Summary
Nous montrons comment utiliser un nouvel instrument d’analyse de suivi des nanoparticules pour estimer la distribution de taille et la concentration totale de particules de vésicules extracellulaires isolées du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain.
Abstract
Les rôles physiologiques et physiopathologiques des vésicules extracellulaires (VE) sont de plus en plus reconnus, faisant du domaine des VÉHICULES électriques un domaine de recherche en évolution rapide. Il existe de nombreuses méthodes différentes pour l’isolation des véhicules électriques, chacune présentant des avantages et des inconvénients distincts qui affectent le rendement en aval et la pureté des véhicules électriques. Ainsi, caractériser la préparation EV isolée d’une source donnée par une méthode choisie est importante pour l’interprétation des résultats en aval et la comparaison des résultats entre les laboratoires. Diverses méthodes existent pour déterminer la taille et la quantité de VE, qui peuvent être modifiées par des états pathologiques ou en réponse à des conditions externes. L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est l’une des principales technologies utilisées pour l’analyse à haut débit des véhicules électriques individuels. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la quantification et la détermination de la taille des VE isolés du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain à l’aide d’une technologie révolutionnaire pour la NTA représentant des avancées majeures dans le domaine. Les résultats démontrent que cette méthode peut fournir des données reproductibles et valides sur la concentration totale des particules et la distribution granulométrique pour les VE isolés de différentes sources à l’aide de différentes méthodes, comme le confirme la microscopie électronique à transmission. L’adaptation de cet instrument à la NTA permettra de répondre à la nécessité d’une normalisation des méthodes de la NTA afin d’accroître la rigueur et la reproductibilité dans la recherche sur les VE.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules membranaires (0,03-2 μm) sécrétées par presque tous les types de cellules1. Ils sont souvent appelés « exosomes », « microvésicules » ou « corps apoptotiques » en fonction de leur mécanisme de libération et de leur taille2. Alors qu’on pensait au départ que les VE étaient simplement un moyen d’éliminer les déchets de la cellule pour maintenir l’homéostasie3,nous savons maintenant qu’ils peuvent également participer à la communication intercellulaire via le transfert de matériel moléculaire - y compris l’ADN, l’ARN (ARNm, microARN), les lipides et les protéines4,5 - et qu’ils sont d’importants régulateurs de la physiologie normale ainsi que des processus pathologiques1, 5,6,7,8.
Il existe de nombreuses méthodes différentes pour isoler et quantifier les VE, qui ont été décritesailleurs 9,10,11,12. Le protocole d’isolement utilisé ainsi que la source des véhicules électriques peuvent avoir un impact considérable sur le rendement et la pureté des véhicules électriques. Même la centrifugation différentielle, longtemps considérée comme l’approche « étalon-or » pour l’isolement des exosomes, peut être sujette à une variabilité substantielle ayant par la suite un impact sur la population de VE obtenue et les analyses en aval13. Ainsi, les différentes méthodologies d’isolement et de quantification des VE rendent difficile la comparaison, la reproduction et l’interprétation des résultats des expériences rapportées dans la littérature14. En outre, la libération de VE peut être régulée par des conditions cellulaires ou divers facteurs externes. Il a été suggéré que les VE jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie cellulaire en protégeant les cellules contre le stress intracellulaire15, car plusieurs études ont montré que le stress cellulaire stimule la sécrétion de VE. Parexemple, une augmentation de la libération de VE a été rapportée après une exposition cellulaire à l’hypoxie, au stress du réticulum endoplasmique, au stress oxydatif, au stress mécanique, à l’extrait de fumée de cigarette et à la pollution de l’air par les particules16,17,18,19, 20,21,22. Il a également été démontré que la libération de VE est modifiée in vivo; les souris soumises à un régime riche en graisses ou à un jeûne pendant seize heures ont libéré plus de VE adipocytaires23. Pour déterminer si un traitement ou une affection spécifique modifie la libération de VE, le nombre de VE doit être déterminé avec précision. L’évaluation de la distribution de la taille des VE peut également indiquer l’origine subcellulaire prédominante des VE (p. ex., fusion d’endosomes/corps multivésiculaires tardifs avec la membrane plasmique par rapport au bourgeonnement de la membrane plasmique)24. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes robustes pour mesurer avec précision la concentration totale et la distribution granulométrique de la préparation ev étudiée.
Une méthode rapide et très sensible pour la visualisation et la caractérisation des véhicules électriques en solution est l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Une explication détaillée des principes de cette méthode et une comparaison avec d’autres méthodes d’évaluation de la taille et de la concentration des VE ont été décrites précédemment25,26,27,28. En bref, lors de la mesure NTA, les véhicules électriques sont visualisés par la lumière diffusée lorsqu’ils sont irradiés avec un faisceau laser. La lumière diffusée est focalée par un microscope sur une caméra qui enregistre le mouvement des particules. Le logiciel NTA suit le mouvement thermique aléatoire de chaque particule, connu sous le nom de mouvement brownien, pour déterminer le coefficient de diffusion qui est utilisé pour calculer la taille de chaque particule à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein. La NTA a été appliquée pour la première fois à la mesure des VE dans un échantillon biologique en 201125. Jusqu’à récemment, il n’y avait que deux sociétés grand public offrant des instruments NTA commerciaux29 jusqu’à l’introduction du ViewSizer 3000 (ci-après dénommé l’instrument de suivi des particules) qui utilise une combinaison de nouvelles solutions matérielles et logicielles pour surmonter les limites importantes d’autres techniques NTA.
L’instrument de suivi des particules caractérise les nanoparticules dans les échantillons liquides en analysant leur mouvement brownien et caractérise les particules plus grosses de la taille d’un micron en analysant la décantation gravitationnelle. Le système optique unique de cet instrument, qui comprend un éclairage multispectral avec trois sources de lumière laser (à 450 nm, 520 nm et 635 nm), permet aux chercheurs d’analyser simultanément un large éventail de tailles de particules (par exemple, exosomes, microvésicules). Un schéma de la configuration de l’instrument est illustré à la figure 1.
Ici, nous montrons comment effectuer des mesures de distribution granulométrique et de concentration de véhicules électriques isolés de souris et d’humains à l’aide d’un nouvel instrument NTA.
Figure 1: Système optique d’instrument de suivi des particules. L’instrument NTA éclaire les particules à l’aide de trois lasers avec les longueurs d’onde suivantes : 450 nm, 520 nm, 635 nm. L’enregistrement vidéo de la lumière diffusée à partir de particules individuelles est détecté et suivi par une caméra vidéo numérique orientée à 90 ° de la cuvette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les travaux avec ces échantillons ont été effectués conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement et du Comité d’examen de l’établissement. Une vue d’ensemble schématique de la méthode NTA est illustrée à la figure 2.
Figure 2: Vue d’ensemble de la méthode NTA à l’aide de l’instrument de suivi des particules. L’échantillon est préparé et inséré dans l’instrument. Le logiciel NTA est ouvert, les paramètres d’enregistrement sont ajustés et l’échantillon est concentré. Ensuite, les données sont enregistrées, traitées et affichées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Isolement des vésicules extracellulaires
REMARQUE: Les VE du tissu adipeux périgornadique de souris ont été isolés comme décrit précédemment23. Les VE plasmatiques ont été isolés à partir de 1 mL de plasma humain à l’aide du protocole suivant :
- Prélever le plasma et centrifuger à 3 000 x g pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
REMARQUE: Si des débris supplémentaires restent détectables, centrifugez le surnageant pendant 10 minutes supplémentaires à 12 000 x g et transférez le surnageant dans un nouveau tube. - Ajouter 67 μL du réactif d’isolement des exosomes par 250 μL de plasma. Bien mélanger en inversant ou en agitant le tube.
- Incuber sur de la glace à la verticale pendant 30 min.
- Centrifuger le mélange réactif/plasma d’isolement des exosomes à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
REMARQUE: La centrifugation peut être effectuée à température ambiante ou à 4 ° C avec des résultats similaires, mais 4 ° C est préférable. Après centrifugation, les véhicules électriques peuvent apparaître sous la forme d’une pastille beige ou blanche au fond du tube. - Aspirer soigneusement le surnageant. Faites tourner toute solution résiduelle d’isolation des exosomes et éliminez toute trace de liquide par aspiration, en prenant grand soin de ne pas perturber les véhicules électriques précipités dans la pastille.
- Resuspendez la pastille dans 200 μL de tampon B (fourni par le fabricant). Mesurez et enregistrez la concentration en protéines de l’échantillon (pour l’étape 2.8) à l’aide d’un spectrophotomètre, d’un fluoromètre, d’un test de Bradford ou d’une autre méthode préférée.
2. Purification des ve électriques isolés
- Ajouter 200 μL de tampon A (fourni par le fabricant) aux véhicules électriques suspendus.
- Retirez la colonne de purification (fournie), desserrez le bouchon à vis et enclenchez la fermeture inférieure. Placez la colonne dans un tube de collecte.
REMARQUE: Enregistrez la fermeture inférieure pour les étapes 2.7 à 2.9. - Centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s pour retirer le tampon de stockage.
- Jetez le flux et replacez la colonne dans le tube de collecte.
- Pour laver la colonne, retirez le bouchon et appliquez 500 μL de tampon B sur le dessus de la résine et centrifugez à 1 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux à travers. Enregistrez le bouchon pour les étapes 2.7 à 2.9.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.5 une fois de plus pour laver la colonne.
- Branchez le bas de la colonne avec la fermeture inférieure (à partir de l’étape 2.2). Appliquez 100 μL de tampon B sur la résine pour la préparer au chargement de l’échantillon.
- Ajouter la totalité du contenu de l’étape 1.6 (ou jusqu’à l’équivalent volumique de 4 mg de protéines totales) à la résine. Placez le bouchon à vis sur le dessus de la colonne.
- Mélanger à température ambiante sur un agitateur rotatif pendant 5 min au plus.
3. Élution de l’échantillon
- Desserrer le bouchon à vis et retirer la fermeture inférieure, puis transférer immédiatement dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
REMARQUE: L’échantillon commencera à éluer dès que la fermeture inférieure sera retirée. Veuillez vous assurer que des tubes de microcentrifugation de 2 mL sont prêts à recevoir de l’éluat pour minimiser la perte d’échantillon. - Centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s pour obtenir des VÉHICULES purifiés. Ignorez la colonne.
4. Préparation des échantillons pour l’analyse de suivi des nanoparticules
- Utilisez un matériau non pelucheux comme un chiffon en microfibre pour couvrir l’espace de travail et empêcher les fibres de pénétrer dans les cuvettes.
- En portant des gants, placez la cuvette sur le gabarit de cuvette magnétique, puis placez la barre de remuage dans la cuvette. Manipulez toujours les cuvettes avec des gants pour éviter que des empreintes digitales et des taches n’apparaissent sur la surface de la cuvette.
- Utilisez l’outil crochet pour placer l’insert dans la cuvette, comme illustré à la figure 3. Il est important de noter l’orientation de l’insert pour plus tard (étape 5.4).
Figure 3: Orientation correcte de l’insert dans la cuvette de quartz. L’encoche de l’insert doit être visible de l’avant de la cuvette. Celui-ci doit être inséré dans l’instrument face à la caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- À l’aide d’une pipette, ajouter lentement 400 à 500 μL du diluant ou de l’échantillon dilué à température ambiante à la cuvette à travers le trou de l’insert. Pipetter doucement de haut en bas pour mélanger. Évitez d’introduire des bulles d’air.
- Préparez d’abord une cuvette chargée du diluant choisi (blanc) pour mesurer la concentration en particules du diluant. Cela doit être fait avant de mesurer l’échantillon afin que la concentration de fond de l’échantillon puisse être corrigée.
REMARQUE: Un bon blanc (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] dans ce cas) aura une concentration <9 x 106 (selon le diluant) et affichera 1 à 10 particules par écran dans la vue en direct (Figure 4). Il est recommandé que la concentration réelle de particules de l’échantillon soit au moins 3 fois supérieure à la concentration de fond. - En option, avant d’enregistrer l’échantillon, amorcer la cuvette avec 400-500 μL du diluant ou de l’échantillon dilué avant la mesure. Pour ce faire, chargez 400 à 500 μL de l’échantillon dilué dans la cuvette, jetez la solution, puis ajoutez 400 à 500 μL de plus de l’échantillon pour la mesure. Cela peut aider à éliminer les résidus dans la cuvette.
- Préparez d’abord une cuvette chargée du diluant choisi (blanc) pour mesurer la concentration en particules du diluant. Cela doit être fait avant de mesurer l’échantillon afin que la concentration de fond de l’échantillon puisse être corrigée.
Figure 4: Vue représentative en direct d’un diluant dans la plage de concentration appropriée d’un blanc. Diluer les préparations EV dans du PBS filtré (0,02 μm ou 3 kDa, de préférence). Un bon blanc affichera ~ 1-10 particules par écran dans la vue en direct, ce qui donne une concentration comprise entre 105et 106. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Coiuchez la cuvette et vérifiez la ne pas y avoir de bulles. Appuyez sur les bulles si nécessaire. Utilisez un chiffon non pelucheux pour essuyer les faces extérieures de la cuvette.
5. Procédure de démarrage de l’instrument de suivi des particules
- Allumez le poste de travail et l’instrument de l’ordinateur, attendez quelques minutes avant d’exécuter le premier échantillon et démarrez le programme en cliquant sur l’icône du logiciel. Lorsque vous y êtes invité, cliquez sur NTA à l’écran pour effectuer une analyse de suivi des nanoparticules. Commencez dans l’onglet Enregistrement et cliquez sur les différents onglets logiciels(Enregistrement, Processus, Tracé)pour basculer entre eux tout au long du protocole. Enregistrez d’abord l’échantillon (diluant ou préparation EV), puis traitez les enregistrements et enfin tracez les résultats.
- Suivez les instructions à l’écran pour remplir toutes les informations nécessaires sur l’échantillon. Vérifiez que tous les champs nécessaires sont remplis et exacts, c’est-à-dire le nom de l’échantillon, la description, la préparation de l’échantillon, le facteur de dilution [1000], la température cible (réglée sur 22 °C) et le diluant : Sélectionnez le diluant dans le menu déroulant et utilisez PBS comme diluant pour les VE. La sélection de PBS dans le menu déroulant remplira automatiquement la salinité à 9%. Ces informations sont nécessaires pour déterminer la viscosité dynamique du liquide.
REMARQUE: Il peut prendre jusqu’à 3 minutes pour que la température s’équilibre à l’intérieur de la cuvette même si la sonde indique déjà la température souhaitée (c’est-à-dire que le point vert devient stable). Les lectures d’échantillons peuvent varier considérablement si la température cible n’est pas définie, car les différences de température des échantillons pourraient modifier considérablement le mouvement brownien des particules. - Ouvrez le couvercle de l’instrument et retirez le couvercle du capuchon de protection à l’endroit où la cuvette sera placée.
ATTENTION : L’instrument de suivi des particules est certifié comme un produit laser de classe 1 (21 CFR Ch. I partie 1040), contenant des lasers qui peuvent être dangereux et pourraient causer des blessures graves telles que des brûlures et / ou des dommages permanents à la vue. Pour éviter tout accident ou blessure, ne retirez pas le couvercle de l’instrument en dévissant les boulons sur le côté. Notez que pendant le fonctionnement, les faisceaux laser sont complètement fermés, ne représentant aucune menace pour les utilisateurs. En outre, un verrouillage de sécurité magnétique est intégré dans le porte-échantillon de l’instrument pour empêcher les lasers de fonctionner lorsque le capuchon du porte-échantillon est retiré. - Placez la cuvette (à partir de l’étape 4.3) à l’intérieur de l’instrument dans la bonne orientation (voir Figure 5). Replacez le capuchon sur la cuvette et fermez le couvercle de l’instrument. Utilisez toujours l’instrument avec le capuchon en place sur le porte-échantillon. Ne désactivez pas et ne tentez pas de contourner la fonction de verrouillage de sécurité.
Figure 5: Orientation correcte de la cuvette dans l’instrument de suivi des particules. La face de la cuvette (avec l’encoche de l’insert visible) doit faire face à la caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Allumez l’appareil photo en cliquant sur la flèche au-dessus de Streaming.
- Cliquez sur la flèche en chevron pour développer les paramètres d’enregistrement. Réglez gain et puissance laser sur des valeurs appropriées pour l’application. Voir le tableau 1 (et la figure supplémentaire 1)pour les paramètres utilisés pour la NTA des petits véhicules électriques (100 nm).
REMARQUE: Ces paramètres avancés accessibles en cliquant sur la flèche du chevron peuvent être protégés par mot de passe. Utilisez les mêmes paramètres pour l’enregistrement et le traitement du diluant (blanc) que ceux utilisés pour les échantillons suivants. - Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les particules soient correctement focalées. La mise au point doit être faite sur des particules relativement petites (Figure 6). Pour la quantification des petits VE (compatible avec les exosomes), les paramètres d’enregistrement suivants sont recommandés : Fréquence d’images : 30 ips, Exposition : 15 ms, Temps d’agitation : 5 s, Temps d’attente : 3 s, Puissance laser - Bleu : 210 mW, Vert : 12 mW, Rouge : 8 mW, Images par vidéo : 300 images et Gain : 30 dB.
REMARQUE: L’utilisateur peut augmenter le zoom à 1x et / ou augmenter le gain pour aider à la mise au point. N’oubliez pas de redéfinir ces paramètres sur les valeurs recommandées avant d’enregistrer des vidéos.
Figure 6: Vues représentatives en direct montrant la focalisation des particules. (A) Exemple de vue en direct des particules non focales. Les particules ont un halo semblable à une lueur ou semblent floues. Ajustez la mise au point. (B) Un exemple de vue en direct des particules dans la mise au point appropriée. Les plus petites particules sont au point. Commencez l’enregistrement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Effectuez un contrôle de qualité visuelle pour vous assurer que l’échantillon est correctement dilué. Si l’échantillon est trop concentré, retirez la cuvette de l’instrument et diluez l’échantillon séquentiellement. Répétez l’opération jusqu’à ce que l’échantillon soit correctement dilué avant de passer à l’étape 6.
REMARQUE: Ne diluez pas trop l’échantillon! Faites toujours des dilutions séquentiellement. L’ébauche idéale n’affichera que quelques particules à l’écran (1-4) comme illustré à la figure 4. En ce qui concerne les échantillons EV, un échantillon correctement dilué aura environ 20 à 100 particules visibles à l’écran, sans images brillantes ou nuageuses en arrière-plan (voir la figure 7 à titre d’exemple). Cela devrait se traduire par une concentration optimale de particules comprise entre 5 x 106 et 2 x 108 particules par mL (sans ajustement pour le facteur de dilution).
Figure 7: Vues représentatives en direct illustrant différentes dilutions de particules. (A) Exemple de vue en direct d’un échantillon trop concentré. L’enregistrement d’un échantillon trop concentré donnera des résultats inexacts. (B) Exemple de vue en direct d’un échantillon correctement dilué. Il y a 60-100 particules visibles à l’écran et l’enregistrement donne une concentration brute de 5 x 106- 2 x 108 particules / mL. (C) Exemple de vue en direct d’un échantillon trop dilué. Si un échantillon est aussi dilué, il n’y aura pas assez de particules suivies, ce qui réduira la taille de l’échantillon et, par conséquent, les résultats seront statistiquement invalides. Dans ce cas, il est recommandé d’augmenter le nombre de vidéos enregistrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Acquisition de données vidéo
- (Facultatif) Réglez le paramètre de zoom sur 0,5x pour économiser de la bande passante et éviter les images perdues.
- Commencez à enregistrer les vidéos en cliquant sur Enregistrer (voir le tableau 1 pour les paramètres d’enregistrement recommandés).
REMARQUE: Par défaut, l’instrument remue l’échantillon pendant 5 s, attend 3 s, puis enregistre pendant 10 s avant de répéter ce processus. Le temps de mesure typique pour 50 vidéos est d’environ 15 minutes à enregistrer et d’environ 13 minutes à traiter. - Ne touchez pas l’instrument lors de l’enregistrement de vidéos. Assurez-vous que la surface du banc de laboratoire ne vibre pas.
REMARQUE: Il est préférable que l’instrument soit placé sur une plate-forme ou une table anti-vibration pour réduire les perturbations vibratoires provenant de l’équipement à proximité qui interféreront avec la détermination du mouvement des nanoparticules. Évitez de faire fonctionner des centrifugeuses, des mélangeurs de vortex ou d’autres dispositifs générateurs de vibrations potentiels sur le même banc que l’instrument de suivi des particules. Les vibrations sont facilement visibles à l’écran sous forme d’allongement de particules généralement rondes. S’il est exposé à de fortes vibrations, l’instrument peut nécessiter un réalignement des éléments optiques. L’instrument n’a pas été conçu pour être entretenu ou étalonné par le client; contactez le fabricant pour la maintenance, l’entretien et l’étalonnage. - Notez toute vidéo enregistrée qui a de très grosses particules visibles sous forme de grosses taches blanches irrégulières. Supprimez ces vidéos du traitement à l’étape 7.3.
7. Traiter les données acquises
- Lorsqu’une invite s’affiche indiquant que des vidéos ont été enregistrées, cliquez sur OK pour terminer l’enregistrement. Sélectionnez ensuite l’onglet Processus.
REMARQUE: Le protocole peut être arrêté ici. Le traitement des données acquises peut être redémarré ultérieurement en passant directement à l’onglet Processus après avoir ouvert le logiciel de l’instrument de suivi des particules et en spécifiant le répertoire dans lequel les vidéos enregistrées sont enregistrées. - Lors de l’analyse des véhicules électriques, cochez la case Désactiver le remplacement de la détection automatique et définissez le diamètre de la fonction sur 30. Cliquez sur Processus. (Voir le tableau 2 pour les paramètres de traitement et la figure supplémentaire 2 pour l’affichage du traitement). Un graphique de distribution en direct s’affichera afin que l’utilisateur puisse visualiser le traitement en temps réel.
- Pour les exosomes, traitez avec le seuil de détection défini sur l’échantillon polydispersépar défaut . Traitez les données avec le manuel de seuil de détection défini sur 0,8 au lieu d’un seuil standard de 0,99 uniquement pour les solutions présentant de très grandes différences de taille de particules.
- Si des vidéos avaient visiblement de très grosses particules (voir l’étape 6.4), accédez au répertoire des vidéos enregistrées et supprimez la vidéo problématique. Après avoir modifié la liste des fichiers vidéo, modifiez le nombre de vidéos enregistrées dans d’autres journaux conservés par l’utilisateur.
- Une fois le traitement terminé, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez l’onglet Tracé. Pour les véhicules électriques, affichez le graphique principal sous la forme LogBinSilica.
REMARQUE: Ici, dans l’onglet Tracé, l’utilisateur peut personnaliser d’autres fonctionnalités du graphique, telles que la définition de la plage de l’axe des x (diamètre des particules, nm) pour définir la zone d’intégration de la figure produite.
8. Afficher et interpréter les résultats
- Pour créer un rapport PDF, cliquez sur le bouton Rapport. La mesure est maintenant terminée et les résultats peuvent être consultés.
REMARQUE: N’oubliez pas d’enregistrer et de traiter d’abord le blanc afin que la concentration de fond des échantillons suivants puisse être corrigée. Si cette étape est oubliée, le blanc peut être enregistré après des échantillons et la concentration de particules de l’échantillon corrigée manuellement. - Examinez le rapport PDF qui affiche la taille moyenne, médiane et de mode ainsi que la concentration ajustée pour le facteur de dilution et corrigée en soustrayant la concentration de particules du diluant. La largeur de distribution (écart type) est également affichée.
REMARQUE : Il existe très peu d’applications où une seule valeur est appropriée et représentative. Il est donc recommandé de décrire la distribution de taille entière et de déclarer la largeur de la distribution pour tout échantillon analysé (comme le montre le tableau 3 par exemple). - Enregistrez les paramètres d’instrument suivants utilisés pour générer les données qui doivent être indiquées lors de la communication des résultats : Diluant, Puissance laser de chaque laser [mW], Exposition [ms], Gain [dB], Fréquence d’images [fps], Images par vidéo, Nombre de vidéos enregistrées, Réglage de traitement (par exemple, LogBinSilica), Plage d’intégration [nm min, max nm] (recommandé de régler min à 50 nm) et Nombre de particules suivies (souhaitable pour analyser au moins ~ 150 particules par vidéo; minimum 3 750 pistes totales par échantillon recommandé d’éviter les pics artéfactuels dans la distribution granulométrique et de générer des données statistiquement significatives).
9. Nettoyage des cuvettes
- Nettoyez les cuvettes manuellement entre les échantillons. Tout d’abord, videz la cuvette.
REMARQUE: L’échantillon peut être récupéré à partir de la cuvette et enregistré ou jeté. - Une fois la cuvette vide, nettoyez la cuvette en la rinçant 10 à 15 fois avec de l’eau désionisée (DI). Ensuite, rincez 3 fois avec de l’éthanol (70-100%). Ce faisant, assurez-vous de remplir complètement la cuvette avec du solvant.
- Séchez l’extérieur de la cuvette avec un chiffon en microfibre non pelucheux. Évitez les taches sur les surfaces. Sécher à l’air libre l’intérieur de la cuvette ou sécher à l’aide d’un filtre à air comprimé.
REMARQUE: Seul le papier de nettoyage des lentilles ou le chiffon en microfibre non pelucheux doit être utilisé pour essuyer les surfaces optiques de la cuvette, car la plupart des produits en papier contiennent de petites fibres de bois qui peuvent rayer ou endommager la surface de la cuvette. - Préparez deux flacons de scintillation en verre: l’un rempli de 70 à 100% d’éthanol et l’autre d’eau DI. Rincez d’abord les inserts et les barres d’agitation dans l’éthanol (puis l’eau DI) en plaçant l’insert/la barre de remuage dans le flacon de scintillation approprié et en agitant vigoureusement le flacon. Séchez les inserts et remuez les barres à l’aide de chiffons non pelucheux ou de dusters à air comprimé.
REMARQUE: La cuvette et l’insert peuvent également être nettoyés à l’aide d’un bain-marie sonique. Pour ce faire, assurez-vous d’abord que l’unité de sonication contient suffisamment d’eau (au moins 5 cm de profondeur). Placez ensuite la cuvette et insérez-la à l’intérieur d’un bécher en verre (50 mL ou plus), remplissez le bécher d’alcool au même niveau que le bain-marie, placez le bécher dans l’eau et allumez l’alimentation. Sonicate pendant un maximum de 5 minutes à la fois, permettant à la machine de reposer >5 minutes entre chaque rafale de 5 minutes si des temps plus longs sont nécessaires. - Une fois terminé, rangez immédiatement tous les composants nettoyés et séchés pour les stocker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avant cette démonstration, l’étalonnage de l’instrument a d’abord été testé pour s’assurer de la validité des données acquises en mesurant la distribution granulométrique des étalons de billes de polystyrène. Nous avons testé la distribution de taille des billes de 100 nm et 400 nm en utilisant les paramètres d’enregistrement par défaut et les paramètres de traitement recommandés dans ce protocole (Figure 8).
Pour l’étalon de billes de polystyrène de 100 nm, une concentration de 4,205 x 107 particules/mL a été mesurée. La taille moyenne (écart-type, ET) était de 102 (±17) nm avec un coefficient de variation (CV) de 0,16. Les valeurs D10/D50/D90 étaient de 76/104/126 nm. Cela indique que l’instrument de suivi des particules a rapporté avec précision la taille des billes monodispersées de 100 nm. Pour l’étalon des billes de polystyrène de 400 nm, la concentration était de 4,365 x 107 particules/mL. La taille moyenne (ET) était de 391 (±47) nm, avec un CV de 0,12. Les valeurs D10/D50/D90 étaient de 150/358/456 nm(tableau 3). Bien que la moyenne rapportée soit très proche de la taille réelle des perles, nous pouvons voir que les paramètres de l’instrument appliqués dans ce protocole sont plus précis pour les particules plus petites ~ 100 nm. Ainsi, pour les particules supérieures à 400 nm, l’optimisation des paramètres laser est suggérée. Les chercheurs devraient d’abord mener une méthode telle que la microscopie électronique à transmission (TEM) pour une estimation de la distribution de la taille des VE résultante à partir d’une source donnée et d’une méthode d’isolement avant la NTA.
Une concentration moyenne de 4,41 x 1010 particules/mL a été mesurée pour l’échantillon de tissu EV de souris utilisé pour cette démonstration. Cet échantillon a été enregistré conformément aux paramètres résumés dans le tableau 1 et traité conformément aux paramètres décrits dans le tableau 2. Nous démontrons l’impact de divers facteurs de dilution à la figure 9 et rapportons les concentrations de particules brutes et ajustées dans le tableau 4. La dilution optimale pour les VE dérivés de tissus de souris était comprise entre 1 000 et 3 000, tandis que pour les VE dérivés du plasma humain, elle était de 1 000, ce qui indique que lors du premier essai d’une source de biofluide donnée ou d’une méthode d’isolement EV pour la NTA, des dilutions en série doivent être testées afin que la dilution optimale pour la mesure de la NTA puisse être identifiée. Nous recommandons de mesurer et de déclarer au moins deux dilutions différentes d’un échantillon. Nous avons également mesuré quatre échantillons supplémentaires à diverses dilutions sur deux instruments distincts de suivi des particules. La figure supplémentaire 3 compare la précision des mesures de taille de l’instrument de suivi des particules par rapport à un autre instrument NTA disponible dans le commerce. Le tableau supplémentaire 1 démontre en outre la précision des mesures de cet instrument, montrant que la concentration de particules a changé proportionnellement à la dilution de l’échantillon, mais que les mesures de la taille des particules ne l’ont pas fait.
Après le traitement, les résultats (ainsi que les informations sur l’instrument / logiciel, les paramètres d’enregistrement et de traitement et les notes expérimentales) peuvent être enregistrés dans un rapport .pdf. L’histogramme inclus dans ce rapport peut être modifié comme décrit dans le protocole (section 7.4). Les résultats bruts sont enregistrés dans un fichier .dat qui peut être exporté. Les vidéos enregistrées sont également enregistrées et peuvent être utilisées pour un traitement et une analyse hors ligne ultérieurs. Cependant, une fois les vidéos enregistrées, les paramètres d’enregistrement ne peuvent pas être modifiés rétrospectivement.
L’impact de la modification des différentes puissances et du gain du laser dans les paramètres d’enregistrement a été démontré à l’aide de véhicules électriques dérivés du plasma humain. Ceci est visualisé dans les figures 10 à 12 et l’information quantitative basée sur ces images est présentée dans le tableau 5. L’augmentation du gain augmente la sensibilité de la caméra, permettant la visualisation de particules plus petites (Figure 10) entraînant une augmentation de la concentration totale de particules avec une taille moyenne de particules plus petite (Tableau 5). Cependant, l’augmentation du gain au-dessus de 30 dB (nos recommandations) rend la vue trop granuleuse, permettant au bruit d’obscurcir la mesure des particules réelles. Avec un gain de caméra de 30 dB, l’effet de la modification de la puissance du laser bleu est représenté à la figure 11. L’augmentation de la puissance du laser bleu (450 nm, courte longueur d’onde) entraîne une plus grande résolution pour détecter les particules plus petites (c’est-à-dire celles dont la taille est compatible avec les exosomes). Maintenir les puissances laser vertes et rouges constantes aux réglages par défaut, augmenter la puissance laser bleue de 70 mW à 210 mW a déplacé la taille moyenne des particules signalée de 122 nm à 105 nm et a augmenté la concentration totale de particules rapportée de 1,1 x10 8 à 1,7 x 108 (tableau 5).
L’effet de l’augmentation des puissances laser vertes et rouges a également été démontré(Figure 12). L’augmentation de la puissance du laser rouge (650 nm, longue longueur d’onde) a augmenté la taille moyenne des particules signalée de 175 à 246 nm. La concentration totale de particules rapportée a diminué, mais c’est parce que dans cet échantillon de plasma humain EV, nous n’avions pas beaucoup de grosses particules présentes, confirmées par une coloration TEM négative (Figure supplémentaire 4). L’augmentation de la puissance du laser vert a entraîné une diminution de la taille moyenne des particules signalée et une augmentation de la concentration totale de particules signalée. Ainsi, l’utilisateur peut optimiser la puissance des trois lasers pour détecter avec sensibilité des particules de différentes tailles.
Ce protocole est optimisé pour les vésicules plus petites (par exemple, <400 nm). Les chercheurs intéressés par les microvésicules de plus grandes tailles (par exemple, 400-1000 nm) sont encouragés à optimiser les paramètres laser en utilisant des billes d’organosilica creuses qui ont des propriétés de diffusion de la lumière similaires à celles des VE, ce qui en fait une référence plus appropriée que les étalons de polystyrène ou de billes de silice30. Pourtant, les nanoparticules de silice peuvent être le meilleur substitut pratique jusqu’à ce que les normes organosilica deviennent plus largement disponibles.
Ici, un instrument NTA a été utilisé pour quantifier avec succès les VE isolés du tissu de souris par ultracentrifugation et plasma humain à l’aide d’un kit commercial. Les effets de la modification des paramètres de la NTA ont été illustrés et montrent que les paramètres de ce protocole sont optimisés pour les petites vésicules. L’importance de l’étape de dilution a également été démontrée et montre que l’instrument de suivi des particules démontré ici peut détecter avec précision les variations des facteurs de dilution. La concentration a changé proportionnellement avec de multiples dilutions, alors que la distribution granulométrique ne l’a pas fait. Les données qui en ont résulté ont montré peu de variabilité technique. Ainsi, l’adaptation de ce protocole par les chercheurs utilisant cet instrument pour la NTA augmentera la rigueur et la reproductibilité dans le domaine de la recherche sur les véhicules électriques.
Figure 8: Distribution granulométrique des étalons de billes de polystyrène monodispersé. ( A )Distributiongranulométrique de 100 nm de billes de polystyrène standard. (B) Distribution granulométrique de 400 nm de billes de polystyrène standard. Les valeurs sont indiquées dans le tableau 3. L’encart montre un exemple de vue en direct de la première image mesurée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9: Concentrations brutes de particules totales par facteur de dilution pour les VE du tissu adipeux périgornadique de souris. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Trois mesures ont été prises pour chaque dilution. Les valeurs sont indiquées dans le tableau 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10: Impact visuel de l’augmentation du gain. Images représentatives des particules mesurées avec les réglages laser par défaut (Bleu = 70 mW, Vert = 12 mW, Rouge = 8 mW) et gain réglé sur (A) 18 dB, (B) 24 dB - par défaut, et (C) 30 dB - recommandé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 11: Effet du laser bleu sur les petites particules lorsque les lasers rouges et verts sont réglés sur les paramètres par défaut. (A) Laser bleu = 70 mW (par défaut). (B) Laser bleu = 210 mW (recommandé). Plus de petites particules sont visibles et au point lorsque la puissance du laser bleu est augmentée à 210 mW. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 12: Impact visuel de la puissance altérée des lasers bleus, verts et rouges. Des vues d’écran en direct représentatives représentent les différentes tailles de particules visualisées dans différents paramètres laser. Les valeurs NTA résultantes sont indiquées dans le tableau 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Particules | Diamètre [nm] | Laser bleu [mW] | Laser vert [mW] | Laser rouge [mW] | Gain de caméra [dB] | Régulation de la température | Traitement | # Vidéos |
| Exosomes | 100 | 210 | 12 | 8 | 30 | Activé, réglé sur 22 ºC | Remplacement de la détection automatique désactivé | 50 |
Tableau 1 : Paramètres d’enregistrement des petites vésicules extracellulaires (~100 nm).
| Description du processus | Seuil de détection | Désactiver le remplacement de la détection automatique | Diamètre de la fonction [px] |
| Exosomes | Échantillon polydispersé | Vérifié | 30 |
Tableau 2 : Paramètres de traitement des petites vésicules extracellulaires (~100 nm).
| Taille du polystyrène standard [nm] | Plage d’intégration [nm] | Taille moyenne [nm] | Taille SD [nm] | CV de taille | D10 [nm] | D50 [nm] | D90 [nm] | Nombre total |
| 100 | 50 à 150 | 102 | 17 | 0.16 | 76 | 104 | 126 | 2628 |
| 400 | 300 à 500 | 391 | 47 | 0.12 | 150 | 358 | 456 | 2728 |
Tableau 3 : Résultats de la NTA des étalons de billes de polystyrène monodispersés. Les deux étalons ont été dilués de manière optimale, avec des concentrations brutes pour l’étalon 100 nm et l’étalon 400 nm de 4,205 x10 7 particules/mL et 4,365 x 107 particules/mL, respectivement. D10 est le point dans la distribution de taille où 10% de l’échantillon est contenu, D50 est le point où 50% de l’échantillon est contenu (médiane), et D90 est le point où 90% de l’échantillon est contenu. SD : Écart-type; CV : Coefficient de variation.
| Facteur de dilution | Concentration de particules, particules/mL | Concentration totale de particules, particules/mL |
| Cru | Ajusté pour le facteur de dilution | |
| 1000 | 4.10E+07 | 4.10E+10 |
| 4.00E+07 | 4.00E+10 | |
| 3,70E+07 | 3,70E+10 | |
| moyenne (ET) | 3.93E+07 (1.70E+06) | 3,93E+10 (1,70E+09) |
| 1500 | 3,60E+07 | 5.40E+10 |
| 2,60E+07 | 3,80E+10 | |
| 2,90E+07 | 4.40E+10 | |
| moyenne (ET) | 3.03E+07 (4.19E+06) | 4,55E+10 (6,60E+09) |
| 2000 | 2.40E+07 | 4,80E+10 |
| 2.30E+07 | 4,60E+10 | |
| 2.00E+07 | 4.00E+10 | |
| moyenne (ET) | 2.23E+07 (1.70E+06) | 4,46E+10 (3,40E+09) |
| 3000 | 2.00E+07 | 6.00E+10 |
| 1.30E+07 | 3,90E+10 | |
| 1.40E+07 | 4.20E+10 | |
| moyenne (ET) | 1.57E+07 (3.09E+06) | 4,71E+10 (9,27E+09) |
Tableau 4 : Les résultats de la NTA des VE du tissu adipeux périgornadique de souris démontrent la reproductibilité des mesures de la NTA. Concentrations brutes de particules NTA (particules/mL) mesurées sur l’instrument de suivi des particules et concentration totale de particules (particules/mL) ajustées en fonction du facteur de dilution des VE dérivés du tissu adipeux périgornadique de souris à diverses dilutions.
| Gain [dB] | Laser bleu [mW] | Laser vert [mW] | Laser rouge [mW] | Concentration totale, particules/mL (brut) | Taille moyenne [nm]* | Écart-type de taille / CV | Taille modale | D10 / D50 / D90 |
| 18 | 70 | 12 | 8 | 5,90E+07 | 133 | 89 / 0.66 | 67 | 66.57 / 131.08 / 322.70 |
| 24 | 70 | 12 | 8 | 1.00E+08 | 118 | 73 / 0.61 | 64 | 60.21 / 117.93 / 257.08 |
| 30 | 210 | 12 | 8 | 1.70E+08 | 105 | 57 / 0.54 | 80 | 59.83 / 104.74 / 206.07 |
| 30 | 70 | 12 | 8 | 1.10E+08 | 122 | 75 / 0.61 | 74 | 73.17 / 123.09 / 278.70 |
| 30 | 210 | 0 | 0 | 1.00E+08 | 116 | 70 / 0.6 | 82 | 71.33 / 115.63 / 257.65 |
| 30 | 70 | 0 | 0 | 7.00E+07 | 126 | 79 / 0.63 | 82 | 74.81 / 125.16 / 284.23 |
| 30 | 0 | 12 | 0 | 2,80E+07 | 169 | 106 / 0.63 | 100 | 98.28 / 163.39 / 392.50 |
| 30 | 0 | 24 | 0 | 4.40E+07 | 148 | 95 / 0.64 | 88 | 84.24 / 147.69 / 354.15 |
| 30 | 0 | 0 | 8 | 1,50E+07 | 175 | 129 / 0.74 | 62 | 8.81 / 15.32 / 108.93 |
| 30 | 0 | 0 | 16 | 9.20E+06 | 246 | 147 / 0.6 | 13 | 8.55 / 14.93 / 136.75 |
| *Intégré dans la plage 50-1000 nm | ||||||||
Tableau 5 : Les résultats de la NTA des VE dérivés du plasma humain démontrent l’effet de la modification de la puissance et du gain du laser sur les mesures de la taille et de la concentration en particules des VE humains (dilution 1:1000). D10 est le point dans la distribution de taille où 10% de l’échantillon est contenu, D50 est le point où 50% de l’échantillon est contenu (médiane), et D90 est le point où 90% de l’échantillon est contenu. SD : Écart-type; CV : Coefficient de variation.
Figure supplémentaire 1 : Capture d’écran du panneau d’enregistrement illustrant les paramètres d’enregistrement recommandés. Accédez aux paramètres avancés pour modifier le gain de la caméra et la puissance du laser aux paramètres recommandés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Capture d’écran du panneau de traitement illustrant les paramètres de traitement recommandés. Assurez-vous que l’option « Désactiver le remplacement de la détection automatique » est cochée et que le diamètre de la fonction est défini sur « 30 ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Mesures de la taille des particules sur plusieurs dilutions : Précision de l’instrument de suivi des particules (ViewSizer 3000) par rapport à l’instrument NTA commercial comparable (NanoSight NS300). La NTA des VE isolés du tissu adipeux périgornadique de souris a été réalisée sur deux instruments. Pour chaque souris, trois dilutions (1:1000, 1:500, 1:100) ont été mesurées. Les valeurs brutes des mesures prises sur le ViewSizer 3000 (illustrées dans ce protocole) sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1. Les paramètres de capture et d’analyse des mesures NanoSight NS300 sont présentés dans le tableau supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4 : Microscopie électronique à transmission (TEM) représentative à coloration négative des veuves dérivées du plasma humain. Les grilles ont été imagées avec un microscope électronique à transmission fonctionnant à une tension d’accélération de 100 kV. Les images ont été capturées sur une caméra CCD 2K x 2K. La barre d’échelle reflète le grossissement de la caméra. Les micrographies électroniques montrent des vésicules rondes d’environ 25 nm de diamètre. Grossissement de 100k, barre d’échelle 200 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Mesures de la taille et de la concentration des particules ViewSizer 3000 des VE du tissu adipeux périgornadique de souris sur plusieurs dilutions. La NTA des VE isolés du tissu adipeux périgornadique de souris a été réalisée. Pour chaque souris, trois dilutions (1:1000, 1:500, 1:100) ont été mesurées. D10 est le point dans la distribution de taille où 10% de l’échantillon est contenu, D50 est le point où 50% de l’échantillon est contenu (médiane), et D90 est le point où 90% de l’échantillon est contenu. Les concentrations de particules sont corrigées en arrière-plan. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire 2 : Paramètres de capture et d’analyse de NanoSight NS300. Paramètres (à l’aide de NTA 3.4 Build 3.4.003) utilisés pour mesurer les échantillons de tissu adipeux périgornadique de souris EV rapportés dans la figure supplémentaire 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous démontrons un protocole pour la NTA des VE pour mesurer simultanément la distribution granulométrique d’une large gamme de tailles de particules et mesurer la concentration totale de VE dans un échantillon polydispersé. Dans cette étude, le tissu adipeux périgornadique de souris et le plasma humain ont été utilisés comme source de VE. Cependant, les VE isolés d’autres tissus ou liquides biologiques tels que le sérum, l’urine, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique et le surnageant de culture cellulaire peuvent également être utilisés pour le NTA. Les mesures des étalons de billes de polystyrène ont permis de s’assurer que l’instrument était correctement étalonné et ont démontré que cet instrument NTA peut mesurer correctement la taille des nanoparticules ≤400 nm. Diverses dilutions d’un échantillon de tissu ev de souris ont ensuite été testées. Comme le montre la figure 9,la concentration de particules rapportée s’échelonnes en conséquence avec le facteur de dilution, comme prévu, démontrant que l’instrument peut détecter avec précision la concentration de particules à diverses dilutions avec peu de variabilité entre les répétitions techniques. Cependant, c’était lorsque l’on travaillait avec des concentrations de particules dans la plage de travail de l’instrument (5 x10 6 à 2 x 108 particules par mL); la dilution appropriée d’un échantillon est une étape critique du protocole. L’ajustement pour le facteur de dilution a donné à peu près la même estimation pour la concentration totale de particules de l’échantillon, avec un CV de 15,1 pour les quatre dilutions testées. En outre, différentes mesures, répétées sur plusieurs dilutions des mêmes échantillons, ont montré la précision des évaluations de la distribution granulométrique, car les concentrations de particules étaient proportionnellement proportionnelles au facteur de dilution, mais pas les mesures de taille rapportées.
Les véhicules électriques en suspension subissent un mouvement thermique aléatoire connu sous le nom de mouvement brownien, selon lequel la diffusion des particules dans une suspension liquide est inversement proportionnelle à leur taille. Ce mouvement aléatoire est modélisé par l’équation de Stokes-Einstein, où le diamètre hydrodynamique D d’une particule sphérique est :
Où kB est la constante de Boltzmann et R est le rayon des particules. Comme on peut le voir dans l’équation, le mouvement des particules en suspension dépend également de la température(T)et de la viscosité dynamique(η)du liquide. Pendant la NTA, les VÉHICULES sont irradiés avec des faisceaux laser focalisés qui traversent les particules en suspension et sont détectés par l’éclairage incident provenant des lasers. La lumière diffusée par chaque particule individuelle est focalée par un microscope sur le capteur d’image d’une caméra CCD (Charge-Coupled Device) haute résolution et sensible à la lumière, qui enregistre des images numériques de la lumière diffusée des particules (Figure 1). Le logiciel NTA identifie et suit le mouvement brownien de chaque particule individuelle pour calculer le coefficient de diffusion de chaque particule. Ceci est utilisé avec la température et la viscosité du liquide contenant les particules pour calculer le diamètre des particules à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein. Ainsi, une seule mesure peut déterminer deux éléments d’information critiques : la distribution granulométrique et le nombre total de particules des véhicules électriques en suspension.
Une comparaison de la NTA avec d’autres techniques de détection et de quantification des VE a été décrite ailleurs31,32. Comparé à d’autres méthodes basées sur la diffusion de la lumière telles que la diffusion dynamique de la lumière (DLS), NTA a des capacités de résolution plus élevées et est une méthode particulièrement puissante pour analyser les particules d’un diamètre moyen inférieur à 100 nm. Contrairement à l’analyse monoparticulaire telle que la TEM, la NTA ne prend pas de temps ou n’est pas techniquement difficile et peut phénotyper un échantillon entier dans un volume relativement faible à la fois de manière semi-automatisée. Bien que la NTA soit une technique de caractérisation puissante, elle a des limites. Tout d’abord, le NTA est soumis à des limites de sensibilité en raison de la forte diminution de l’intensité de la mise à l’échelle de la lumière diffusée avec le diamètre des particules, ce qui fait disparaître la lumière diffusée de très petites particules sous le bruit de fond33. Ainsi, la NTA a réduit la sensibilité pour les véhicules électriques de moins de ~ 50 nm31 et entraîne une surestimation de la taille des véhicules électriques. Des lasers à courte longueur d’onde sont nécessaires pour détecter les particules plus petites d’un échantillon polydispersé en raison de leur potentiel de diffusion de la lumière. Cependant, cet instrument de suivi des particules offre une amélioration à cette limitation inhérente à la technologie de suivi des nanoparticules. Equipé de trois sources lumineuses variables (450 nm, 520 nm, 635 nm), ce système permet de visualiser des particules sur une large gamme de tailles, faisant de cet instrument un outil particulièrement précieux pour les analyses NTA d’échantillons polydispersés tels qu’une population hétérogène de VE. Néanmoins, étant donné que la plupart des préparations pour VÉHICULES électriques seront polydispersées dans leur composition et contiendront probablement des impuretés, les chercheurs doivent savoir que les limites de détection dépendantes de l’échantillon ont une incidence sur la forme de la distribution globale de la taille et font donc preuve de prudence lors de l’interprétation des résultats.
Une autre limitation majeure de la NTA est qu’elle mesure plus que les véhicules électriques. L’instrument NTA détectera, mesurera et comptera toutes les particules dépassant la limite de détection, y compris les agrégats de protéines, les lipoprotéines, les débris cellulaires et la contamination causée par les diluants. Cependant, la concentration de particules en arrière-plan peut être corrigée en mesurant la concentration de particules du diluant avant le chargement et en mesurant un échantillon. Nous recommandons d’utiliser au moins 0,02 μm de PBS filtré et avons constaté une très faible contamination particulaire lors de l’utilisation de PBS filtré de 3 kDa. En outre, il est possible d’étendre la NTA pour mesurer et analyser les véhicules électriques marqués par fluorescence, en surmontant la limitation de la mesure non spécifique. Des kits commerciaux sont disponibles qui teignent spécifiquement et efficacement les membranes des vésicules intactes uniquement, à l’exclusion des fragments de membrane, des agrégats de protéines et d’autres particules de la mesure NTA. Ainsi, les données dérivées de la NTA fluorescente représentent plus précisément la concentration réelle de VE et la distribution de taille. Grâce au marquage sélectif des antigènes de surface des VE, la NTA fluorescente peut également mesurer des VE spécifiques marqués par des anticorps marqués par fluorescence, ce qui permet de compter et de dimensionner des sous-populations de VE spécifiques à l’antigène et biologiquement pertinentes.
Il y a eu peu de travail sur la normalisation des protocoles NTA, ce qui rend difficile la comparabilité des résultats et entrave la reproductibilité entre les échantillons, les jours, les opérateurs et les laboratoires. L’instrument de suivi des particules démontré dans ce protocole nécessite peu de temps pratique. Nous avons également noté quels paramètres d’instruments les utilisateurs devraient signaler pour faciliter la reproductibilité des données générées. Ainsi, suivre le protocole optimisé présenté ici devrait aboutir à une normalisation et permettre la comparaison des résultats entre les laboratoires. Un autre avantage de l’utilisation de cet instrument est que l’échantillon est préparé dans une cuvette, ce qui permet à l’instrument de remuer à plusieurs reprises entre les vidéos, assurant un échantillon statistiquement aléatoire pour chaque vidéo et donnant un résultat plus reproductible que d’autres instruments NTA disponibles dans le commerce qui reposent sur des pompes à seringues et des cellules de débit. En outre, les multiples lasers permettent de détecter des particules avec des indices de réfraction variables, ce qui donne des résultats plus robustes. Pourtant, le fonctionnement de cet instrument de suivi des particules ne nécessite pas la connaissance des propriétés des matériaux particulaires telles que l’indice de réfraction, ce qui rend les mesures plus reproductibles entre les opérateurs.
Les VE ont été identifiés dans presque tous les biofluides testés2,5. Cependant, l’isolement efficace de VE spécifiques (p. ex., ves spécifiques à un type cellulaire) de différents milieux (p. ex., sang, lait maternel, milieux de culture cellulaire) présente un défi difficile. De nombreuses méthodes différentes d’isolation des véhicules électriques ont été décrites9. La NTA peut être effectuée pour comparer les rendements des VE isolés à l’aide de différentes méthodes et identifier les variations dans les vésicules qui découlent de différentes méthodes d’isolement. Ceci est important pour interpréter les résultats en aval, car la fonction des différentes sous-populations de VE reste actuellement floue. Il est également important de mesurer avec précision la concentration de VE dans les études qui déterminent si un certain traitement, une certaine condition ou une certaine molécule a un impact sur la libération de VE. Par exemple, notre groupe s’intéresse à l’impact des expositions environnementales telles que la pollution atmosphérique par les particules sur le contenu et les rejets de véhicules électriques. Afin d’évaluer si une condition affecte la libération de VE, le nombre de vésicules doit être quantifié avec précision. Lors de l’utilisation de VE comme biomarqueurs diagnostiques, la concentration de VE dans l’échantillon pourrait avoir une incidence sur les résultats du test. Ainsi, une méthode fiable pour déterminer la concentration des particules et la distribution granulométrique est essentielle.
Quoi qu’il en soit, les mesures NTA doivent être accompagnées d’autres techniques complémentaires qui peuvent mesurer les particules indépendamment des autres particules de l’échantillon, telles que la TEM. Les technologies plus récentes telles que la détection d’impulsions résistives microfluidiques (MRPS) sont également prometteuses pour le dimensionnement et le comptage des véhicules électriques indépendamment de la polydispersité de l’échantillon. D’autres analyses biochimiques ou protéomiques d’échantillons de VE peuvent être utilisées en plus des données de taille et de concentration pour regrouper des sous-ensembles de VE en populations d’importance biologique. En conclusion, la mesure de concentrations de particules valides et reproductibles et de distributions granulométriques est importante pour le domaine des VÉHICULES ÉLECTRIQUES. Le ViewSizer 3000 permet d’obtenir des mesures précises et reproductibles de la concentration totale de VE et de la distribution de la taille des VE, même pour les échantillons hautement polydispersés, comme démontré ici. À l’avenir, nous espérons voir d’autres comparaisons expérimentales rigoureuses de cet instrument avec d’autres instruments de la NTA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tous les auteurs ont déclaré qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Nous reconnaissons Jeffrey Bodycomb, Ph.D. de HORIBA Instruments Incorporated pour son aide à calibrer l’instrument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | To dilute samples |
| 100 nm bead standard | Thermo Scientific | 3100A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| 400 nm bead standard | Thermo Scientific | 3400A | To test ViewSizer 3000 calibration |
| Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC901024 | To filter PBS diluent |
| Collection tubes, 2 mL | Qiagen | 19201 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Compressed air duster | DustOff | DPSJB-12 | To clean cuvettes |
| Cuvette insert | HORIBA Scientific | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Cuvette jig | HORIBA Scientific | - | To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| De-ionized water | VWR | 02-0201-1000 | To clean cuvettes |
| Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables | Dell | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Ethanol (70-100%) | Millipore Sigma | - | To clean cuvettes |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Glass scintillation vials with lids | Thermo Scientific | B780020 | To clean cuvettes |
| "Hook" tool | Excelta | - | Provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| Lint-free microfiber cloth | Texwipe | TX629 | To clean cuvettes and cover work surface |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | For isolation of human plasma extracellular vesicles |
| Stir bar | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Quartz cuvette with cap | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Initially provided with purchase of ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | Nanoparticle tracking instrument |
References
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad. Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2, 1800021 (2018).
- Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Erdbrügger, U., Lannigan, J. Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).
- Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis. Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).
- Kanemoto, S., et al. Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).
- Benedikter, B. J., et al. Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants. Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).
- Saeed-Zidane, M., et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. PloS One. 12, 0187569 (2017).
- Wang, K., et al. Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells. ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).
- King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 12, 421 (2012).
- Bonzini, M., et al. Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects. Environment Research. 155, 228-234 (2017).
- Neri, T., et al. Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells. Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).
- Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363, 989-993 (2019).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).
- Saveyn, H., et al. Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation. Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).
- Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).
- Varga, Z., et al. Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).
- Serrano-Pertierra, E., et al. Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification. Biomolecules. 10, (2020).
- Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies. Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).
- Bohren, C. F., Huffman, D. R. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
