Summary
Мы демонстрируем, как использовать новый инструмент для анализа отслеживания наночастиц для оценки распределения по размеру и общей концентрации частиц внеклеточных везикул, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши и плазмы человека.
Abstract
Физиологические и патофизиологические роли внеклеточных везикул (EV) становятся все более признанными, что делает область EV быстро развивающейся областью исследований. Существует множество различных методов изоляции электромобилей, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, которые влияют на выход и чистоту электромобилей. Таким образом, характеристика подготовки EV, изолированной от заданного источника выбранным методом, важна для интерпретации последующих результатов и сравнения результатов в разных лабораториях. Существуют различные методы определения размера и количества EV, которые могут быть изменены болезненными состояниями или в ответ на внешние условия. Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является одной из выдающихся технологий, используемых для высокопроизводительного анализа отдельных электромобилей. Здесь мы представляем подробный протокол количественной оценки и определения размера EV, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши и плазмы человека, с использованием прорывной технологии для NTA, представляющей основные достижения в этой области. Результаты показывают, что этот метод может предоставлять воспроизводимые и достоверные данные об общей концентрации частиц и распределении по размеру для электромобилей, выделенных из разных источников с использованием различных методов, что подтверждается просвечиваюрной электронной микроскопией. Адаптация этого инструмента для NTA позволит рассмотреть необходимость стандартизации методов NTA для повышения строгости и воспроизводимости в исследованиях EV.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой небольшие (0,03-2 мкм) связанные с мембраной везикулы, секретируемые почти всеми типами клеток1. Их часто называют «экзосомами», «микровезикулами» или «апоптотическими телами» в зависимости от их механизма высвобождения и размера2. Хотя первоначально считалось, что электромобили были просто средством устранения отходов из клетки для поддержания гомеостаза3,теперь мы знаем, что они также могут участвовать в межклеточной коммуникации посредством переноса молекулярного материала, включая ДНК, РНК (мРНК, микроРНК), липиды и белки4,5, и что они являются важными регуляторами нормальной физиологии, а также патологических процессов1, 5,6,7,8.
Существует множество различных методов выделения и количественной оценки электромобилей, которые были описаны в других разделах9,10,11,12. Используемый протокол изоляции, а также источник электромобилей могут сильно повлиять на выход и чистоту электромобилей. Даже дифференциальное центрифугирование, долгое время считавшийся подходом «золотого стандарта» для выделения экзосом, может подвергаться существенной изменчивости, впоследствии влияющей на популяцию электромобилей, полученную и последующий анализ13. Таким образом, различные методологии изоляции и количественной оценки электромобилей затрудняют сравнение, воспроизведение и интерпретацию результатов экспериментов, о которых сообщается в литературе14. Кроме того, высвобождение EV может регулироваться клеточными условиями или различными внешними факторами. Было высказано предположение, что EV играют роль в поддержании клеточного гомеостаза, защищая клетки от внутриклеточного стресса15,поскольку несколько исследований показали, что клеточный стресс стимулирует секрецию EV. Например, сообщалось об увеличении высвобождения EV после клеточного воздействия гипоксии, эндоплазматического стресса риткулума, окислительного стресса, механического стресса, экстракта сигаретного дыма и загрязнения воздуха твердыми частицами16,17,18,19,20,21,22. Также было показано, что релиз EV модифицируется in vivo; мыши, подвергаемые диете с высоким содержанием жиров или голодания в течение шестнадцати часов, высвобождали больше адипоцитарных EV23. Чтобы выяснить, изменяет ли конкретное лечение или состояние высвобождение EV, количество EV должно быть точно определено. Оценка распределения EV по размерам может также указывать на преобладающее субклеточное происхождение EV (например, слияние поздних эндосом/мультивезикулярных тел с плазматической мембраной против почкоделения плазматической мембраны)24. Таким образом, существует потребность в надежных методах для точного измерения общей концентрации и распределения по размерам изучаемого ev prep.
Быстрым и высокочувствительным методом визуализации и характеристики электромобилей в растворе является анализ отслеживания наночастиц (NTA). Подробное объяснение принципов применения данного метода и сравнение с альтернативными методами оценки размера и концентрации ЭВ были описаныранее 25,26,27,28. Вкратце, во время измерения NTA электромобили визуализируются светом, рассеянным при их облучении лазерным лучом. Рассеянный свет фокусируется микроскопом на камере, которая записывает движение частиц. Программное обеспечение NTA отслеживает случайное тепловое движение каждой частицы, известное как броуновское движение, чтобы определить коэффициент диффузии, который используется для расчета размера каждой частицы с использованием уравнения Стокса-Эйнштейна. NTA был впервые применен для измерения EV в биологическом образце в 2011году25. До недавнего времени существовало только две основные компании, предлагающие коммерческие инструменты NTA29 до появления ViewSizer 3000 (далее именуемого инструментом отслеживания частиц), который использует комбинацию новых аппаратных и программных решений для преодоления значительных ограничений других методов NTA.
Инструмент отслеживания частиц характеризует наночастицы в жидких образцах путем анализа их броуновского движения и характеризует более крупные частицы микронный размером, анализируя гравитационное оседание. Уникальная оптическая система этого прибора, которая включает в себя мультиспектральное освещение с тремя лазерными источниками света (при 450 нм, 520 нм и 635 нм), позволяет исследователям анализировать широкий диапазон размеров частиц (например, экзосомы, микровезикулы) одновременно. Схема установки прибора показана на рисунке 1.
Здесь мы демонстрируем, как выполнять измерения размера частиц и концентрации изолированных электромобилей мышей и человека с помощью нового инструмента NTA.
Рисунок 1:Оптическая система прибора слежения за частицами. Прибор NTA освещает частицы с помощью трех лазеров со следующими длинами волн: 450 нм, 520 нм, 635 нм. Видеозапись рассеянного света от отдельных частиц обнаруживается и отслеживается цифровой видеокамерой, ориентированной на 90° от кюветы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся работа с этими образцами проводилась в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию и Совета по институциональному обзору. Схематический обзор метода NTA показан на рисунке 2.
Рисунок 2:Обзор метода NTA с использованием прибора слежения за частицами. Образец подготавливается и вставляется в инструмент. Программное обеспечение NTA открывается, параметры записи настраиваются, и образец фокусируется. Затем данные записываются, обрабатываются и отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
1. Изоляция внеклеточных везикул
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭV перигонадальной жировой ткани мыши были выделены, какописано ранее 23. Плазменные EV были выделены из 1 мл плазмы человека с использованием следующего протокола:
- Соберите плазму и центрифугу при 3000 х г в течение 15 мин для удаления клеточного мусора. Перенесите супернатант в новую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если дополнительный мусор остается обнаруживаемым, центрифугируют супернатант в течение дополнительных 10 мин при 12 000 х г и перекладывайте супернатант в новую трубку. - Добавьте 67 мкл реагента выделения экзосом на 250 мкл плазмы. Хорошо перемешать, перевернув или щелкнув трубкой.
- Инкубировать на льду вертикально в течение 30 мин.
- Центрифугировать смесь экзосомного реагента/плазмы при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование может быть выполнено при комнатной температуре или 4 °C с аналогичными результатами, но предпочтительно 4 °C. После центрифугирования EV могут выглядеть в виде бежевой или белой гранулы в нижней части трубки. - Осторожно аспирировать супернатант. Раскрутите любой остаточный раствор для выделения экзосом и удалите все следы жидкости путем аспирации, проявляя большую осторожность, чтобы не нарушить осажденные EV в грануле.
- Повторно суспендируют гранулу в 200 мкл буфера В (предоставлено производителем). Измерьте и запишите концентрацию белка в образце (для этапа 2.8) с использованием спектрофотометра, флуорометра, анализа Брэдфорда или другого предпочтительного метода.
2. Очистка изолированных электромобилей
- Добавить 200 мкл буфера А (предоставленного заводом-изготовителем) к повторно подвешенным электромобилям.
- Выньте очистителю колонну (при условии), ослабьте крышку винта и защелкнуть нижнюю застежку. Поместите столбец в коллекционную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните нижнюю замыкание для шагов 2.7-2.9. - Центрифуга при 1 000 х г в течение 30 с для удаления буфера хранения.
- Отбросьте проточную трубу и поместите колонну обратно в коллекторную трубку.
- Чтобы промыть колонну, снимите колпачок и нанесите 500 мкл буфера B поверх смолы и центрифуги при 1000 х г в течение 30 с. Отбросьте поток. Сохраните колпачок для шагов 2.7-2.9.
- Повторите шаги 2.4-2.5 еще раз, чтобы промыть колонну.
- Заткнуть нижнюю часть колонны нижним затвором (из шага 2.2). Нанесите 100 мкл буфера B поверх смолы, чтобы подготовить ее к загрузке образца.
- Добавьте все содержимое со шага 1.6 (или до объема, эквивалентного 4 мг общего белка) к смоле. Поместите винтовой колпачок в верхнюю часть колонны.
- Перемешивать при комнатной температуре на вращающемся шейкере не более 5 мин.
3. Элюляция образца
- Ослабьте крышку винта и снимите нижнюю застежку, и немедленно переложите на микроцентрифужную трубку 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец начнет элюироваться, как только нижняя крышка будет удалена. Пожалуйста, убедитесь, что микроцентрифужные трубки 2 мл готовы к приему элюата, чтобы свести к минимуму потери образца. - Центрифуга при 1000 х г в течение 30 с для получения очищенных электромобилей. Отменить столбец.
4. Пробоподготовка к анализу отслеживания наночастиц
- Используйте безворсовый материал, такой как ткань из микрофибры, чтобы покрыть рабочее пространство и предотвратить попадание волокон в кюветы.
- Надев перчатки, поместите кювету на магнитный джиг кюветы, затем поместите перемешиватель в кювету. Всегда обрабатывайте кюветы перчатками, чтобы предотвратить появление отпечатков пальцев и пятен на поверхности кюветы.
- Используйте инструмент «Крючок», чтобы поместить вставку в кювету, как показано на рисунке 3. Важно отметить ориентацию вставки на более поздний срок (Шаг 5.4).
Рисунок 3:Правильная ориентация вставки внутри кварцевой кюветы. "Выемка" вкладыша должна быть видна с передней части кюветы. Он должен быть вставлен в прибор, обращенный к камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Используя пипетку, медленно добавляйте 400-500 мкл разбавителяя или разбавленный образец при комнатной температуре в кювету через отверстие во вставке. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать. Избегайте введения пузырьков воздуха.
- Сначала подготовьте кювету, загруженную выбранным разлучителем (заготовкой), чтобы измерить концентрацию частиц разжижаемого. Это следует сделать перед измерением образца, чтобы можно было скорректировать фоновую концентрацию образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая заготовка (в данном случае фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS]) будет иметь концентрацию <9 x 106 (в зависимости от разбавителяющего) и будет отображать 1-10 частиц на экране в режиме реальноговремени (рисунок 4). Рекомендуется, чтобы фактическая концентрация частиц образца по меньшей мере в 3 раза превышала фоновую концентрацию. - Необязательно, перед записью образца загрунтуют кювету с 400-500 мкл разбавителяющей или разбавленной пробы перед измерением. Для этого загрузите в кювету 400-500 мкл разбавленного образца, выбросьте раствор, а затем добавьте еще 400-500 мкл образца для измерения. Это может помочь с вымыванием остатков в кювете.
- Сначала подготовьте кювету, загруженную выбранным разлучителем (заготовкой), чтобы измерить концентрацию частиц разжижаемого. Это следует сделать перед измерением образца, чтобы можно было скорректировать фоновую концентрацию образца.
Рисунок 4:Репрезентативный вид в реальном времени размывая в пределах надлежащего диапазона концентрации заготовки. Разбавляйте препараты EV в фильтрованном (0,02 мкм или 3 кДа, предпочтительно) PBS. Хорошая заготовка будет отображать ~ 1-10 частиц на экране в режиме реального времени, давая концентрацию в диапазоне 105-106. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Заткните кювету крышкой и проверьте наличие пузырьков. При необходимости выжмите пузырьки. Используйте безворсовую ткань, чтобы протереть внешние грани кюветы.
5. Процедура запуска прибора слежения за частицами
- Включите компьютерную рабочую станцию и прибор, подождите несколько минут до запуска первого образца и запустите программу, нажав на значок программного обеспечения. При появлении запроса нажмите NTA на экране, чтобы провести анализ отслеживания наночастиц. Начните с вкладки Запись и нажмите на различные вкладки программного обеспечения(Запись, Процесс, График),чтобы переключаться между ними по всему протоколу. Сначала запишите образец (разбок или подготовку к EV), затем обработайте записи и, наконец, настройте график результатов.
- Следуйте инструкциям на экране, чтобы заполнить всю необходимую информацию о образце. Убедитесь, что все необходимые поля заполнены и точны, например, название образца, описание, подготовка образца, коэффициент разбавления [1000], целевая температура (установлено на 22 °C) и разбавитель: выберите разбавитель из раскрывающегося меню и используйте PBS в качестве разбавителя для электромобилей. Выбор PBS из раскрывающегося меню автоматически заполнит соленость до 9%. Эта информация необходима для определения динамической вязкости жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться до 3 минут, чтобы температура уравновешивалась внутри кюветы, даже если зонд уже показывает желаемую температуру (т. Е. Зеленая точка становится стабильной). Показания образцов могут значительно варьироваться, если целевая температура не установлена, поскольку разница температур образца может значительно изменить броуновское движение частиц. - Откройте крышку инструмента и снимите защитное покрытие колпачка, где будет размещена кювета.
ВНИМАНИЕ: Прибор для отслеживания частиц сертифицирован как лазерный продукт класса 1 (21 CFR Ch. I часть 1040), содержащие лазеры, которые могут быть опасными и могут привести к серьезным травмам, таким как ожоги и / или необратимые повреждения зрения. Чтобы предотвратить несчастный случай или травму, не снимайте крышку прибора, откручивая болты сбоку. Отметим, что во время работы лазерные лучи полностью закрыты, не представляя угрозы для пользователей. Кроме того, магнитная предохранительная блокировка встроена в держатель образца прибора, чтобы предотвратить работу лазеров при снятии крышки держателя образца. - Поместите кювету (из шага 4.3) внутрь инструмента в правильной ориентации (см. рисунок 5). Установите колпачок на кювету и закройте крышку прибора. Всегда управляйте прибором с колпачком на месте над держателем образца. Не отключайте и не пытайтесь обойти функцию блокировки безопасности.
Рисунок 5:Правильная ориентация кюветы в приборе слежения за частицами. Лицевая часть кюветы (с видимой «выемкой» вставки) должна быть обращена к камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Включите камеру, щелкнув стрелку над Streaming.
- Щелкните стрелку шеврона, чтобы развернуть параметры записи. Установите значение коэффициента усиления и мощности лазера, соответствующего приложению. См. таблицу 1 (и дополнительный рисунок 1)для параметров, используемых для NTA малых (100 нм) электромобилей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти дополнительные настройки, доступные нажатием стрелки шеврона, могут быть защищены паролем. Используйте те же настройки для записи и обработки для разбойного (пустого), что и для последующих образцов. - Отрегулируйте фокус до тех пор, пока частицы не будут правильно сфокусированы. Фокусировка должна быть выполнена на относительно небольших частицах(рисунок 6). Для количественной оценки небольших EV (в соответствии с экзосомами) рекомендуются следующие настройки записи: Частота кадров: 30 кадров в секунду, Экспозиция: 15 мс, Время перемешивания: 5 с, Время ожидания: 3 с, Мощность лазера - синий: 210 мВт, Зеленый: 12 мВт, Красный: 8 мВт, Кадры на видео: 300 кадров и Усиление: 30 дБ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь может увеличить масштаб до 1x и / или увеличить усиление, чтобы помочь с фокусировкой. Не забудьте переуступить эти параметры на рекомендуемые значения перед записью видео.
Рисунок 6:Репрезентативные виды потокового потока, показывающие фокус частиц. (A) Пример просмотра в реальном времени частиц, не намечающихся в фокусе. Частицы имеют светящийся гало или кажутся размытыми. Отрегулируйте фокус. (B) Пример просмотра частиц в правильном фокусе в реальном времени. Мельчайшие частицы находятся в фокусе. Начните запись. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Выполните визуальную проверку качества, чтобы убедиться, что образец правильно разбавлен. Если образец слишком концентрирован, извлеките кювету из инструмента и последовательно разбавьте образец. Повторяйте до тех пор, пока образец не будет должным образом разбавлен, прежде чем перейти к шагу 6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не разбавляйте образец чрезмерно! Всегда делайте разведения последовательно. Идеальная заготовка будет отображать на экране только несколько частиц (1-4), как показано на рисунке 4. Что касается образцов EV, правильно разбавленный образец будет иметь примерно 20-100 частиц, видимых на экране, без светящихся или мутных изображений на заднем плане (см. Рисунок 7 в качестве примера). Это должно привести к оптимальной концентрации частиц в диапазоне от 5 х 106 до 2 х 108 частиц на мл (без поправки на коэффициент разрежения).
Рисунок 7:Репрезентативные представления потоков в реальном времени, изображающие различные разбавления частиц. (A) Пример просмотра в реальном времени слишком концентрированного образца. Запись слишком концентрированного образца даст неточные результаты. (B)Пример просмотра в реальном времени правильно разбавленного образца. На экране видно 60-100 частиц, и запись приводит к сырой концентрации 5 x 106- 2 x 108 частиц / мл. (C) Пример просмотра в реальном времени слишком разбавленного образца. Если образец настолько разбавлен, то не будет отслежено достаточное количество частиц, что уменьшит размер выборки и, следовательно, результаты будут статистически недействительными. В этом случае рекомендуется увеличить количество записанных видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
6. Сбор видеоданных
- (Необязательно) Установите значение масштаба 0,5x, чтобы сэкономить пропускную способность и предотвратить потерю кадров.
- Начните запись видео, нажав кнопку Запись (рекомендуемые параметры записи см. в таблице 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию инструмент будет перемешивать образец в течение 5 с, ждать 3 с, а затем записывать в течение 10 с, прежде чем повторить этот процесс. Типичное время измерения для 50 видео составляет ~ 15 минут для записи и ~ 13 минут для обработки. - Не прикасайтесь к инструменту во время записи видео. Убедитесь, что поверхность лабораторного стенда не вибрирует.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно, чтобы прибор устанавливался на антивибрационную платформу или стол для уменьшения любых вибрационных возмущений от близлежащего оборудования, которые будут мешать определению движения наночастиц. Избегайте работы центрифуг, вихревых смесителей или других потенциально виброгенерирующих устройств на том же стенде, что и прибор для отслеживания частиц. Вибрации легко видны на экране как удлинение обычно круглых частиц. При воздействии сильных вибраций прибор может потребовать перенастройки оптических элементов. Прибор не был предназначен для обслуживания или калибровки заказчиком; свяжитесь с производителем для технического обслуживания, обслуживания и калибровки. - Обратите внимание на любое записанное видео, в которое очень крупные частицы видны в виде больших, нерегулярных белых пятен. Удалите эти видео из обработки на шаге 7.3.
7. Обработка полученных данных
- Когда появится запрос о том, что видео было записано, нажмите кнопку ОК, чтобы завершить запись. Затем перейдите на вкладку Процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен здесь. Обработку полученных данных можно перезапустить позже, перейдя непосредственно на вкладку Процесс после открытия программного обеспечения прибора отслеживания частиц и указания каталога, в котором сохраняются записанные видео. - При анализе электромобилей установите флажок Отключить переопределение автоматического обнаружения и установите для параметра Диаметр компонента значение 30. Щелкните Обработать. (См. таблицу 2 для обработки настроек и дополнительный рисунок 2 для обработки дисплея). Отобразится график распределения в реальном времени, чтобы пользователь мог просматривать обработку в режиме реального времени.
- Для экзосом процесс с пороговым значением обнаружения, установленным на полидисперсный образецпо умолчанию. Обрабатывайте данные с помощью Руководства по порогу обнаружения, установленного на уровне 0,8 вместо стандартного порога 0,99, только для решений с очень большими различиями в размерах частиц.
- Если на каком-либо видео были видны заметно очень крупные частицы (см. Шаг 6.4), перейдите в каталог записанных видео и удалите проблемное видео. После редактирования списка видеофайлов измените количество записанных видео в других журналах, хранящихся у пользователя.
- После завершения обработки нажмите кнопку ОК. Затем выберите вкладку График. Для электромобилей отобразите основную диаграмму как LogBinSilica.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, на вкладке «График», пользователь может настроить другие функции графика, такие как определение диапазона оси x (диаметр частиц, нм), чтобы задать область интеграции для полученного рисунка.
8. Отображение и интерпретация результатов
- Чтобы создать отчет в формате PDF, нажмите кнопку Отчет. Теперь измерение завершено, и результаты можно просмотреть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте сначала записать и обработать пустой, чтобы можно было скорректировать фоновую концентрацию последующих образцов. Если этот этап забыт, заготовка может быть записана после образцов, а концентрация частиц образца скорректирована вручную. - Изучите отчет в формате PDF, в котором отображаются средний, медианный и режимный размер, а также концентрация, скорректированная на коэффициент разрежения и скорректированная путем вычитания концентрации частиц разбавителяющего фактора. Также показана ширина распределения (стандартное отклонение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует очень мало приложений, в которых одно значение является уместным и репрезентативным. Таким образом, рекомендуется описывать все распределение размеров и сообщать о ширине распределения для любой анализируемой выборки (как показано в таблице 3, например). - Запишите следующие настройки прибора, используемые для генерации данных, которые должны быть указаны при представлении результатов: Разбавлятель, мощность лазера каждого лазера [мВт], экспозиция [мс], усиление [дБ], частота кадров [fps], количество записанных видео, настройка обработки (например, LogBinSilica), диапазон интеграции [мин нм, макс нм] (рекомендуется установить минимум до 50 нм) и количество отслеживаемых частиц (желательно проанализировать не менее ~ 150 частиц на видео; минимум 3 750 общих треков на образец рекомендуется избегать артефактных всплесков в распределении частиц по размерам и генерировать статистически значимые данные).
9. Чистка кювет
- Очищайте кюветы вручную между образцами. Во-первых, опустошите кювету.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может быть извлечен из кюветы и сохранен или выброшен. - Как только кювета опустеет, очистите кювету, промыв ее 10-15 раз деионизированной (DI) водой. Затем промыть 3 раза этанолом (70-100%). При этом обязательно полностью заполните кювету растворителем.
- Высушите внешнюю сторону кюветы безворсовой салфеткой из микрофибры. Избегайте пятен на поверхностях. Высушите внутреннюю часть кюветы на воздухе или высушите с помощью пылесборника сжатого воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для протирания оптических поверхностей кюветы следует использовать только бумагу для чистки линз или ткань из микрофибры без ворса, так как большинство бумажных изделий содержат небольшие древесные волокна, которые могут поцарапать или повредить поверхность кюветы. - Приготовьте два стеклянных сцинтилляционных флакона: один заполнен 70-100% этанолом, а другой водой DI. Сначала промойте вкладыши и перемешайте батончики в этаноле (затем в воде DI), поместив вставку/перемешиваемий батончик в соответствующий сцинтилляционный флакон и энергично встряхнув флакон. Высушите вставки и перемешиватели с помощью безворсовых тряпок или пылесосов для сжатого воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кювету и вставку также можно очистить с помощью водяной бани с ультразвуком. Для этого сначала убедитесь, что блок ультразвука содержит достаточно воды (глубина не менее 5 см). Затем поместите кювету и вставьте внутрь стеклянный стакан (50 мл или больше), наполните стакан спиртом до того же уровня, что и водяная баня, поместите стакан в воду и включите питание. Соник в течение максимум 5 минут за раз, что позволяет машине отдыхать >5 минут между каждым 5-минутным всплеском, если требуется больше времени. - Когда закончите, немедленно уберите все очищенные и высушенные компоненты для хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед этой демонстрацией калибровка прибора была сначала протестирована для обеспечения достоверности полученных данных путем измерения распределения по размерам стандартов полистирольных шариков. Мы протестировали распределение размеров бусин 100 нм и 400 нм с использованием параметров записи по умолчанию и настроек обработки, рекомендованных в этом протоколе(рисунок 8).
Для стандарта на полистирольные шарики 100 нм была измерена концентрация 4,205 х10 7 частиц/мл. Средний (стандартное отклонение, SD) размер составил 102 (±17) нм с коэффициентом вариации (CV) 0,16. Значения D10/D50/D90 составляли 76/104/126 нм. Это указывает на то, что прибор для отслеживания частиц точно сообщил размер монодисперсных шариков 100 нм. Для стандарта на полистирольные шарики 400 нм концентрация составляла 4,365 x 107 частиц/мл. Средний (SD) размер составил 391 (±47) нм, с CV 0,12. Значения D10/D50/D90 составляли 150/358/456 нм(таблица 3). Хотя сообщаемое среднее очень близко к истинному размеру бусин, мы можем видеть, что настройки прибора, применяемые в этом протоколе, более точны для более мелких частиц ~ 100 нм. Так, для частиц размером более 400 нм предлагается оптимизация параметров лазера. Исследователи должны сначала провести такой метод, как просвечивающая электронная микроскопия (TEM) для оценки результирующего распределения по размерам EV из данного источника и метода изоляции до NTA.
Средняя концентрация 4,41 х 1010 частиц/мл была измерена для образца EV ткани мыши, используемого для этой демонстрации. Этот образец был записан в соответствии с параметрами, обобщенными в таблице 1, и обработан в соответствии с параметрами, указанными в таблице 2. Мы демонстрируем влияние различных коэффициентов разрежения на рисунке 9 и сообщаем о концентрациях сырых и скорректированных частиц в таблице 4. Оптимальное разведение для эб-цепей, полученных из тканей мыши, составляло от 1000 до 3000, тогда как для ev, полученных из плазмы человека, оно составляло 1000, что указывает на то, что при первом тестировании данного источника биотекучих или метода изоляции EV для NTA следует тестировать последовательные разведения, чтобы можно было определить оптимальное разведение для измерения NTA. Мы рекомендуем измерять и сообщать по крайней мере о двух различных разведениях образца. Мы также измерили четыре дополнительных образца при различных разведениях на двух различных приборах отслеживания частиц. На дополнительном рисунке 3 сравнивается точность измерения размера прибора отслеживания частиц с другим коммерчески доступным прибором NTA. Дополнительная таблица 1 дополнительно демонстрирует точность измерений этого прибора, показывая, что концентрация частиц изменялась пропорционально разбавлению пробы, но что измерения размера частиц этого не делали.
После обработки результаты (вместе с информацией об приборе /программном обеспечении, настройками записи и обработки, а также экспериментальными заметками) могут быть сохранены в отчете .pdf. Гистограмма, включенная в этот отчет, может быть изменена, как описано в протоколе (раздел 7.4). Необработанные результаты сохраняются в .dat файле, который можно экспортировать. Записанные видео также сохраняются и могут быть использованы для последующей обработки и анализа в оффлайне. Однако после записи видео настройки записи не могут быть изменены ретроспективно.
Влияние изменения различных мощностей лазера и усиления в настройках записи было продемонстрировано с использованием электромобилей, полученных из плазмы человека. Это визуализировано на рисунках 10-12, а количественная информация, основанная на этих изображениях, показана в таблице 5. Увеличение коэффициента усиления увеличивает чувствительность камеры, позволяя визуализировать более мелкие частицы(рисунок 10),что приводит к увеличению общей концентрации частиц с меньшим средним размером частиц(таблица 5). Однако увеличение коэффициента усиления выше 30 дБ (наши рекомендации) делает представление слишком зернистым, позволяя шуму скрывать измерение истинных частиц. При коэффициенте усиления камеры 30 дБ эффект изменения мощности синего лазера изображен на рисунке 11. Увеличение мощности синего лазера (450 нм, короткая длина волны) приводит к большему разрешению для обнаружения меньших частиц (то есть тех, которые соответствуют размеру экзосом). Сохраняя мощность зеленого и красного лазера постоянной в настройках по умолчанию, увеличивая мощность синего лазера с 70 мВт до 210 мВт, сообщалось о среднем размере частиц со 122 нм до 105 нм и увеличивая общую концентрацию частиц с 1,1 x 108 до 1,7 x 108 (таблица 5).
Также был продемонстрирован эффект увеличения мощности зеленого и красного лазера(рисунок 12). Увеличение мощности красного лазера (650 нм, длинная длина волны) увеличило зарегистрированный средний размер частиц со 175 до 246 нм. Сообщенная общая концентрация частиц уменьшилась, но это связано с тем, что в этом образце EV плазмы человека у нас не было много крупных частиц, подтвержденных отрицательным окрашиванием TEM(дополнительный рисунок 4). Увеличение мощности зеленого лазера привело к уменьшению зарегистрированного среднего размера частиц и увеличению общей концентрации частиц. Таким образом, пользователь может оптимизировать мощность трех лазеров для чувствительного обнаружения частиц различных размеров.
Этот протокол оптимизирован для небольших везикул (например, <400 нм). Исследователям, заинтересованным в микровезикулах больших размеров (например, 400-1000 нм), рекомендуется оптимизировать параметры лазера с использованием полых кремнийорганических шариков, которые обладают светорассеивающими свойствами, аналогичными свойствам электромобилей, что делает их более подходящим эталоном, чем стандарты полистирола или кварцевого бисера30. Тем не менее, наночастицы кремнезема могут быть лучшим практическим заменителем до тех пор, пока стандарты на кремнийорганические органы не станут более доступными.
Здесь инструмент NTA был использован для успешной количественной оценки электромобилей, выделенных из ткани мыши путем ультрацентрифугирования и плазмы человека с использованием коммерческого набора. Эффекты изменения параметров NTA были проиллюстрированы и показали, что параметры в этом протоколе оптимизированы для небольших везикул. Была также показана важность этапа разбавления, которая показывает, что показанный здесь прибор для отслеживания частиц может точно обнаруживать изменения коэффициентов разрежения. Концентрация изменялась пропорционально при многократном разбавлевании, в то время как распределение по размерам не изменялось. Полученные данные показали небольшую техническую изменчивость. Таким образом, адаптация этого протокола исследователями, использующими этот инструмент для NTA, повысит строгость и воспроизводимость в области исследований EV.
Рисунок 8:Распределение частиц по размерам монодисперсных полистирольных шариков стандартов. (A) Распределение частиц по размерам 100 нм полистирольных шариков стандарта. (B) Распределение частиц по размерам 400 нм из полистирольного шарика стандарта. Значения приведены в таблице 3. Inset показывает пример просмотра потока в реальном времени первого измеренного кадра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9:Общие концентрации частиц в сыром виде по коэффициенту разбавления для э-ов перигонадной жировой ткани мыши. Полосы погрешности представляют стандартное отклонение. Для каждого разбавления было проведено три измерения. Значения приведены в таблице 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10:Визуальное воздействие увеличения усиления. Репрезентативные изображения частиц, измеренные с помощью лазерных настроек по умолчанию (синий = 70 мВт, зеленый = 12 мВт, красный = 8 мВт) и коэффициент усиления, установленный на (A) 18 дБ, (B) 24 дБ - по умолчанию, и(C) 30 дБ - рекомендуется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11:Влияние синего лазера на мелкие частицы, когда красный и зеленый лазеры установлены на настройки по умолчанию. (A) Синий лазер = 70 мВт (по умолчанию). (B) Синий лазер = 210 мВт (рекомендуется). Больше мелких частиц видно и находится в фокусе, когда мощность синего лазера увеличивается до 210 мВт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 12:Визуальное воздействие измененной мощности синего, зеленого и красного лазера. Репрезентативные виды экрана в реальном времени отображают различные размеры частиц, визуализированные в различных лазерных настройках. Результирующие значения NTA представлены в таблице 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Частиц | Диаметр [нм] | Синий лазер [мВт] | Зеленый лазер [мВт] | Красный лазер [мВт] | Коэффициент усиления камеры [дБ] | Регулирование температуры | Обработка | # Видео |
| Экзосомы | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Включено, установлено значение 22 ºC | Отключенное автоматическое переопределение обнаружения | 50 |
Таблица 1: Параметры записи для малых внеклеточных везикул (~100 нм).
| Описание процесса | Порог обнаружения | Отключение переопределения автоматического обнаружения | Диаметр характеристики [px] |
| Экзосомы | Полидисперсный образец | Проверенный | 30 |
Таблица 2: Параметры обработки для малых внеклеточных везикул (~100 нм).
| Размер полистирола стандартный [нм] | Диапазон интеграции [нм] | Средний размер [нм] | Размер SD [нм] | Резюме размера | D10 [нм] | D50 [нм] | D90 [нм] | Всего подсчетов |
| 100 | от 50 до 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 до 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Таблица 3: Результаты НТА стандартов монодисперсных полистирольных шариков. Оба стандарта были оптимально разбавлены, с необработанными концентрациями для стандарта 100 нм и стандарта 400 нм 4,205 x10 7 частиц/мл и 4,365 x 107 частиц/мл, соответственно. D10 - это точка в распределении размеров, где содержится 10% образца, D50 - точка, где содержится 50% образца (медиана), а D90 - точка, где содержится 90% образца. SD: Стандартное отклонение; CV: Коэффициент вариации.
| Коэффициент разбавления | Концентрация частиц, частиц/мл | Общая концентрация частиц, частиц/мл |
| Сырой | С поправкой на коэффициент разрежения | |
| 1000 | 4.10Е+07 | 4.10Е+10 |
| 4.00Е+07 | 4.00Е+10 | |
| 3.70Е+07 | 3.70Е+10 | |
| среднее (SD) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3.93E+10 (1.70E+09) |
| 1500 | 3.60Е+07 | 5.40Е+10 |
| 2.60Е+07 | 3.80Е+10 | |
| 2.90Е+07 | 4.40Е+10 | |
| среднее (SD) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4.55E+10 (6.60E+09) |
| 2000 | 2.40Е+07 | 4.80Е+10 |
| 2.30Е+07 | 4.60Е+10 | |
| 2.00Е+07 | 4.00Е+10 | |
| среднее (SD) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4.46E+10 (3.40E+09) |
| 3000 | 2.00Е+07 | 6.00Е+10 |
| 1.30E+07 | 3.90Е+10 | |
| 1.40Е+07 | 4.20Е+10 | |
| среднее (SD) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4.71E+10 (9.27E+09) |
Таблица 4: Результаты NTA перигонадальных ev жировой ткани мышей демонстрируют воспроизводимость измерений NTA. Концентрации частиц NTA в сыром виде (частицы/мл), измеренные на приборе слежения за частицами, и общая концентрация частиц (частиц/мл), скорректированная на коэффициент разбавления EV, полученных из перигонадной жировой ткани мыши при различных разведениях.
| Коэффициент усиления [дБ] | Синий лазер [мВт] | Зеленый лазер [мВт] | Красный лазер [мВт] | Общая концентрация, частиц/мл (в сыром виде) | Средний размер [нм]* | Стандартное отклонение размера / CV | Модальный размер | Д10 / Д50 / Д90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5.90Е+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00Е+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10Е+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00Е+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00Е+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2.80Е+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40Е+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1.50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20Е+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Интегрирован в диапазоне 50-1000 нм | ||||||||
Таблица 5: Результаты NTA электромобилей, полученных из плазмы человека, демонстрируют влияние изменения мощности и усиления лазера на измерения размера и концентрации частиц человеческих EV (разбавление 1:1000). D10 - это точка в распределении размеров, где содержится 10% образца, D50 - точка, где содержится 50% образца (медиана), а D90 - точка, где содержится 90% образца. SD: Стандартное отклонение; CV: Коэффициент вариации.
Дополнительный рисунок 1: Снимок экрана панели записи с рекомендуемыми параметрами записи. Получите доступ к дополнительным настройкам, чтобы изменить коэффициент усиления камеры и мощность лазера на рекомендуемые настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Снимок экрана панели обработки с рекомендуемыми настройками обработки. Убедитесь, что установлен флажок «Отключить переопределение автоматического обнаружения», а для параметра «Диаметр компонента» установлено значение «30». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Измерение размера частиц в нескольких разбавлениях: точность прибора отслеживания частиц (ViewSizer 3000) по сравнению с сопоставимым коммерческим прибором NTA (NanoSight NS300). NTA EV, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши, проводили на двух инструментах. Для каждой мыши было измерено три разведения (1:1000, 1:500, 1:100). Необработанные значения для мер, принятых на ViewSizer 3000 (продемонстрированных в настоящем протоколе), приведены в дополнительной таблице 1. Параметры захвата и анализа для мер NanoSight NS300 показаны в дополнительной таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Репрезентативная электронная микроскопия с отрицательным пятном (ТЭМ) электромобилей, полученных из плазмы человека. Сетки были сфотографированы с помощью просвечивающего электронного микроскопа, работающего при ускоряющих напряжениях 100 кВ. Изображения были сделаны на ПЗС-камеру 2K x 2K. Шкала отражает увеличение на камере. Электронные микроснимки показывают круглые везикулы ~ 25 нм в диаметре. Увеличение 100k, шкала 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Измерение размера и концентрации частиц ViewSizer 3000 в перигонадных эпах жировой ткани мыши в нескольких разведениях. Проводили NTA EV, выделенных из перигонадальной жировой ткани мыши. Для каждой мыши было измерено три разведения (1:1000, 1:500, 1:100). D10 - это точка в распределении размеров, где содержится 10% образца, D50 - точка, где содержится 50% образца (медиана), а D90 - точка, где содержится 90% образца. Концентрации частиц скорректированы фоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 2: Настройки захвата и анализа NanoSight NS300. Настройки (с использованием NTA 3.4 Build 3.4.003), используемые для измерения перигонадальной жировой ткани мыши EV образцов, представленных на дополнительном рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем протокол для NTA электромобилей для измерения распределения по размерам широкого диапазона размеров частиц одновременно и измерения общей концентрации EV в полидисперсном образце. В этом исследовании перигонадная жировая ткань мыши и плазма человека были использованы в качестве источника EV. Тем не менее, EV, выделенные из других тканей или биологических жидкостей, таких как сыворотка, моча, слюна, грудное молоко, амниотическая жидкость и супернатант клеточной культуры, также могут быть использованы для NTA. Измерения стандартов полистирольных шариков обеспечили правильную калибровку прибора и продемонстрировали, что этот инструмент NTA может правильно измерять размер наночастиц ≤400 нм. Затем были протестированы различные разведения образца EV ткани мыши. Как показано на рисунке 9,сообщаемая концентрация частиц масштабируется соответственно коэффициенту разрежения, как и ожидалось, демонстрируя, что прибор может точно обнаруживать концентрацию частиц при различных разбавлениях с небольшой изменчивостью между техническими репликами. Однако это было при работе с концентрациями частиц в пределах рабочего диапазона прибора (от 5 х 106 до 2 х 108 частиц на мл); надлежащее разбавление образца является критически важным шагом в протоколе. Корректировка коэффициента разрежения дала примерно такую же оценку общей концентрации частиц в образце, при этом CV составил 15,1 по четырем испытанным разбавлениям. Кроме того, различные показатели, повторенные при многократном разбавлении одних и тех же образцов, показали точность оценок распределения частиц по размерам, поскольку концентрации частиц масштабировались пропорционально коэффициенту разрежения, но сообщали о размерах, но сообщали о размерах.
Электромобили в суспензии подвергаются случайному тепловому движению, известному как броуновское движение, согласно которому диффузия частиц в жидкой суспензии обратно пропорциональна их размеру. Это случайное движение моделируется уравнением Стокса-Эйнштейна, где гидродинамический диаметр D сферической частицы составляет:
Где kB — постоянная Больцмана, а R — радиус частицы. Как видно из уравнения, движение частиц в суспензии также зависит от температуры(T)и динамической вязкости(η)жидкости. Во время NTA электромобили облучаются сфокусированными лазерными лучами, которые проходят через частицы в суспензии и обнаруживаются падежной подсветкой, исходящей от лазеров. Свет, рассеянный каждой отдельной частицей, фокусируется микроскопом на датчике изображения камеры с высоким разрешением, светочувствительной к зарядовой цепи (ПЗС), которая записывает цифровые изображения рассеянного света частиц(рисунок 1). Программное обеспечение NTA идентифицирует и отслеживает броуновское движение каждой отдельной частицы для расчета коэффициента диффузии каждой частицы. Это используется вместе с температурой и вязкостью жидкости, содержащей частицы, для расчета диаметра частиц с использованием уравнения Стокса-Эйнштейна. Таким образом, одно измерение может определить две критические части информации: распределение частиц по размерам и общее количество частиц EV в суспензии.
Сравнение NTA с другими методами обнаружения и количественной оценки ЭЛЕКТРОМОБИЛей было описано в другом месте31,32. По сравнению с другими методами, основанными на рассеянии света, такими как динамическое рассеяние света (DLS), NTA обладает более высокими разрешающими способностями и является особенно мощным методом анализа частиц со средним диаметром менее 100 нм. В отличие от аналитики с одной частицей, такой как TEM, NTA не занимает много времени или технически не является сложной задачей и может фенотипизировать весь образец в относительно небольшом объеме одновременно полуавтоматическим способом. Хотя NTA является мощным методом характеристики, у него есть ограничения. Во-первых, NTA подвержена ограничениям чувствительности из-за сильного снижения интенсивности рассеянного света с диаметром частиц, в результате чего рассеянный свет очень мелких частиц исчезает ниже фонового шума33. Таким образом, NTA снижает чувствительность для электромобилей менее ~ 50 нм31 и приводит к переоценке размеров EV. Коротковолновые лазеры необходимы для обнаружения более мелких частиц полидисперсного образца из-за их потенциала рассеяния света. Тем не менее, этот инструмент отслеживания частиц предлагает улучшение этого ограничения, присущего технологии отслеживания наночастиц. Оснащенная тремя переменными источниками света (450 нм, 520 нм, 635 нм), эта система позволяет визуализировать частицы в широком диапазоне размеров, что делает этот инструмент особенно ценным инструментом для анализа NTA полидисперсных образцов, таких как гетерогенная популяция электромобилей. Тем не менее, поскольку большинство ev preps будут полидисперсными по составу и, вероятно, содержат примеси, исследователи должны знать, что зависящие от образца пределы обнаружения влияют на форму общего распределения размеров и, следовательно, проявлять осторожность при интерпретации результатов.
Еще одним серьезным ограничением NTA является то, что он измеряет больше, чем просто электромобили. Инструмент NTA будет обнаруживать, измерять и подсчитывать все частицы, превышающие предел обнаружения, включая белковые агрегаты, липопротеины, клеточный мусор и загрязнение, вызванное разбокрушителями. Однако концентрацию частиц в фоновом режиме можно скорректировать путем измерения концентрации частиц разбойника перед загрузкой и измерением образца. Мы рекомендуем использовать фильтрованный PBS не менее 0,02 мкм и обнаружили очень низкое загрязнение частицами при использовании фильтроованного PBS с 3 кДа. Кроме того, можно расширить NTA для измерения и анализа флуоресцентно меченых электромобилей, преодолевая ограничение неспецифических измерений. Доступны коммерческие наборы, которые специально и эффективно окрашивают мембраны только интактных везикул, исключая фрагменты мембран, белковые агрегаты и другие частицы из измерения NTA. Таким образом, данные, полученные из флуоресцентных NTA, более точно представляют истинную концентрацию EV и распределение по размерам. Благодаря селективной маркировке поверхностных антигенов EV флуоресцентный NTA также может измерять специфические EV, помеченные флуоресцентно мечеными антителами, что позволяет подсчитывать и измерять антиген-специфические, биологически значимые субпопуляции EV.
Было проведено мало работы по стандартизации протоколов NTA, что затрудняет сопоставимость результатов и препятствует воспроизводимости между образцами, днями, операторами и лабораториями. Инструмент отслеживания частиц, продемонстрированный в этом протоколе, требует мало практического времени. Мы также отметили, о каких настройках приборов пользователи должны сообщать, чтобы облегчить воспроизводимость генерируемых данных. Таким образом, следование оптимизированным протоколам, изложенным здесь, должно привести к стандартизации и позволить сравнивать результаты между лабораториями. Еще одним преимуществом использования этого инструмента является то, что образец готовится в кювете, что позволяет инструменту многократно перемешиваться между видео, обеспечивая статистически случайную выборку для каждого видео и давая более воспроизводимый результат, чем другие коммерчески доступные инструменты NTA, которые полагаются на шприцевые насосы и проточные ячейки. Кроме того, несколько лазеров позволяют обнаруживать частицы с различными показателями преломления, что дает более надежные результаты. Тем не менее, работа этого инструмента отслеживания частиц не требует знания свойств материала частиц, таких как показатель преломления, что делает измерения более воспроизводимыми между операторами.
Электромобили были идентифицированы почти во всех биожидях, протестированных2,5. Однако эффективная изоляция специфических EV (например, специфических для клеточного типа EV) из различных сред (например, крови, грудного молока, сред клеточных культур) представляет собой сложную задачу. Описано множество различных методов изоляции электромобилей9. NTA может быть выполнен для сравнения выходов ev, выделенных с использованием различных методов, и выявления вариаций в везикулах, которые возникают в результате различных методов изоляции. Это важно для интерпретации последующих результатов, так как в настоящее время функция различных субпопуляций EV остается неясной. Точное измерение концентрации EV также важно в исследованиях, изучающих, влияет ли определенное лечение, состояние или молекула на высвобождение EV. Например, наша группа заинтересована в влиянии воздействия окружающей среды, такого как загрязнение воздуха твердыми частицами, на содержание и выбросы электромобилей. Чтобы оценить, влияет ли состояние на высвобождение EV, количество везикул должно быть точно количественно определено. При использовании EV в качестве диагностических биомаркеров концентрация EV в образце может повлиять на результаты анализа. Таким образом, надежный метод определения концентрации частиц и распределения по размерам имеет решающее значение.
Несмотря на это, измерения NTA должны сопровождаться другими дополнительными методами, которые могут измерять частицы независимо от других частиц в образце, таких как ТЕА. Новые технологии, такие как микрофлюидное резистивное импульсное зондирование (MRPS), также перспективны для определения размеров и подсчета электромобилей независимо от полидисперсности образца. Дальнейшие биохимические или протеомные анализы образцов EV могут быть использованы в дополнение к данным о размере и концентрации для кластеризации подмножеств EV в популяции биологического значения. В заключение, измерение допустимых и воспроизводимых концентраций частиц и распределения частиц по размерам имеет важное значение для поля EV. ViewSizer 3000 обеспечивает точные и воспроизводимые измерения общей концентрации EV и распределения EV по размерам даже для образцов с высоким полидисперсом, как показано здесь. В будущем мы надеемся увидеть дальнейшие строгие экспериментальные сравнения этого инструмента с другими инструментами NTA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявили, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Мы благодарим Джеффри Бодикомба, доктора философии HORIBA Instruments Incorporated, за его помощь в калибровке прибора.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
