Summary
Demonstramos como usar um novo instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas para estimar a distribuição de tamanho e concentração total de partículas de vesículas extracelulares isoladas do tecido adiposo de camundongos e plasma humano.
Abstract
Os papéis fisiológicos e fisiofisiológicos de vesículas extracelulares (EVs) tornaram-se cada vez mais reconhecidos, tornando o campo EV uma área de pesquisa em rápida evolução. Existem muitos métodos diferentes para o isolamento do EV, cada um com vantagens e desvantagens distintas que afetam o rendimento a jusante e a pureza dos EVs. Assim, caracterizar a preparação de EV isolada de uma determinada fonte por um método escolhido é importante para a interpretação dos resultados a jusante e comparação dos resultados entre laboratórios. Existem vários métodos para determinar o tamanho e a quantidade de EVs, que podem ser alterados por estados da doença ou em resposta a condições externas. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é uma das tecnologias proeminentes utilizadas para análise de alto rendimento de EVs individuais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para quantificação e determinação de tamanho de EVs isolados do tecido adiposo do rato e plasma humano usando uma tecnologia inovadora para a NTA representando grandes avanços no campo. Os resultados demonstram que este método pode fornecer dados de concentração de partículas e tamanho totais reprodutíveis e válidos para EVs isolados de diferentes fontes usando diferentes métodos, conforme confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão. A adaptação deste instrumento para a NTA abordará a necessidade de padronização nos métodos NTA para aumentar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa de EV.
Introduction
As vesículas extracelulares (EVs) são pequenas (0,03-2 μm) de vesículas ligadas à membrana secretadas por quase todos os tipos de células1. Eles são frequentemente referidos como "exossomos", "microvesículos" ou "corpos apoptóticos" dependendo de seu mecanismo de liberação e tamanho2. Embora inicialmente se pensasse que os EVs eram simplesmente um meio de eliminar resíduos da célula para manter a homeostase3, agora sabemos que eles também podem participar da comunicação intercelular via transferência de material molecular - incluindo DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipídios e proteínas4,5 - e que eles são importantes reguladores da fisiologia normal, bem como processos patológicos1, 5,6,7,8.
Existem muitos métodos diferentes para isolar e quantificar EVs, que foram descritos em outros lugares9,10,11,12. O protocolo de isolamento usado, bem como a fonte de EVs, podem impactar muito o rendimento e a pureza do EV. Mesmo a centrifugação diferencial, considerada por muito tempo a abordagem "padrão-ouro" para o isolamento exóssomo, pode estar sujeita a variabilidade substancial, impactando posteriormente a população de EV obtida e análises a jusante13. Assim, as diferentes metodologias de isolamento e quantificação do EV dificultam a comparação, reprodução e interpretação dos resultados dos experimentos relatados na literatura14. Além disso, a liberação de EV pode ser regulada por condições celulares ou vários fatores externos. Tem sido sugerido que os EVs desempenham um papel na manutenção da homeostase celular protegendo as células contra o estresse intracelular15,como vários estudos têm mostrado que o estresse celular estimula a secreção de EV. Por exemplo, o aumento da liberação de EV foi relatado após exposição celular à hipóxia, estresse órticulo endoplasmático, estresse oxidativo, estresse mecânico, extrato de fumaça de cigarro e poluição atmosférica de material particulado16,17,18,19,20,21,22. A versão eV também foi mostrada como modificada in vivo; camundongos submetidos a uma dieta rica em gordura ou jejum por dezesseis horas liberaram mais EVs adipócitos23. Para investigar se um tratamento ou condição específico altera a liberação do EV, o número de EVs deve ser determinado com precisão. A avaliação da distribuição do tamanho do EV também pode indicar a origem subcelular predominante dos EVs (por exemplo, fusão de endosomes/corpos multivesiculares tardios com a membrana plasmática versus brotação da membrana plasmática)24. Assim, há necessidade de métodos robustos para medir com precisão a concentração total e a distribuição de tamanho da preparação de EV que está sendo estudada.
Um método rápido e altamente sensível para a visualização e caracterização de EVs na solução é a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Uma explicação detalhada dos princípios deste método e a comparação com métodos alternativos de avaliação do tamanho e concentração de EV foram descritas anteriormente25,26,27,28. Resumidamente, durante a medição da NTA, os EVs são visualizados pela luz espalhada quando são irradiados com um raio laser. A luz dispersa é focada por um microscópio em uma câmera que registra o movimento das partículas. O software NTA rastreia o movimento térmico aleatório de cada partícula, conhecido como movimento browniano, para determinar o coeficiente de difusão que é usado para calcular o tamanho de cada partícula usando a equação de Stokes-Einstein. A NTA foi aplicada pela primeira vez à medição de EVs em uma amostra biológica em 201125. Até recentemente, havia apenas duas empresas tradicionais oferecendo instrumentos NTA comerciais29 até a introdução do ViewSizer 3000 (doravante chamado de instrumento de rastreamento de partículas) que usa uma combinação de novas soluções de hardware e software para superar limitações significativas de outras técnicas NTA.
O instrumento de rastreamento de partículas caracteriza nanopartículas em amostras líquidas analisando seu movimento browniano e caracteriza partículas maiores do tamanho de micron, analisando a fixação gravitacional. O sistema óptico único deste instrumento, que inclui iluminação multiespectral com três fontes de luz laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), permite que os pesquisadores analisem uma ampla gama de tamanhos de partículas (por exemplo, exosósmos, microvesculas) simultaneamente. Um esquema da configuração do instrumento é mostrado na Figura 1.
Aqui, demonstramos como realizar a distribuição de tamanho de partículas e medições de concentração de mouses isolados e EVs humanos usando um novo instrumento NTA.
Figura 1: Sistema óptico do instrumento de rastreamento de partículas. O instrumento NTA ilumina partículas usando três lasers com os seguintes comprimentos de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. A gravação de vídeo da luz dispersa de partículas individuais é detectada e rastreada por uma câmera de vídeo digital orientada a 90° do cuvette. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os trabalhos com essas amostras foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e do Conselho de Revisão Institucional. Uma visão geral esquemática do método NTA é retratada na Figura 2.
Figura 2: Visão geral do método NTA utilizando o instrumento de rastreamento de partículas. A amostra é preparada e inserida no instrumento. O software NTA é aberto, os parâmetros de gravação são ajustados e a amostra é focada. Em seguida, os dados são gravados, processados e exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Isolamento vesícula extracelular
NOTA: Os EVs de tecido adiposo do mouse perigonadal foram isolados como descrito anteriormente23. Os EVs de plasma foram isolados a partir de 1 mL de plasma humano usando o seguinte protocolo:
- Colete o plasma e a centrífuga a 3.000 x g por 15 minutos para remover detritos celulares. Transfira o supernatante para um novo tubo.
NOTA: Se os detritos adicionais permanecerem detectáveis, centrifugar o supernatante por mais 10 min a 12.000 x g e transferir o supernatante para um novo tubo. - Adicione 67 μL do reagente de isolamento exososome por 250 μL de plasma. Misture bem invertendo ou mexendo o tubo.
- Incubar no gelo ereto por 30 minutos.
- Centrifugar a mistura de reságio/plasma de isolamento exososome a 3.000 x g por 10 min a 4 °C.
NOTA: A centrifugação pode ser realizada à temperatura ambiente ou 4 °C com resultados semelhantes, mas é preferível 4 °C. Após a centrifugação, os EVs podem aparecer como uma pelota bege ou branca na parte inferior do tubo. - Aspire cuidadosamente o supernante. Gire qualquer solução de isolamento exossomo residual e remova todos os traços de fluido por aspiração, tomando muito cuidado para não perturbar os EVs precipitados na pelota.
- Resuspense a pelota em 200 μL de Buffer B (fornecido pelo fabricante). Meça e regisse a concentração proteica da amostra (para a etapa 2.8) utilizando um espectógrafo, fluorômetro, ensaio de Bradford ou outro método preferido.
2. Purificação de EVs isolados
- Adicione 200 μL de Buffer A (fornecido pelo fabricante) aos EVs re-suspensos.
- Tire a coluna de purificação (fornecida), solte a tampa do parafuso e solte o fechamento inferior. Coloque a coluna em um tubo de coleta.
NOTA: Guarde o fechamento inferior para as etapas 2.7-2.9. - Centrifugar a 1.000 x g por 30 s para remover o buffer de armazenamento.
- Descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
- Para lavar a coluna, remova a tampa e aplique 500 μL de Buffer B em cima da resina e centrífuga a 1.000 x g para 30 s. Descarte o fluxo através. Guarde a tampa para as etapas 2.7-2.9.
- Repita as etapas 2.4-2.5 mais uma vez para lavar a coluna.
- Conecte a parte inferior da coluna com o fechamento inferior (a partir da etapa 2.2). Aplique 100 μL de Tampão B em cima da resina para prepará-la para o carregamento da amostra.
- Adicione todo o conteúdo da etapa 1.6 (ou até o volume equivalente a 4 mg de proteína total) à resina. Coloque a tampa do parafuso na parte superior da coluna.
- Misture à temperatura ambiente em um agitador rotativo por não mais do que 5 minutos.
3. Elução da amostra
- Solte a tampa do parafuso e remova o fechamento inferior e transfira imediatamente para um tubo de microcentrifuuagem de 2 mL.
NOTA: A amostra começará a eluto assim que o fechamento inferior for removido. Certifique-se de que os tubos de microcentrifuuuge de 2 mL estejam prontos para receber elunato para minimizar a perda de amostras. - Centrifugar a 1.000 x g por 30 s para obter EVs purificados. Descarte a coluna.
4. Preparação da amostra para análise de rastreamento de nanopartículas
- Use um material sem fiapos como um pano de microfibra para cobrir o espaço de trabalho e evitar que as fibras entrem em cuvetas.
- Usando luvas, coloque a cuvette no gabarito de cuvette magnético, em seguida, coloque a barra de agitação no cuvette. Manuseie sempre as cuvetas com luvas para evitar que impressões digitais e manchas apareçam na superfície do cuvette.
- Use a ferramenta de gancho para colocar a inserção na cuvette, conforme descrito na Figura 3. É importante observar a orientação da inserção para depois (Passo 5.4).
Figura 3: Orientação adequada da inserção dentro da cuvette de quartzo. O "entalhe" da inserção deve ser visível na parte frontal da cuvette. Isso deve ser inserido no instrumento voltado para a câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Usando uma pipeta, adicione lentamente 400-500 μL da amostra diluída ou diluída à temperatura ambiente até o cuvette através do orifício na pastilha. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar. Evite introduzir bolhas de ar.
- Primeiro prepare uma cuvette carregada com o diluído escolhido (em branco) para medir a concentração de partículas do diluído. Isso deve ser feito antes de medir a amostra para que a concentração de fundo da amostra possa ser corrigida.
NOTA: Um bom espaço em branco (salina tamponada de fosfato [PBS] neste caso) terá uma concentração <9 x 106 (dependendo do diluente) e exibirá 1-10 partículas por tela na visão ao vivo(Figura 4). Recomenda-se que a concentração real de partículas amostrais seja pelo menos 3 vezes a concentração de fundo. - Opcionalmente, antes de registrar a amostra prime a cuvette com 400-500 μL da amostra diluída ou diluída antes de medir. Para isso, carregue 400-500 μL da amostra diluída no cuvette, descarte a solução e, em seguida, adicione 400-500 μL a mais da amostra para a medição. Isso pode ajudar na lavagem de resíduos dentro da cuvette.
- Primeiro prepare uma cuvette carregada com o diluído escolhido (em branco) para medir a concentração de partículas do diluído. Isso deve ser feito antes de medir a amostra para que a concentração de fundo da amostra possa ser corrigida.
Figura 4: Exibição de transmissão ao vivo representativa de um diluído dentro da faixa de concentração adequada de um branco. Prepara-se EV diluído em PBS filtrado (0,02 μm ou 3 kDa, preferencial). Um bom branco exibirá ~1-10 partículas por tela na visualização ao vivo, produzindo uma concentração dentro da faixa 105-106. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Tampe o cuvette e verifique se há bolhas. Bata bolhas, se necessário. Use um pano livre de fiapos para limpar as faces externas da cuvette.
5. Procedimento de inicialização do instrumento de rastreamento de partículas
- Ligue a estação de trabalho e o instrumento do computador, aguarde alguns minutos antes de executar a primeira amostra e inicie o programa clicando no ícone do software. Quando solicitado, clique em NTA na tela para realizar análise de rastreamento de nanopartículas. Comece na guia Gravação e clique nas várias guias de software (Gravar, Processar, Plot) para alternar entre elas ao longo do protocolo. Grave a amostra (preparação diluída ou EV) primeiro, depois processe as gravações e, finalmente, plote os resultados.
- Siga as instruções na tela para preencher todas as informações necessárias sobre a amostra. Verifique se todos os campos necessários estão concluídos e precisos, ou seja, nome da amostra, Descrição, Preparação da amostra, fator de diluição [1000], temperatura-alvo (Definido para 22 °C) e Diluente: Selecione diluente do menu suspenso e use PBS como diluente para EVs. A seleção do PBS no menu suspenso irá preencher automaticamente a salinidade para 9%. Essas informações são necessárias para determinar a viscosidade dinâmica do líquido.
NOTA: Pode levar até 3 minutos para que a temperatura se equilibre dentro da cuvette mesmo que a sonda já mostre temperatura desejada (ou seja, ponto verde se torna estável). As leituras das amostras podem variar consideravelmente se a temperatura-alvo não for definida, pois as diferenças de temperatura da amostra podem alterar muito o movimento browniano das partículas. - Abra a tampa do instrumento e remova a tampa protetora que cobre onde a cuvette será colocada.
ATENÇÃO: O instrumento de rastreamento de partículas é certificado como um produto laser classe 1 (21 CFR Ch. Eu parte 1040), contendo lasers que podem ser perigosos e podem causar ferimentos graves, como queimaduras e/ou danos permanentes à visão. Para evitar acidentes ou ferimentos, não remova a tampa do instrumento desparafusando os parafusos do lado. Observe que durante a operação, os raios laser estão completamente fechados, não representando nenhuma ameaça aos usuários. Além disso, um bloqueio de segurança magnética é incorporado no suporte de amostra do instrumento para evitar que os lasers operem quando a tampa do suporte da amostra for removida. - Coloque o cuvette (a partir da etapa 4.3) dentro do instrumento na orientação correta (ver Figura 5). Substitua a tampa sobre a tampa e feche a tampa do instrumento. Sempre opere o instrumento com a tampa no lugar sobre o suporte da amostra. Não desabilitar ou tentar contornar o recurso de bloqueio de segurança.
Figura 5: Orientação adequada da cuvette dentro do instrumento de rastreamento de partículas. A face do cuvette (com o "entalhe" da inserção visível) deve ficar de frente para a câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Ligue a câmera clicando na seta acima do Streaming.
- Clique na seta chevron para expandir as configurações do Registro. Defina energia Gain e Laser para valores apropriados para a aplicação. Consulte Tabela 1 (e Figura Suplementar 1) para parâmetros utilizados para NTA de EVs pequenos (100 nm).
NOTA: Essas configurações avançadas acessadas clicando na seta chevron podem ser protegidas por senha. Use as mesmas configurações para gravação e processamento para o diluente (em branco) como os utilizados para as amostras subsequentes. - Ajuste o foco até que as partículas estejam devidamente focadas. O foco deve ser feito em partículas relativamente pequenas(Figura 6). Para quantificação de EV pequena (consistente com exosósmos), recomenda-se as seguintes configurações de gravação: Taxa de quadros: 30 fps, Exposição: 15 ms, Tempo de agitação: 5 s, Tempo de espera: 3 s, laser power - Azul: 210 mW, Verde: 12 mW, Vermelho: 8 mW, Quadros por vídeo: 300 quadros e Ganho: 30 dB.
NOTA: O usuário pode aumentar o Zoom para 1x e/ou aumentar o Ganho para ajudar no foco. Lembre-se de reefinar esses parâmetros para valores recomendados antes de gravar vídeos.
Figura 6: Visualizações de transmissão ao vivo representativas mostrando foco em partículas. (A) Uma visão de transmissão ao vivo de partículas não em foco. As partículas têm halo semelhante a brilho ou parecem embaçadas. Ajuste o foco. (B) Um exemplo de visualização ao vivo das partículas em foco adequado. As menores partículas estão em foco. Comece a gravar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Realize uma verificação de qualidade visual para garantir que a amostra esteja devidamente diluída. Se a amostra estiver muito concentrada, remova o cuvette do instrumento e dilua a amostra sequencialmente. Repita até que a amostra esteja devidamente diluída antes de prosseguir para a Etapa 6.
NOTA: Não dilua demais a amostra! Sempre faça diluições sequencialmente. O branco ideal exibirá apenas algumas partículas na tela (1-4) como mostrado na Figura 4. Em relação às amostras de EV, uma amostra devidamente diluída terá cerca de 20-100 partículas visíveis na tela, sem imagens semelhantes a brilho ou nubladas no fundo (ver Figura 7 como exemplo). Isso deve resultar em uma concentração de partículas ideal na faixa de 5 x 106 a 2 x 108 partículas por mL (não ajuste para fator de diluição).
Figura 7: Visualizações representativas de transmissão ao vivo representando diferentes diluições de partículas. (A) Um exemplo de visualização de transmissão ao vivo de uma amostra muito concentrada. Gravar uma amostra muito concentrada produzirá resultados imprecisos. (B) Uma visão de transmissão ao vivo de uma amostra devidamente diluída. Há 60-100 partículas visíveis na tela e o registro resulta em uma concentração bruta de 5 x 106- 2 x 108 partículas/mL. (C) Uma visão de transmissão ao vivo de uma amostra muito diluída. Se uma amostra for tão diluída, não haverá partículas suficientes rastreadas, diminuindo o tamanho da amostra e, portanto, os resultados serão estatisticamente inválidos. Neste caso, recomenda-se aumentar o número de vídeos gravados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Aquisição de dados de vídeo
- (Opcional) Defina a configuração de zoom em 0,5x para salvar a largura de banda e evitar quadros perdidos.
- Comece a gravar os vídeos clicando em Registro (ver Tabela 1 para parâmetros de gravação recomendados).
NOTA: Por padrão, o instrumento irá agitar a amostra por 5 s, esperar por 3 s e, em seguida, gravar por 10 s antes de repetir este processo. O tempo típico de medição para 50 vídeos é de ~15 minutos para gravar e ~13 min para processar. - Não toque no instrumento durante a gravação de vídeos. Certifique-se de que a superfície do banco de laboratório não está vibrando.
NOTA: É preferível que o instrumento esteja colocado em uma plataforma ou tabela anti-vibração para reduzir quaisquer distúrbios de vibração de equipamentos próximos que interferirão na determinação do movimento das nanopartículas. Evite operar centrífugas, misturadores de vórtices ou outros dispositivos potenciais geradores de vibração no mesmo banco que o instrumento de rastreamento de partículas. Vibrações são facilmente visíveis na tela como alongamento de partículas geralmente redondas. Se exposto a vibrações vigorosas, o instrumento pode exigir realinhamento de elementos ópticos. O instrumento não foi projetado para ser atendido ou calibrado pelo cliente; entrar em contato com o fabricante para manutenção, serviço e calibração. - Observe qualquer vídeo gravado que tenha partículas muito grandes visíveis como grandes bolhas brancas irregulares. Remova esses vídeos do processamento na Etapa 7.3.
7. Processar dados adquiridos
- Quando um prompt aparecer afirmando que os vídeos foram gravados, clique em OK para concluir a gravação. Em seguida, selecione a guia Processo.
NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui. O processamento dos dados adquiridos pode ser reiniciado posteriormente, movendo-se diretamente para a guia Process após a abertura do software do instrumento de rastreamento de partículas e especificando o diretório onde os vídeos gravados são salvos. - Ao analisar os EVs, verifique a caixa Desativar a substituição de detecção automática e defina o Diâmetro do Recurso para 30. Clique em Processo. (Consulte a Tabela 2 para as configurações de processamento e a Figura Suplementar 2 para exibição de processamento). Um gráfico de distribuição ao vivo será exibido para que o usuário possa visualizar o processamento em tempo real.
- Para exosósmos, processe com limiar de detecção definido para a amostra de polidisperse padrão. Processe os dados com o Manual do Limiar de Detecção definido para 0,8 em vez de um limiar padrão de 0,99 apenas para soluções com diferenças muito grandes no tamanho das partículas.
- Se algum vídeo tivesse partículas visivelmente muito grandes visíveis (veja o Passo 6.4), navegue até o diretório de vídeos gravados e remova o vídeo problemático. Depois de editar a lista de arquivos de vídeo, altere o número de vídeos gravados em outros logs mantidos pelo usuário.
- Após o processamento ser concluído, clique em OK. Em seguida, selecione a guia Plot. Para EVs, exiba o gráfico principal como LogBinSilica.
NOTA: Aqui na guia Plot, o usuário pode personalizar outras características do gráfico, como definir a faixa do eixo x (diâmetro de partículas, nm) para definir a área de integração para a figura produzida.
8. Exibir e interpretar resultados
- Para criar um relatório PDF, clique no botão Relatar. A medição está agora completa, e os resultados podem ser visualizados.
NOTA: Lembre-se de gravar e processar o em branco primeiro para que a concentração de fundo das amostras subsequentes possa ser corrigida. Se este passo for esquecido, o branco pode ser registrado após amostras e a concentração de partículas da amostra corrigida manualmente. - Examine o relatório PDF que exibe o tamanho médio, mediano e de modo, bem como a concentração ajustada para o fator de diluição e corrigida subtraindo a concentração de partículas do diluído. A largura de distribuição (desvio padrão) também é mostrada.
NOTA: Há muito poucas aplicações em que um único valor é apropriado e representativo. Assim, recomenda-se descrever toda a distribuição de tamanho e relatar a largura da distribuição para qualquer amostra analisada (como mostrado na Tabela 3, por exemplo). - Registre as seguintes configurações de instrumentos usadas para gerar os dados que devem ser indicados ao relatar resultados: Diluente, laser de potência de cada laser [mW], Exposição [ms], Gain [dB], Taxa de quadros [fps], Quadros por vídeo, Número de vídeos gravados, Configuração de processamento (por exemplo, LogBinSilica), faixa de integração [min nm, max nm] (recomendado para definir min a 50 nm) e Número de partículas rastreadas (desejável analisar pelo menos ~150 partículas por vídeo; mínimo de 3.750 faixas totais por amostra recomendado para evitar picos artefatos na distribuição do tamanho das partículas e gerar dados estatisticamente significativos).
9. Limpeza das cuvetas
- Limpe as cuvetas manualmente entre as amostras. Primeiro, esvazie o cuvette.
NOTA: A amostra pode ser recuperada da cuvette e salva ou descartada. - Uma vez que a cuvette esteja vazia, limpe a cuvette enxaguando-a 10-15 vezes com água desionizada (DI). Em seguida, enxágue 3 vezes com etanol (70-100%). Ao fazer isso, certifique-se de encher completamente a cuvette com solvente.
- Seque o lado de fora da cuvette com um pano de microfibra sem fiapos. Evite manchas nas superfícies. O ar seque o interior da cuvette ou seque usando um espanador de ar comprimido.
NOTA: Apenas o papel de limpeza da lente ou o pano de microfibra livre de fiapos devem ser usados para limpar as superfícies ópticas da cuvette, uma vez que a maioria dos produtos de papel contém pequenas fibras de madeira que podem arranhar ou danificar a superfície do cuvette. - Prepare dois frascos de cintilação de vidro: um cheio com 70-100% de etanol e outro com água DI. Enxágüe as pastilhas e mexa as barras no etanol primeiro (depois água DI) colocando a barra de inserção/mexida no frasco de cintilação apropriado e sacudindo o frasco vigorosamente. Seque as pastilhas e mexa as barras usando panos sem fiapos ou espanadores de ar comprimidos.
NOTA: O cuvette e a inserção também podem ser limpos usando um banho de água sônico. Para isso, primeiro certifique-se de que a unidade de sonicação contenha água suficiente (pelo menos 5 cm de profundidade). Em seguida, coloque o cuvette e insira dentro de um copo de vidro (50 mL ou maior), encha o béquer com álcool ao mesmo nível do banho de água, coloque o béquer na água e ligue a energia. Sonicate por um máximo de 5 minutos de cada vez, permitindo que a máquina descanse >5 min entre cada rajada de 5 minutos se forem necessários tempos mais longos. - Quando terminar, coloque imediatamente todos os componentes limpos e secos para armazenamento.
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Representative Results
Antes desta demonstração, a calibração do instrumento foi testada pela primeira vez para garantir a validade dos dados adquiridos, medindo a distribuição de tamanho das normas de contas de poliestireno. Testamos a distribuição de tamanho de contas de 100 nm e 400 nm usando os parâmetros de gravação padrão e as configurações de processamento recomendadas neste protocolo(Figura 8).
Para o padrão de contas de poliestireno de 100 nm, foi medida uma concentração de 4,205 x 107 partículas/mL. O tamanho médio (desvio padrão, SD) foi de 102 (±17) nm com coeficiente de variação (CV) de 0,16. Os valores D10/D50/D90 foram de 76/104/126 nm. Isso indica que o instrumento de rastreamento de partículas relatou com precisão o tamanho das contas monodispersas de 100 nm. Para o padrão de 400 nm de poliestireno, a concentração foi de 4,365 x 107 partículas/mL. O tamanho médio (SD) foi de 391 (±47) nm, com cv de 0,12. Os valores D10/D50/D90 foram de 150/358/456 nm(Tabela 3). Embora a média relatada esteja muito próxima do tamanho real das contas, podemos ver que as configurações do instrumento aplicadas neste protocolo são mais precisas para as partículas menores ~100 nm. Assim, para partículas maiores que 400 nm, sugere-se a otimização dos parâmetros do laser. Os pesquisadores devem primeiro conduzir um método como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para uma estimativa da distribuição resultante do tamanho do EV a partir de um determinado método de origem e isolamento antes da NTA.
Uma concentração média de 4,41 x 1010 partículas/mL foi medida para a amostra de tecido do camundongo EV utilizada para esta demonstração. Esta amostra foi registrada seguindo os parâmetros resumidos na Tabela 1 e processadas seguindo os parâmetros descritos na Tabela 2. Demonstramos o impacto de vários fatores de diluição na Figura 9 e relatamos as concentrações de partículas cruas e ajustadas na Tabela 4. A diluição ideal para os EVs derivados do tecido do camundongo foi entre 1.000 a 3.000, enquanto para EVs derivados do plasma humano foi de 1.000, indicando que ao testar pela primeira vez uma determinada fonte biofluida ou método de isolamento EV para NTA, diluições seriais devem ser testadas para que a diluição ideal para a medição da NTA possa ser identificada. Recomendamos medir e relatar pelo menos duas diluições diferentes de uma amostra. Também medimos quatro amostras adicionais em várias diluições em dois instrumentos distintos de rastreamento de partículas. Figura Suplementar 3 compara a precisão do instrumento de rastreamento de partículas em medições de tamanho em comparação com outro instrumento NTA comercialmente disponível. A Tabela Suplementar 1 demonstra ainda a precisão das medições deste instrumento, mostrando que a concentração de partículas mudou proporcionalmente com a diluição amostral, mas que as medidas de tamanho da partícula não.
Após o processamento, os resultados (juntamente com as informações de instrumentos/software, configurações de gravação e processamento e notas experimentais) podem ser salvos em um relatório .pdf. O histograma incluído neste relatório pode ser modificado conforme descrito no protocolo (seção 7.4). Os resultados brutos são salvos em um arquivo .dat que pode ser exportado. Os vídeos gravados também são salvos e podem ser usados para processamento e análise off-line posteriores. No entanto, uma vez que os vídeos são gravados, as configurações de gravação não podem ser alteradas retrospectivamente.
O impacto da alteração dos vários poderes laser e ganho nas configurações de gravação foi demonstrado usando EVs derivados de plasma humano. Isso é visualizado nas Figuras 10-12 e as informações quantitativas baseadas nessas imagens são mostradas na Tabela 5. O aumento do ganho aumenta a sensibilidade da câmera, permitindo a visualização de partículas menores (Figura 10), resultando em uma crescente concentração total de partículas com um tamanho médio menor de partículas(Tabela 5). No entanto, aumentar o ganho acima de 30 dB (nossas recomendações) torna a visão muito granunte, permitindo que o ruído obscureça a medição de partículas verdadeiras. Com um ganho de câmera de 30 dB, o efeito de alterar a potência do laser azul é retratado na Figura 11. O aumento do laser azul (450 nm, comprimento de onda curto) resulta em maior resolução para detectar partículas menores (ou seja, aquelas com um tamanho consistente com exosóis). Segurando os poderes laser verde e vermelho constantes nas configurações padrão, aumentando a potência do laser azul de 70 mW para 210 mW mudou o tamanho médio de partículas relatado de 122 nm para 105 nm e aumentou a concentração total de partículas relatada de 1,1 x 108 para 1,7 x 108 (Tabela 5).
Também foi demonstrado o efeito do aumento das potências laser verde e vermelha (Figura 12). O aumento da potência do laser vermelho (650 nm, comprimento de onda longo) aumentou o tamanho médio de partículas relatado de 175 para 246 nm. A concentração total de partículas relatada diminuiu, mas isso porque nesta amostra de EV de plasma humano não tínhamos muitas partículas grandes presentes, confirmadas pela coloração negativa tem (Figura Suplementar 4). O aumento da potência do laser verde resultou em uma diminuição no tamanho médio de partículas relatada e um aumento na concentração total de partículas relatada. Assim, o usuário pode otimizar a potência dos três lasers para detectar sensivelmente partículas de vários tamanhos.
Este protocolo é otimizado para vesículas menores (por exemplo, <400 nm). Pesquisadores interessados em microvesículos de tamanhos maiores (por exemplo, 400-1000 nm) são encorajados a otimizar os parâmetros de laser usando contas de organosílica oca que têm propriedades de dispersão de luz semelhantes às dos EVs tornando-os uma referência mais adequada do que os padrões de poliestireno ou sílica30. No entanto, as nanopartículas de sílica podem ser o melhor substituto prático até que os padrões organosílicos se tornem mais amplamente disponíveis.
Aqui, um instrumento NTA foi usado para quantificar com sucesso EVs isolados do tecido do rato por ultracentrifugação e plasma humano usando um kit comercial. Os efeitos da alteração dos parâmetros nta foram ilustrados e mostram que os parâmetros neste protocolo são otimizados para pequenas vesículas. A importância da etapa de diluição também foi demonstrada e mostra que o instrumento de rastreamento de partículas aqui demonstrado pode detectar com precisão variações nos fatores de diluição. A concentração mudou proporcionalmente com múltiplas diluições, enquanto a distribuição de tamanho não. Os dados resultantes mostraram pouca variabilidade técnica. Assim, a adaptação desse protocolo pelos pesquisadores que utilizam este instrumento para a NTA aumentará o rigor e a reprodutibilidade no campo de pesquisa do EV.
Figura 8: Distribuições de tamanho de partículas de padrões de contas de poliestireno monodisperse. (A) Distribuição de tamanho de partícula de 100 nm padrão de contas de poliestireno. (B) Distribuição do tamanho da partícula de 400 nm padrão de contas de poliestireno. Os valores são informados na Tabela 3. Inset mostra a visualização de transmissão ao vivo do primeiro quadro medido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Concentrações totais brutas de partículas por fator de diluição para EVs de tecido adiposo do rato perigonadal. As barras de erro representam desvio padrão. Foram tomadas três medidas para cada diluição. Os valores são informados na Tabela 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Impacto visual do ganho crescente. Imagens representativas de partículas medidas com configurações padrão de laser (Azul = 70 mW, Verde = 12 mW, Vermelho = 8 mW) e ganho definido para (A) 18 dB, (B) 24 dB - padrão, e (C) 30 dB - recomendado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Efeito do laser azul em pequenas partículas quando os lasers vermelhos e verdes são definidos como configurações padrão. (A) Laser azul = 70 mW (padrão). (B) Laser azul = 210 mW (recomendado). Mais partículas pequenas são visíveis e em foco quando a potência do laser azul é aumentada para 210 mW. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Impacto visual da potência do laser azul, verde e vermelho alterado. As visualizações representativas da tela ao vivo retratam os diferentes tamanhos de partículas visualizados em diferentes configurações de laser. Os valores nta resultantes são relatados na Tabela 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Partículas | Diâmetro [nm] | Laser azul [mW] | Laser verde [mW] | Laser vermelho [mW] | Ganho de câmera [dB] | Regulação da Temperatura | Processamento | Vídeos |
| Exosóis | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Habilitado, definido para 22 ºC | Substituição de detecção automática de detecção desativada | 50 |
Tabela 1: Parâmetros de gravação para pequenas vesículas extracelulares (~100 nm).
| Descrição do processo | Limiar de detecção | Desativar a substituição de detecção automática | Diâmetro do recurso [px] |
| Exosóis | Amostra de polidisperse | Verificado | 30 |
Tabela 2: Parâmetros de processamento para pequenas vesículas extracelulares (~100 nm).
| Tamanho do Padrão de Poliestireno [nm] | Faixa de integração [nm] | Tamanho médio [nm] | Tamanho SD [nm] | CV de tamanho | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Contagem Total |
| 100 | 50 a 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 a 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabela 3: Resultados nta de padrões de contas de poliestireno monodisperse. Ambos os padrões foram otimizados, com concentrações brutas para o padrão de 100 nm e padrão de 4.205 x 107 partículas/mL e 4,365 x 107 partículas/mL, respectivamente. D10 é o ponto na distribuição de tamanho onde 10% da amostra está contida, D50 é o ponto onde 50% da amostra está contida (mediana), e D90 é o ponto onde 90% da amostra está contida. SD: Desvio padrão; CV: Coeficiente de variação.
| Fator de diluição | Concentração de partículas, partículas/mL | Concentração total de partículas, partículas/mL |
| Cru | Ajustado para fator de diluição | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4.10E+10 |
| 4.00E+07 | 4.00E+10 | |
| 3.70E+07 | 3.70E+10 | |
| média (SD) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3.60E+07 | 5.40E+10 |
| 2.60E+07 | 3.80E+10 | |
| 2.90E+07 | 4.40E+10 | |
| média (SD) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4.55E+10 (6.60E+09) |
| 2000 | 2.40E+07 | 4.80E+10 |
| 2.30E+07 | 4.60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4.00E+10 | |
| média (SD) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1.30E+07 | 3.90E+10 | |
| 1.40E+07 | 4.20E+10 | |
| média (SD) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4.71E+10 (9.27E+09) |
Tabela 4: Os resultados da NTA dos EVs de tecido adiposo do mouse perigonadal demonstram a reprodutibilidade das medidas de NTA. Concentrações brutas de partículas NTA (partículas/mL) medidas no instrumento de rastreamento de partículas e concentração total de partículas (partículas/mL) ajustadas para fator de diluição de EVs derivados do tecido adiposo do rato perigonadal em várias diluições.
| Ganho [dB] | Laser Azul [mW] | Laser Verde [mW] | Laser Vermelho [mW] | Concentração Total, partículas/mL (cru) | Tamanho médio [nm]* | Desvio padrão de tamanho / CV | Tamanho modal | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1.50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integrado dentro da faixa de 50-1000 nm | ||||||||
Tabela 5: Os resultados da NTA dos EVs derivados do plasma humano demonstram o efeito da alteração do poder do laser e do ganho nas medidas de tamanho e concentração de partículas dos EVs humanos (diluição de 1:1000). D10 é o ponto na distribuição de tamanho onde 10% da amostra está contida, D50 é o ponto onde 50% da amostra está contida (mediana), e D90 é o ponto onde 90% da amostra está contida. SD: Desvio padrão; CV: Coeficiente de variação.
Figura suplementar 1: Captura de tela do painel de gravação que mostra parâmetros de gravação recomendados. Acesse configurações avançadas para alterar o ganho da câmera e a potência do laser para as configurações recomendadas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Captura de tela do painel de processamento que retrata as configurações de processamento recomendadas. Certifique-se de que "Desativar a substituição de detecção automática" seja verificado e o Diâmetro do recurso esteja definido como "30". Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 3: Medidas de tamanho de partículas em várias diluições: Precisão do instrumento de rastreamento de partículas (ViewSizer 3000) vs. instrumento NTA comercial comparável (NanoSight NS300). Nta de EVs isolados do tecido adiposo do rato perigonadal foi realizado em dois instrumentos. Para cada rato, foram medidas três diluições (1:1000, 1:500, 1:100). Os valores brutos das medidas tomadas no ViewSizer 3000 (demonstrado neste protocolo) são mostrados na Tabela Suplementar 1. As configurações de captura e análise das medidas NanoSight NS300 são mostradas na Tabela Suplementar 2. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 4: Microscopia eletrônica de transmissão de manchas negativas (TEM) representativa dos EVs derivados do plasma humano. As grades foram imagens com um microscópio eletrônico de transmissão operando a 100 kV acelerando a tensão. As imagens foram capturadas em uma câmera CCD 2K x 2K. A barra de escala reflete a ampliação da câmera. Micrografos eletrônicos mostram vesículas redondas ~25 nm de diâmetro. Ampliação de 100k, barra de escala 200 nm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabela suplementar 1: VerSizer 3000 tamanho de partículas e medidas de concentração de EVs de tecido adiposo do rato perigonadal em várias diluições. Foi realizada NTA de EVs isolados do tecido adiposo do rato perigonadal. Para cada rato, foram medidas três diluições (1:1000, 1:500, 1:100). D10 é o ponto na distribuição de tamanho onde 10% da amostra está contida, D50 é o ponto onde 50% da amostra está contida (mediana), e D90 é o ponto onde 90% da amostra está contida. As concentrações de partículas são corrigidas em segundo plano. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela suplementar 2: Configurações de captura e análise nanoSight NS300. Configurações (utilizando NTA 3.4 Build 3.4.003) utilizadas para medir o tecido adiposo do rato, relatado em amostras de EV suplementares relatadas na Figura Suplementar 3. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Aqui, demonstramos um protocolo para nta de EVs medir a distribuição de tamanho de uma ampla gama de tamanhos de partículas simultaneamente e medir a concentração total de EV em uma amostra de polidisperse. Neste estudo, o tecido adiposo do rato perigonadal e o plasma humano foram usados como fonte de EVs. No entanto, EVs isolados de outros tecidos ou fluidos biológicos, como soro, urina, saliva, leite materno, fluido amniótico e supernanato de cultura celular também podem ser usados para NTA. As medições das normas de contas de poliestireno garantiram que o instrumento estava devidamente calibrado e demonstraram que este instrumento NTA pode medir corretamente o tamanho das nanopartículas ≤400 nm. Várias diluições de uma amostra de EV de tecido do rato foram então testadas. Como mostrado na Figura 9,a concentração de partículas relatadas escamas de acordo com o fator de diluição, como esperado, demonstrando que o instrumento pode detectar com precisão a concentração de partículas em várias diluições com pouca variabilidade entre as réplicas técnicas. No entanto, isso foi quando se trabalha com concentrações de partículas dentro da faixa de trabalho do instrumento (5 x 106 a 2 x 108 partículas por mL); diluir adequadamente uma amostra é um passo crítico no protocolo. O ajuste para o fator de diluição rendeu aproximadamente a mesma estimativa para a concentração total de partículas da amostra, com um CV de 15,1 nas quatro diluições testadas. Além disso, diferentes medidas, repetidas em múltiplas diluições das mesmas amostras, mostraram a precisão nas avaliações de distribuição do tamanho das partículas, como concentrações de partículas dimensionadas proporcionalmente com o fator de diluição, mas as medidas de tamanho relatadas não.
Os EVs em suspensão sofrem movimento térmico aleatório conhecido como movimento browniano, segundo o qual a difusão de partículas em uma suspensão líquida é inversamente proporcional ao seu tamanho. Este movimento aleatório é modelado pela equação de Stokes-Einstein, onde o diâmetro hidrodinâmico D de uma partícula esférica é:
Onde kB é a constante Boltzmann e R é o raio de partículas. Como se pode ver na equação, o movimento de partículas na suspensão também depende da temperatura(T)e da viscosidade dinâmica(η)do líquido. Durante a NTA, os EVs são irradiados com raios laser focados que passam pelas partículas em suspensão e são detectados pela iluminação do incidente proveniente dos lasers. A luz espalhada por cada partícula individual é focada por um microscópio no sensor de imagem de uma câmera ccd (dispositivo acoplado à carga) de alta resolução, sensível à luz, que registra imagens digitais da luz dispersa das partículas(Figura 1). O software NTA identifica e rastreia o movimento browniano de cada partícula individual para calcular o coeficiente de difusão de cada partícula. Isto é usado em conjunto com a temperatura e a viscosidade do líquido contendo as partículas para calcular o diâmetro das partículas usando a equação de Stokes-Einstein. Assim, uma única medição pode determinar duas informações críticas: distribuição do tamanho das partículas e contagem total de partículas de EVs em suspensão.
Uma comparação da NTA com outras técnicas de detecção e quantificação de EVs foi descrita em outros lugares31,32. Em comparação com outros métodos baseados em dispersão de luz, como a dispersão dinâmica de luz (DLS), a NTA tem maiores capacidades de resolução e é um método particularmente poderoso para analisar partículas com um diâmetro médio inferior a 100 nm. Ao contrário das análises de partículas únicas como o TEM, o NTA não é demorado ou tecnicamente desafiador e pode fenótipo uma amostra inteira em um volume relativamente baixo de uma só vez de uma maneira semi-automatizada. Embora a NTA seja uma técnica de caracterização poderosa, ela tem limitações. Em primeiro lugar, a NTA está sujeita a limites de sensibilidade devido à forte diminuição da intensidade do dimensionamento de luz dispersa com diâmetro de partículas, fazendo com que a luz dispersa de partículas muito pequenas desapareça abaixo do ruído de fundo33. Assim, a NTA reduziu a sensibilidade para EVs menor que ~50 nm31 e resulta em uma superestimação dos tamanhos de EV. Lasers de comprimento de onda curto são necessários para detectar as partículas menores de uma amostra de polidisperse devido ao seu potencial de dispersão de luz. No entanto, este instrumento de rastreamento de partículas oferece uma melhoria nessa limitação inerente à tecnologia de rastreamento de nanopartículas. Equipado com três fontes de luz variáveis (450 nm, 520 nm, 635 nm), este sistema permite a visualização de partículas sobre uma ampla gama de tamanhos, tornando este instrumento uma ferramenta particularmente valiosa para análises de NTA de amostras polidisperse, como uma população heterogênea de EVs. No entanto, como a maioria dos preps de EV será polidisperse na composição e provavelmente conterá impurezas, os pesquisadores devem estar cientes de que os limites dependentes da amostra de detecção impactam a forma da distribuição geral do tamanho e, portanto, tenham cuidado ao interpretar resultados.
Outra grande limitação da NTA é que ela mede mais do que apenas EVs. O instrumento NTA detectará, medirá e contará todas as partículas que excedem o limite de detecção, incluindo agregados proteicos, lipoproteínas, detritos celulares e contaminação causada por diluentes. No entanto, a concentração de partículas no fundo pode ser corrigida medindo a concentração de partículas do diluído antes de carregar e medir uma amostra. Recomendamos o uso no mínimo de 0,02 μm de PBS filtrado e encontramos contaminação de partículas muito baixa ao usar PBS filtrado de 3 kDa. Além disso, é possível estender a NTA para medir e analisar EVs rotulados fluorescentes, superando a limitação da medição não específica. Kits comerciais estão disponíveis que, especificamente e eficientemente, tingem as membranas apenas de vesículas intactas, excluindo fragmentos de membrana, agregados proteicos e outras partículas da medição da NTA. Assim, os dados derivados da NTA fluorescente representam com mais precisão a verdadeira concentração e distribuição de tamanho do EV. Através da marcação seletiva de antígenos de superfície EV, a NTA fluorescente também pode medir EVs específicos rotulados por anticorpos fluorescentes marcados, permitindo a contagem e o dimensionamento de subpopulações EV específicas e biologicamente relevantes de antígenos.
Tem havido pouco trabalho na padronização dos protocolos NTA, dificultando a comparabilidade dos resultados e dificultando a reprodutibilidade entre amostras, dias, operadores e laboratórios. O instrumento de rastreamento de partículas demonstrado neste protocolo requer pouco tempo prático. Também notamos quais configurações de instrumentos os usuários devem relatar para facilitar a reprodutibilidade dos dados gerados. Assim, seguir o protocolo otimizado aqui estabelecido deve resultar em padronização e possibilitar a comparação de resultados entre laboratórios. Outra vantagem do uso deste instrumento é que a amostra é preparada em uma cuvette, o que permite que o instrumento se misture repetidamente entre vídeos, garantindo uma amostra estatisticamente aleatória para cada vídeo e produzindo um resultado mais reprodutível do que outros instrumentos NTA disponíveis comercialmente que dependem de bombas de seringa e células de fluxo. Além disso, os múltiplos lasers permitem a detecção de partículas com diferentes índices de refração, gerando resultados mais robustos. No entanto, o funcionamento deste instrumento de rastreamento de partículas não requer conhecimento das propriedades do material de partículas, como o índice de refração, tornando as medições mais reprodutíveis entre os operadores.
EVs foram identificados em quase todos os biofluidos testados2,5. No entanto, o isolamento efetivo de EVs específicos (por exemplo, EVs específicos do tipo celular) de diferentes mídias (por exemplo, sangue, leite materno, mídia de cultura celular) apresenta um desafio difícil. Muitos métodos diferentes para isolamento de EV foramdescritos 9. O NTA pode ser realizado para comparar rendimentos de EVs isolados usando diferentes métodos e identificar variações nas vesículas que surgem de diferentes métodos de isolamento. Isso é importante para interpretar os resultados a jusante, uma vez que atualmente a função de diferentes subpopulações de EV permanece incerta. Medir com precisão a concentração de EV também é importante em estudos que investigam se um determinado tratamento, condição ou molécula impacta a liberação de EV. Por exemplo, nosso grupo está interessado no impacto de exposições ambientais, como a poluição do ar de material particulado no conteúdo e liberação de EV. Para avaliar se uma condição afeta a liberação de EV, o número de vesículas deve ser quantificado com precisão. Ao usar EVs como biomarcadores diagnósticos, a concentração de EVs na amostra poderia impactar os resultados do ensaio. Assim, um método confiável para determinar a concentração de partículas e a distribuição de tamanho é fundamental.
Independentemente disso, as medições de NTA devem ser acompanhadas por outras técnicas complementares que podem medir partículas independentemente das outras partículas da amostra, como o TEM. Tecnologias mais novas, como o sensor de pulso resistivo microfluido (MRPS) também são promissoras para o dimensionamento e contagem de EVs independentes da polidispersidade da amostra. Outras análises bioquímicas ou proteômicas das amostras de EV podem ser utilizadas, além do tamanho e dados de concentração para agrupar subconjuntos de EVs em populações de significância biológica. Em conclusão, medir concentrações de partículas válidas e reprodutíveis e distribuições de tamanho de partículas é importante para o campo EV. O ViewSizer 3000 consegue medições precisas e reprodutíveis da concentração total de EV e distribuição de tamanho EV, mesmo para amostras altamente polidisperses, como demonstrado aqui. No futuro, esperamos ver comparações experimentais mais rigorosas deste instrumento com outros instrumentos da NTA.
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Disclosures
Todos os autores declararam que não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Reconhecemos Jeffrey Bodycomb, Ph.D. da HORIBA Instruments Incorporated por sua ajuda para calibrar o instrumento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
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