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Biology

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के क्वांटिफिकेशन और आकार निर्धारण के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण

Published: March 28, 2021 doi: 10.3791/62447
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Department of Environmental Health Sciences, Columbia University Mailman School of Public Health, 2Department of Medicine, Naomi Berrie Diabetes Center, Columbia University

Summary

हम माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक और मानव प्लाज्मा से अलग किए गए आकार वितरण और बाह्यसील वेसिकल के कुल कण एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए एक उपन्यास नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण उपकरण का उपयोग कैसे करते हैं।

Abstract

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) की शारीरिक और रोगविज्ञानी भूमिकाएं तेजी से पहचानी जा चुकी हैं, जिससे ईवी क्षेत्र अनुसंधान का एक त्वरित रूप से विकसित होता है। ईवी अलगाव के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं, प्रत्येक में अलग-अलग फायदे और नुकसान हैं जो ईवी की डाउनस्ट्रीम उपज और शुद्धता को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, एक चुने हुए विधि द्वारा दिए गए स्रोत से अलग ईवी तैयारी की विशेषता डाउनस्ट्रीम परिणामों की व्याख्या और प्रयोगशालाओं में परिणामों की तुलना के लिए महत्वपूर्ण है। ईवीएस के आकार और मात्रा का निर्धारण करने के लिए विभिन्न तरीके मौजूद हैं, जिन्हें रोग राज्यों द्वारा या बाहरी परिस्थितियों के जवाब में बदला जा सकता है। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) व्यक्तिगत ईवीएस के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रमुख प्रौद्योगिकियों में से एक है। यहां, हम इस क्षेत्र में प्रमुख प्रगति का प्रतिनिधित्व करने वाली एनटीए के लिए एक सफलता प्रौद्योगिकी का उपयोग करके माउस पेरिगोनाडल एडिपोस ऊतक और मानव प्लाज्मा से अलग ईवीएस के परिमाणीकरण और आकार निर्धारण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। परिणाम दर्शाते हैं कि यह विधि विभिन्न तरीकों का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से अलग ईवीएस के लिए प्रजनन योग्य और वैध कुल कण एकाग्रता और आकार वितरण डेटा प्रदान कर सकती है, जैसा कि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई है। एनटीए के लिए इस उपकरण के अनुकूलन से ईवी अनुसंधान में कठोरता और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए एनटीए विधियों में मानकीकरण की आवश्यकता का समाधान होगा ।

Introduction

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) छोटे (0.03-2 माइक्रोन) झिल्ली से बंधे वेसिकल्स हैं जो लगभग सभी सेल प्रकार1द्वारा स्रावित होते हैं। उन्हें अक्सर रिलीज और आकार 2 के उनके तंत्र के आधार पर "एक्सोसोम्स," "माइक्रोवेसिकल्स" या "एपोप्टिक बॉडी" के रूप में जानाजाताहै। हालांकि शुरू में यह सोचा गया था कि ईवीएस बस होम्योपैथी3को बनाए रखने के लिए सेल से कचरे को नष्ट करने का एक साधन था, अब हम जानते हैं कि वे डीएनए, आरएनए (एमआरएनए, माइक्रोआरएनए), लिपिड, और प्रोटीन4,5 सहित आणविक सामग्री के हस्तांतरण के माध्यम से अंतरकोशिकीय संचार में भी भाग ले सकते हैं - और वे सामान्य शरीर विज्ञान के साथ-साथ पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामक हैं1, 5,6,7,8.

ईवीएस को अलग-थलग करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं, जिन्हें कहीं और9,10,11,12वर्णित किया गया है। अलगाव प्रोटोकॉल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से EVs के स्रोत का इस्तेमाल किया बहुत EV उपज और शुद्धता को प्रभावित कर सकते हैं । यहां तक कि अंतर अपकेंद्रित्र, लंबे समय से एक्सोसोम अलगाव के लिए "सोने के मानक" दृष्टिकोण माना जाता है, पर्याप्त परिवर्तनशीलता के अधीन किया जा सकता है बाद में प्राप्त EV आबादी को प्रभावित करने और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण13। इस प्रकार, ईवी अलगाव और मात्राकरण के विभिन्न विभिन्न तरीकों से साहित्य में सूचित प्रयोगों के परिणामों की तुलना करना, पुन: पेश करना और व्याख्या करना मुश्किल होजाताहै। इसके अलावा, ईवी रिलीज को सेलुलर स्थितियों या विभिन्न बाहरी कारकों द्वारा विनियमित किया जा सकता है। यह सुझाव दिया गया है कि ईवीएस इंट्रासेलुलर तनाव15के खिलाफ कोशिकाओं की रक्षा करके सेलुलर होमोस्टेसिस को बनाए रखने में भूमिका निभाते हैं, क्योंकि कई अध्ययनों से पता चला है कि सेलुलर तनाव ईवी स्राव को उत्तेजित करता है। उदाहरण के लिए, हाइपोक्सिया, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव, ऑक्सीडेटिव तनाव, यांत्रिक तनाव, सिगरेट के धुएं के निकालने और कण पदार्थ वायुप्रदूषण16, 17,18,19,20,21, 22के सेलुलर एक्सपोजर के बाद बढ़ी हुई ईवी रिलीज की सूचना दी गई है। ईवी रिलीज को भी वीवो में संशोधित किया गया है; चूहों एक उच्च वसा आहार या सोलह घंटे के लिए उपवास के अधीन अधिक adipocyte EVs23जारी . यह जांचने के लिए कि क्या कोई विशिष्ट उपचार या स्थिति ईवी रिलीज को बदल देती है, ईवीएस की संख्या सही रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। ईवी आकार वितरण का आकलन भी ईवीएस के प्रमुख उपकोशिकीय मूल का संकेत हो सकता है (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली बनाम प्लाज्मा झिल्ली के नवोदित के साथ देर से एंडोसोम/मल्टीवेस्कुलर निकायों का संलयन)24। इस प्रकार, कुल एकाग्रता और ईवी प्रेप के आकार वितरण का अध्ययन करने के लिए सटीक रूप से मापने के लिए मजबूत तरीकों की आवश्यकता है।

समाधान में ईवीएस के विज़ुअलाइज़ेशन और लक्षण वर्णन के लिए एक तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील तरीका नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) है। इस विधि के सिद्धांतों और ईवी आकार और एकाग्रता के आकलन के लिए वैकल्पिक तरीकों से तुलना की विस्तृत व्याख्या पहले25 , 26,27,28बताई गई है . संक्षेप में, एनटीए माप के दौरान, ईवीएस को लेजर बीम के साथ विकिरणित होने पर बिखरे हुए प्रकाश द्वारा कल्पना की जाती है। बिखरे हुए प्रकाश एक कैमरे पर एक माइक्रोस्कोप द्वारा केंद्रित है जो कण आंदोलन को रिकॉर्ड करता है। एनटीए सॉफ्टवेयर प्रत्येक कण की यादृच्छिक थर्मल गति को ट्रैक करता है, जिसे ब्राउनियन मोशन के नाम से जाना जाता है, प्रसार गुणांक का निर्धारण करने के लिए जो स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक कण के आकार की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एनटीए को सबसे पहले 201125में जैविक नमूने में ईवीएस के मापन के लिए लागू किया गया था । हाल ही में जब तक, व्यूसाइजर 3000(इसके बाद कण ट्रैकिंग उपकरण के रूप में संदर्भित) की शुरूआत तक वाणिज्यिक एनटीए उपकरणों की पेशकश करने वाली केवल दो मुख्यधारा की कंपनियां थीं, जो अन्य एनटीए तकनीकों की महत्वपूर्ण सीमाओं को दूर करने के लिए उपन्यास हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर समाधानों के संयोजन का उपयोग करती हैं।

कण ट्रैकिंग उपकरण उनके ब्राउनियन गति का विश्लेषण करके तरल नमूनों में नैनोकणों की विशेषता है और गुरुत्वाकर्षण बसने का विश्लेषण करके बड़े माइक्रोन आकार के कणों की विशेषता है । इस उपकरण की अनूठी ऑप्टिकल प्रणाली, जिसमें तीन लेजर प्रकाश स्रोतों (450 एनएम, 520 एनएम और 635 एनएम) के साथ बहुस्पेक्ट्रल रोशनी शामिल है, शोधकर्ताओं को एक साथ कण आकार (जैसे, एक्सोसोम्स, माइक्रोवेसिकल्स) की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। चित्र 1 में इंस्ट्रूमेंट सेटअप का एक योजनाबद्ध दिखायागया है ।

यहां, हम एक उपन्यास एनटीए उपकरण का उपयोग करके अलग माउस और मानव ईवीएस के कण आकार वितरण और एकाग्रता माप का प्रदर्शन कैसे करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:कण ट्रैकिंग उपकरण ऑप्टिकल प्रणाली। एनटीए उपकरण निम्नलिखित तरंगदैर्ध्य के साथ तीन लेजर का उपयोग करके कणों को रोशन करता है: 450 एनएम, 520 एनएम, 635 एनएम। अलग-अलग कणों से बिखरे हुए प्रकाश की वीडियो रिकॉर्डिंग का पता लगाया जाता है और क्यूवेट से 90 डिग्री उन्मुख डिजिटल वीडियो कैमरा द्वारा ट्रैक किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

इन नमूनों के साथ सभी कार्य संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति और संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशा-निर्देशों के अनुपालन में किए गए थे । एनटीए विधि का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 2में दर्शाया गया है ।

Figure 2
चित्रा 2:कण ट्रैकिंग उपकरण का उपयोग कर एनटीए विधि का अवलोकन। नमूना तैयार किया जाता है और उपकरण में डाला जाता है। एनटीए सॉफ्टवेयर खोला जाता है, रिकॉर्डिंग मापदंडों को समायोजित किया जाता है, और नमूना केंद्रित होता है। फिर, डेटा रिकॉर्ड किया जाता है, संसाधित किया जाता है, और प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. एक्सेरैलुलर वेसिकल आइसोलेशन

नोट: माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक EVs के रूप में पहले23वर्णित अलग थे । प्लाज्मा ईवीएस को निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव प्लाज्मा के 1 एमएल से अलग किया गया था:

  1. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर प्लाज्मा और अपकेंद्रित्र ले लीजिए। सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि अतिरिक्त मलबे का पता लगाने योग्य रहता है, तो 12,000 x ग्राम पर अतिरिक्त 10 मिनट के लिए सुपरनैंट को अपकेंद्री करें और सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. प्लाज्मा के प्रति 250 माइक्रोन एक्सोसोम आइसोलेशन रिएजेंट के 67 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब को उलटा या फ्लिक करके अच्छी तरह मिलाएं।
  3. 30 मिनट के लिए सीधे बर्फ पर इनक्यूबेट।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर एक्सोसोम आइसोलेशन रिएजेंट/प्लाज्मा मिश्रण को अपकेंद्रित्र करें।
    नोट: अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान या इसी तरह के परिणामों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जा सकता है, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस पसंद किया जाता है। अपकेंद्रित्र के बाद, ईवी ट्यूब के नीचे बेज या सफेद गोली के रूप में दिखाई दे सकता है।
  5. ध्यान से सुपरनेट से आकांक्षी। किसी भी अवशिष्ट एक्सोसोम अलगाव समाधान को स्पिन करें और आकांक्षा द्वारा तरल पदार्थ के सभी निशान हटा दें, जिससे गोली में उपजी ईवीएस को परेशान न किया जा सके।
  6. बफर बी (निर्माता द्वारा प्रदान की गई) के 200 माइक्रोल में गोली को फिर से खर्च करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, फ्लोरोमीटर, ब्रैडफोर्ड परख, या अन्य पसंदीदा विधि का उपयोग करके नमूने की प्रोटीन एकाग्रता (चरण 2.8 के लिए) को मापें और रिकॉर्ड करें।

2. अलग ईवीएस का शुद्धिकरण

  1. फिर से निलंबित EVs के लिए बफर ए (निर्माता द्वारा प्रदान की गई) के 200 μL जोड़ें।
  2. शुद्धिकरण कॉलम (प्रदान) को बाहर निकालें, स्क्रू कैप को ढीला करें, और नीचे बंद होने से स्नैप करें। कॉलम को एक संग्रह ट्यूब में रखें।
    नोट: चरण 2.7-2.9 के लिए नीचे बंद सहेजें ।
  3. भंडारण बफर को हटाने के लिए 30 एस के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  4. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और कॉलम को संग्रह ट्यूब में वापस रखें।
  5. कॉलम को धोने के लिए, टोपी निकालें और राल के शीर्ष पर बफर बी के 500 माइक्रोन लागू करें और 30 एस के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। चरण 2.7-2.9 के लिए टोपी को बचाएं।
  6. कॉलम को धोने के लिए 2.4-2.5 एक बार और दोहराएं।
  7. कॉलम के नीचे बंद होने के साथ प्लग करें (चरण 2.2 से)। इसे सैंपल लोडिंग के लिए तैयार करने के लिए राल के ऊपर बफर बी का 100 माइक्रोन लगाएं।
  8. पूरी सामग्री को चरण 1.6 (या कुल प्रोटीन के 4 मिलीग्राम के बराबर मात्रा तक) से राल में जोड़ें। कॉलम के शीर्ष पर स्क्रू कैप रखें।
  9. कोई 5 मिनट से अधिक के लिए एक घूर्णन शेखर पर कमरे के तापमान पर मिलाएं ।

3. नमूना योग

  1. स्क्रू कैप को ढीला करें और नीचे बंद करें, और तुरंत 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    नोट: नीचे बंद होने के रूप में जल्द ही नमूना elute करने के लिए शुरू कर देंगे । कृपया सुनिश्चित करें कि 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब नमूना हानि को कम करने के लिए एलुएट प्राप्त करने के लिए तैयार हैं।
  2. शुद्ध ईवीएस प्राप्त करने के लिए 30 एस के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। कॉलम को छोड़ दें।

4. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी

  1. कार्यक्षेत्र को कवर करने और फाइबर को क्यूवेट में प्रवेश करने से रोकने के लिए माइक्रोफाइबर कपड़े की तरह लिंट-फ्री सामग्री का उपयोग करें।
  2. दस्ताने पहने हुए, चुंबकीय क्यूवेट जिग पर क्यूवेट रखें, फिर क्यूवेट में हलचल बार रखें। हमेशा दस्ताने के साथ cuvettes संभाल करने के लिए उंगलियों के निशान और कुवेट की सतह पर प्रदर्शित होने से धब्बा को रोकने के लिए ।
  3. डालने को क्यूवेट में रखने के लिए हुक टूल का उपयोग करें जैसा कि चित्र 3में दर्शाया गया है। बाद में (चरण 5.4) के लिए डालने के अभिविन्यास को नोट करना महत्वपूर्ण है।

Figure 3
चित्रा 3:क्वार्ट्ज क्यूवेट के भीतर डालने का उचित अभिविन्यास। डालने का "पायदान" क्यूवेट के सामने से दिखाई देना चाहिए। इसे कैमरे का सामना कर रहे इंस्ट्रूमेंट में डाला जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एक पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे डालने में छेद के माध्यम से कमरे के तापमान पर पतला या पतला नमूना के 400-500μl को क्यूवेट में जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। हवा के बुलबुले शुरू करने से बचें।
    1. सबसे पहले डिलुएंट के कण एकाग्रता को मापने के लिए चुने हुए मंद (खाली) से भरा एक क्यूवेट तैयार करें। यह नमूना मापने से पहले किया जाना चाहिए ताकि नमूने की पृष्ठभूमि एकाग्रता को ठीक किया जा सके।
      नोट: एक अच्छा खाली (फॉस्फेट बफर खारा [PBS] इस मामले में) एक एकाग्रता <9 x 106 (मंद के आधार पर) होगा और लाइव व्यू(चित्रा 4)में प्रति स्क्रीन 1-10 कणों को प्रदर्शित करेगा । यह सिफारिश की जाती है कि वास्तविक नमूना कण एकाग्रता पृष्ठभूमि एकाग्रता से कम से कम 3 गुना है।
    2. वैकल्पिक रूप से, मापने से पहले पतला या पतला नमूना के 400-500 माइक्रोन के साथ नमूना प्राइम को रिकॉर्ड करने से पहले क्यूवेट। ऐसा करने के लिए, क्यूवेट में पतला नमूने के 400-500 माइक्रोन लोड करें, समाधान को त्यागें, और फिर माप के लिए 400-500 माइक्रोन को अधिक नमूना जोड़ें। यह क्यूवेट के भीतर अवशेषों को धोने में मदद कर सकता है।

Figure 4
चित्र 4:एक खाली की उचित एकाग्रता सीमा के भीतर एक मंद का प्रतिनिधि लाइव स्ट्रीम दृश्य। फ़िल्टर (0.02 माइक्रोन या 3 केडीए, पसंदीदा) पीबीएस में पतला ईवी प्रेप। एक अच्छा खाली लाइव दृश्य में प्रति स्क्रीन ~ 1-10 कणों को प्रदर्शित करेगा, जो रेंज 105 -106 के भीतर एकाग्रता पैदाकरेगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. कुवेट को कैप करें और बुलबुले की जांच करें। यदि आवश्यक हो तो बुलबुले को टैप करें। क्यूवेट के बाहरी चेहरों को पोंछने के लिए लिंट फ्री कपड़े का इस्तेमाल करें।

5. कण ट्रैकिंग उपकरण की स्टार्टअप प्रक्रिया

  1. कंप्यूटर वर्कस्टेशन और इंस्ट्रूमेंट चालू करें, पहला नमूना चलाने से पहले कुछ मिनट इंतजार करें और सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करके प्रोग्राम शुरू करें। जब प्रेरित किया जाता है, तो नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण का संचालन करने के लिए स्क्रीन पर एनटीए पर क्लिक करें। रिकॉर्डिंग टैब में शुरू करें और प्रोटोकॉल के दौरान उनके बीच स्विच करने के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर टैब(रिकॉर्ड, प्रक्रिया, प्लॉट)पर क्लिक करें। पहले नमूना (मंद या ईवी तैयारी) रिकॉर्ड करें, फिर रिकॉर्डिंग को संसाधित करें, और अंत में परिणामों की साजिश करें।
  2. नमूने के बारे में सभी आवश्यक जानकारी भरने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें। जांच करें कि सभी आवश्यक फ़ील्ड पूरे हो गए हैं और सटीक हैं, यानी, नमूना नाम, विवरण, नमूना तैयारी, कमजोर पड़ने का कारक [1000], लक्ष्य तापमान (22 डिग्री सेल्सियस तक सेट), और पतला: ड्रॉपडाउन मेनू से पतला चुनें और पीबीएस का उपयोग ईवीएस के लिए पतला के रूप में करें। ड्रॉपडाउन मेनू से पीबीएस का चयन करने से लवणता को 9% तक आबाद कर दिया जाएगा । यह जानकारी तरल की गतिशील चिपचिपाहट निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।
    नोट: यह तापमान के लिए 3 मिनट तक ले जा सकते है क्यूवेट के अंदर संतुलन भले ही जांच पहले से ही वांछित तापमान से पता चलता है (यानी, हरी डॉट स्थिर हो जाता है) । यदि लक्ष्य तापमान निर्धारित नहीं किया जाता है तो नमूना रीडआउट काफी भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि नमूना तापमान अंतर कणों की ब्राउनियन गति को बहुत बदल सकता है।
  3. उपकरण ढक्कन खोलें और सुरक्षात्मक टोपी को कवर करें जहां क्यूवेट रखा जाएगा।
    सावधानी: कण ट्रैकिंग उपकरण एक वर्ग 1 लेजर उत्पाद (21 सीएफआर चौधरी) के रूप में प्रमाणित है । मैं भाग १०४०), लेजर कि खतरनाक हो सकता है और इस तरह के जलता है और/ दुर्घटना या चोट को रोकने के लिए, बोल्ट को साइड से अनस्क्रूइंग करके इंस्ट्रूमेंट कवर को न हटाएं। ध्यान दें कि ऑपरेशन के दौरान, लेजर बीम पूरी तरह से संलग्न हैं, जिससे उपयोगकर्ताओं के लिए कोई खतरा नहीं है। इसके अलावा, एक चुंबकीय सुरक्षा इंटरलॉक उपकरण के नमूना धारक में बनाया गया है ताकि नमूना धारक की टोपी को हटा दिया जाता है जब लेजर को परिचालन से रोका जा सके।
  4. सही अभिविन्यास में उपकरण के अंदर क्यूवेट (चरण 4.3 से) रखें (चित्रा 5देखें)। कु्वेट के ऊपर टोपी को बदलें और उपकरण ढक्कन को बंद करें। हमेशा नमूना धारक पर जगह में टोपी के साथ साधन संचालित करें। सुरक्षा इंटरलॉक सुविधा को दरकिनार करने या करने का प्रयास न करें।

Figure 5
चित्रा 5:कण ट्रैकिंग उपकरण के भीतर क्यूवेट का उचित अभिविन्यास। क्यूवेट का चेहरा (दृश्यमान डालने के "पायदान" के साथ) कैमरे का सामना करना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. स्ट्रीमिंगके ऊपर तीर पर क्लिक करके कैमरे को चालू करें ।
  2. रिकॉर्ड सेटिंग्स का विस्तार करने के लिए धरण तीर पर क्लिक करें। आवेदन के लिए उपयुक्त मूल्यों के लिए लाभ और लेजर शक्ति सेट करें। छोटे (100 एनएम) ईवीएस के एनटीए के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों के लिए तालिका 1 (और पूरक चित्रा1) देखें।
    नोट: धरण तीर पर क्लिक करके पहुँचा इन उन्नत सेटिंग्स पासवर्ड से संरक्षित हो सकता है। बाद के नमूनों के लिए उपयोग किए जाने वाले मंद (खाली) के लिए रिकॉर्डिंग और प्रसंस्करण के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें।
  3. ध्यान तब तक समायोजित करें जब तक कि कण ठीक से केंद्रित न हों। ध्यान केंद्रित अपेक्षाकृत छोटे कणों(चित्रा 6)पर किया जाना चाहिए । छोटे EV क्वांटिफिकेशन (एक्सोसोम्स के अनुरूप) के लिए, निम्नलिखित रिकॉर्डिंग सेटिंग्स की सिफारिश की जाती है: फ्रेम दर: 30 एफपीएस, एक्सपोजर: 15 एमएस, हलचल समय: 5 एस, प्रतीक्षा समय: 3 एस, लेजर पावर - नीला: 210 एमडब्ल्यू, ग्रीन: 12 एमडब्ल्यू, रेड: 8 एमडब्ल्यू, फ्रेम प्रति वीडियो: 300 फ्रेम, और गेन: 30 डीबी।
    नोट: उपयोगकर्ता 1x करने के लिए ज़ूम बढ़ा सकते है और/या ध्यान केंद्रित करने के साथ मदद करने के लिए लाभ में वृद्धि । वीडियो रिकॉर्ड करने से पहले अनुशंसित मानों के लिए इन मापदंडों को फिर से सेट करना याद रखें।

Figure 6
चित्र 6:प्रतिनिधि लाइव स्ट्रीम दृश्य कण फोकस दिखाते हैं। (A)एक उदाहरण के लिए ध्यान में नहीं कणों का लाइव स्ट्रीम दृश्य । कणों में चमक की तरह हेलो होता है या धुंधला दिखाई देता है। फोकस एडजस्ट करें। (ख)उचित ध्यान में कणों के लाइव स्ट्रीम दृश्य का एक उदाहरण रहते हैं । सबसे छोटे कण फोकस में हैं। रिकॉर्डिंग शुरू करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. यह सुनिश्चित करने के लिए एक दृश्य गुणवत्ता की जांच करें कि नमूना ठीक से पतला है। यदि नमूना बहुत केंद्रित है, तो उपकरण से क्यूवेट निकालें और नमूने को क्रमिक रूप से पतला करें। जब तक नमूना ठीक से 6 चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले पतला है दोहराएं ।
    नोट: नमूने को अधिक पतला न करें! हमेशा क्रमिक रूप से कमजोर पड़ना चाहिए। आदर्श खाली स्क्रीन पर केवल कुछ कणों (1-4) प्रदर्शित करेगा जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। EV नमूनों के बारे में, एक ठीक से पतला नमूना स्क्रीन पर दिखाई लगभग 20-100 कणों होगा, कोई चमक की तरह या पृष्ठभूमि में बादल छवियों के साथ (एक उदाहरण के रूप में चित्रा 7 देखें) । इसके परिणामस्वरूप 5 x 106 से 2 x 108 कण प्रति एमएल (कमजोर पड़ने के कारक के लिए समायोजन नहीं) की सीमा में इष्टतम कण एकाग्रता होनी चाहिए।

Figure 7
चित्र 7:प्रतिनिधि लाइव स्ट्रीम दृश्य ों में विभिन्न कण कमजोर पड़ने का चित्रण किया गया है।(क)एक उदाहरण एक नमूने का लाइव स्ट्रीम दृश्य जो बहुत केंद्रित है। एक नमूना है कि बहुत केंद्रित है रिकॉर्डिंग गलत परिणाम निकलेगा । (ख)एक उदाहरण एक ठीक से पतला नमूने का लाइव स्ट्रीम दृश्य । स्क्रीन पर 60-100 कण दिखाई देते हैं और रिकॉर्डिंग के परिणामस्वरूप 5 x 106-2x 108 कण/एमएल की कच्ची एकाग्रता होती है । (ग)एक उदाहरण एक नमूने का लाइव स्ट्रीम दृश्य जो बहुत पतला है। यदि एक नमूना यह पतला है, तो पर्याप्त कणों को ट्रैक नहीं किया जाएगा, नमूना आकार को कम किया जाएगा और इसलिए, परिणाम सांख्यिकीय रूप से अमान्य होंगे। इस मामले में, रिकॉर्ड किए गए वीडियो की संख्या बढ़ाने की सिफारिश की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6. वीडियो डेटा अधिग्रहण

  1. (वैकल्पिक) बैंडविड्थ को बचाने और खोए हुए फ्रेम को रोकने के लिए ज़ूम सेटिंग को 0.5x तक सेट करें।
  2. रिकॉर्ड पर क्लिक करके वीडियो रिकॉर्ड करना शुरू करें (अनुशंसित रिकॉर्डिंग मापदंडों के लिए तालिका 1 देखें)।
    नोट: डिफ़ॉल्ट रूप से, उपकरण 5 एस के लिए नमूना हलचल, 3 एस के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर इस प्रक्रिया को दोहराने से पहले 10 एस के लिए रिकॉर्ड होगा । 50 वीडियो के लिए विशिष्ट माप समय रिकॉर्ड करने के लिए ~ 15 मिनट और प्रक्रिया के लिए ~ 13 मिनट है।
  3. वीडियो रिकॉर्ड करते समय यंत्र को न छुएं। सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला पीठ की सतह हिल नहीं रही है।
    नोट: यह पसंद किया जाता है कि उपकरण को पास के उपकरणों से किसी भी कंपन गड़बड़ी को कम करने के लिए एक एंटी-कंपन प्लेटफॉर्म या टेबल पर सेट किया गया है जो नैनोपार्टिकल आंदोलन के निर्धारण में हस्तक्षेप करेगा। कण ट्रैकिंग उपकरण के रूप में एक ही बेंच पर ऑपरेटिंग अपकेंद्री, भंवर मिक्सर, या अन्य संभावित कंपन पैदा करने वाले उपकरणों से बचें। कंपन आमतौर पर गोल कणों के विस्तार के रूप में स्क्रीन पर आसानी से दिखाई देते हैं। यदि जोरदार कंपन के संपर्क में है, तो उपकरण को ऑप्टिकल तत्वों के पुनर्संरेखण की आवश्यकता हो सकती है। उपकरण को ग्राहक द्वारा सेवित या कैलिब्रेट करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया था; रखरखाव, सेवा और अंशांकन के लिए निर्माता से संपर्क करें।
  4. किसी भी रिकॉर्ड किए गए वीडियो पर ध्यान दें जिसमें बड़े, अनियमित सफेद ब्लॉब्स के रूप में बहुत बड़े कण दिखाई देते हैं। इन वीडियो को स्टेप 7.3 में प्रोसेसिंग से निकालें।

7. प्रक्रिया अधिग्रहीत डेटा

  1. जब कोई त्वरित यह कहते हुए दिखाई देता है कि वीडियो रिकॉर्ड किए गए हैं, तो रिकॉर्डिंग पूरी करने के लिए ओके पर क्लिक करें। इसके बाद प्रोसेस टैब का चयन करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । अधिग्रहीत डेटा की प्रोसेसिंग को बाद में पार्टिकल ट्रैकिंग इंस्ट्रूमेंट के सॉफ्टवेयर खोलने और डायरेक्टरी को निर्दिष्ट करने के बाद प्रोसेस टैब पर सीधे जाकर पुनः आरंभ किया जा सकता है जहां रिकॉर्ड किए गए वीडियो सहेजे जाते हैं।
  2. ईवीएस का विश्लेषण करते समय, बॉक्स डिसेबल ऑटो डिटेक्शन ओवरराइड की जांच करें और फीचर व्यास को 30सेट करें। प्रक्रियापर क्लिक करें । (प्रोसेसिंग डिस्प्ले के लिए प्रोसेसिंग सेटिंग्स और सप्लीमेंट्री फिगर 2 के लिए टेबल 2 देखें) । एक लाइव वितरण ग्राफ प्रदर्शित करेगा ताकि उपयोगकर्ता वास्तविक समय में प्रसंस्करण देख सके।
    1. एक्सोसोम्स के लिए, डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड के साथ प्रक्रिया डिफ़ॉल्ट पॉलीडिसपर्स नमूनेके लिए सेट करें। डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड मैनुअल सेट के साथ डेटा को 0.99 की मानक सीमा के बजाय 0.8 तक संसाधित करें केवल कण आकारों में बहुत बड़े अंतर वाले समाधानों के लिए।
  3. यदि किसी भी वीडियो में बहुत बड़े कण दिखाई देते थे (चरण 6.4 देखें), तो रिकॉर्ड किए गए वीडियो की निर्देशिका पर नेविगेट करें और समस्याग्रस्त वीडियो को हटा दें। वीडियो फ़ाइलों की सूची को संपादित करने के बाद, अन्य उपयोगकर्ता द्वारा रखे गए लॉग में रिकॉर्ड किए गए वीडियो की संख्या बदलें।
  4. प्रसंस्करण पूरा होने के बाद, ओकेपर क्लिक करें। इसके बाद प्लॉट टैब का चयन करें। ईवीएस के लिए, मुख्य चार्ट को लॉगबिनसिलिकाके रूप में प्रदर्शित करें।
    नोट: यहां प्लॉट टैब में, उपयोगकर्ता ग्राफ की अन्य विशेषताओं को अनुकूलित कर सकता है, जैसे कि उत्पादित आकृति के लिए एकीकरण के लिए क्षेत्र निर्धारित करने के लिए एक्स एक्सिस (कण व्यास, एनएम) की सीमा को परिभाषित करना।

8. प्रदर्शन और परिणामों की व्याख्या

  1. पीडीएफ रिपोर्ट बनाने के लिए रिपोर्ट बटन पर क्लिक करें। माप अब पूरा हो गया है, और परिणाम देखा जा सकता है।
    नोट: पहले खाली को रिकॉर्ड करना और संसाधित करना याद रखें ताकि बाद के नमूनों की पृष्ठभूमि एकाग्रता को ठीक किया जा सके। यदि इस कदम को भुला दिया जाता है, तो नमूनों के बाद खाली दर्ज किया जा सकता है और नमूना कण एकाग्रता को मैन्युअल रूप से सही किया जा सकता है।
  2. पीडीएफ रिपोर्ट की जांच करें जो मतलब, औसत और मोड आकार के साथ-साथ कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए समायोजित एकाग्रता को प्रदर्शित करता है और कमजोर कण एकाग्रता को घटाकर सही करता है। वितरण चौड़ाई (मानक विचलन) भी दिखाया गया है।
    नोट: बहुत कम आवेदन हैं जहां एक ही मूल्य उपयुक्त और प्रतिनिधि है। इस प्रकार, पूरे आकार के वितरण का वर्णन करना और विश्लेषण किए गए किसी भी नमूने के लिए वितरण की चौड़ाई की रिपोर्ट करना अनुशंसित है (जैसा कि उदाहरण के लिए तालिका 3 में दिखाया गया है)।
  3. डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली निम्नलिखित उपकरण सेटिंग्स रिकॉर्ड करें जो परिणामों की रिपोर्ट करते समय बताए जाने चाहिए: प्रत्येक लेजर [एमडब्ल्यू] की डिलुएंटर, लेजर पावर, एक्सपोजर [एमएस], लाभ [डीबी], फ्रेम दर [एफपीएस], फ्रेम प्रति वीडियो, रिकॉर्ड किए गए वीडियो की संख्या, प्रोसेसिंग सेटिंग (जैसे, लॉगबिनसिलिका), एकीकरण रेंज [न्यूनतम एनएम, अधिकतम एनएम] (न्यूनतम को 50 एनएम तक सेट करने की सिफारिश) और ट्रैक किए गए कणों की संख्या (प्रति वीडियो कम से ~ 150 कणों का विश्लेषण करने के लिए वांछनीय; न्यूनतम 3,750 कुल पटरियां प्रति नमूना कण आकार वितरण में विरूपण साक्ष्य स्पाइक्स से बचने और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा उत्पन्न करने की सिफारिश की गई है।)

9. क्यूवेट की सफाई

  1. नमूनों के बीच मैन्युअल रूप से साफ क्यूवेट। सबसे पहले, क्यूवेट खाली करें।
    नोट: नमूना या तो cuvette से बरामद किया जा सकता है और बचाया या खारिज कर दिया ।
  2. एक बार क्यूवेट खाली होने के बाद, डी-आयनाइज्ड (डीआई) पानी के साथ 10-15 बार इसे कुल्ला करके साफ करें। फिर, इथेनॉल (70-100%) के साथ 3 बार कुल्ला। ऐसा करते समय, सॉल्वेंट के साथ क्यूवेट को पूरी तरह से भरना सुनिश्चित करें।
  3. एक लिंट मुक्त माइक्रोफाइबर कपड़े के साथ क्यूवेट के बाहर सूखी। सतहों पर धब्बा से बचें। हवा एक संकुचित हवा डस्टर का उपयोग कर क्यूवेट या सूखी के अंदर सूखी।
    नोट: केवल लेंस सफाई कागज या लिंट मुक्त माइक्रोफाइबर कपड़े का उपयोग क्यूवेट की ऑप्टिकल सतहों को मिटाने के लिए किया जाना चाहिए, क्योंकि अधिकांश कागज उत्पादों में छोटे लकड़ी के फाइबर होते हैं जो क्यूवेट की सतह को खरोंच या नुकसान पहुंचा सकते हैं।
  4. दो ग्लास प्रस्फुटन शीशियों को तैयार करें: एक 70-100% इथेनॉल से भरा और दूसरा डीआई पानी के साथ। सम्मिलन कुल्ला और इथेनॉल में पहले (तब DI पानी हलचल) सम्मिलित में डालना/उचित प्रस्फुटन शीशी में बार हलचल और शीशी जोर से मिलाते हुए । आवेषण को सुखाएं और लिंट मुक्त कपड़े या संकुचित हवा डस्टर का उपयोग करके सलाखों को हिलाएं।
    नोट: क्यूवेट और डालें को सोनिकिंग वॉटर बाथ का उपयोग करके भी साफ किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, सबसे पहले यह सुनिश्चित करें कि सोनिकटिंग यूनिट में पर्याप्त पानी (कम से कम 5 सेमी गहराई) होता है। फिर क्यूवेट रखें और एक ग्लास बीकर (50 एमएल या बड़े) के अंदर डालें, बीकर को शराब के साथ पानी स्नान के समान स्तर पर भरें, बीकर को पानी में रखें, और बिजली पर स्विच करें। एक समय में अधिकतम 5 मिनट के लिए Sonicate, मशीन प्रत्येक 5 मिनट फट के बीच >5 मिनट आराम करने की अनुमति अगर अब समय की आवश्यकता है ।
  5. समाप्त होने पर, तुरंत सभी साफ और सूखे घटकों को भंडारण के लिए दूर रखें।

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Representative Results

इस प्रदर्शन से पहले, पॉलीस्टीरिन मनका मानकों के आकार वितरण को मापने के द्वारा अधिग्रहीत डेटा की वैधता सुनिश्चित करने के लिए उपकरण के अंशांकन का परीक्षण किया गया था। हमने डिफ़ॉल्ट रिकॉर्डिंग मापदंडों और इस प्रोटोकॉल में अनुशंसित प्रसंस्करण सेटिंग्स(चित्र 8)का उपयोग करके 100 एनएम और 400 एनएम मोतियों के आकार वितरण का परीक्षण किया।

100 एनएम पॉलीस्टीरिन मनका मानक के लिए, 4.205 x 107 कणों/एमएल की एकाग्रता मापी गई थी। मतलब (मानक विचलन, एसडी) आकार 0.16 के भिन्नता (सीवी) के गुणांक के साथ 102 (±17) एनएम था। D10/D50/D90 मान 76/104/126 एनएम थे । यह इंगित करता है कि कण ट्रैकिंग उपकरण सही 100 एनएम मोनोडिस्पर्स मोतियों के आकार की सूचना दी। 400 एनएम पॉलीस्टीरिन मनका मानक के लिए, एकाग्रता 4.365 x 107 कण/एमएल थी। मतलब (एसडी) का आकार 391 (±47) एनएम था, जिसमें सीवी 0.12 था। D10/D50/D90 मान 150/358/456 एनएम(तालिका 3)थे । जबकि रिपोर्ट किया गया मतलब मोतियों के सही आकार के बहुत करीब है, हम देख सकते हैं कि इस प्रोटोकॉल में लागू उपकरण सेटिंग्स छोटे कणों ~ 100 एनएम के लिए अधिक सटीक हैं। इस प्रकार, 400 एनएम से बड़े कणों के लिए, लेजर मापदंडों का अनुकूलन सुझाया जाता है। शोधकर्ताओं को पहले एनटीए से पहले दिए गए स्रोत और अलगाव विधि से परिणामस्वरूप EV आकार वितरण के अनुमान के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) जैसी विधि का संचालन करना चाहिए ।

४.४१ x 1010 कणों/एमएल का एक मतलब एकाग्रता इस प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल माउस ऊतक EV नमूना के लिए मापा गया था । यह नमूना तालिका 1 में संक्षेप में दिए गए मापदंडों के बाद दर्ज किया गया था और तालिका 2 में उल्लिखित मापदंडों का पालन करते हुएसंसाधित किया गया था। हम चित्रा 9 में विभिन्न कमजोर पड़ने वाले कारकों के प्रभाव को प्रदर्शित करते हैं और तालिका 4 में कच्चे और समायोजित कणों की सांद्रता की रिपोर्ट करते हैं। माउस ऊतक-व्युत्पन्न ईवीएस के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने 1,000 से 3,000 के बीच था जबकि मानव प्लाज्मा-व्युत्पन्न ईवीएस के लिए यह 1,000 था, यह दर्शाता है कि जब पहली बार किसी दिए गए बायोफ्लुइड स्रोत या एनटीए के लिए ईवी अलगाव विधि का परीक्षण किया जाता है, तो सीरियल कमजोर पड़ने का परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि एनटीए के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने की पहचान की जा सके। हम एक नमूने के कम से कम दो अलग-अलग कमजोर पड़ने को मापने और रिपोर्ट करने की सलाह देते हैं। हमने दो अलग-अलग कण ट्रैकिंग उपकरणों पर विभिन्न कमजोर पड़ने पर चार अतिरिक्त नमूने भी मापा। पूरक चित्रा 3 एक और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनटीए उपकरण की तुलना में आकार माप में कण ट्रैकिंग उपकरण की सटीकता की तुलना करता है। पूरक तालिका 1 आगे इस उपकरण के माप की सटीकता को दर्शाता है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि कण एकाग्रता नमूना कमजोर पड़ने के साथ आनुपातिक रूप से बदल गई है, लेकिन कण आकार के उपाय नहीं थे।

प्रसंस्करण के बाद, परिणाम (साधन/सॉफ्टवेयर जानकारी, रिकॉर्डिंग और प्रसंस्करण सेटिंग्स, और प्रयोगात्मक नोट्स के साथ) एक .pdf रिपोर्ट में सहेजा जा सकता है । इस रिपोर्ट पर शामिल हिस्टोग्राम को प्रोटोकॉल (धारा 7.4) में वर्णित संशोधित किया जा सकता है। कच्चे परिणाम एक .dat फ़ाइल है कि निर्यात किया जा सकता है में सहेजा जाता है । रिकॉर्ड किए गए वीडियो भी सहेजे जाते हैं और बाद में ऑफ-लाइन प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, एक बार वीडियो रिकॉर्ड होने के बाद, रिकॉर्डिंग सेटिंग्स को भूतलक्षी प्रभाव से नहीं बदला जा सकता है।

रिकॉर्डिंग सेटिंग्स में विभिन्न लेजर शक्तियों और लाभ में फेरबदल के प्रभाव को मानव प्लाज्मा व्युत्पन्न ईवीएस का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। यह आंकड़े 10-12 में कल्पना की है और इन छवियों पर आधारित मात्रात्मक जानकारी तालिका 5 में दिखाया गया है । लाभ बढ़ाने से कैमरे की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, जिससे छोटे कणों(चित्रा 10)के दृश्य की अनुमति होती है जिसके परिणामस्वरूप एक छोटे औसत कण आकार(तालिका 5)के साथ कुल कण एकाग्रता बढ़ जाती है। हालांकि, 30 डीबी (हमारी सिफारिशों) से ऊपर लाभ बढ़ाने से दृश्य बहुत दानेदार हो जाता है, जिससे शोर सच्चे कणों के माप को अस्पष्ट करने की अनुमति देता है। 30 डीबी के एक कैमरा लाभ पर, नीले लेजर शक्ति में फेरबदल के प्रभाव चित्रा 11में चित्रित किया गया है । नीले लेजर (450 एनएम, लघु तरंगदैर्ध्य) शक्ति में वृद्धि के परिणामस्वरूप छोटे कणों का पता लगाने के लिए अधिक से अधिक संकल्प होता है (यानी एक्सोसोम्स के अनुरूप आकार वाले)। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर स्थिर हरे और लाल लेजर शक्तियों को पकड़े हुए, नीले लेजर शक्ति को 70 मीटर से बढ़ाकर 210 मीटर कर दिया गया, रिपोर्ट औसत कण आकार को 122 एनएम से 105 एनएम तक स्थानांतरित कर दिया और रिपोर्ट किए गए कुल कण एकाग्रता को 1.1 x 108 से बढ़ाकर 1.7 x 108 (तालिका 5)कर दिया।

हरे और लाल लेजर शक्तियों को बढ़ाने के प्रभाव का भी प्रदर्शन किया गया(चित्र 12)। रेड लेजर (650 एनएम, लंबी तरंगदैर्ध्य) की शक्ति में वृद्धि हुई औसत कण का आकार 175 से बढ़कर 246 एनएम हो गया। रिपोर्ट कुल कण एकाग्रता में कमी आई है, लेकिन ऐसा इसलिए है क्योंकि इस मानव प्लाज्मा EV नमूने में हमारे पास कई बड़े कण मौजूद नहीं थे, जो टेम निगेटिव स्टेनिंग(पूरक चित्रा 4)द्वारा पुष्टि की गई थी। हरे लेजर शक्ति में वृद्धि की रिपोर्ट औसत कण आकार में कमी और रिपोर्ट कुल कण एकाग्रता में वृद्धि हुई । इस प्रकार, उपयोगकर्ता विभिन्न आकारों के कणों का संवेदनशीलता से पता लगाने के लिए तीन लेजर की शक्ति का अनुकूलन कर सकता है।

यह प्रोटोकॉल छोटे वेसिकल्स (जैसे, <400 एनएम) के लिए अनुकूलित है। बड़े आकार (जैसे, 400-1000 एनएम) के माइक्रोवेसिकल्स में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को खोखले ऑर्गेनोसिलिका मोतियों का उपयोग करके लेजर मापदंडों को अनुकूलित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जिनमें ईवीएस के समान हल्के-बिखरने वाले गुण होते हैं जो उन्हें पॉलीस्टीरिन या सिलिका बीड मानकों30की तुलना में अधिक उपयुक्त संदर्भ बनाते हैं। फिर भी सिलिका नैनोकणों का सबसे अच्छा व्यावहारिक विकल्प हो सकता है जब तक ऑर्गेनोसिलिका मानक अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हो जाते।

यहां, एक एनटीए उपकरण का उपयोग वाणिज्यिक किट का उपयोग करके अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन और मानव प्लाज्मा द्वारा माउस ऊतक से अलग किए गए ईवीएस को सफलतापूर्वक निर्धारित करने के लिए किया गया था। एनटीए मापदंडों में फेरबदल के प्रभावों को दर्शाया गया था और यह दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल में पैरामीटर छोटे वेसिकल्स के लिए अनुकूलित हैं। कमजोर पड़ने के कदम के महत्व को भी प्रदर्शित किया गया था और पता चलता है कि यहां प्रदर्शित कण ट्रैकिंग उपकरण कमजोर पड़ने के कारकों में विविधताओं का सही पता लगा सकते हैं । एकाग्रता कई कमजोर पड़ने के साथ आनुपातिक रूप से बदल गई, जबकि आकार वितरण नहीं हुआ। परिणामस्वरूप डेटा थोड़ा तकनीकी परिवर्तनशीलता दिखाया । इस प्रकार, एनटीए के लिए इस उपकरण का उपयोग कर शोधकर्ताओं द्वारा इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन ईवी अनुसंधान क्षेत्र में कठोरता और प्रजनन क्षमता में वृद्धि होगी ।

Figure 8
चित्र 8:मोनोडिस्पर्स पॉलीस्टीरिन मनका मानकों का कण आकार वितरण। 100 एनएम पॉलीस्टीरिन मनका मानक का कण आकार वितरण। 400 एनएम पॉलीस्टीरिन मनका मानक का कण आकार वितरण। तालिका 3में मानों की सूचना दी जाती है । इनसेट पहले मापा फ्रेम के उदाहरण लाइव स्ट्रीम दृश्य दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक ईवीएस के लिए कमजोर पड़ने के कारक द्वारा कच्चे कुल कण सांद्रता। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए तीन माप लिए गए । तालिका 4में मानों की सूचना दी जाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10:बढ़ते लाभ का दृश्य प्रभाव। डिफ़ॉल्ट लेजर सेटिंग्स के साथ मापा कणों के प्रतिनिधि छवियां (ब्लू = 70 mW, ग्रीन = 12 mW, लाल = 8 mW) और लाभ सेट करने के लिए सेट(ए)18 डीबी,(बी)24 डीबी - डिफ़ॉल्ट, और(सी)30 डीबी - की सिफारिश की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11:छोटे कणों पर नीले लेजर का प्रभाव जब लाल और हरे रंग के लेजर डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के लिए सेट कर रहे हैं। (A)ब्लू लेजर = 70 एमडब्ल्यू (डिफॉल्ट)। (ख)ब्लू लेजर = 210 मिलियन रुपये (अनुशंसित)। अधिक छोटे कण दिखाई देते हैं और ध्यान में जब नीले लेजर शक्ति 210 mW करने के लिए वृद्धि हुई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12:बदल नीले, हरे और लाल लेजर शक्ति का दृश्य प्रभाव। प्रतिनिधि लाइव स्क्रीन दृश्य विभिन्न लेजर सेटिंग्स में कल्पना किए गए विभिन्न कण आकारों को दर्शाते हैं। परिणामस्वरूप एनटीए मूल्यों की सूचना तालिका 5में दी जाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कणों व्यास [एनएम] ब्लू लेजर [mW] ग्रीन लेजर [mW] लाल लेजर [mW] कैमरा लाभ [डीबी] तापमान विनियमन संसाधन # वीडियो
एक्सोसोम्स 100 210 12 8 30 सक्षम, 22 ºC के लिए सेट विकलांग ऑटो डिटेक्शन ओवरराइड 50

तालिका 1: छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (~ 100 एनएम) के लिए रिकॉर्डिंग पैरामीटर।

प्रक्रिया विवरण डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड ऑटो डिटेक्शन ओवरराइड को अक्षम फ़ीचर व्यास [px]
एक्सोसोम्स पॉलीडिस्पर्स नमूना जाँच 30

तालिका 2: छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (~ 100 एनएम) के लिए प्रसंस्करण पैरामीटर।

पॉलीस्टीरिन मानक का आकार [एनएम] एकीकरण रेंज [एनएम] मतलब आकार [एनएम] एसडी आकार [एनएम] आकार का सीवी D10 [एनएम] D50 [एनएम] D90 [एनएम] कुल मायने रखता है
100 50 से 150 102 17 0.16 76 104 126 2628
400 300 से 500 391 47 0.12 150 358 456 2728

तालिका 3: मोनोडिस्पर्स पॉलीस्टीरिन मनका मानकों के एनटीए परिणाम। दोनों मानकों को 100 एनएम मानक के लिए कच्चे सांद्रता और 4.205 x 107 कण/एमएल और 4.365 x 107 कण/एमएल के 400 एनएम मानक के साथ बेहतर ढंग से पतला किया गया था। D10 आकार वितरण में बिंदु है जहां नमूना का 10% निहित है, D50 बिंदु है जहां नमूना का 50% निहित है (औसत), और D90 बिंदु है जहां नमूना का 90% निहित है। एसडी: मानक विचलन; सीवी: भिन्नता का गुणांक।

कमजोर पड़ने का कारक कण एकाग्रता, कण/एमएल कुल कण एकाग्रता, कण/एमएल
कच्चा कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए समायोजित
1000 4.10E+07 4.10E+10
4.00E+07 4.00E+10
3.70E+07 3.70E+10
मतलब (एसडी) 3.93E+07 (1.70E+06) 3.93E+10 (1.70E+09)
1500 3.60E+07 5.40E+10
2.60E+07 3.80E+10
2.90E+07 4.40E+10
मतलब (एसडी) 3.03E+07 (4.19E+06) 4.55E+10 (6.60E+09)
2000 2.40E+07 4.80E+10
2.30E+07 4.60E+10
2.00E+07 4.00E+10
मतलब (एसडी) 2.23E+07 (1.70E+06) 4.46E+10 (3.40E+09)
3000 2.00E+07 6.00E+10
1.30E+07 3.90E+10
1.40E+07 4.20E+10
मतलब (एसडी) 1.57E+07 (3.09E+06) 4.71E+10 (9.27E+09)

तालिका 4: माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक ईवीएस के एनटीए परिणाम एनटीए माप की प्रजनन क्षमता प्रदर्शित करते हैं। कच्चे एनटीए कण सांद्रता (कण/एमएल) कण ट्रैकिंग साधन और कुल कण एकाग्रता (कण/एमएल) पर मापा जाता है जो विभिन्न कमजोर पड़ने पर माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक से प्राप्त ईवीएस के कमजोर पड़ने के कारक के लिए समायोजित होता है ।

लाभ [डीबी] ब्लू लेजर [mW] ग्रीन लेजर [mW] लाल लेजर [mW] कुल एकाग्रता, कण/एमएल (कच्चा) औसत आकार [एनएम]* आकार/सीवी का मानक विचलन मोडल आकार D10/D50/D90
18 70 12 8 5.90E+07 133 89 / 0.66 67 66.57 / 131.08 / 322.70
24 70 12 8 1.00E+08 118 73 / 0.61 64 60.21 / 117.93 / 257.08
30 210 12 8 1.70E+08 105 57 / 0.54 80 59.83 / 104.74 / 206.07
30 70 12 8 1.10E+08 122 75 / 0.61 74 73.17 / 123.09 / 278.70
30 210 0 0 1.00E+08 116 70 / 0.6 82 71.33 / 115.63 / 257.65
30 70 0 0 7.00E+07 126 79 / 0.63 82 74.81 / 125.16 / 284.23
30 0 12 0 2.80E+07 169 106 / 0.63 100 98.28 / 163.39 / 392.50
30 0 24 0 4.40E+07 148 95 / 0.64 88 84.24 / 147.69 / 354.15
30 0 0 8 1.50E+07 175 129 / 0.74 62 8.81 / 15.32 / 108.93
30 0 0 16 9.20E+06 246 147 / 0.6 13 8.55 / 14.93 / 136.75
* 50-1000 एनएम रेंज के भीतर एकीकृत

तालिका 5: मानव प्लाज्मा व्युत्पन्न ईवीएस के एनटीए परिणाम लेजर शक्ति में फेरबदल और मानव ईवीएस (1:1000 कमजोर पड़ने) के आकार और कण एकाग्रता माप पर लाभ के प्रभाव को प्रदर्शित करते हैं। D10 आकार वितरण में बिंदु है जहां नमूना का 10% निहित है, D50 बिंदु है जहां नमूना का 50% निहित है (औसत), और D90 बिंदु है जहां नमूना का 90% निहित है। एसडी: मानक विचलन; सीवी: भिन्नता का गुणांक।

पूरक चित्रा 1: अनुशंसित रिकॉर्डिंग मापदंडों को दर्शाते हुए रिकॉर्डिंग पैनल का स्क्रीनशॉट। अनुशंसित सेटिंग्स के लिए कैमरा गेन और लेजर पावर बदलने के लिए उन्नत सेटिंग्स तक पहुंचें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: अनुशंसित प्रसंस्करण सेटिंग्स को दर्शाते हुए प्रोसेसिंग पैनल का स्क्रीनशॉट। सुनिश्चित करें कि "अक्षम ऑटो डिटेक्शन ओवरराइड" की जांच की जाती है और फीचर व्यास "30" के लिए सेट किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 3: कई कमजोर पड़ने में कण आकार माप: कण ट्रैकिंग साधन (ViewSizer 3000) बनाम तुलनीय वाणिज्यिक एनटीए साधन (नैनोसाइट NS300) की सटीकता। माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक से अलग ईवीएस की एनटीए दो उपकरणों पर किया गया था। प्रत्येक माउस के लिए, तीन कमजोर पड़ने (1:1000, 1:500, 1:100) मापा गया। व्यूसाइजर 3000 (इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित) पर किए गए उपायों के लिए कच्चे मूल्य पूरक तालिका 1में दिखाए गए हैं। नैनोसाइट NS300 उपायों के लिए कैप्चर और विश्लेषण सेटिंग्स पूरक तालिका 2में दिखाई जाती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 4: मानव प्लाज्मा-व्युत्पन्न ईवीएस के प्रतिनिधि नकारात्मक-दाग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) । ग्रिड 100 केवी तेज वोल्टेज पर संचालित ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ इमेज किए गए थे। छवियों को 2K x 2K सीसीडी कैमरे पर कैप्चर किया गया था। स्केल बार कैमरे पर आवर्धन को दर्शाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ व्यास में गोल वेसिकल्स ~ 25 एनएम दिखाते हैं। 100k आवर्धन, स्केल बार 200 एनएम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 1: व्यूसाइजर 3000 कण आकार और माउस पेरिगोनाडल एडिपोस ऊतक ईवीएस के एकाग्रता माप कई कमजोर पड़ने में। माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक से अलग ईवीएस की एनटीए किया गया था। प्रत्येक माउस के लिए, तीन कमजोर पड़ने (1:1000, 1:500, 1:100) मापा गया। D10 आकार वितरण में बिंदु है जहां नमूना का 10% निहित है, D50 बिंदु है जहां नमूना का 50% निहित है (औसत), और D90 बिंदु है जहां नमूना का 90% निहित है। कण सांद्रता पृष्ठभूमि-सही हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 2: नैनोसाइट NS300 कैप्चर और विश्लेषण सेटिंग्स। सेटिंग्स (एनटीए 3.4 बिल्ड 3.4.003 का उपयोग करके) पूरक चित्रा 3 में रिपोर्ट किए गए माउस पेरिगोनडल एडीपोस ऊतक ईवी नमूनों को मापने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।  

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Discussion

यहां, हम एक साथ कण आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के आकार वितरण को मापने और एक पॉलीडिसपर्स नमूने में कुल ईवी एकाग्रता को मापने के लिए ईवीएस के एनटीए के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। इस अध्ययन में, माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक और मानव प्लाज्मा का उपयोग ईवीएस के स्रोत के रूप में किया गया था। हालांकि, अन्य ऊतकों या जैविक तरल पदार्थ जैसे सीरम, मूत्र, लार, स्तन दूध, एमनियोटिक द्रव और सेल कल्चर सुपरनैंट से अलग ईवीएस का भी एनटीए के लिए उपयोग किया जा सकता है। पॉलीस्टीरिन मनका मानकों के माप ने यह सुनिश्चित किया कि उपकरण को ठीक से कैलिब्रेट किया गया था और यह प्रदर्शित किया गया था कि यह एनटीए उपकरण नैनोकणों ≤400 एनएम के आकार को सही ढंग से माप सकता है। एक माउस ऊतक EV नमूने के विभिन्न कमजोर पड़ने तो परीक्षण किया गया। जैसा कि चित्र 9में दिखाया गया है, रिपोर्ट किए गए कण एकाग्रता तराजू तदनुसार कमजोर पड़ने के कारक के साथ, जैसा कि अपेक्षित था, यह प्रदर्शित करता है कि उपकरण तकनीकी प्रतिकृति के बीच थोड़ी परिवर्तनशीलता के साथ विभिन्न कमजोर पड़ने पर कण एकाग्रता का सही पता लगा सकता है। हालांकि, यह उपकरण की कार्य सीमा के भीतर कण सांद्रता के साथ काम करते समय था (5 x10 6 से 2 x10 8 कण प्रति एमएल); एक नमूने को उचित रूप से कमजोर करना प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। कमजोर पड़ने के कारक के लिए समायोजन नमूने के कुल कण एकाग्रता के लिए लगभग एक ही अनुमान निकला, चार कमजोर पड़ने परीक्षण भर में १५.१ के एक सीवी के साथ । इसके अलावा, एक ही नमूनों के कई कमजोर पड़ने पर दोहराए गए विभिन्न उपायों ने कण आकार वितरण आकलन में सटीकता दिखाई, क्योंकि कणों की सांद्रता कमजोर पड़ने के कारक के साथ आनुपातिक रूप से अधिक थी लेकिन रिपोर्ट किए गए आकार के उपाय नहीं थे ।

निलंबन में ईवीएस ब्राउनियन मोशन के रूप में जाना जाता है यादृच्छिक थर्मल गति से गुजरना, जिसके अनुसार एक तरल निलंबन में कणों का प्रसार उनके आकार के विपरीत आनुपातिक है । यह यादृच्छिक गति स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण द्वारा मॉडलिंग की गई है, जहां गोलाकार कण का हाइड्रोडायनामिक व्यास डी है:

Equation 1

जहां केबी बोल्ट्जमान स्थिर है और आर कण त्रिज्या है । जैसा कि कोई समीकरण से देख सकता है, निलंबन में कण आंदोलन तरल के तापमान(टी)और गतिशील चिपचिपाहट(η)पर भी निर्भर करता है। एनटीए के दौरान, ईवीएस केंद्रित लेजर बीम के साथ विकिरणित होते हैं जो निलंबन में कणों से गुजरते हैं और लेजर से आने वाली घटना रोशनी से पता लगाए जाते हैं। प्रत्येक व्यक्ति कण द्वारा बिखरे हुए प्रकाश एक उच्च संकल्प, प्रकाश के प्रति संवेदनशील चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा है, जो कणों के बिखरे हुए प्रकाश(चित्रा 1)की डिजिटल छवियों को रिकॉर्ड की छवि सेंसर पर एक माइक्रोस्कोप द्वारा केंद्रित है । एनटीए सॉफ्टवेयर प्रत्येक कण के प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए प्रत्येक कण की ब्राउनियन गति को पहचानता है और ट्रैक करता है। यह स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग कर कण व्यास की गणना करने के लिए कणों युक्त तरल के तापमान और चिपचिपाहट के साथ एक साथ प्रयोग किया जाता है । इस प्रकार, एक ही माप जानकारी के दो महत्वपूर्ण टुकड़े निर्धारित कर सकते हैं: कण आकार वितरण और निलंबन में ईवीएस की कुल कण गिनती।

ईवीएस का पता लगाने और उनकी मात्रा निर्धारित करने के लिए एनटीए की तुलना अन्यतकनीकोंसे की गई है. गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) जैसे अन्य प्रकाश बिखरने आधारित तरीकों की तुलना में, एनटीए में उच्च समाधान क्षमताएं हैं और 100 एनएम से कम के औसत व्यास वाले कणों का विश्लेषण करने के लिए एक विशेष रूप से शक्तिशाली तरीका है। इस TEM के रूप में एकल कण विश्लेषिकी के विपरीत, एनटीए समय लेने वाली या तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण नहीं है और एक अर्द्ध स्वचालित तरीके से एक बार में अपेक्षाकृत कम मात्रा में एक पूरे नमूने फेनोटाइप कर सकते हैं । जबकि एनटीए एक शक्तिशाली लक्षण वर्णन तकनीक है, इसकी सीमाएं हैं। सबसे पहले, एनटीए कण व्यास के साथ बिखरे हुए प्रकाश स्केलिंग की तीव्रता में मजबूत कमी के कारण संवेदनशीलता सीमा के अधीन है, जिससे बहुत छोटे कणों की बिखरी हुई रोशनी पृष्ठभूमि शोर33से नीचे गायब हो जाती है। इस प्रकार एनटीए ने ~ 50 एनएम31 से छोटे ईवीएस के लिए संवेदनशीलता को कम किया है और इसके परिणामस्वरूप ईवी आकार का अधिक अनुमान लगाया गया है। उनके प्रकाश बिखरने की क्षमता के कारण पॉलीडिस्पर्स नमूने के छोटे कणों का पता लगाने के लिए लघु तरंग दैर्ध्य लेजर की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह कण ट्रैकिंग उपकरण नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग तकनीक के लिए निहित इस सीमा में सुधार प्रदान करता है। तीन चर प्रकाश स्रोतों (450 एनएम, 520 एनएम, 635 एनएम) से लैस, यह प्रणाली विभिन्न प्रकार के आकारों में कणों के दृश्य के लिए अनुमति देती है, जिससे यह उपकरण बहुविषर नमूनों के एनटीए विश्लेषणों के लिए एक विशेष रूप से मूल्यवान उपकरण बनाता है जैसे कि ईवी की विषम आबादी। बहरहाल, क्योंकि सबसे EV preps संरचना में पॉलीडिस्पर्स होगा और संभावना अशुद्धियों होते हैं, शोधकर्ताओं को पता होना चाहिए कि नमूना का पता लगाने की निर्भर सीमा समग्र आकार वितरण के आकार को प्रभावित करती है और इसलिए परिणामों की व्याख्या करते समय सावधानी बरतती है।

एनटीए की एक और बड़ी सीमा यह है कि यह सिर्फ EVs से अधिक उपाय करता है। एनटीए उपकरण का पता लगाने, उपाय, और प्रोटीन समुच्चय, लिपोप्रोटीन, सेलुलर मलबे, और diluents की वजह से संदूषण सहित पता लगाने की सीमा से अधिक सभी कणों की गिनती करेगा । हालांकि, पृष्ठभूमि में कण एकाग्रता को लोड करने और एक नमूने को मापने से पहले मंदक के कण एकाग्रता को मापने के लिए सही किया जा सकता है। हम न्यूनतम 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर किए गए पीबीएस का उपयोग करने की सलाह लेते हैं और 3 केडीए फ़िल्टर किए गए पीबीएस का उपयोग करते समय बहुत कम कण संदूषण पाया है। इसके अलावा, गैर-विशिष्ट माप की सीमा पर काबू पाने, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवीएस को मापने और विश्लेषण करने के लिए एनटीए का विस्तार करना संभव है। वाणिज्यिक किट उपलब्ध हैं जो विशेष रूप से और कुशलता से बरकरार वेसिकल्स की झिल्ली को डाई करते हैं, झिल्ली के टुकड़ों, प्रोटीन समुच्चय और एनटीए माप से अन्य कणों को छोड़कर। इस प्रकार, फ्लोरोसेंट एनटीए से प्राप्त डेटा अधिक सटीक ईवी एकाग्रता और आकार वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। चुनिंदा टैगिंग EV सतह एंटीजन के माध्यम से, फ्लोरोसेंट एनटीए फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए एंटीबॉडी द्वारा लेबल किए गए विशिष्ट ईवीएस को भी माप सकता है, जो एंटीजन-विशिष्ट, जैविक रूप से प्रासंगिक ईवी उपजनसंख्या की गिनती और आकार देने की अनुमति देता है।

एनटीए प्रोटोकॉल के मानकीकरण पर बहुत कम काम किया गया है, जिससे परिणामों की तुलनीयता कठिन हो गई है और नमूनों, दिनों, ऑपरेटरों और प्रयोगशालाओं में प्रजनन क्षमता में बाधा उत्पन्न हो रही है । इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित कण ट्रैकिंग उपकरण के लिए समय पर छोटे हाथों की आवश्यकता होती है। हमने यह भी नोट किया है कि उत्पन्न डेटा की प्रजनन क्षमता को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोगकर्ताओं को किस इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स की रिपोर्ट करनी चाहिए। इस प्रकार, यहां निर्धारित अनुकूलित प्रोटोकॉल का पालन करने से मानकीकरण होना चाहिए और प्रयोगशालाओं में परिणामों की तुलना में सक्षम होना चाहिए । इस उपकरण का उपयोग करने का एक और लाभ यह है कि नमूना एक क्यूवेट में तैयार किया जाता है, जो उपकरण को वीडियो के बीच बार-बार हलचल करने की अनुमति देता है, प्रत्येक वीडियो के लिए सांख्यिकीय यादृच्छिक नमूना सुनिश्चित करता है और अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनटीए उपकरणों की तुलना में अधिक प्रजनन योग्य परिणाम देता है जो सिरिंज पंपों और प्रवाह कोशिकाओं पर भरोसा करते हैं। इसके अलावा, कई लेजर अलग-अलग अपवर्तक सूचकांकों वाले कणों का पता लगाने की अनुमति देते हैं, जिससे अधिक मजबूत परिणाम मिलते हैं। फिर भी इस कण ट्रैकिंग उपकरण के संचालन के लिए अपवर्तक सूचकांक जैसे कण सामग्री गुणों के ज्ञान की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे ऑपरेटरों में माप अधिक पुन: उत्पन्न होता है।

लगभग सभी बायोफ्लूइड2,5में ईवीएस की पहचान की गई है . हालांकि, विभिन्न मीडिया (जैसे, रक्त, स्तन दूध, सेल संस्कृति मीडिया) से विशिष्ट ईवीएस (जैसे, सेल-प्रकार विशिष्ट ईवीएस) का प्रभावी अलगाव एक कठिन चुनौती प्रस्तुत करता है। ईवी आइसोलेशन के लिए कई अलग - अलग तरीके बताए गए हैं। एनटीए को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके अलग-थलग ईवीएस की पैदावार की तुलना करने और विभिन्न अलगाव विधियों से उत्पन्न होने वाले वेसिकल्स में विविधताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। यह डाउनस्ट्रीम परिणामों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि वर्तमान में विभिन्न ईवी उपआबादी का कार्य अस्पष्ट बना हुआ है। सही ईवी एकाग्रता को मापने की जांच अध्ययन में भी महत्वपूर्ण है कि क्या एक निश्चित उपचार, हालत, या अणु प्रभावों EV रिलीज । उदाहरण के लिए, हमारा समूह ईवी सामग्री और रिलीज पर पार्टिकुलेट मैटर वायु प्रदूषण जैसे पर्यावरणीय एक्सपोजर के प्रभाव में रुचि रखता है। यह आकलन करने के लिए कि क्या कोई स्थिति ईवी रिलीज को प्रभावित करती है, वेसिकल्स की संख्या को सटीक मात्रा में निर्धारित किया जाना चाहिए। नैदानिक बायोमार्कर के रूप में ईवीएस का उपयोग करते समय, नमूने में ईवीएस की एकाग्रता परख परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इस प्रकार, कण एकाग्रता और आकार वितरण निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय विधि महत्वपूर्ण है।

भले ही, एनटीए माप अन्य पूरक तकनीकों के साथ होना चाहिए जो नमूने में अन्य कणों से स्वतंत्र रूप से कणों को माप सकते हैं, जैसे कि TEM। माइक्रोफ्लुइडिक प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग (एमआरपीएस) जैसी नई प्रौद्योगिकियां भी नमूने की पॉलीडिस्पिटी से स्वतंत्र ईवीएस को आकार देने और गिनने का वादा कर रही हैं। इसके अलावा जैव रासायनिक या EV नमूनों के प्रोटेकोमिक विश्लेषण जैविक महत्व की आबादी में ईवी के सबसेट क्लस्टर करने के लिए आकार और एकाग्रता डेटा के अलावा इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, वैध और प्रजनन योग्य कण सांद्रता और कण आकार वितरण को मापने EV क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण है । व्यूसाइजर 3000 कुल ईवी एकाग्रता और ईवी आकार वितरण के सटीक और प्रजनन योग्य माप प्राप्त करता है, यहां तक कि अत्यधिक पॉलीडिसपर के नमूनों के लिए भी, जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है। भविष्य में हम अन्य एनटीए उपकरणों के साथ इस उपकरण की और कठोर प्रयोगात्मक तुलना देखने की उम्मीद करते हैं।

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Disclosures

सभी लेखकों ने घोषणा की कि हितों के टकराव नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जेफरी Bodycomb, HORIBA उपकरणों के पीएचडी स्वीकार करते है उसकी मदद के लिए शामिल उपकरण अंशांकन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X dPBS VWR 02-0119-1000 To dilute samples
100 nm bead standard Thermo Scientific 3100A To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard Thermo Scientific 3400A To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit Amicon UFC901024 To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL Qiagen 19201 For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster DustOff DPSJB-12 To clean cuvettes
Cuvette insert HORIBA Scientific - Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig HORIBA Scientific - To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water VWR 02-0201-1000 To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables Dell - Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%) Millipore Sigma - To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA System Biosciences EQULTRA-20A-1 For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids Thermo Scientific B780020 To clean cuvettes
"Hook" tool Excelta - Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth Texwipe TX629 To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf 22363344 For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar Sp Scienceware F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap Agilent Technologies AG1000-0544 Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000 HORIBA Scientific - Nanoparticle tracking instrument

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References

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Comfort, N., Cai, K., Bloomquist, T. R., Strait, M. D., Ferrante Jr., A. W., Baccarelli, A. A. Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (169), e62447, doi:10.3791/62447 (2021).

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