Summary
Vi demonstrerer, hvordan man bruger et nyt nanopartikler tracking analyseinstrument til at estimere størrelsesfordelingen og den samlede partikelkoncentration af ekstracellulære vesikler isoleret fra mus perigonadal fedtvæv og human plasma.
Abstract
De fysiologiske og patofysiologiske roller ekstracellulære vesikler (elbiler) er blevet mere og mere anerkendt, hvilket gør EV-feltet til et hurtigt udviklende forskningsområde. Der er mange forskellige metoder til EV isolation, hver med forskellige fordele og ulemper, der påvirker downstream udbytte og renhed af elbiler. Således er det vigtigt at karakterisere EV-prep isoleret fra en given kilde ved en valgt metode for fortolkning af downstream-resultater og sammenligning af resultater på tværs af laboratorier. Der findes forskellige metoder til bestemmelse af elbilers størrelse og mængde, som kan ændres af sygdomstilstande eller som reaktion på eksterne forhold. Nanopartikler tracking analyse (NTA) er en af de fremtrædende teknologier, der anvendes til high-throughput analyse af individuelle elbiler. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til kvantificering og størrelsesbestemmelse af elbiler isoleret fra musesyigonadal fedtvæv og humant plasma ved hjælp af en banebrydende teknologi til NTA, der repræsenterer store fremskridt på området. Resultaterne viser, at denne metode kan levere reproducerbare og gyldige samlede partikelkoncentrations- og størrelsesfordelingsdata for elbiler isoleret fra forskellige kilder ved hjælp af forskellige metoder, som bekræftet af transmissionselektronmikroskopi. Tilpasningen af dette instrument til NTA vil tage fat på behovet for standardisering i NTA-metoder for at øge strengheden og reproducerbarheden i ev-forskning.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er små (0,03-2 μm) membranbundne vesikler, der udskilles af næsten alle celletyper1. De omtales ofte som "exosomer", "mikrovesicles" eller "apoptotiske kroppe" afhængigt af deres frigivelsesmekanisme og størrelse2. Mens det oprindeligt blev antaget, at elbiler simpelthen var et middel til at fjerne affald fra cellen for at opretholde homøostase3, ved vi nu, at de også kan deltage i intercellulær kommunikation via overførsel af molekylært materiale - herunder DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipider og proteiner4,5 - og at de er vigtige regulatorer af normal fysiologi samt patologiske processer1, 5,6,7,8.
Der findes mange forskellige metoder til at isolere og kvantificere elbiler, som er beskrevet andetsteds9,10,11,12. Den anvendte isolationsprotokol samt kilden til elbiler kan i høj grad påvirke EV udbytte og renhed. Selv differentieret centrifugering, der længe har været betragtet som "guldstandardmetoden" for eksosome isolation, kan være genstand for betydelig variation, der efterfølgende påvirker den opnåede EV-population, og downstream-analyser13. Således gør de forskellige forskellige metoder til EV isolation og kvantificering det vanskeligt at sammenligne, reproducere og fortolke resultaterne af eksperimenter rapporteret i litteraturen14. Desuden kan EV-frigivelse reguleres af cellulære forhold eller forskellige eksterne faktorer. Det er blevet foreslået, at elbiler spiller en rolle i at opretholde cellulære homøostase ved at beskytte celler mod intracellulær stress15, som flere undersøgelser har vist, at cellulær stress stimulerer EV sekretion. For eksempel er øget EV-frigivelse blevet rapporteret efter cellulær eksponering for hypoxi, endoplasmisk reticulum stress, oxidativ stress, mekanisk stress, cigaretrøg ekstrakt, og partikler luftforurening16,17,18,19,20,21,22. Ev frigivelse har også vist sig at være ændret in vivo; mus, der er udsat for en kost med højt fedtindhold eller faste i seksten timer, frigav flere adipocyt-elbiler23. For at undersøge, om en bestemt behandling eller tilstand ændrer EV-frigivelsen, skal antallet af elbiler bestemmes nøjagtigt. Vurderingen af fordelingen af ev-størrelsen kan også indikere den fremherskende subcellulære oprindelse af elbiler (f.eks. fusion af sene endoomer/multivesikulære organer med plasmamembranen vs. spirende plasmamembran)24. Der er således behov for robuste metoder til nøjagtigt at måle den samlede koncentration og størrelsesfordelingen af den EV-forberedelse, der undersøges.
En hurtig og meget følsom metode til visualisering og karakterisering af elbiler i opløsning er nanopartikler tracking analyse (NTA). En detaljeret forklaring af principperne i denne metode og sammenligning med alternative metoder til vurdering af EV's størrelse og koncentration er tidligere blevet beskrevet25,26,27,28. Kort sagt, under NTA måling, elbiler visualiseres af lyset spredt, når de er bestrålet med en laserstråle. Det spredte lys er fokuseret af et mikroskop på et kamera, der registrerer partikelbevægelsen. NTA-softwaren sporer den tilfældige termiske bevægelse af hver partikel, kendt som Brownian motion, for at bestemme diffusionskoefficienten, der bruges til at beregne størrelsen af hver partikel ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen. NTA blev første gang anvendt til måling af elbiler i en biologisk prøve i 201125. Indtil for nylig var der kun to mainstream virksomheder, der tilbyder kommercielle NTA instrumenter29 indtil indførelsen af ViewSizer 3000 (i det følgende benævnt partikel tracking instrument), som bruger en kombination af nye hardware og softwareløsninger til at overvinde betydelige begrænsninger af andre NTA teknikker.
Partikelsporingsinstrumentet karakteriserer nanopartikler i flydende prøver ved at analysere deres Brownian bevægelse og karakteriserer større mikron-størrelse partikler ved at analysere gravitationel afregning. Dette instruments unikke optiske system, som omfatter multispektral belysning med tre laserlyskilder (ved 450 nm, 520 nm og 635 nm), gør det muligt for forskere at analysere en bred vifte af partikelstørrelser (f.eks. exosomer, mikrovesicles) samtidigt. Der vises et skema over instrumentopsætningen i figur 1.
Her demonstrerer vi, hvordan man udfører partikelstørrelsesfordeling og koncentrationsmålinger af isolerede mus og menneskelige elbiler ved hjælp af et nyt NTA-instrument.
Figur 1: Partikelsporingsinstrument optisk system. NTA-instrumentet belyser partikler ved hjælp af tre lasere med følgende bølgelængder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videooptagelse af det spredte lys fra individuelle partikler registreres og spores af et digitalt videokamera orienteret 90° fra cuvette. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbejde med disse prøver blev udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee og Institutional Review Board retningslinjer. En skematisk oversigt over NTA-metoden er afbildet i figur 2.
Figur 2: Oversigt over NTA-metoden ved hjælp af partikelsporingsinstrumentet. Prøven fremstilles og indsættes i instrumentet. NTA-softwaren åbnes, optagelsesparametre justeres, og prøven er fokuseret. Derefter registreres, behandles og vises dataene. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Ekstracellulær vesikelisolering
BEMÆRK: Muse perigonadal fedtvævs-elbiler blev isoleret som tidligere beskrevet23. Plasma-elbiler blev isoleret fra 1 mL plasma fra mennesker ved hjælp af følgende protokol:
- Saml plasma og centrifuge ved 3.000 x g i 15 minutter for at fjerne cellulære vragrester. Overfør supernatanten til et nyt rør.
BEMÆRK: Hvis yderligere snavs forbliver påviseligt, centrifugere supernatanten i yderligere 10 min ved 12.000 x g og overføre supernatanten til et nyt rør. - Der tilsættes 67 μL af det eksosome isolationsreagens pr. 250 μL plasma. Bland godt ved at invertere eller svirpe røret.
- Inkuber på is oprejst i 30 min.
- Centrifuge den eksosome isolation reagens/plasma blanding ved 3.000 x g i 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Centrifugering kan udføres ved stuetemperatur eller 4 °C med lignende resultater, men 4 °C foretrækkes. Efter centrifugering kan elbilerne fremstå som en beige eller hvid pellet i bunden af røret. - Slud forsigtigt supernatanten. Skru ned enhver resterende exosome isolation løsning og fjerne alle spor af væske ved aspiration, idet stor omhu for ikke at forstyrre de udfældede elbiler i pellet.
- Brugpillen igen i 200 μL buffer B (leveret af fabrikanten). Mål og registrer prøvens proteinkoncentration (for trin 2.8) ved hjælp af et spektrofotometer, fluorometer, Bradford-analyse eller en anden foretrukken metode.
2. Rensning af isolerede elbiler
- Der tilsættes 200 μL buffer A (leveret af fabrikanten) for at suspendere elbiler igen.
- Tag rensesøjlen ud (medfølgende), løsn skruelåg, og tag bundlukningen af. Placer kolonnen i et opsamlingsrør.
BEMÆRK: Gem den nederste lukning for trin 2.7-2.9. - Centrifuge ved 1.000 x g for 30 s for at fjerne lagerbufferen.
- Kassér gennemstrømningen, og placer kolonnen tilbage i opsamlingsrøret.
- Hvis du vil vaske kolonnen, skal hætten fjernes og påføres 500 μL buffer B oven på harpiksen og centrifugen ved 1.000 x g i 30 s. Kassér strømmen igennem. Gem hætten til trin 2.7-2.9.
- Gentag trin 2.4-2.5 endnu en gang for at vaske kolonnen.
- Sæt bunden af kolonnen sammen med den nederste lukning (fra trin 2.2). Påfør 100 μL buffer B oven på harpiksen for at forberede den til prøvebelastning.
- Tilsæt hele indholdet fra trin 1.6 (eller op til volumen svarende til 4 mg total protein) til harpiksen. Placer skruelåg på toppen af kolonnen.
- Bland ved stuetemperatur på en roterende shaker i højst 5 min.
3. Prøveudløsning
- Løsn skruelågen og fjern bundlukningen, og overfør straks til et 2 mL mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Prøven begynder at stikke af, så snart bundlukningen er fjernet. Sørg for, at 2 ML mikrocentrifugerør er klar til at modtage eluate for at minimere prøvetab. - Centrifuge ved 1.000 x g for 30 s for at opnå rensede elbiler. Slet kolonnen.
4. Prøveforberedelse til nanopartiklersporingsanalyse
- Brug et fnugfrit materiale som en mikrofiberklud til at dække arbejdsområdet og forhindre fibre i at komme ind i cuvettes.
- Iført handsker, placere cuvette på den magnetiske cuvette jig, derefter placere rørestangen i cuvette. Håndter altid cuvettes med handsker for at forhindre, at fingeraftryk og pletter dukker op på cuvettens overflade.
- Brug krogværktøjet til at placere indsatsen i cuvette som afbildet i figur 3. Det er vigtigt at bemærke indlæggets retning til senere (trin 5.4).
Figur 3: Korrekt orientering af indsatsen i kvarts cuvette. "Hak" af indsatsen skal være synlig fra forsiden af cuvette. Dette skal indsættes i instrumentet mod kameraet. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Ved hjælp af en pipette tilsættes 400-500 μL af fortyndingsprøven eller fortyndet prøve ved stuetemperatur til cuvette gennem hullet i indsatsen. Rør forsigtigt op og ned for at blande. Undgå at indføre luftbobler.
- Først forberede en cuvette lastet med den valgte fortyndings (blank) til at måle partikelkoncentrationen af fortyndingsvandet. Dette skal ske, før prøven måles, således at prøvens baggrundskoncentration kan korrigeres.
BEMÆRK: En god blank (fosfatbufferet saltvand [PBS] i dette tilfælde) vil have en koncentration <9 x 106 (afhængigt af fortyndingsstoffer) og vil vise 1-10 partikler pr. skærm i live view (Figur 4). Det anbefales, at den faktiske partikelkoncentration i stikprøven er mindst 3 gange baggrundskoncentrationen. - Eventuelt skal cuvette med 400-500 μL af fortyndingsprøven eller fortyndet prøve før måling før prøveoptagelsen før optagelse af prøven. For at gøre dette skal du lægge 400-500 μL af den fortyndede prøve i cuvette, kassere opløsningen og derefter tilsætte 400-500 μL mere af prøven til målingen. Dette kan hjælpe med at vaske rester i cuvette.
- Først forberede en cuvette lastet med den valgte fortyndings (blank) til at måle partikelkoncentrationen af fortyndingsvandet. Dette skal ske, før prøven måles, således at prøvens baggrundskoncentration kan korrigeres.
Figur 4: Repræsentativ live stream-visning af et fortyndingsvand inden for et tomts korrekte koncentrationsområde. Fortynd EV preps i filtreret (0,02 μm eller 3 kDa, foretrukket) PBS. En god blank vil vise ~ 1-10 partikler pr skærm i live view, hvilket giver en koncentration inden for intervallet 105-106. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Cap cuvette og kontrollere for bobler. Tryk på bobler, hvis det er nødvendigt. Brug en fnugfri klud til at tørre cuvettes udvendige ansigter.
5. Opstartsprocedure for partikelsporingsinstrumentet
- Tænd computerens arbejdsstation og instrument, vent et par minutter, før du kører det første eksempel, og start programmet ved at klikke på softwareikonet. Når du bliver bedt om det, skal du klikke på NTA på skærmen for at udføre Nanoparticle Tracking Analysis. Begynd under fanen Optagelse, og klik på de forskellige softwarefaner (Record, Process, Plot) for at skifte mellem dem i hele protokollen. Optag prøven (fortyndingsstykke eller EV prep) først, derefter behandle optagelserne, og endelig plot resultaterne.
- Følg vejledningen på skærmen for at udfylde alle de nødvendige oplysninger om prøven. Kontroller, at alle nødvendige felter er udfyldt og nøjagtige, dvs. eksempelnavn, Beskrivelse, Prøveforberedelse, Fortyndingsfaktor [1000], Måltemperatur (Indstillet til 22 °C) og Fortyndings: Vælg fortyndingspunkt i rullemenuen, og brug PBS som fortyndingsprodukt for elbiler. Hvis du vælger PBS i rullemenuen, udfyldes saltholdigheden automatisk til 9 %. Disse oplysninger er nødvendige for at bestemme væskens dynamiske viskositet.
BEMÆRK: Det kan tage op til 3 min for temperaturen at ekvilibrere inde i cuvette, selvom sonden allerede viser den ønskede temperatur (dvs. grøn prik bliver stabil). Prøveudlæsninger kan variere betydeligt, hvis måltemperaturen ikke er indstillet, da prøvetemperaturforskelle i høj grad kan ændre brownian bevægelse af partikler. - Åbn instrumentlåget, og fjern beskyttelsesdækslet, hvor cuvette vil blive placeret.
FORSIGTIG: Partikelsporingsinstrumentet er certificeret som et klasse 1 laserprodukt (21 CFR Ch. Jeg del 1040), der indeholder lasere, der kan være farlige og kan forårsage alvorlige skader såsom forbrændinger og / eller permanent skade på synet. For at undgå uheld eller personskade må instrumentdækslet ikke fjernes ved at skrue boltene ud af siden. Bemærk, at laserstrålerne under drift er helt lukkede, hvilket ikke udgør nogen trussel mod brugerne. Der er også indbygget en magnetisk sikkerhedslås i instrumentets prøveholder for at forhindre laserne i at fungere, når prøveholderens hætte fjernes. - Cuvette (fra trin 4.3) placeres inde i instrumentet i den korrekte retning (se figur 5). Udskift hætten over cuvette og luk instrumentlåget. Brug altid instrumentet med hætten på plads over prøveholderen. Du må ikke deaktivere eller forsøge at omgå sikkerhedslåsfunktionen.
Figur 5: Korrekt orientering af cuvette i partikelsporingsinstrumentet. Cuvettes ansigt (med "hak" af indsatsen synlig) skal vende mod kameraet. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tænd kameraet ved at klikke på pilen over Streaming.
- Klik på vinkelpilen for at udvide postindstillingerne. Indstil Gain og Laser power til værdier, der passer til programmet. Se tabel 1 (og supplerende figur 1) for parametre, der anvendes til NTA for små (100 nm) elbiler.
BEMÆRK: Disse avancerede indstillinger, der åbnes ved at klikke på chevronpilen, kan være beskyttet med adgangskode. Brug de samme indstillinger til optagelse og behandling af fortyndingsvandet (blankt) som dem, der anvendes til de efterfølgende prøver. - Juster fokus, indtil partiklerne er korrekt fokuseret. Der bør fokuseres på relativt små partikler (Figur 6). For små EV kvantificering (i overensstemmelse med exosomer) anbefales følgende optagelsesindstillinger: Billedhastighed: 30 fps, Eksponering: 15 ms, Omrøringstid: 5 s, Ventetid: 3 s, Laserkraft - Blå: 210 mW, Grøn: 12 mW, Rød: 8 mW, Rammer pr. video: 300 billeder og Gain: 30 dB.
BEMÆRK: Brugeren kan øge Zoom til 1x og /eller øge gain for at hjælpe med at fokusere. Husk at indstille disse parametre til anbefalede værdier igen, før du optager videoer.
Figur 6: Repræsentative live stream-visninger, der viser partikelfokus. (A) Et eksempel på livestreamvisning af partikler, der ikke er i fokus. Partikler har glød-lignende glorie eller synes sløret. Juster fokus. (B) Et eksempel på levende strøm af partikler i det rette fokus. De mindste partikler er i fokus. Begynd at optage. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Udfør et visuelt kvalitetskontrol for at sikre, at prøven fortyndes korrekt. Hvis prøven er for koncentreret, skal cuvette fra instrumentet fjernes og udtages fortløbende prøven. Gentag, indtil prøven er fortyndet korrekt, før du fortsætter til trin 6.
BEMÆRK: Prøven må ikke fortyndes for meget! Lav altid fortyndinger sekventielt. Den ideelle blank vil kun vise nogle få partikler på skærmen (1-4) som vist i figur 4. Med hensyn til EV-prøver vil en korrekt fortyndet prøve have omkring 20-100 partikler synlige på skærmen uden glødlignende eller overskyede billeder i baggrunden (se figur 7 som et eksempel). Dette bør resultere i en optimal partikelkoncentration i området 5 x 106 til 2 x 108 partikler pr. ML (ikke justering for fortyndingsfaktor).
Figur 7: Repræsentative live stream-visninger, der viser forskellige partikelfortyndinger. (A) Et eksempel på livestreamvisning af en prøve, der er for koncentreret. Optagelse af en prøve, der er for koncentreret, vil give unøjagtige resultater. (B) Et eksempel på livestreamvisning af en korrekt fortyndet prøve. Der er 60-100 partikler synlige på skærmen, og optagelse resulterer i en rå koncentration på 5 x 106- 2 x 108 partikler / mL. (C) Et eksempel på livestreamvisning af en prøve der er for fortyndet. Hvis en prøve er denne fortynder, vil der ikke være nok partikler spores, sænke stikprøvestørrelsen, og derfor vil resultaterne være statistisk ugyldige. I dette tilfælde anbefales det at øge antallet af optagede videoer. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Erhvervelse af videodata
- (Valgfrit) Indstil zoomindstillingen til 0,5 x for at spare båndbredde og forhindre tabte rammer.
- Begynd at optage videoerne ved at klikke på Optag (se tabel 1 for anbefalede optagelsesparametre).
BEMÆRK: Instrumentet vil som standard røre prøven i 5 s, vente på 3 s og derefter optage i 10 s, før du gentager denne proces. Typisk måling tid for 50 videoer er ~ 15 min til at optage og ~ 13 min til at behandle. - Rør ikke ved instrumentet, mens du optager videoer. Sørg for, at laboratoriebænkens overflade ikke vibrerer.
BEMÆRK: Det foretrækkes, at instrumentet er indstillet på en vibrationsdæmpende platform eller et bord for at reducere eventuelle vibrationsforstyrrelser fra nærliggende udstyr, der vil forstyrre bestemmelse af nanopartiklernes bevægelse. Undgå at betjene centrifuger, vortexblandere eller andre potentielle vibrationsgenererende enheder på samme bænk som partikelsporingsinstrumentet. Vibrationer er let synlige på skærmen som forlængelse af normalt runde partikler. Hvis instrumentet udsættes for kraftige vibrationer, kan det kræve justering af optiske elementer. Instrumentet var ikke designet til at blive serviceret eller kalibreret af kunden; kontakt producenten for vedligeholdelse, service og kalibrering. - Bemærk enhver optaget video, der har meget store partikler synlige som store, uregelmæssige hvide klatter. Fjern disse videoer fra behandling i trin 7.3.
7. Proceserhvervede data
- Når der vises en meddelelse om, at videoer er optaget, skal du klikke på OK for at fuldføre optagelsen. Vælg derefter fanen Proces.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her. Behandling af erhvervede data kan genstartes senere ved at flytte direkte til fanen Proces efter åbning af partikelsporingsinstrumentets software og angive den mappe, hvor de optagede videoer gemmes. - Når du analyserer elbiler, skal du markere afkrydsningsfeltet Deaktiver tilsidesættelse af automatisk registrering, og angiv funktionsdiameteren til 30. Klik på Behandl. (Se tabel 2 for behandlingsindstillinger og supplerende figur 2 til behandling af visning). Der vises en livedistributionsgraf, så brugeren kan se behandlingen i realtid.
- I forbindelse med exosomer skal du behandle med registreringstærsklen indstillet til standardpolysprøven for polydisperse. Behandl dataene med Detektionstærskelmanualen indstillet til 0,8 i stedet for en standardtærskel på kun 0,99 for løsninger med meget store forskelle i partikelstørrelser.
- Hvis nogen videoer havde mærkbart meget store partikler synlige (se trin 6.4), skal du navigere til mappen med optagede videoer og fjerne den problematiske video. Når du har redigeret listen over videofiler, skal du ændre antallet af optagede videoer i andre brugerbeholdne logfiler.
- Når behandlingen er fuldført, skal du klikke på OK. Vælg derefter fanen Plot. I tv'er skal du vise hoveddiagrammet som LogBinSilica.
BEMÆRK: Her i fanen Plot kan brugeren tilpasse andre funktioner i grafen, såsom at definere x-aksens område (partikeldiameter, nm) for at indstille integrationsområdet for det producerede tal.
8. Vise og fortolke resultater
- Hvis du vil oprette en PDF-rapport, skal du klikke på knappen Rapport. Målingen er nu færdig, og resultaterne kan ses.
BEMÆRK: Husk at optage og behandle det tomme først, så baggrundskoncentrationen af efterfølgende prøver kan korrigeres. Hvis dette trin glemmes, kan blanken registreres efter prøverne, og prøvens partikelkoncentration korrigeres manuelt. - Undersøg PDF-rapporten, der viser middel-, median- og tilstandsstørrelsen samt den koncentration, der er justeret for fortyndingsfaktoren og korrigeret ved at trække fortyndingspartiklernes partikelkoncentration fra. Fordelingsbredden (standardafvigelse) vises også.
BEMÆRK: Der er meget få applikationer, hvor en enkelt værdi er passende og repræsentativ. Det anbefales således at beskrive hele størrelsesfordelingen og rapportere bredden af fordelingen for en analyseret stikprøve (som vist i tabel 3 for eksempel). - Registrer følgende instrumentindstillinger, der bruges til at generere de data, der skal angives ved rapportering af resultater: Fortyndingsenergi, Lasereffekt for hver laser [mW], Eksponering [ms], Gain [dB], Frame rate [fps], Frames per video, Antal videoer optaget, Behandlingsindstilling (f.eks. LogBinSilica), Integrationsområde [min nm, max nm] (anbefales at indstille min til 50 nm) og Antal sporede partikler (ønskeligt at analysere mindst ~ 150 partikler pr. video; minimum 3.750 samlede spor pr. prøve anbefales at undgå artefaktiske pigge i partikelstørrelsesfordelingen og generere statistisk signifikante data).
9. Rengøring af cuvettes
- Rengør cuvettes manuelt mellem prøverne. Tøm først cuvette.
BEMÆRK: Prøven kan enten gendannes fra cuvette og gemmes eller kasseres. - Når cuvette er tom, rengør cuvette ved at skylle det 10-15 gange med de-ioniseret (DI) vand. Skyl derefter 3 gange med ethanol (70-100%). Når du gør dette, skal du sørge for helt at fylde cuvette med opløsningsmiddel.
- Tør ydersiden af cuvette med en fnugfri mikrofiber klud. Undgå pletter på overfladerne. Luft tørre indersiden af cuvette eller tør ved hjælp af en trykluft duster.
BEMÆRK: Kun linserensningspapir eller fnugfri mikrofiberklud må anvendes til at tørre cuvettens optiske overflader, da de fleste papirprodukter indeholder små træfibre, der kan ridse eller beskadige cuvettes overflade. - Forbered to glas scintillation hætteglas: den ene fyldt med 70-100% ethanol og den anden med DI vand. Skyl skær og rørstængerne i ethanolen først (derefter DI vand) ved at placere skær /rørstangen i det relevante scintillationsglas og ryste hætteglasset kraftigt. Tør skær og rørstænger ved hjælp af fnugfri klude eller trykluftditter.
BEMÆRK: CUVETTE og indsætte kan også rengøres ved hjælp af en sonikering vandbad. For at gøre dette skal du først sikre, at sonikeringsenheden indeholder nok vand (mindst 5 cm dybde). Placer derefter cuvette og indsæt inde i et glasbæger (50 mL eller større), fyld bægeret med alkohol til samme niveau som vandbadet, læg bægeret i vandet og tænd for strømmen. Sonikere i højst 5 min ad gangen, så maskinen til at hvile >5 min mellem hver 5-minutters burst, hvis længere tider er påkrævet. - Når du er færdig, straks sætte alle rengjorte og tørrede komponenter væk til opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før denne demonstration blev kalibreringen af instrumentet først testet for at sikre gyldigheden af de erhvervede data ved at måle størrelsesfordelingen af polystyrenperlestandarder. Vi testede størrelsesfordelingen af 100 nm og 400 nm perler ved hjælp af standardregistreringsparametrene og de behandlingsindstillinger, der anbefales i denne protokol (Figur 8).
For polystyrenperens standard på 100 nm blev der målt en koncentration på 4,205 x 107 partikler/mL. Middelværdi (standardafvigelse, SD) størrelse var 102 (±17) nm med en variationskoefficient (CV) på 0,16. D10/D50/D90-værdierne var 76-104-126 nm. Dette indikerer, at partikelsporingsinstrumentet nøjagtigt rapporterede størrelsen af de 100 nm monodisperse perler. For 400 nm polystyrenperstandarden var koncentrationen 4.365 x 107 partikler/mL. Den gennemsnitlige (SD) størrelse var 391 (±47) nm, med et CV på 0,12. D10/D50/D90-værdierne var 350/358/456 nm (tabel 3). Mens det rapporterede gennemsnit er meget tæt på perlernes sande størrelse, kan vi se, at de instrumentindstillinger, der anvendes i denne protokol, er mere nøjagtige for de mindre partikler ~ 100 nm. Således foreslås det at optimere laserparametrene for partikler, der er større end 400 nm. Forskere bør først gennemføre en metode som transmission elektronmikroskopi (TEM) for et skøn over den deraf følgende EV størrelse fordeling fra en given kilde og isolation metode forud for NTA.
Der blev målt en gennemsnitlig koncentration på 4,41 x10 10 partikler/mL for den musevævs-EV-prøve, der blev anvendt til denne demonstration. Dette eksempel blev registreret efter de parametre, der er opsummeret i tabel 1 og behandlet efter de parametre, der er beskrevet i tabel 2. Vi demonstrerer virkningen af forskellige fortyndingsfaktorer i figur 9 og rapporterer de rå og justerede partikelkoncentrationer i tabel 4. Den optimale fortynding for de musevævsafledte elbiler var mellem 1.000 og 3.000, mens det for plasmaafledte elbiler fra mennesker var 1.000, hvilket indikerer, at når der først blev testet en given biofluidkilde- eller EV-isoleringsmetode for NTA, bør der testes serielle fortyndinger, så den optimale fortynding til NTA-måling kan identificeres. Vi anbefaler, at mindst to forskellige fortyndinger af en prøve måles og rapporteres. Vi målte også fire yderligere prøver ved forskellige fortyndinger på to forskellige partikelsporingsinstrumenter. Supplerende figur 3 sammenligner partikelsporingsinstrumentets præcision i størrelsesmålinger sammenlignet med et andet kommercielt tilgængeligt NTA-instrument. Supplerende tabel 1 viser endvidere præcisionen af dette instruments målinger, hvilket viser, at partikelkoncentrationen ændrede sig proportionalt med prøvefortyndingen, men at partikelstørrelsesmålingerne ikke gjorde det.
Efter behandling kan resultaterne (sammen med instrument/software-oplysninger, optagelses- og behandlingsindstillinger og eksperimentelle noter) gemmes i en .pdf rapport. Det histogramme, der er medtaget i denne rapport, kan ændres som beskrevet i protokollen (afsnit 7.4). De rå resultater gemmes i en .dat fil, der kan eksporteres. De optagede videoer gemmes også og kan bruges til senere offline behandling og analyse. Men når videoer er optaget, kan optagelsesindstillingerne ikke ændres med tilbagevirkende kraft.
Virkningen af at ændre de forskellige laserkræfter og gevinst i optagelsesindstillingerne blev demonstreret ved hjælp af humane plasma afledte elbiler. Dette visualiseres i figur 10-12, og de kvantitative oplysninger baseret på disse billeder er vist i tabel 5. Forøgelse af forstærkningen øger kameraets følsomhed, hvilket gør det muligt at visualisere mindre partikler (Figur 10), hvilket resulterer i en stigende total partikelkoncentration med en mindre gennemsnitlig partikelstørrelse (Tabel 5). Men at øge gevinsten over 30 dB (vores anbefalinger) gør udsigten for kornet, så støj kan skjule måling af sande partikler. Ved en kameragevinst på 30 dB er effekten af at ændre den blå lasereffekt afbildet i figur 11. Forøgelse af den blå laser (450 nm, kort bølgelængde) effekt resulterer i større opløsning til at opdage mindre partikler (dvs. dem med en størrelse i overensstemmelse med exosomer). Hvis de grønne og røde laserkræfter blev holdt konstant ved standardindstillingerne, blev den blå lasereffekt fra 70 mW til 210 mW flyttet den rapporterede gennemsnitlige partikelstørrelse fra 122 nm til 105 nm og øgede den rapporterede samlede partikelkoncentration fra 1,1 x 108 til 1,7 x 108 (tabel 5).
Virkningen af at øge de grønne og røde laserkræfter blev også påvist (Figur 12). Forøgelse af effekten af den røde laser (650 nm, lang bølgelængde) øgede den rapporterede gennemsnitlige partikelstørrelse fra 175 til 246 nm. Den rapporterede samlede partikelkoncentration faldt, men det skyldes, at vi i denne humane plasma-EV-prøve ikke havde mange store partikler til stede, bekræftet af TEM negativ farvning (Supplerende figur 4). Forøgelse af den grønne laserkraft resulterede i et fald i den rapporterede gennemsnitlige partikelstørrelse og en stigning i den rapporterede samlede partikelkoncentration. Således kan brugeren optimere kraften i de tre lasere til følsomt at opdage partikler i forskellige størrelser.
Denne protokol er optimeret til mindre vesikler (f.eks. <400 nm). Forskere interesseret i mikrovesicles af større størrelser (f.eks 400-1000 nm) opfordres til at optimere laser parametre ved hjælp af hule organosilica perler, som har lys-spredning egenskaber svarende til elbiler gør dem til en mere passende reference end polystyren eller silica perle standarder30. Men silica nanopartikler kan være den bedste praktiske erstatning, indtil organosilica standarder bliver mere bredt tilgængelige.
Her blev et NTA-instrument brugt til at kvantificere elbiler isoleret fra musevæv ved ultracentrifugering og human plasma ved hjælp af et kommercielt kit. Virkningerne af at ændre NTA-parametrene blev illustreret og viser, at parametrene i denne protokol er optimeret til små vesikler. Betydningen af fortyndingstrinnet blev også vist og viser, at partikelsporingsinstrumentet, der demonstreres her, nøjagtigt kan opdage variationer i fortyndingsfaktorer. Koncentrationen ændrede sig proportionalt med flere fortyndinger, mens størrelsesfordelingen ikke gjorde det. De resulterende data viste ringe teknisk variation. Således vil tilpasning af denne protokol af forskere, der bruger dette instrument til NTA øge stringens og reproducerbarhed på EV forskningsområdet.
Figur 8: Partikelstørrelsesfordelinger af monodisperse polystyrenper standarder. (A) Partikelstørrelsesfordeling på 100 nm polystyrenperstandard. (B) Partikelstørrelsesfordeling på 400 nm polystyrenpertstandard. Værdier rapporteres i tabel 3. Indsat viser eksempel live stream visning af den første målte ramme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Rå samlede partikelkoncentrationer efter fortyndingsfaktor for muse perigonadal fedtvævs-elbiler. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Der blev foretaget tre målinger for hver fortynding. Værdier rapporteres i tabel 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Visuel effekt af stigende gevinst. Repræsentative billeder af partikler målt med standardlaserindstillinger (Blå = 70 mW, Grøn = 12 mW, Rød = 8 mW) og få indstillet til (A) 18 dB, (B) 24 dB - standard og (C) 30 dB - anbefales. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Effekt af blå laser på små partikler, når røde og grønne lasere er indstillet til standardindstillinger. (A) Blå laser = 70 mW (standard). (B) Blå laser = 210 mW (anbefales). Flere små partikler er synlige og i fokus, når den blå lasereffekt øges til 210 mW. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Visuel påvirkning af ændret blå, grøn og rød lasereffekt. Repræsentative liveskærmvisninger viser de forskellige partikelstørrelser, der visualiseres på tværs af forskellige laserindstillinger. Resulterende NTA-værdier rapporteres i tabel 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Partikler | Diameter [nm] | Blå laser [mW] | Grøn laser [mW] | Rød laser [mW] | Kamera gevinst [dB] | Temperaturregulering | Behandling | # Videoer |
| Exosomer | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Aktiveret, indstillet til 22 ºC | Tilsidesættelse af automatisk registrering af deaktiveret | 50 |
Tabel 1: Registrering af parametre for små ekstracellulære vesikler (~100 nm).
| Beskrivelse af proces | Registreringstærskel | Deaktiver tilsidesættelse af automatisk registrering | Funktionsdiameter [px] |
| Exosomer | Polydispersisk prøve | Kontrolleret | 30 |
Tabel 2: Behandling af parametre for små ekstracellulære vesikler (~100 nm).
| Polystyren Standard [nm] størrelse | Integrationsområde [nm] | Gennemsnitlig størrelse [nm] | SD-størrelse [nm] | CV af størrelse | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Antal i alt |
| 100 | 50 til 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 til 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabel 3: NTA-resultater af monodisperse polystyrenper standarder. Begge standarder blev optimalt fortyndet med rå koncentrationer for 100 nm-standarden og 400 nm-standarden på henholdsvis 4.205 x 107 partikler/mL og 4.365 x 107 partikler/mL. D10 er det punkt i størrelsesfordelingen, hvor 10 % af prøven er indeholdt, D50 er det punkt, hvor 50 % af prøven er indeholdt (median), og D90 er det punkt, hvor 90 % af prøven er indeholdt. SD: Standardafvigelse; CV: Variationskoefficient.
| Fortyndingsfaktor | Partikelkoncentration, partikler/mL | Partikelkoncentration i alt, partikler/mL |
| Rå | Justeret for fortyndingsfaktor | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4.10E+10 |
| 4.00E+07 | 4.00E+10 | |
| 3.70E+07 | 3.70E+10 | |
| gennemsnit (SD) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3.60E+07 | 5.40E+10 |
| 2.60E+07 | 3.80E+10 | |
| 2.90E+07 | 4.40E+10 | |
| gennemsnit (SD) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4.55E+10 (6.60E+09) |
| 2000 | 2.40E+07 | 4.80E+10 |
| 2.30E+07 | 4.60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4.00E+10 | |
| gennemsnit (SD) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1.30E+07 | 3.90E+10 | |
| 1.40E+07 | 4.20E+10 | |
| gennemsnit (SD) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4.71E+10 (9.27E+09) |
Tabel 4: NTA-resultaterne af museigonadal fedtvævs-elbiler viser reproducerbarheden af NTA-målinger. Rå NTA partikelkoncentrationer (partikler/mL) målt på partikelsporingsinstrumentet og den samlede partikelkoncentration (partikler/mL) justeret for fortyndingsfaktor for elbiler, der stammer fra muse perigonadal fedtvæv ved forskellige fortyndinger.
| Gevinst [dB] | Blå Laser [mW] | Grøn Laser [mW] | Rød laser [mW] | Samlet koncentration, partikler/mL (rå) | Gennemsnitlig størrelse [nm]* | Standardafvigelse af størrelse /CV | Modalstørrelse | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1.50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integreret inden for 50-1000 nm rækkevidde | ||||||||
Tabel 5: NTA-resultaterne af humane plasmaafledte elbiler viser effekten af at ændre laserkraft og forstærkning på størrelses- og partikelkoncentrationsmålinger af menneskelige elbiler (1:1000 fortynding). D10 er det punkt i størrelsesfordelingen, hvor 10 % af prøven er indeholdt, D50 er det punkt, hvor 50 % af prøven er indeholdt (median), og D90 er det punkt, hvor 90 % af prøven er indeholdt. SD: Standardafvigelse; CV: Variationskoefficient.
Supplerende figur 1: Skærmbillede af optagelsespanelet, der viser anbefalede optagelsesparametre. Få adgang til avancerede indstillinger for at ændre kameraets gain og laserkraft til anbefalede indstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Skærmbillede af behandlingspanelet, der viser anbefalede behandlingsindstillinger. Kontroller, at tilsidesættelsen af automatisk registrering er markeret, og at funktionsdiameteren er angivet til "30". Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Partikelstørrelsesmålinger på tværs af flere fortyndinger: Partikelsporingsinstrumentets præcision (ViewSizer 3000) vs. sammenligneligt kommercielt NTA-instrument (NanoSight NS300). NTA af elbiler isoleret fra mus perigonadal fedtvæv blev udført på to instrumenter. For hver mus blev der målt tre fortyndinger (1:1000, 1:500, 1:100). Råværdier for foranstaltninger, der er truffet på ViewSizer 3000 (demonstreret i denne protokol) vises i supplerende tabel 1. Fangst- og analyseindstillinger for NanoSight NS300-målingerne er vist i supplerende tabel 2. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Repræsentativ transmissionselektronmikroskopi (TEM) af humane plasmabaserede elbiler. Gitre blev afbildet med en transmission elektron mikroskop, der opererer ved 100 kV accelererende spænding. Billeder blev taget på et 2K x 2K CCD-kamera. Skalalinjen afspejler forstørrelsen på kameraet. Elektron mikrografer viser runde vesikler ~ 25 nm i diameter. 100k forstørrelse, skala bar 200 nm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: ViewSizer 3000 partikelstørrelse og koncentrationsmålinger af muse perigonadal fedtvævs-elbiler på tværs af flere fortyndinger. NTA af elbiler isoleret fra mus perigonadal fedtvæv blev udført. For hver mus blev der målt tre fortyndinger (1:1000, 1:500, 1:100). D10 er det punkt i størrelsesfordelingen, hvor 10 % af prøven er indeholdt, D50 er det punkt, hvor 50 % af prøven er indeholdt (median), og D90 er det punkt, hvor 90 % af prøven er indeholdt. Partikelkoncentrationer er baggrundskorrigerede. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: NanoSight NS300-optagelses- og analyseindstillinger. Indstillinger (ved hjælp af NTA 3.4 Build 3.4.003), der anvendes til at måle muse perigonadal fedtvæv EV prøver rapporteret i supplerende figur 3. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en protokol for NTA af elbiler for at måle størrelsesfordelingen af en bred vifte af partikelstørrelser samtidigt og måle den samlede EV-koncentration i en polydispersprøve. I denne undersøgelse blev musemaigonadal fedtvæv og humant plasma brugt som kilde til elbiler. Men, Elbiler isoleret fra andre væv eller biologiske væsker såsom serum, urin, spyt, modermælk, fostervand, og celle kultur supernatant kan også anvendes til NTA. Målinger af polystyrenperlestandarder sikrede, at instrumentet var korrekt kalibreret, og påviste, at dette NTA-instrument korrekt kan måle nanopartiklernes størrelse ≤400 nm. Forskellige fortyndinger af en musevæv EV prøve blev derefter testet. Som vist i figur 9skaleres den rapporterede partikelkoncentration i overensstemmelse hermed med fortyndingsfaktoren som forventet, hvilket viser, at instrumentet nøjagtigt kan detektere partikelkoncentrationen ved forskellige fortyndinger med ringe variation mellem tekniske replikater. Dette var dog ved arbejde med partikelkoncentrationer inden for instrumentets arbejdsområde (5 x 106 til 2 x 108 partikler pr. ML); udvanding af en prøve er et kritisk skridt i protokollen. Justering for fortyndingsfaktoren gav omtrent det samme skøn for den samlede partikelkoncentration af prøven med et CV på 15,1 på tværs af de fire testede fortyndinger. Forskellige foranstaltninger, der blev gentaget på flere fortyndinger af de samme prøver, viste også præcisionen i partikelstørrelsesfordelingsvurderingerne, da partikelkoncentrationer skaleres proportionalt med fortyndingsfaktoren, men rapporterede størrelsesmålinger ikke gjorde det.
Elbiler i suspension gennemgår tilfældig termisk bevægelse kendt som Brownian bevægelse, hvorefter diffusion af partikler i en flydende suspension er omvendt proportional med deres størrelse. Denne tilfældige bevægelse er modelleret af Stokes-Einstein ligning, hvor den hydrodynamiske diameter D af en sfærisk partikel er:
Hvor kB er Boltzmann konstanten og R er partikelradius. Som man kan se fra ligningen, partikelbevægelse i suspension afhænger også af temperaturen (T) og dynamisk viskositet (η)af væsken. Under NTA bestråles elbiler med fokuserede laserstråler, der passerer gennem partiklerne i suspension og detekteres af hændelsesbelysningen, der kommer fra laserne. Lyset spredt af hver enkelt partikel er fokuseret af et mikroskop på billedsensoren af en høj opløsning, lys-følsomme opladning-koblet enhed (CCD) kamera, som registrerer digitale billeder af det spredte lys af partiklerne (Figur 1). NTA-softwaren identificerer og sporer brownianbevægelsen af hver enkelt partikel for at beregne diffusionskoefficienten for hver partikel. Dette bruges sammen med temperaturen og viskositeten af væsken, der indeholder partiklerne til at beregne partikeldiameter ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen. Således kan en enkelt måling bestemme to kritiske stykker information: partikelstørrelsesfordeling og det samlede partikelantal af elbiler i suspension.
En sammenligning af NTA med andre teknikker til påvisning og kvantificering af elbiler er blevet beskrevet andetsteds31,32. Sammenlignet med andre lysspredningsbaserede metoder såsom dynamisk lysspredning (DLS) har NTA højere opløsningsfunktioner og er en særlig kraftfuld metode til analyse af partikler med en gennemsnitlig diameter på mindre end 100 nm. I modsætning til enkelt-partikel analytics såsom TEM, NTA er ikke tidskrævende eller teknisk udfordrende og kan fænotype en hel prøve i en relativt lav volumen på én gang i en semi-automatiseret måde. Mens NTA er en kraftfuld karakterisering teknik, det har begrænsninger. For det første er NTA underlagt følsomhedsgrænser på grund af det stærke fald i intensiteten af spredt lysskalering med partikeldiameter, hvilket får det spredte lys af meget små partikler til at forsvinde under baggrundsstøjen33. NTA har således reduceret følsomheden for elbiler mindre end ~ 50 nm31 og resulterer i en overvurdering af EV størrelser. Korte bølgelængde lasere er nødvendige for at opdage de mindre partikler af en polydisperse prøve på grund af deres lys spredning potentiale. Men denne partikel tracking instrument tilbyder en forbedring af denne begrænsning iboende til nanopartikler tracking teknologi. Udstyret med tre variable lyskilder (450 nm, 520 nm, 635 nm) giver dette system mulighed for visualisering af partikler over en lang række størrelser, hvilket gør dette instrument til et særligt værdifuldt værktøj til NTA-analyser af polydisperseprøver som en heterogen population af elbiler. Ikke desto mindre, fordi de fleste EV preps vil være polydisperse i sammensætning og sandsynligvis indeholder urenheder, forskerne bør være opmærksomme på, at prøve-afhængige grænser for detektion indvirkning formen af den samlede størrelse fordeling og derfor udvise forsigtighed ved fortolkningen af resultater.
En anden væsentlig begrænsning af NTA er, at det måler mere end blot elbiler. NTA-instrumentet vil detektere, måle og tælle alle partikler, der overskrider detektionsgrænsen, herunder proteinaggregater, lipoproteiner, cellulære snavs og forurening forårsaget af fortyndingsstoffer. Partikelkoncentrationen i baggrunden kan dog korrigeres ved at måle diluents partikelkoncentration før belastning og måling af en prøve. Vi anbefaler, at du bruger mindst 0,02 μm filtreret PBS og har fundet meget lav partikelforurening ved brug af 3 kDa filtreret PBS. Desuden er det muligt at udvide NTA til at måle og analysere fluorescerende mærket elbiler, overvinde begrænsningen af ikke-specifikke måling. Kommercielle kits er tilgængelige, der specifikt og effektivt farve membranerne af intakte vesikler kun, undtagen membranfragmenter, protein aggregater, og andre partikler fra NTA måling. De data, der stammer fra fluorescerende NTA, repræsenterer således mere præcist den sande EV-koncentration og størrelsesfordeling. Ved selektiv mærkning af EV-overfladeantigener kan fluorescerende NTA også måle specifikke elbiler mærket af fluorescerende mærkede antistoffer, hvilket giver mulighed for optælling og dimensionering af antigenspecifikke, biologisk relevante EV-delpopulationer.
Der har været lidt arbejde med standardisering af NTA protokoller, hvilket gør sammenligneligheden af resultaterne vanskeligt og hindrer reproducerbarhed på tværs af prøver, dage, operatører og laboratorier. Partikelsporingsinstrumentet, der demonstreres i denne protokol, kræver lidt hands-on tid. Vi har også bemærket, hvilke instrumentindstillinger brugerne skal rapportere for at lette reproducerbarheden af genererede data. Således bør efter den optimerede protokol, der er fastsat her resultere i standardisering og muliggøre sammenligning af resultater på tværs af laboratorier. En anden fordel ved at bruge dette instrument er, at prøven fremstilles i et cuvette, som gør det muligt for instrumentet gentagne gange at røre mellem videoer, hvilket sikrer en statistisk tilfældig prøve for hver video og giver et mere reproducerbart resultat end andre kommercielt tilgængelige NTA-instrumenter, der er afhængige af sprøjtepumper og flowceller. De mange lasere giver også mulighed for påvisning af partikler med varierende brydningsindekser, hvilket giver mere robuste resultater. Men driften af dette partikelsporingsinstrument kræver ikke kendskab til partikelmaterialeegenskaber som f.eks. brydningsindekset, hvilket gør målinger mere reproducerbare på tværs af operatører.
Elbiler er blevet identificeret i næsten alle biofluider testet2,5. Effektiv isolering af specifikke elbiler (f.eks. cellespecifikke elbiler) fra forskellige medier (f.eks. blod, modermælk, cellekulturmedier) udgør imidlertid en vanskelig udfordring. Mange forskellige metoder til EV isolation er blevet beskrevet9. NTA kan udføres for at sammenligne udbyttet af elbiler isoleret ved hjælp af forskellige metoder og identificere variationer i vesikler, der opstår fra forskellige isolationsmetoder. Dette er vigtigt for fortolkningen af downstream-resultaterne, da funktionen af forskellige ev-delpopulationer i øjeblikket fortsat er uklar. Nøjagtig måling ev koncentration er også vigtigt i undersøgelser undersøge, om en bestemt behandling, tilstand, eller molekyle virkninger EV frigivelse. For eksempel er vores gruppe interesseret i virkningen af miljøeksponeringer såsom partikel luftforurening på EV indhold og frigivelse. For at vurdere, om en tilstand påvirker frigivelsen af ev, skal antallet af vesikler kvantificeres nøjagtigt. Når du bruger elbiler som diagnostiske biomarkører, kan koncentrationen af elbiler i prøven påvirke analyseresultaterne. Således er en pålidelig metode til at bestemme partikelkoncentration og størrelsesfordeling kritisk.
Uanset hvad bør NTA-målinger ledsages af andre komplementære teknikker, der kan måle partikler uafhængigt af de andre partikler i prøven, såsom TEM. Nyere teknologier såsom mikrofluidisk resistiv pulsmåling (MRPS) er også lovende for dimensionering og optælling af elbiler uafhængigt af prøvens polydispersitet. Yderligere biokemiske eller proteomiske analyser af EV-prøver kan anvendes ud over størrelses- og koncentrationsdata til klyngeundersæt af elbiler i populationer af biologisk betydning. Afslutningsvis er det vigtigt for EV-feltet at måle gyldige og reproducerbare partikelkoncentrationer og partikelstørrelsesfordelinger. ViewSizer 3000 opnår nøjagtige og reproducerbare målinger af den samlede EV koncentration og EV størrelse fordeling, selv for meget polydisperse prøver, som vist her. I fremtiden håber vi at se yderligere strenge eksperimentelle sammenligninger af dette instrument med andre NTA-instrumenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærede, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Vi anerkender Jeffrey Bodycomb, Ph.D. af HORIBA Instruments Incorporated for hans hjælp kalibrere instrumentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
