elektrofahrzeugen in Suspension.
Ein Vergleich von NTA mit anderen Techniken zur Erkennung und Quantifizierung von Elektrofahrzeugen wurde an anderer Stelle beschrieben31,32. Im Vergleich zu anderen lichtstreubasierten Methoden wie der dynamischen Lichtstreuung (DLS) hat NTA höhere Auflösungsfähigkeiten und ist eine besonders leistungsfähige Methode zur Analyse von Partikeln mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm. Im Gegensatz zu Einzelpartikelanalytik wie TEM ist NTA nicht zeitaufwendig oder technisch anspruchsvoll und kann eine ganze Probe in einem relativ geringen Volumen auf einmal halbautomatisiert phänotypieren. Während NTA eine leistungsstarke Charakterisierungstechnik ist, hat es Einschränkungen. Erstens unterliegt NTA Empfindlichkeitsgrenzen aufgrund der starken Abnahme der Intensität der Streulichtskalierung mit dem Partikeldurchmesser, wodurch das Streulicht sehr kleiner Partikel unter dem Hintergrundrauschen verschwindet33. Somit hat NTA die Empfindlichkeit für Elektrofahrzeuge kleiner als ~ 50 nm31 reduziert und führt zu einer Überschätzung der EV-Größen. Kurzwellige Laser werden benötigt, um die kleineren Partikel einer polydispersen Probe aufgrund ihres Lichtstreupotentials zu detektieren. Dieses Partikelverfolgungsinstrument bietet jedoch eine Verbesserung dieser Einschränkung, die der Nanopartikel-Tracking-Technologie innewohnt. Ausgestattet mit drei variablen Lichtquellen (450 nm, 520 nm, 635 nm) ermöglicht dieses System die Visualisierung von Partikeln über einen weiten Größenbereich, was dieses Instrument zu einem besonders wertvollen Werkzeug für NTA-Analysen von polydispersen Proben wie einer heterogenen Population von Elektrofahrzeugen macht. Da die meisten EV-Preps jedoch polydispers in der Zusammensetzung sind und wahrscheinlich Verunreinigungen enthalten, sollten sich die Forscher bewusst sein, dass probenabhängige Nachweisgrenzen die Form der Gesamtgrößenverteilung beeinflussen und daher bei der Interpretation der Ergebnisse Vorsicht walten lassen.
Eine weitere wichtige Einschränkung von NTA ist, dass es mehr als nur Elektrofahrzeuge misst. Das NTA-Instrument erkennt, misst und zählt alle Partikel, die die Nachweisgrenze überschreiten, einschließlich Proteinaggregate, Lipoproteine, Zelltrümmer und Verunreinigungen durch Verdünnungsstoffe. Die Partikelkonzentration im Hintergrund kann jedoch korrigiert werden, indem die Partikelkonzentration des Verdünnungssstoffs vor dem Laden und Messen einer Probe gemessen wird. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 0,02 μm gefilterten PBS und haben bei verwendung von 3 kDa-gefilterten PBS eine sehr geringe Partikelkontamination festgestellt. Darüber hinaus ist es möglich, NTA auf die Messung und Analyse fluoreszierend markierter EVs auszudehnen und so die Einschränkung unspezifischer Messungen zu überwinden. Es sind kommerzielle Kits erhältlich, die die Membranen intakter Vesikel spezifisch und effizient färben, wobei Membranfragmente, Proteinaggregate und andere Partikel aus der NTA-Messung ausgeschlossen sind. Somit stellen die aus fluoreszierendem NTA abgeleiteten Daten die wahre EV-Konzentration und -Größenverteilung genauer dar. Durch die selektive Markierung von EV-Oberflächenantigenen kann fluoreszierendes NTA auch spezifische EVs messen, die durch fluoreszierend markierte Antikörper markiert sind, was die Zählung und Dimensionierung antigenspezifischer, biologisch relevanter EV-Subpopulationen ermöglicht.
Es wurde wenig an der Standardisierung von NTA-Protokollen gearbeitet, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erschwert und die Reproduzierbarkeit über Proben, Tage, Bediener und Labore hinweg behindert. Das in diesem Protokoll demonstrierte Partikelverfolgungsinstrument benötigt wenig praktische Zeit. Wir haben auch notiert, welche Geräteeinstellungen Benutzer melden sollten, um die Reproduzierbarkeit der generierten Daten zu erleichtern. Daher sollte die Befolgung des hier dargelegten optimierten Protokolls zu einer Standardisierung führen und einen Laborvergleich ermöglichen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung dieses Instruments besteht darin, dass die Probe in einer Küvette vorbereitet wird, wodurch das Instrument wiederholt zwischen Videos rühren kann, wodurch eine statistisch zufällige Probe für jedes Video sichergestellt wird und ein reproduzierbareres Ergebnis erzielt wird als andere kommerziell erhältliche NTA-Instrumente, die auf Spritzenpumpen und Durchflusszellen angewiesen sind. Außerdem ermöglichen die Mehrfachlaser die Detektion von Partikeln mit unterschiedlichen Brechungsindizes, was zu robusteren Ergebnissen führt. Der Betrieb dieses Partikelverfolgungsinstruments erfordert jedoch keine Kenntnis der Partikelmaterialeigenschaften wie des Brechungsindex, wodurch die Messungen über die Bediener hinweg reproduzierbarer werden.
EVs wurden in fast allen getesteten Bioflüssigkeiten identifiziert2,5. Die effektive Isolierung spezifischer EVs (z. B. zelltypspezifische EVs) aus verschiedenen Medien (z. B. Blut, Muttermilch, Zellkulturmedien) stellt jedoch eine schwierige Herausforderung dar. Viele verschiedene Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen wurden beschrieben9. NTA kann durchgeführt werden, um die Ausbeute von EVs zu vergleichen, die mit verschiedenen Methoden isoliert wurden, und Variationen in den Vesikeln zu identifizieren, die sich aus verschiedenen Isolationsmethoden ergeben. Dies ist wichtig für die Interpretation nachgelagerter Ergebnisse, da derzeit die Funktion verschiedener EV-Subpopulationen unklar bleibt. Die genaue Messung der EV-Konzentration ist auch wichtig in Studien, in der untersucht wird, ob eine bestimmte Behandlung, ein bestimmter Zustand oder ein bestimmtes Molekül die EV-Freisetzung beeinflusst. Zum Beispiel interessiert sich unsere Gruppe für die Auswirkungen von Umweltbelastungen wie Feinstaub-Luftverschmutzung auf den Inhalt und die Freisetzung von Elektrofahrzeugen. Um beurteilen zu können, ob eine Bedingung die EV-Freisetzung beeinflusst, muss die Anzahl der Vesikel genau quantifiziert werden. Bei der Verwendung von EVs als diagnostische Biomarker könnte sich die Konzentration von EVs in der Probe auf die Assay-Ergebnisse auswirken. Daher ist eine zuverlässige Methode zur Bestimmung der Partikelkonzentration und -größenverteilung von entscheidender Bedeutung.
Unabhängig davon sollten NTA-Messungen von anderen komplementären Techniken begleitet werden, die Partikel unabhängig von den anderen Partikeln in der Probe messen können, wie z. B. TEM. Neuere Technologien wie die mikrofluidische resistive Pulsmessung (MRPS) sind ebenfalls vielversprechend für die Dimensionierung und Zählung von Elektrofahrzeugen unabhängig von der Polydispersität der Probe. Weitere biochemische oder proteomische Analysen von EV-Proben können zusätzlich zu den Größen- und Konzentrationsdaten verwendet werden, um Untergruppen von EVs in Populationen von biologischer Bedeutung zu gruppieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Messung gültiger und reproduzierbarer Partikelkonzentrationen und Partikelgrößenverteilungen für das EV-Feld wichtig ist. Der ViewSizer 3000 ermöglicht genaue und reproduzierbare Messungen der Gesamt-EV-Konzentration und EV-Größenverteilung, selbst für hochpolydisperse Proben, wie hier gezeigt. In Zukunft hoffen wir auf weitere rigorose experimentelle Vergleiche dieses Instruments mit anderen NTA-Instrumenten.
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Disclosures
Alle Autoren erklärten, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608) unterstützt. Wir danken Jeffrey Bodycomb, Ph.D. von HORIBA Instruments Incorporated für seine Hilfe bei der Kalibrierung des Instruments.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
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