Summary
Dimostriamo come utilizzare un nuovo strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle per stimare la distribuzione dimensionale e la concentrazione totale di particelle di vescicole extracellulari isolate dal tessuto adiposo perigonadale di topo e dal plasma umano.
Abstract
I ruoli fisiologici e fisiopatologici delle vescicole extracellulari (EV) sono diventati sempre più riconosciuti, rendendo il campo EV un'area di ricerca in rapida evoluzione. Esistono molti metodi diversi per l'isolamento dei veicoli elettrici, ognuno con vantaggi e svantaggi distinti che influenzano la resa a valle e la purezza dei veicoli elettrici. Pertanto, caratterizzare la preparazione EV isolata da una determinata fonte con un metodo scelto è importante per l'interpretazione dei risultati a valle e il confronto dei risultati tra i laboratori. Esistono vari metodi per determinare le dimensioni e la quantità di veicoli elettrici, che possono essere alterati da stati patologici o in risposta a condizioni esterne. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è una delle tecnologie di spicco utilizzate per l'analisi ad alto rendimento di singoli veicoli elettrici. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni dei veicoli elettrici isolati dal tessuto adiposo perigonadale del topo e dal plasma umano utilizzando una tecnologia rivoluzionaria per NTA che rappresenta i principali progressi nel campo. I risultati dimostrano che questo metodo può fornire dati riproducibili e validi sulla concentrazione totale di particelle e sulla distribuzione delle dimensioni per veicoli elettrici isolati da fonti diverse utilizzando metodi diversi, come confermato dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'adattamento di questo strumento per NTA affronterà la necessità di standardizzazione nei metodi NTA per aumentare il rigore e la riproducibilità nella ricerca EV.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole (0,03-2 μm) vescicole legate alla membrana secrete da quasi tutti i tipi di cellule1. Sono spesso indicati come "esosomi", "microvescicole" o "corpi apoptotici" a seconda del loro meccanismo di rilascio e della dimensione2. Mentre inizialmente si pensava che gli EV fossero semplicemente un mezzo per eliminare i rifiuti dalla cellula per mantenere l'omeostasi3, ora sappiamo che possono anche partecipare alla comunicazione intercellulare tramite il trasferimento di materiale molecolare - tra cui DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipidi e proteine4,5 - e che sono importanti regolatori della normale fisiologia e dei processi patologici1, 5,6,7,8.
Esistono molti metodi diversi per isolare e quantificare i veicoli elettrici, che sono stati descritti altrove9,10,11,12. Il protocollo di isolamento utilizzato e la fonte dei veicoli elettrici possono influire notevolmente sulla resa e sulla purezza dei veicoli elettrici. Anche la centrifugazione differenziale, a lungo considerata l'approccio "gold standard" per l'isolamento degli esosomi, può essere soggetta a una sostanziale variabilità che successivamente influisce sulla popolazione EV ottenuta e sulle analisi a valle13. Pertanto, le varie metodologie diverse per l'isolamento e la quantificazione dei veicoli elettrici rendono difficile confrontare, riprodurre e interpretare i risultati degli esperimenti riportati nella letteratura14. Inoltre, il rilascio di EV può essere regolato da condizioni cellulari o vari fattori esterni. È stato suggerito che gli EV svolgono un ruolo nel mantenimento dell'omeostasi cellulare proteggendo le cellule dallo stress intracellulare15, poiché diversi studi hanno dimostrato che lo stress cellulare stimola la secrezione ev. Ad esempio, è stato riportato un aumento del rilascio di EV dopo l'esposizione cellulare a ipossia, stress del reticolo endoplasmatico, stress ossidativo, stress meccanico, estratto di fumo di sigaretta e inquinamento atmosferico da particolato16,17, 18,19,20,21,22. Il rilascio di EV ha anche dimostrato di essere modificato in vivo; topi sottoposti a una dieta ricca di grassi o a digiuno per sedici ore hanno rilasciato più EV di adipociti23. Per indagare se un trattamento o una condizione specifica altera il rilascio di veicoli elettrici, il numero di veicoli elettrici deve essere determinato con precisione. La valutazione della distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici può anche indicare l'origine subcellulare predominante dei veicoli elettrici (ad esempio, fusione di endosomi tardivi/corpi multivesicolari con la membrana plasmatica rispetto al germogliamento della membrana plasmatica)24. Pertanto, vi è la necessità di metodi robusti per misurare con precisione la concentrazione totale e la distribuzione dimensionale della preparazione EV in fase di studio.
Un metodo rapido e altamente sensibile per la visualizzazione e la caratterizzazione dei veicoli elettrici in soluzione è l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Una spiegazione dettagliata dei principi di questo metodo e il confronto con metodi alternativi per la valutazione delle dimensioni e della concentrazione dei veicoli elettrici sono stati descritti in precedenza25,26,27,28. In breve, durante la misurazione NTA, i veicoli elettrici vengono visualizzati dalla luce diffusa quando vengono irradiati con un raggio laser. La luce diffusa viene focalizzata da un microscopio su una fotocamera che registra il movimento delle particelle. Il software NTA tiene traccia del moto termico casuale di ogni particella, noto come moto browniano, per determinare il coefficiente di diffusione che viene utilizzato per calcolare la dimensione di ciascuna particella utilizzando l'equazione di Stokes-Einstein. NTA è stato applicato per la prima volta alla misurazione di veicoli elettrici in un campione biologico nel 201125. Fino a poco tempo fa, c'erano solo due aziende mainstream che offrivano strumenti NTA commerciali29 fino all'introduzione del ViewSizer 3000 (di seguito denominato strumento di tracciamento delle particelle) che utilizza una combinazione di nuove soluzioni hardware e software per superare i limiti significativi di altre tecniche NTA.
Lo strumento di tracciamento delle particelle caratterizza le nanoparticelle in campioni liquidi analizzando il loro moto browniano e caratterizza particelle più grandi di dimensioni micron analizzando l'assestamento gravitazionale. L'esclusivo sistema ottico di questo strumento, che include l'illuminazione multispettrale con tre sorgenti di luce laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), consente ai ricercatori di analizzare contemporaneamente una vasta gamma di dimensioni delle particelle (ad esempio, esosomi, microvescicole). Uno schema della configurazione dello strumento è mostrato nella Figura 1.
Qui, dimostriamo come eseguire la distribuzione delle dimensioni delle particelle e le misurazioni della concentrazione di veicoli elettrici isolati di topi e umani utilizzando un nuovo strumento NTA.
Figura 1: Sistema ottico dello strumento di tracciamento delle particelle. Lo strumento NTA illumina le particelle utilizzando tre laser con le seguenti lunghezze d'onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. La registrazione video della luce diffusa dalle singole particelle viene rilevata e tracciata da una videocamera digitale orientata a 90° dalla cuvetta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutto il lavoro con questi campioni è stato eseguito in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e del Comitato di revisione istituzionale. Una panoramica schematica del metodo NTA è illustrata nella Figura 2.
Figura 2: Panoramica del metodo NTA utilizzando lo strumento di tracciamento delle particelle. Il campione viene preparato e inserito nello strumento. Il software NTA viene aperto, i parametri di registrazione vengono regolati e il campione viene focalizzato. Quindi, i dati vengono registrati, elaborati e visualizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Isolamento delle vescicole extracellulari
NOTA: Gli EV del tessuto adiposo perigonadale del topo sono stati isolati come descritto in precedenza23. I veicoli elettrici al plasma sono stati isolati da 1 mL di plasma umano utilizzando il seguente protocollo:
- Raccogliere il plasma e la centrifuga a 3.000 x g per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo.
NOTA: se ulteriori detriti rimangono rilevabili, centrifugare il surnatante per ulteriori 10 minuti a 12.000 x g e trasferire il surnatante in un nuovo tubo. - Aggiungere 67 μL del reagente di isolamento dell'esosoma per 250 μL di plasma. Mescolare bene invertendo o facendo scorrere il tubo.
- Incubare su ghiaccio in posizione verticale per 30 min.
- Centrifugare la miscela reagente/plasma di isolamento dell'esosoma a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: la centrifugazione può essere eseguita a temperatura ambiente o 4 °C con risultati simili, ma è preferibile 4 °C. Dopo la centrifugazione, i veicoli elettrici possono apparire come un pellet beige o bianco nella parte inferiore del tubo. - Aspirare accuratamente il surnatante. Girare verso il basso qualsiasi soluzione di isolamento dell'esosoma residuo e rimuovere tutte le tracce di fluido mediante aspirazione, facendo molta attenzione a non disturbare i veicoli elettrici precipitati nel pellet.
- Risuspendare il pellet in 200 μL di Buffer B (fornito dal produttore). Misurare e registrare la concentrazione proteica del campione (per il passaggio 2.8) utilizzando uno spettrofotometro, un fluorometro, un saggio di Bradford o un altro metodo preferito.
2. Purificazione di veicoli elettrici isolati
- Aggiungere 200 μL di Buffer A (fornito dal produttore) ai veicoli elettrici nuovamente sospesi.
- Togliere la colonna di purificazione (fornita), allentare il tappo a vite e staccare la chiusura inferiore. Posizionare la colonna in un tubo di raccolta.
NOTA: salvare la chiusura inferiore per i passaggi 2.7-2.9. - Centrifugare a 1.000 x g per 30 s per rimuovere il buffer di stoccaggio.
- Scartare il flusso passante e riporre la colonna nel tubo di raccolta.
- Per lavare la colonna, rimuovere il tappo e applicare 500 μL di Tampone B sulla parte superiore della resina e centrifugare a 1.000 x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso. Salvare il limite per i passaggi 2.7-2.9.
- Ripetere i passaggi 2.4-2.5 ancora una volta per lavare la colonna.
- Collegare la parte inferiore della colonna con la chiusura inferiore (dal passaggio 2.2). Applicare 100 μL di Tampone B sulla parte superiore della resina per prepararla al carico del campione.
- Aggiungere l'intero contenuto dal punto 1.6 (o fino all'equivalente in volume di 4 mg di proteine totali) alla resina. Posizionare il tappo a vite sulla parte superiore della colonna.
- Mescolare a temperatura ambiente su uno shaker rotante per non più di 5 minuti.
3. Eluizione del campione
- Allentare il tappo a vite e rimuovere la chiusura inferiore e trasferire immediatamente in un tubo microcentrifuga da 2 ml.
NOTA: il campione inizierà a eluire non appena la chiusura inferiore viene rimossa. Assicurarsi che 2 mL di tubi microcentrifuga siano pronti a ricevere l'eluato per ridurre al minimo la perdita di campione. - Centrifuga a 1.000 x g per 30 s per ottenere veicoli elettrici purificati. Eliminare la colonna.
4. Preparazione del campione per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle
- Utilizzare un materiale privo di lanugine come un panno in microfibra per coprire lo spazio di lavoro e impedire alle fibre di entrare nelle cuvette.
- Indossando i guanti, posizionare la cuvetta sulla maschera magnetica a cuvetta, quindi posizionare la barra di agitazione nella cuvetta. Maneggiare sempre le cuvette con i guanti per evitare che impronte digitali e macchie appaiano sulla superficie della cuvetta.
- Utilizzare lo strumento gancio per posizionare l'inserto nella cuvetta come illustrato nella Figura 3. È importante notare l'orientamento dell'inserto per dopo (passaggio 5.4).
Figura 3: Corretto orientamento dell'inserto all'interno della cuvetta di quarzo. La "tacca" dell'inserto dovrebbe essere visibile dalla parte anteriore della cuvetta. Questo deve essere inserito nello strumento rivolto verso la fotocamera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Utilizzando una pipetta, aggiungere lentamente 400-500 μL del campione diluente o diluito a temperatura ambiente alla cuvetta attraverso il foro nell'inserto. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Evitare di introdurre bolle d'aria.
- Per prima cosa preparare una cuvetta caricata con il diluente scelto (bianco) per misurare la concentrazione di particelle del diluente. Questo dovrebbe essere fatto prima di misurare il campione in modo che la concentrazione di fondo del campione possa essere corretta.
NOTA: un buon bianco (soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] in questo caso) avrà una concentrazione <9 x10 6 (a seconda del diluente) e visualizzerà 1-10 particelle per schermo nella vista dal vivo (Figura 4). Si raccomanda che la concentrazione effettiva di particelle del campione sia almeno 3 volte la concentrazione di fondo. - Facoltativamente, prima di registrare il campione innescare la cuvetta con 400-500 μL del campione diluente o diluito prima della misurazione. Per fare ciò, caricare 400-500 μL del campione diluito nella cuvetta, scartare la soluzione e quindi aggiungere 400-500 μL in più del campione per la misurazione. Questo può aiutare a lavare i residui all'interno della cuvetta.
- Per prima cosa preparare una cuvetta caricata con il diluente scelto (bianco) per misurare la concentrazione di particelle del diluente. Questo dovrebbe essere fatto prima di misurare il campione in modo che la concentrazione di fondo del campione possa essere corretta.
Figura 4: Visualizzazione rappresentativa in diretta streaming di un diluente all'interno del corretto intervallo di concentrazione di un bianco. Preparazioni EV diluite in PBS filtrato (0,02 μm o 3 kDa, preferibile). Un buon bianco visualizzerà ~ 1-10 particelle per schermo nella vista dal vivo, producendo una concentrazione nell'intervallo 105-106. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Tappare la cuvetta e verificare la presenza di bolle. Tocca le bolle se necessario. Utilizzare un panno privo di lanugine per pulire le facce esterne della cuvetta.
5. Procedura di avvio dello strumento di tracciamento delle particelle
- Accendere la postazione di lavoro e lo strumento del computer, attendere qualche minuto prima di eseguire il primo campione e avviare il programma facendo clic sull'icona del software. Quando richiesto, fare clic su NTA sullo schermo per eseguire l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Inizia nella scheda Registrazione e fai clic sulle varie schede software(Registra, Elabora, Traccia)per passare da una all'altro in tutto il protocollo. Registrare prima il campione (diluente o preparazione EV), quindi elaborare le registrazioni e infine tracciare i risultati.
- Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo per compilare tutte le informazioni necessarie sul campione. Verificare che tutti i campi necessari siano compilati e accurati, ad esempio Nome campione, Descrizione, Preparazione del campione, Fattore di diluizione [1000], Temperatura target (impostata su 22 °C) e Diluente: selezionare il diluente dal menu a discesa e utilizzare PBS come diluente per i veicoli elettrici. Selezionando PBS dal menu a discesa, la salinità verrà popolata automaticamente al 9%. Queste informazioni sono necessarie per determinare la viscosità dinamica del liquido.
NOTA: possono essere necessari fino a 3 minuti prima che la temperatura si equilibra all'interno della cuvetta anche se la sonda mostra già la temperatura desiderata (ad esempio, il punto verde diventa stabile). Le lettura del campione potrebbero variare considerevolmente se la temperatura target non è impostata, poiché le differenze di temperatura del campione potrebbero alterare notevolmente il moto browniano delle particelle. - Aprire il coperchio dello strumento e rimuovere il cappuccio protettivo che copre il punto in cui verrà posizionata la cuvetta.
ATTENZIONE: Lo strumento di tracciamento delle particelle è certificato come prodotto laser di Classe 1 (21 CFR Ch. I parte 1040), contenente laser che possono essere pericolosi e potrebbero causare gravi lesioni come ustioni e/o danni permanenti alla vista. Per evitare incidenti o lesioni, non rimuovere il coperchio dello strumento svitando i bulloni dal lato. Si noti che durante il funzionamento, i raggi laser sono completamente chiusi, senza rappresentare una minaccia per gli utenti. Inoltre, un interblocco di sicurezza magnetico è integrato nel porta campioni dello strumento per impedire ai laser di funzionare quando viene rimosso il cappuccio del porta campioni. - Posizionare la cuvetta (dal punto 4.3) all'interno dello strumento con l'orientamento corretto (vedere figura 5). Sostituire il cappuccio sopra la cuvetta e chiudere il coperchio dello strumento. Azionare sempre lo strumento con il cappuccio in posizione sopra il porta campioni. Non disabilitare o tentare di aggirare la funzione di interblocco di sicurezza.
Figura 5: Corretto orientamento della cuvetta all'interno dello strumento di tracciamento delle particelle. La faccia della cuvetta (con la "tacca" dell'inserto visibile) dovrebbe essere rivolte verso la fotocamera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Accendi la fotocamera facendo clic sulla freccia sopra Streaming.
- Fare clic sulla freccia chevron per espandere le impostazioni di registrazione. Impostare guadagno e potenza laser sui valori appropriati per l'applicazione. Vedere la Tabella 1 (e la Figura supplementare 1)per i parametri utilizzati per nTA di veicoli elettrici di piccole dimensioni (100 nm).
NOTA: queste impostazioni avanzate a cui si accede facendo clic sulla freccia chevron potrebbero essere protette da password. Utilizzare le stesse impostazioni per la registrazione e l'elaborazione per il diluente (vuoto) di quelle utilizzate per i campioni successivi. - Regolare la messa a fuoco fino a quando le particelle non sono correttamente focalizzate. La messa a fuoco dovrebbe essere fatta su particelle relativamente piccole (Figura 6). Per la piccola quantificazione EV (compatibile con gli esosomi), si consigliano le seguenti impostazioni di registrazione: Frame rate: 30 fps, Esposizione: 15 ms, Tempo di agitazione: 5 s, Tempo di attesa: 3 s, Potenza laser - Blu: 210 mW, Verde: 12 mW, Rosso: 8 mW, Fotogrammi per video: 300 fotogrammi e Guadagno: 30 dB.
NOTA: l'utente può aumentare lo zoom a 1x e/o aumentare il guadagno per aiutare con la messa a fuoco. Ricorda di reim impostare questi parametri sui valori consigliati prima di registrare video.
Figura 6: Viste rappresentative in live streaming che mostrano lo stato attivo delle particelle. (A) Un esempio di visualizzazione in live streaming di particelle non a fuoco. Le particelle hanno un alone luminoso o appaiono sfocate. Regola la messa a fuoco. (B) Un esempio di visualizzazione in live streaming di particelle a fuoco corretta. Le particelle più piccole sono a fuoco. Inizia la registrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Eseguire un controllo di qualità visiva per garantire che il campione sia correttamente diluito. Se il campione è troppo concentrato, rimuovere la cuvetta dallo strumento e diluire il campione in sequenza. Ripetere l'operazione fino a quando il campione non è correttamente diluito prima di procedere al passaggio 6.
NOTA: non diluire eccessivamente il campione! Fai sempre diluizioni in sequenza. Lo spazio vuoto ideale visualizzerà solo poche particelle sullo schermo (1-4) come mostrato nella Figura 4. Per quanto riguarda i campioni EV, un campione correttamente diluito avrà circa 20-100 particelle visibili sullo schermo, senza immagini luminose o nuvolose sullo sfondo (vedere la Figura 7 come esempio). Ciò dovrebbe comportare una concentrazione ottimale di particelle nell'intervallo da 5 x 106 a 2 x 108 particelle per mL (senza aggiustamento per il fattore di diluizione).
Figura 7: Viste rappresentative in diretta streaming che raffigurano diverse diluizioni di particelle. (A) Un esempio di visualizzazione in diretta streaming di un campione troppo concentrato. La registrazione di un campione troppo concentrato produrrà risultati imprecisi. (B) Un esempio di visualizzazione in diretta streaming di un campione correttamente diluito. Ci sono 60-100 particelle visibili sullo schermo e la registrazione si traduce in una concentrazione grezza di 5 x10 6- 2 x 108 particelle / mL. (C) Un esempio di visualizzazione in live streaming di un campione troppo diluito. Se un campione è questo diluito, non ci saranno abbastanza particelle tracciate, abbassando la dimensione del campione e, quindi, i risultati saranno statisticamente non validi. In questo caso, si consiglia di aumentare il numero di video registrati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Acquisizione dati video
- (Facoltativo) Impostare l'impostazione dello zoom su 0,5x per risparmiare larghezza di banda ed evitare la perdita di fotogrammi.
- Inizia a registrare i video facendo clic su Registra (vedi Tabella 1 per i parametri di registrazione consigliati).
NOTA: per impostazione predefinita, lo strumento mescola il campione per 5 s, attende 3 s e quindi registra per 10 s prima di ripetere questo processo. Il tempo di misurazione tipico per 50 video è di ~ 15 minuti per registrare e ~ 13 minuti per elaborare. - Non toccare lo strumento durante la registrazione di video. Assicurarsi che la superficie del banco di laboratorio non vibri.
NOTA: Si preferisce che lo strumento sia impostato su una piattaforma o un tavolo antivibrante per ridurre eventuali disturbi vibrazionali provenienti da apparecchiature vicine che interferiranno con la determinazione del movimento delle nanoparticelle. Evitare di utilizzare centrifughe, miscelatori a vortice o altri potenziali dispositivi che generano vibrazioni sullo stesso banco dello strumento di tracciamento delle particelle. Le vibrazioni sono facilmente visibili sullo schermo come allungamento di particelle solitamente rotonde. Se esposto a vibrazioni vigorose, lo strumento può richiedere il riallineamento di elementi ottici. Lo strumento non è stato progettato per essere revisionato o tarato dal cliente; contattare il produttore per la manutenzione, l'assistenza e la calibrazione. - Nota qualsiasi video registrato con particelle molto grandi visibili come macchie bianche grandi e irregolari. Rimuovi questi video dall'elaborazione nel passaggio 7.3.
7. Trattamento dei dati acquisiti
- Quando viene visualizzato un messaggio che indica che i video sono stati registrati, fare clic su OK per completare la registrazione. Quindi selezionare la scheda Processo.
NOTA: il protocollo può essere interrotto qui. L'elaborazione dei dati acquisiti può essere riavviata in un secondo momento passando direttamente alla scheda Processo dopo aver aperto il software dello strumento di tracciamento delle particelle e specificando la directory in cui vengono salvati i video registrati. - Quando analizzate i veicoli elettrici, selezionare la casella Disattiva sostituzione rilevamento automatico e impostare il diametro della feature su 30. Fare clic su Elabora. (Vedere la Tabella 2 per le impostazioni di elaborazione e la Figura supplementare 2 per la visualizzazione dell'elaborazione). Verrà visualizzato un grafico di distribuzione in tempo reale in modo che l'utente possa visualizzare l'elaborazione in tempo reale.
- Per gli esosomi, elaborare con Soglia di rilevamento impostata sul campione polidisperso predefinito. Elaborare i dati con Detection Threshold Manual impostato su 0,8 invece di una soglia standard di 0,99 solo per soluzioni con differenze molto grandi nelle dimensioni delle particelle.
- Se alcuni video avevano particelle notevolmente molto grandi visibili (vedere il passaggio 6.4), passare alla directory dei video registrati e rimuovere il video problematico. Dopo aver modificato l'elenco dei file video, modificare il numero di video registrati in altri registri mantenuti dall'utente.
- Al termine dell'elaborazione, fare clic su OK. Quindi, selezionare la scheda Plot. Per i veicoli elettrici, visualizzare il grafico principale come LogBinSilica.
NOTA: nella scheda Plot, l'utente può personalizzare altre funzionalità del grafico, ad esempio la definizione dell'intervallo dell'asse x (diametro delle particelle, nm) per impostare l'area di integrazione per la figura prodotta.
8. Visualizzare e interpretare i risultati
- Per creare un report PDF, fare clic sul pulsante Report. La misurazione è ora completa e i risultati possono essere visualizzati.
NOTA: Ricordarsi di registrare ed elaborare prima lo spazio vuoto in modo che la concentrazione di fondo dei campioni successivi possa essere corretta. Se questo passaggio viene dimenticato, il bianco può essere registrato dopo i campioni e la concentrazione di particelle del campione corretta manualmente. - Esaminare il report PDF che visualizza la dimensione media, mediana e modale, nonché la concentrazione regolata per il fattore di diluizione e corretta sottraendo la concentrazione di particelle del diluente. Viene mostrata anche la larghezza di distribuzione (deviazione standard).
NOTA: esistono pochissime applicazioni in cui un singolo valore è appropriato e rappresentativo. Pertanto, si consiglia di descrivere l'intera distribuzione dimensionale e di riportare la larghezza della distribuzione per qualsiasi campione analizzato (come mostrato nella Tabella 3 per esempio). - Registrare le seguenti impostazioni dello strumento utilizzate per generare i dati che devono essere indicati quando si riportano i risultati: Diluente, Potenza laser di ciascun laser [mW], Esposizione [ms], Guadagno [dB], Frequenza fotogrammi [fps], Fotogrammi per video, Numero di video registrati, Impostazione di elaborazione (ad esempio, LogBinSilica), Intervallo di integrazione [min nm, nm massimo] (consigliato per impostare min a 50 nm) e Numero di particelle tracciate (desiderabile per analizzare almeno ~ 150 particelle per video; minimo 3.750 tracce totali per campione raccomandato per evitare picchi artefatti nella distribuzione granulometrica e generare dati statisticamente significativi).
9. Pulizia delle cuvette
- Pulire manualmente le cuvette tra i campioni. Per prima cosa, svuotare la cuvetta.
NOTA: il campione può essere recuperato dalla cuvetta e salvato o scartato. - Una volta che la cuvetta è vuota, pulire la cuvetta risciacquandola 10-15 volte con acqua deionabilizzata (DI). Quindi, risciacquare 3 volte con etanolo (70-100%). Quando lo fai, assicurati di riempire completamente la cuvetta con solvente.
- Asciugare l'esterno della cuvetta con un panno in microfibra privo di lanugine. Evitare sbavature sulle superfici. Asciugare all'aria l'interno della cuvetta o asciugare utilizzando uno spolverino ad aria compressa.
NOTA: per pulire le superfici ottiche della cuvetta, è necessario utilizzare solo carta per la pulizia delle lenti o panno in microfibra privo di lanugine, poiché la maggior parte dei prodotti di carta contiene piccole fibre di legno che possono graffiare o danneggiare la superficie della cuvetta. - Preparare due flaconcini di vetro scintillante: uno riempito con etanolo al 70-100% e l'altro con acqua DI. Risciacquare gli inserti e mescolare prima le barre nell'etanolo (poi nell'acqua DI) posizionando l'inserto/la barra di agitazione nell'apposito flaconcino a scintillazione e agitando vigorosamente il flaconcino. Asciugare gli inserti e mescolare le barre utilizzando panni privi di lanugine o spolveratori ad aria compressa.
NOTA: La cuvetta e l'inserto possono anche essere puliti utilizzando un bagno d'acqua sonicante. Per fare ciò, assicurarsi innanzitutto che l'unità sonicante contenga abbastanza acqua (almeno 5 cm di profondità). Quindi posizionare la cuvetta e inserire all'interno di un bicchiere di vetro (50 ml o superiore), riempire il becher con alcool allo stesso livello del bagno d'acqua, posizionare il becher nell'acqua e accendere l'alimentazione. Sonicare per un massimo di 5 minuti alla volta, consentendo alla macchina di riposare >5 minuti tra ogni raffica di 5 minuti se sono necessari tempi più lunghi. - Al termine, mettere immediatamente via tutti i componenti puliti e asciugati per la conservazione.
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Representative Results
Prima di questa dimostrazione, la calibrazione dello strumento è stata prima testata per garantire la validità dei dati acquisiti misurando la distribuzione dimensionale degli standard di perline di polistirene. Abbiamo testato la distribuzione dimensionale di perle da 100 nm e 400 nm utilizzando i parametri di registrazione predefiniti e le impostazioni di elaborazione consigliate in questo protocollo (Figura 8).
Per lo standard di perline di polistirene da 100 nm, è stata misurata una concentrazione di 4,205 x10 7 particelle/ml. La dimensione media (deviazione standard, SD) era di 102 (±17) nm con un coefficiente di variazione (CV) di 0,16. I valori D10/D50/D90 erano 76/104/126 nm. Ciò indica che lo strumento di tracciamento delle particelle ha riportato con precisione la dimensione delle perline monodisperse da 100 nm. Per lo standard di perline di polistirene da 400 nm, la concentrazione era di 4.365 x 107 particelle/ml. La dimensione media (SD) era di 391 (±47) nm, con un CV di 0,12. I valori D10/D50/D90 erano 150/358/456 nm (Tabella 3). Mentre la media riportata è molto vicina alla vera dimensione delle perle, possiamo vedere che le impostazioni dello strumento applicate in questo protocollo sono più accurate per le particelle più piccole ~ 100 nm. Pertanto, per le particelle più grandi di 400 nm, si consiglia di ottimizzare i parametri laser. I ricercatori dovrebbero prima condurre un metodo come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per una stima della distribuzione delle dimensioni EV risultante da una determinata fonte e il metodo di isolamento prima dell'NTA.
Una concentrazione media di 4,41 x 1010 particelle/mL è stata misurata per il campione EV di tessuto di topo utilizzato per questa dimostrazione. Questo campione è stato registrato seguendo i parametri riassunti nella Tabella 1 ed elaborato seguendo i parametri descritti nella Tabella 2. Dimostriamo l'impatto di vari fattori di diluizione nella Figura 9 e riportiamo le concentrazioni di particelle grezze e corrette nella Tabella 4. La diluizione ottimale per i veicoli elettrici derivati dal tessuto di topo era compresa tra 1.000 e 3.000, mentre per i veicoli elettrici derivati dal plasma umano era di 1.000, indicando che quando si testava per la prima volta una data fonte di biofluidi o un metodo di isolamento EV per NTA, le diluizioni seriali dovevano essere testate in modo da poter identificare la diluizione ottimale per la misurazione dell'NTA. Si consiglia di misurare e segnalare almeno due diverse diluizioni di un campione. Abbiamo anche misurato quattro campioni aggiuntivi in varie diluizioni su due distinti strumenti di tracciamento delle particelle. La Figura 3 supplementare confronta la precisione dello strumento di tracciamento delle particelle nelle misurazioni delle dimensioni rispetto a un altro strumento NTA disponibile in commercio. La Tabella supplementare 1 dimostra ulteriormente la precisione delle misurazioni di questo strumento, mostrando che la concentrazione di particelle è cambiata proporzionalmente con la diluizione del campione, ma che le misure di dimensione delle particelle non lo hanno fatto.
Dopo l'elaborazione, i risultati (insieme alle informazioni sullo strumento / software, alle impostazioni di registrazione ed elaborazione e alle note sperimentali) possono essere salvati in un rapporto .pdf. L'istogramma incluso in questo rapporto può essere modificato come descritto nel protocollo (paragrafo 7.4). I risultati non elaborati vengono salvati in un file .dat che può essere esportato. Anche i video registrati vengono salvati e possono essere utilizzati per la successiva elaborazione e analisi off-line. Tuttavia, una volta registrati i video, le impostazioni di registrazione non possono essere modificate retrospettivamente.
L'impatto dell'alterazione delle varie potenze laser e del guadagno nelle impostazioni di registrazione è stato dimostrato utilizzando veicoli elettrici derivati dal plasma umano. Questo è visualizzato nelle figure 10-12 e le informazioni quantitative basate su queste immagini sono mostrate nella tabella 5. L'aumento del guadagno aumenta la sensibilità della telecamera, consentendo la visualizzazione di particelle più piccole (Figura 10) con conseguente aumento della concentrazione totale di particelle con una dimensione media delle particelle più piccola (Tabella 5). Tuttavia, l'aumento del guadagno superiore a 30 dB (le nostre raccomandazioni) rende la vista troppo granulosa, consentendo al rumore di oscurare la misurazione delle particelle vere. Con un guadagno della fotocamera di 30 dB, l'effetto di alterare la potenza del laser blu è illustrato nella Figura 11. Aumentando la potenza del laser blu (450 nm, lunghezza d'onda corta) si traduce in una maggiore risoluzione per rilevare particelle più piccole (cioè quelle con una dimensione coerente con gli esosomi). Mantenendo costanti le potenze laser verdi e rosse alle impostazioni predefinite, aumentando la potenza del laser blu da 70 mW a 210 mW si è spostata la dimensione media delle particelle riportata da 122 nm a 105 nm e si è aumentata la concentrazione totale di particelle riportata da 1,1 x10 8 a 1,7 x 108 (Tabella 5).
È stato anche dimostrato l'effetto dell'aumento delle potenze laser verdi e rosse (Figura 12). Aumentando la potenza del laser rosso (650 nm, lunghezza d'onda lunga) è aumentata la dimensione media delle particelle riportata da 175 a 246 nm. La concentrazione totale di particelle riportata è diminuita, ma questo perché in questo campione di plasma umano EV non avevamo molte particelle di grandi dimensioni presenti, confermate dalla colorazione negativa TEM (Figura supplementare 4). L'aumento della potenza del laser verde ha comportato una diminuzione della dimensione media delle particelle riportata e un aumento della concentrazione totale di particelle riportata. Pertanto, l'utente può ottimizzare la potenza dei tre laser per rilevare sensibilmente particelle di varie dimensioni.
Questo protocollo è ottimizzato per vescicole più piccole (ad esempio, <400 nm). I ricercatori interessati a microvescicole di dimensioni maggiori (ad esempio, 400-1000 nm) sono incoraggiati a ottimizzare i parametri laser utilizzando perle organosilice cave che hanno proprietà di diffusione della luce simili a quelle dei veicoli elettrici che li rendono un riferimento più adatto rispetto agli standard di polistirene o perline di silice30. Tuttavia, le nanoparticelle di silice possono essere il miglior sostituto pratico fino a quando gli standard organosilica non saranno più ampiamente disponibili.
Qui, uno strumento NTA è stato utilizzato per quantificare con successo i veicoli elettrici isolati dal tessuto di topo mediante ultracentrifugazione e plasma umano utilizzando un kit commerciale. Gli effetti dell'alterazione dei parametri NTA sono stati illustrati e mostrano che i parametri in questo protocollo sono ottimizzati per piccole vescicole. È stata anche mostrata l'importanza della fase di diluizione e mostra che lo strumento di tracciamento delle particelle qui dimostrato può rilevare con precisione le variazioni dei fattori di diluizione. La concentrazione è cambiata proporzionalmente con diluizioni multiple, mentre la distribuzione dimensionale no. I dati risultanti hanno mostrato poca variabilità tecnica. Pertanto, l'adattamento di questo protocollo da parte dei ricercatori che utilizzano questo strumento per NTA aumenterà il rigore e la riproducibilità nel campo della ricerca EV.
Figura 8: Distribuzioni granulometriche delle norme monodisperse per perline di polistirene. (A) Distribuzione granulometrica di 100 nm polistirene perline standard. (B) Distribuzione granulometrica di 400 nm di polistirene perlato standard. I valori sono riportati nella Tabella 3. Inset mostra un esempio di visualizzazione live stream del primo fotogramma misurato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Concentrazioni grezze di particelle totali per fattore di diluizione per ev del tessuto adiposo perigonadale di topo. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Per ogni diluizione sono state effettuate tre misurazioni. I valori sono riportati nella Tabella 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Impatto visivo dell'aumento del guadagno. Immagini rappresentative di particelle misurate con impostazioni laser predefinite (Blu = 70 mW, Verde = 12 mW, Rosso = 8 mW) e guadagno impostato su (A) 18 dB, (B) 24 dB - predefinito e (C) 30 dB - consigliato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Effetto del laser blu su piccole particelle quando i laser rossi e verdi sono impostati sulle impostazioni predefinite. (A) Laser blu = 70 mW (predefinito). (B) Laser blu = 210 mW (consigliato). Più piccole particelle sono visibili e a fuoco quando la potenza del laser blu viene aumentata a 210 mW. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Impatto visivo della potenza laser blu, verde e rossa alterata. Le viste rappresentative dello schermo dal vivo raffigurano le diverse dimensioni delle particelle visualizzate attraverso diverse impostazioni laser. I valori NTA risultanti sono riportati nella Tabella 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Particelle | Diametro [nm] | Laser blu [mW] | Laser verde [mW] | Laser rosso [mW] | Guadagno della fotocamera [dB] | Regolazione della temperatura | Elaborazione | # Video |
| Esosomi | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Abilitato, impostato su 22 ºC | Sostituzione del rilevamento automatico disabilitata | 50 |
Tabella 1: Parametri di registrazione per piccole vescicole extracellulari (~ 100 nm).
| Descrizione del processo | Soglia di rilevamento | Disabilita l'override del rilevamento automatico | Diametro feature [px] |
| Esosomi | Esempio di polidisperso | Quadrettato | 30 |
Tabella 2: Parametri di lavorazione per piccole vescicole extracellulari (~100 nm).
| Dimensione del polistirene standard [nm] | Intervallo di integrazione [nm] | Dimensione media [nm] | Dimensione SD [nm] | CV di taglia | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Conteggi totali |
| 100 | Da 50 a 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | Da 300 a 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tabella 3: Risultati NTA degli standard monodispersi di polistirene perline. Entrambi gli standard sono stati diluiti in modo ottimale, con concentrazioni grezze per lo standard 100 nm e 400 nm di 4.205 x10 7 particelle / mL e 4.365 x 107 particelle / mL, rispettivamente. D10 è il punto nella distribuzione dimensionale in cui è contenuto il 10% del campione, D50 è il punto in cui è contenuto il 50% del campione (mediana) e D90 è il punto in cui è contenuto il 90% del campione. SD: deviazione standard; CV: Coefficiente di variazione.
| Fattore di diluizione | Concentrazione di particelle, particelle/mL | Concentrazione totale di particelle, particelle/mL |
| Crudo | Rettificato per il fattore di diluizione | |
| 1000 | 4,10E+07 | 4,10E+10 |
| 4,00E+07 | 4,00E+10 | |
| 3,70E+07 | 3,70E+10 | |
| media (SD) | 3,93E+07 (1,70E+06) | 3,93E+10 (1,70E+09) |
| 1500 | 3,60E+07 | 5,40E+10 |
| 2,60E+07 | 3,80E+10 | |
| 2,90E+07 | 4,40E+10 | |
| media (SD) | 3,03E+07 (4,19E+06) | 4,55E+10 (6,60E+09) |
| 2000 | 2,40E+07 | 4,80E+10 |
| 2,30E+07 | 4,60E+10 | |
| 2,00E+07 | 4,00E+10 | |
| media (SD) | 2,23E+07 (1,70E+06) | 4,46E+10 (3,40E+09) |
| 3000 | 2,00E+07 | 6,00E+10 |
| 1,30E+07 | 3,90E+10 | |
| 1,40E+07 | 4,20E+10 | |
| media (SD) | 1,57E+07 (3,09E+06) | 4,71E+10 (9,27E+09) |
Tabella 4: I risultati NTA degli EV del tessuto adiposo perigonadale di topo dimostrano la riproducibilità delle misurazioni NTA. Concentrazioni di particelle NTA grezze (particelle/mL) misurate sullo strumento di tracciamento delle particelle e concentrazione totale di particelle (particelle/mL) aggiustate per il fattore di diluizione degli EV derivati dal tessuto adiposo perigonadale di topo a varie diluizioni.
| Guadagno [dB] | Laser blu [mW] | Laser verde [mW] | Laser rosso [mW] | Concentrazione totale, particelle/mL (grezzo) | Dimensione media [nm]* | Deviazione standard di taglia / CV | Dimensione modale | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5,90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1,00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1,70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1,10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1,00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7,00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2,80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4,40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1,50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9,20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Integrato nell'intervallo 50-1000 nm | ||||||||
Tabella 5: I risultati NTA dei veicoli elettrici derivati dal plasma umano dimostrano l'effetto dell'alterazione della potenza e del guadagno del laser sulle misurazioni delle dimensioni e della concentrazione di particelle dei veicoli elettrici umani (diluizione 1:1000). D10 è il punto nella distribuzione dimensionale in cui è contenuto il 10% del campione, D50 è il punto in cui è contenuto il 50% del campione (mediana) e D90 è il punto in cui è contenuto il 90% del campione. SD: deviazione standard; CV: Coefficiente di variazione.
Figura 1 supplementare: Screenshot del pannello di registrazione che raffigura i parametri di registrazione consigliati. Accedi alle impostazioni avanzate per modificare il guadagno della fotocamera e la potenza del laser in impostazioni consigliate. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura 2 supplementare: Screenshot del pannello di elaborazione che illustra le impostazioni di elaborazione consigliate. Assicurati che "Disabilita sostituzione rilevamento automatico" sia selezionata e che il diametro della feature sia impostato su "30". Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Misurazioni delle dimensioni delle particelle su diluizioni multiple: precisione dello strumento di tracciamento delle particelle (ViewSizer 3000) rispetto allo strumento NTA commerciale comparabile (NanoSight NS300). L'NTA degli EV isolati dal tessuto adiposo perigonadale del topo è stato eseguito su due strumenti. Per ogni topo sono state misurate tre diluizioni (1:1000, 1:500, 1:100). I valori grezzi per le misure adottate su ViewSizer 3000 (dimostrati in questo protocollo) sono mostrati nella Tabella supplementare 1. Le impostazioni di acquisizione e analisi per le misure NanoSight NS300 sono mostrate nella Tabella supplementare 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 4: Microscopia elettronica rappresentativa a trasmissione a macchie negative (TEM) di veicoli elettrici derivati dal plasma umano. Le griglie sono state riprese con un microscopio elettronico a trasmissione che opera a una tensione di accelerazione di 100 kV. Le immagini sono state catturate su una telecamera CCD 2K x 2K. La barra della scala riflette l'ingrandimento della fotocamera. Le micrografie elettroniche mostrano vescicole rotonde di circa 25 nm di diametro. Ingrandimento 100k, barra di scala 200 nm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: ViewSizer 3000 misurazioni delle dimensioni delle particelle e della concentrazione dei veicoli elettrici del tessuto adiposo perigonadale di topo attraverso diluizioni multiple. È stata eseguita NTA di EV isolati dal tessuto adiposo perigonadale del topo. Per ogni topo sono state misurate tre diluizioni (1:1000, 1:500, 1:100). D10 è il punto nella distribuzione dimensionale in cui è contenuto il 10% del campione, D50 è il punto in cui è contenuto il 50% del campione (mediana) e D90 è il punto in cui è contenuto il 90% del campione. Le concentrazioni di particelle sono corrette in background. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 2: Impostazioni di acquisizione e analisi di NanoSight NS300. Impostazioni (utilizzando NTA 3.4 Build 3.4.003) utilizzate per misurare i campioni EV di tessuto adiposo perigonadale di topo riportati nella Figura supplementare 3. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Qui, dimostriamo un protocollo per NTA di veicoli elettrici per misurare la distribuzione dimensionale di un'ampia gamma di dimensioni delle particelle contemporaneamente e misurare la concentrazione totale di EV in un campione polidisperso. In questo studio, il tessuto adiposo perigonadale di topo e il plasma umano sono stati utilizzati come fonte di veicoli elettrici. Tuttavia, gli EV isolati da altri tessuti o fluidi biologici come siero, urina, saliva, latte materno, liquido amniotico e surnatante di coltura cellulare possono anche essere utilizzati per NTA. Le misurazioni degli standard delle perle di polistirene hanno assicurato che lo strumento fosse correttamente calibrato e hanno dimostrato che questo strumento NTA può misurare correttamente la dimensione delle nanoparticelle ≤ 400 nm. Sono state quindi testate varie diluizioni di un campione EV di tessuto di topo. Come mostrato nella Figura 9,la concentrazione di particelle riportata scala di conseguenza con il fattore di diluizione, come previsto, dimostrando che lo strumento è in grado di rilevare con precisione la concentrazione di particelle a varie diluizioni con poca variabilità tra le repliche tecniche. Tuttavia, questo è stato quando si lavora con concentrazioni di particelle all'interno del campo di lavoro dello strumento (da 5 x10 6 a 2 x 108 particelle per mL); diluire in modo appropriato un campione è un passo critico nel protocollo. L'aggiustamento per il fattore di diluizione ha prodotto all'incirca la stessa stima per la concentrazione totale di particelle del campione, con un CV di 15,1 tra le quattro diluizioni testate. Inoltre, diverse misure, ripetute su diluizioni multiple degli stessi campioni, hanno mostrato la precisione nelle valutazioni della distribuzione granulometrica, poiché le concentrazioni di particelle sono scalate proporzionalmente con il fattore di diluizione ma le misure di dimensione riportate no.
I veicoli elettrici in sospensione subiscono un movimento termico casuale noto come moto browniano, secondo il quale la diffusione di particelle in una sospensione liquida è inversamente proporzionale alle loro dimensioni. Questo moto casuale è modellato dall'equazione di Stokes-Einstein, dove il diametro idrodinamico D di una particella sferica è:
Dove kB è la costante di Boltzmann e R è il raggio delle particelle. Come si può vedere dall'equazione, il movimento delle particelle in sospensione dipende anche dalla temperatura (T) e dalla viscosità dinamica (η) del liquido. Durante l'NTA, i veicoli elettrici vengono irradiati con raggi laser focalizzati che passano attraverso le particelle in sospensione e vengono rilevati dall'illuminazione incidente proveniente dai laser. La luce diffusa da ogni singola particella viene focalizzata da un microscopio sul sensore di immagine di una telecamera CCD (Charge-Coupled Device) ad alta risoluzione e sensibile alla luce, che registra le immagini digitali della luce diffusa delle particelle (Figura 1). Il software NTA identifica e traccia il moto browniano di ogni singola particella per calcolare il coefficiente di diffusione di ogni particella. Questo viene utilizzato insieme alla temperatura e alla viscosità del liquido contenente le particelle per calcolare il diametro delle particelle usando l'equazione di Stokes-Einstein. Pertanto, una singola misurazione può determinare due informazioni critiche: la distribuzione granulometrica e il numero totale di particelle dei veicoli elettrici in sospensione.
Un confronto tra NTA e altre tecniche per rilevare e quantificare i veicoli elettrici è stato descritto altrove31,32. Rispetto ad altri metodi basati sulla diffusione della luce come la diffusione dinamica della luce (DLS), nta ha capacità di risoluzione più elevate ed è un metodo particolarmente potente per analizzare particelle con un diametro medio inferiore a 100 nm. A differenza dell'analisi a singola particella come TEM, l'NTA non richiede tempo o tecnicamente impegnativo e può fenotipizzare un intero campione in un volume relativamente basso contemporaneamente in modo semi-automatizzato. Mentre NTA è una potente tecnica di caratterizzazione, ha dei limiti. In primo luogo, nTA è soggetto a limiti di sensibilità a causa della forte diminuzione dell'intensità della luce diffusa che si ridimensiona con il diametro delle particelle, causando la scomparsa della luce diffusa di particelle molto piccole al di sotto del rumore di fondo33. Pertanto, NTA ha ridotto la sensibilità per i veicoli elettrici di dimensioni inferiori a ~ 50 nm31 e si traduce in una sovrastima delle dimensioni dei veicoli elettrici. I laser a lunghezza d'onda corta sono necessari per rilevare le particelle più piccole di un campione polidisperso a causa del loro potenziale di diffusione della luce. Tuttavia, questo strumento di tracciamento delle particelle offre un miglioramento a questa limitazione inerente alla tecnologia di tracciamento delle nanoparticelle. Dotato di tre sorgenti luminose variabili (450 nm, 520 nm, 635 nm), questo sistema consente la visualizzazione di particelle su un'ampia gamma di dimensioni, rendendo questo strumento uno strumento particolarmente prezioso per le analisi NTA di campioni polidispersi come una popolazione eterogenea di veicoli elettrici. Tuttavia, poiché la maggior parte dei preparati EV sarà polidispersa nella composizione e probabilmente conterrà impurità, i ricercatori dovrebbero essere consapevoli del fatto che i limiti di rilevamento dipendenti dal campione influenzano la forma della distribuzione dimensionale complessiva e quindi esercitare cautela nell'interpretazione dei risultati.
Un altro importante limite di NTA è che misura più di un semplice EV. Lo strumento NTA rileverà, misurerà e conterà tutte le particelle che superano il limite di rilevamento, inclusi aggregati proteici, lipoproteine, detriti cellulari e contaminazione causata da diluenti. Tuttavia, la concentrazione di particelle sullo sfondo può essere corretta misurando la concentrazione di particelle del diluente prima del caricamento e misurando un campione. Si consiglia di utilizzare almeno PBS filtrato da 0,02 μm e di aver riscontrato una contaminazione da particelle molto bassa quando si utilizzano PBS filtrati da 3 kDa. Inoltre, è possibile estendere l'NTA per misurare e analizzare i veicoli elettrici etichettati in modo fluorescente, superando la limitazione della misurazione non specifica. Sono disponibili kit commerciali che tingono in modo specifico ed efficiente le membrane solo di vescicole intatte, esclusi i frammenti di membrana, gli aggregati proteici e altre particelle dalla misurazione NTA. Pertanto, i dati derivati dall'NTA fluorescente rappresentano in modo più accurato la vera concentrazione ev e la distribuzione delle dimensioni. Attraverso la marcatura selettiva degli antigeni di superficie EV, l'NTA fluorescente può anche misurare specifici veicoli elettrici etichettati da anticorpi marcati fluorescentemente, consentendo il conteggio e il dimensionamento di sottopopolazioni EV antigene-specifiche e biologicamente rilevanti.
C'è stato poco lavoro sulla standardizzazione dei protocolli NTA, rendendo difficile la comparabilità dei risultati e ostacolando la riproducibilità tra campioni, giorni, operatori e laboratori. Lo strumento di tracciamento delle particelle dimostrato in questo protocollo richiede poco tempo pratico. Abbiamo anche notato quali impostazioni dello strumento gli utenti dovrebbero segnalare per facilitare la riproducibilità dei dati generati. Pertanto, seguire il protocollo ottimizzato qui esposto dovrebbe portare alla standardizzazione e consentire il confronto dei risultati tra i laboratori. Un altro vantaggio dell'utilizzo di questo strumento è che il campione viene preparato in una cuvetta, che consente allo strumento di mescolare ripetutamente tra i video, garantendo un campione statisticamente casuale per ogni video e producendo un risultato più riproducibile rispetto ad altri strumenti NTA disponibili in commercio che si basano su pompe a siringa e celle di flusso. Inoltre, i laser multipli consentono il rilevamento di particelle con indici di rifrazione variabili, ottenendo risultati più robusti. Tuttavia, il funzionamento di questo strumento di tracciamento delle particelle non richiede la conoscenza delle proprietà del materiale particellare come l'indice di rifrazione, rendendo le misurazioni più riproducibili tra gli operatori.
I veicoli elettrici sono stati identificati in quasi tutti i biofluidi testati2,5. Tuttavia, l'isolamento efficace di veicoli elettrici specifici (ad esempio, veicoli elettrici specifici per tipo cellulare) da diversi mezzi (ad esempio, sangue, latte materno, terreni di coltura cellulare) presenta una sfida difficile. Sono stati descritti molti metodi diversi per l'isolamento dei veicoli elettrici9. L'NTA può essere eseguita per confrontare i rendimenti dei veicoli elettrici isolati utilizzando metodi diversi e identificare le variazioni nelle vescicole che derivano da diversi metodi di isolamento. Questo è importante per interpretare i risultati a valle, poiché attualmente la funzione di diverse sottopopolazioni ev rimane poco chiara. Misurare con precisione la concentrazione di EV è anche importante negli studi che indagano se un determinato trattamento, condizione o molecola influisce sul rilascio di EV. Ad esempio, il nostro gruppo è interessato all'impatto delle esposizioni ambientali come l'inquinamento atmosferico da particolato sul contenuto e sul rilascio di veicoli elettrici. Al fine di valutare se una condizione influisce sul rilascio di veicoli elettrici, il numero di vescicole deve essere quantificato con precisione. Quando si utilizzano i veicoli elettrici come biomarcatori diagnostici, la concentrazione di veicoli elettrici nel campione potrebbe influire sui risultati del test. Pertanto, un metodo affidabile per determinare la concentrazione delle particelle e la distribuzione dimensionale è fondamentale.
Indipendentemente da ciò, le misurazioni NTA dovrebbero essere accompagnate da altre tecniche complementari in grado di misurare le particelle indipendentemente dalle altre particelle nel campione, come TEM. Tecnologie più recenti come il rilevamento microfluidico degli impulsi resistivi (MRPS) sono anche promettenti per il dimensionamento e il conteggio dei veicoli elettrici indipendentemente dalla polidispersità del campione. Ulteriori analisi biochimiche o proteomiche di campioni EV possono essere utilizzate in aggiunta ai dati di dimensioni e concentrazione per raggruppare sottoinsiemi di VEICOLI elettrici in popolazioni di significato biologico. In conclusione, misurare concentrazioni di particelle valide e riproducibili e distribuzioni granulometriche è importante per il campo EV. Il ViewSizer 3000 raggiunge misurazioni accurate e riproducibili della concentrazione totale di EV e della distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici, anche per campioni altamente polidispersi, come dimostrato qui. In futuro speriamo di vedere ulteriori rigorosi confronti sperimentali di questo strumento con altri strumenti NTA.
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Disclosures
Tutti gli autori hanno dichiarato che non ci sono conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Riconosciamo Jeffrey Bodycomb, Ph.D. di HORIBA Instruments Incorporated per il suo aiuto nella calibrazione dello strumento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
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- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
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