Summary
هنا، نقدم استراتيجية مناعة لتوصيف تمايز الخلايا العملاقة، ونظهر كيف تسمح تلك الاستراتيجية بفرز الخلايا الضخمة في مراحل مختلفة مع مفرز خلايا مضان. يمكن تطبيق المنهجية على الأنسجة الأولية البشرية ، ولكن أيضا على الخلايا الضخمة المتولدة في الثقافة في المختبر.
Abstract
التمايز Megakaryocyte (MK) يشمل عددا من الدورات البطينية التي تؤدي إلى متعدد الأضلاع للغاية (تصل حتى >64N) وخلية كبيرة للغاية (40-60 ميكرومتر). على عكس المعرفة المتزايدة بسرعة في megakaryopoiesis على بيولوجيا الخلية والمستوى الجزيئي ، يقتصر توصيف megakaryopoiesis عن طريق قياس التدفق الخلوي على تحديد MKs الناضجة باستخدام علامات سطحية خاصة بالنسب ، في حين أن مراحل التمايز السابقة MK لا تزال غير مستكشفة. هنا، نقدم استراتيجية مناعة تسمح بتحديد مراحل التمايز MK المتعاقبة، مع زيادة حالة الحيلة، في المصادر الأولية البشرية أو في الثقافات المختبرية مع لوحة دمج MK علامات سطح محددة وغير محددة. على الرغم من حجمها وهشاشتها، يمكن أن تكون MKs مناعية باستخدام اللوحة المذكورة أعلاه ومثرية بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس في ظل ظروف محددة من الضغط وقطر الفوهة. يسهل هذا النهج الدراسات متعددة الوميك ، بهدف فهم أفضل لتعقيد megakaryopoiesis وإنتاج الصفائح الدموية في البشر. قد يشكل التوصيف الأفضل للأورام الضخمة أمرا أساسيا في تشخيص أو تشخيص الأمراض المرتبطة بالنسب والخبيثة.
Introduction
تتطور الخلايا الضخمة (MKs) من الخلايا الجذعية الدموية (HSCs) بعد عملية معقدة تسمى megakaryopoiesis ، والتي يتم تنظيمها بشكل رئيسي من خلال هرمون thrombopoietin (TPO). تصف الرؤية الكلاسيكية ل megakaryopoiesis الرحلة الخلوية من HSCs من خلال سلسلة من المراحل الهرمية للأسلاف الملتزمين والخلايا السليفة ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى عضو الكنيست الناضج. أثناء النضج ، تواجه MKs جولات متعددة من بطانة الرحم ، وتطوير نظام غشاء ترسيم معقد داخل الخلايا (DMS) ، والذي يوفر مساحة غشاء كافية لإنتاج الصفائح الدموية ، وإنتاج وتعبئة عدد كبير من العوامل الموجودة في الحبيبات المختلفة الموروثة من الصفائح الدموية الناضجة1و2و3. ونتيجة لذلك، فإن MKs الناضجة هي خلايا كبيرة (40-60 ميكرومتر) تتميز ب نواة متعددة الأضلاع للغاية (تصل حتى إلى >64N). تشير الدراسات الحديثة إلى طرق بديلة تفرق بها HSCs إلى MKs متجاوزة نقاط التفتيش التقليدية للالتزام بالنسب استجابة لبعض الحالات المرضية الفيزيائية4و5و6و7و8و9و 10و11. وتسلط هذه النتائج الضوء على أن التمايز الدموي تجاه عضو الكنيست الناضج هو عملية متصلة ومتكيفة تستجيب للاحتياجات البيولوجية.
مع زيادة المعرفة حول بيولوجيا الخلية والجوانب الجزيئية التي تميز megakaryopoiesis12، فإن معظم الأبحاث المخصصة لدراسة العملية عن طريق قياس التدفق الخلوي تقتصر على تحديد MKs الناضجة باستخدام علامات سطحية خاصة بالنسب(أي CD42A /B ، CD41/CD61) ، في حين أن مراحل التمايز السابقة MK لا تزال غير مستكشفة. ونحن وثقت سابقا استراتيجية لمرحلة megakaryopoiesis في نخاع العظام الماوس والعظام المستمدة من نخاع MK الثقافات13،14، والتي قمنا بتكييفها وتطبيقها على البشر15. في هذه المقالة نعرض استراتيجية مناعة تسمح بتحديد خصائص megakaryopoiesis ، من HSCs إلى MKs الناضجة ، في المصادر الأولية البشرية (نخاع العظام - BM - والدم المحيطي - PB - ) أو في الثقافات المختبرية باستخدام لوحة دمج علامات سطح محددة وغير محددة MK (CD61 ، CD42B ، CD49B ، CD31 ، KIT و CD71 ، من بين أمور أخرى). على الرغم من حجمها الكبير وهشاشتها ، يمكن أن تكون MKs مناعية باستخدام علامات سطح الخلية المذكورة أعلاه ومثرية بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس في ظل ظروف محددة من الضغط وقطر الفوهة لتقليل تمزق الخلايا و / أو الضرر. هذه التقنية تسهل النهج متعددة Omics، بهدف فهم أفضل لتعقيد megakaryopoiesis وإنتاج الصفائح الدموية في صحة الإنسان والمرض. والجدير بالذكر، أنها سوف تشكل أداة مفيدة للمساعدة في التشخيص والتكهن في سياق سريري من الطلب المتزايد.
في هذه المخطوطة نوثق استراتيجية لتنظيم الهياكل الضخمة البشرية مع لوحة دمج علامات سطح MK محددة وغير محددة من المصادر الأولية أو ولدت في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم بروتوكول لفرز، مع مضان تنشيط خلية الفرز، والكسور المفضلة و MKs ناضجة(الشكل 1). هذه الخطوة ليست شعبية، كما أنها صعبة من الناحية الفنية نظرا لحجم وهشاشة كبيرة من MKs. ومع ذلك، فقد تم استخدامه في كل من الماوس وعينات نخاع العظم البشري سابقا، ونظرا للتقدم التكنولوجي، مع نتيجة أفضل في كل مرة16،17،18. المصادر الأساسية البشرية حيث يمكن دراسة MKs أو MK السلائف تشمل نخاع العظام ودم الحبل السري والدم المحيطي، من بين أمور أخرى. معالجة عينة المناسبة لعزل كسر الخلية ذات الصلة للتحليل على كل عينة من الأهمية. يتم دمج الإجراءات القياسية ، مع بعض الاعتبارات التي يجب مراعاتها عند استهداف دراسة megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على عينات كاملة من الدم ونخاع العظم ومعالجتها وفقا لإعلان هلسنكي لعام 1964. تم الحصول على عينات دم كاملة من متبرعين أصحاء بعد إعطاء موافقة مستنيرة (ISPA) ، ضمن دراسة وافقت عليها لجنتنا الأخلاقية الطبية المؤسسية (مستشفى يونيفرسيتياريو سنترال دي أستورياس - HUCA-). تم الحصول على عينات نخاع العظم من نخاع العظم يستنشق المواد المهملة من المرضى الذين تدار في قسم أمراض الدم في مستشفى كلينيكو سان كارلوس (HCSC).
الشكل 1:التمثيل التخطيطي للبروتوكول الموثق في هذه المخطوطة. يشار إلى المصادر البشرية الأساسية أو الثقافات الأولية حيث يمكن تنظيم تمايز MK باستخدام الفينوتينات المناعية. يمكن تطبيق استراتيجية التشتيت المناعي هذه على دراسة العملية في الأمراض المختلفة المرتبطة بالنسب أو الأورام الخبيثة في المصادر الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يجعل من الممكن فرز الخلية من MKs والسلائف مع مفرز الخلية المضان تنشيط، والذي يسمح بمزيد من التحليل للكسور المخصب. الصور المستخدمة هي جزء من الفن الطبي سيرفييه (SMART) من قبل سيرفييه ومرخصة بموجب CC BY 3.0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. معالجة الدم الكامل ونخاع العظام قبل إجراء الفينوتينات المناعية
- عند استخدام الدم الكامل (البنك الدولي) من التبرعات كمصدر أساسي، قم بعزل مكون الخلية أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMC) اختياريا. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الطرد المركزي التفاضلي القياسي جنبا إلى جنب مع فصل الخلايا المتدرجة الكثافة، كما هو موضح سابقا15.
- باختصار، دم الطرد المركزي عند 193 × ز لمدة 15 دقيقة (الفرامل 3) في درجة حرارة الغرفة. تجاهل كسر البلازما العلوي وجمع حلقة بافي. تمييع 1:1 مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS) / تريصوديوم سيترات ديهيدرات (38 غرام / لتر، درجة الحموضة 7) العازلة وماصة بعناية حجم 25 مل على رأس 15 مل من محلول الانحدار الكثافة (1.076 غرام / مل) في أنابيب 50 مل.
- جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 1114 × ز (مسرع 3، فرامل 3، درجة حرارة الغرفة). تجاهل كسر البلازما وجمع حلقة بافي التي تحتوي على PBMCs. غسل عن طريق إضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي في 435 × ز لمدة 5 دقائق، وإعادة الإنفاق في برنامج تلفزيوني لمزيد من الاستخدام.
- بدلا من ذلك، استخدم عينة البنك الدولي (حوالي 100 ميكرولتر) للكتابة المناعية بعد جرف خلايا الدم الحمراء (RBCs) والغسيل الشامل.
- باختصار، تمييع 1:1 في الجليد البارد RBC lysing العازلة (4.15 غرام من NH4Cl، 0.5 غرام من KHCO3 و 18.5 ملغ من EDTA (الثلاثي الثالث) إلى 500 مل من H2O، pH 7.1-7.4). انتظر حتى يصبح تعليق الخلية أحمر متحول (3-5 دقائق).
- جهاز الطرد المركزي في 435 س ز لمدة 5 دقائق، في 4 درجة مئوية، وإعادة إنفاق الخلايا في برنامج تلفزيوني. كرر الإجراء عدة مرات حسب الضرورة للحصول على بيليه خلية بيضاء.
- وبالمثل، معالجة مباشرة العينات التي تم الحصول عليها من نخاع العظام (الطموح) مع RBC lysing العازلة (انظر النقطة 1.2) وغسل شامل، لتبدأ مع تعليق واضح خلية واحدة (الشكل 1).
- تجنب استخدام الدوامة لخلط العينات أثناء المعالجة ، لأنها قد تضر MKs الهشة.
ملاحظة: قد يؤدي تدرج الكثافة للحصول على PBMCs إلى كسر خلية أكثر ثراء وأنظف بالمقارنة مع RBC-lysed WB. ومع ذلك ، ينبغي أن نضع في اعتبارنا أن عالية الكثافة ، قد تضيع MKs ناضجة في كسر "العدلات". وسيناقش هذا الأمر في النتائج التمثيلية.
- تجنب استخدام الدوامة لخلط العينات أثناء المعالجة ، لأنها قد تضر MKs الهشة.
2. في المختبر MK التمايز من PBMCs
ملاحظة: يمكن تمييز الحيوانات المبرومة في المختبر عن السلائف السابقة، مثل الخلايا CD34+ الموجودة في مصادر أولية مختلفة(أي البنك الدولي/PBMCs، دم الحبل السري، نخاع العظم) ومن iPSCs. هناك بروتوكولات مختلفة تم تطبيقها لهذه الغاية. هنا، نستخدم أسلوب ثقافة التي وضعتها لنا أن يسمح MK التمايز من PBMCs، دون الحاجة إلى إثراء لCD34+ السلائف15،19،20،21،22.
- يتكون هذا البروتوكول من ثلاث مراحل ثقافية ، حيث يزداد تركيز الجلطات الدموية (TPO) تدريجيا على حساب عوامل النمو التي تفضل انتشار السلائف السابقة(أيSCF و EPO) ، والتي تنخفض تدريجيا(الشكل 2)15.
- للوسط الأساس, استخدام StemSpan SFEM تكملها مع 0.4٪ من مزيج الدهون الغنية بالكوليسترول و 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين.
- بالنسبة للمرحلة الأولى المتوسطة، استخدم وسيط الأساس المكمل ب SCF (100 نانوغرام/مل)، والإريثروبويتين (EPO، 0.5 U/mL) وثرومبوبوتين (TPO، 30 نانوغرام/مل). المرحلة الثانية المتوسطة هي الأساس المتوسطة تكملها مع SCF (50 نانوغرام / مل) ، EPO (0.25 U / مل) و TPO (50 نانوغرام / مل). بالنسبة للمرحلة الثالثة المتوسطة، استخدم الوسيطة الأساسية المكملة ب TPO (100 نانوغرام/مل).
- PBMCs الثقافة في المرحلة الأولى المتوسطة. في اليوم 6-8، ضع PBMCs في المرحلة الثانية المتوسطة، وفي اليوم 9-12 وضع PBMCs في المرحلة الثالثة المتوسطة.
- استبدل الخلايا المتوسطة بخلايا الطرد المركزي عند 435 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة من المرحلة الأولى إلى المرحلة الثانية، وعلى 95 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة من المرحلة الثانية إلى المرحلة الثالثة، وإعادة تعليقها في وسط جديد.
- خلايا الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. في هذه الثقافات الأولية، يستمر تمايز MK من 10 إلى 14 يوما، ويمكن سحب العينات في نقاط زمنية مختلفة طوال فترة الثقافة، وذلك لمتابعة تمايز MK.
- للوسط الأساس, استخدام StemSpan SFEM تكملها مع 0.4٪ من مزيج الدهون الغنية بالكوليسترول و 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين.
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لأسلوب ثقافة MK المشتقة من PBMC. وقد تم استزراع مركبات PBMCs من المتبرعين الأصحاء وفقا للبروتوكول الثلاثي المرحلة الذي طورناه لتوليد MK في المختبر (مخطط مقتبس من Salunkhe وآخرون). 15 يتم عرض الصور التي التقطت في اليوم 10 واليوم 13 من الثقافة. يتم التقاط الصور مع هدف 20X. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- جمع العينات: غسل الخلايا عن طريق تطبيق الطرد المركزي منخفض السرعة لمدة 5 دقائق (95 × ز) وإعادة إنفاقها في PBS أو PBS التي تحتوي على 1٪ من ألبوم مصل البقر (BSA). بالنسبة للتشكيل المناعي، تبلغ الكثافة المثالية 105-10 خلايا 6/100 ميكرولتر (انظر النقطة 3.1). اعتمادا على حالة الثقافات(أي وجود خلايا ميتة، والحطام، وما إلى ذلك)، قد تكون هناك حاجة إلى 1 أو 2 يغسل. جمع الخلايا الخاصة بك في الوقت نقطة الاهتمام أثناء الثقافة.
3. Immunophenotyping من التمايز MK - الحضانة مع لوحة من الأجسام المضادة الموسومة
- احتضان عينات الخلية بلوحة من الأجسام المضادة الموسومة باتباع الإجراءات القياسية ، مع الانتباه إلى أجهزة الطرد المركزي بسرعة منخفضة (95 × ز) عند معالجة الخلايا الضخمة. نحن عادة احتضان العينات مع 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني في أحجام 100 ميكرولتر في 4 درجة مئوية، 20 دقيقة، مع مجموعة من 105-106 خلايا.
- توسيع نطاق عند الضرورة.
- بعد الحضانة، أضف 5 مل من 1٪ BSA في PBS، والطرد المركزي بسرعة منخفضة (95 × ز)، ونسيخ الفائق وإعادة إنفاق العينة في 2٪ BSA في PBS للحفاظ على صلاحية MK (2 مل). إضافة 1-5 mM EDTA لتعطيل المجاميع الخلية الخلية (التي ينظر إليها بشكل طبيعي في الثقافات MK).
- نقل العينات إلى أنبوب قاع مستدير 12 × 75 مم (أنبوب FACS) أو لوحة ، وإبقائها في الظلام حتى تحليل قياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا.
- إعداد الأجسام المضادة واحد ويمزج لوحة الأجسام المضادة؛ إعداد مقياس التدفق الخلوي:
- يتجدد الأجسام المضادة قبل استخدامها لتحديد التركيز الأمثل في لوحات الأجسام المضادة. التركيز الأمثل للأجسام المضادة هو أدنى تركيز يفصل بشكل واضح إيجابي عن الخلايا السلبية (ويسمح بامتياز المستويات المتوسطة للتعبير). على سبيل المثال، تستخدم معظم الأجسام المضادة في تخفيف 1:200 (المخزون 100 ميكروغرام / مل) ما لم يتم ثدي خلاف ذلك أو الإشارة إليها من قبل الشركة المصنعة.
- بمجرد تحديد المعايرة المضادة ، قم بإعداد تخفيف 10x لكل الأجسام المضادة. وتستخدم هذه التخفيفات لضوابط لون واحد ولإعداد يمزج لوحة. المخففات ويمزج لوحة على ما يرام للاستخدام حتى بعد شهر من التحضير (المخزنة في 4 درجة مئوية، ما لم تمنع مؤشرات الشركة المصنعة هذه الظروف التخزين). وهذا يسمح تلطيخ العينات مع نفس اللوحة خلال فترة زمنية.
- استخدم 10 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر من تخفيف 10x لكل من عناصر التحكم أحادية اللون ولمزيج اللوحة.
- بالنسبة لعناصر التحكم أحادية اللون، استخدم حبات تقارب الأجسام المضادة، والتي يمكن قياسها مباشرة بعد إضافة الأجسام المضادة. وينبغي قياس عناصر التحكم أحادية اللون مع كل تجربة، للسماح بتعديل التعويض المناسب (وصقل ما بعد القياس مع برنامج التحليل).
- بدلا من ذلك، قم بتنفيذ عناصر التحكم أحادية اللون مع عينات الخلية. ومع ذلك ، فإن الخرز تسمح للقياس السريع لعدد معين من الأحداث ، والتي ، اعتمادا على الأجسام المضادة / علامة السطح ، قد لا يكون من الممكن الحصول على مصادر الخلايا الأولية أو المستزرعة المعقدة. كما ننصح بتشغيل عينات الخلايا الملطخة بمزيج لوحة "Fluorescence Minus One" (FMO) لإعداد إعدادات التعويض المناسبة (قبل تشغيل التجارب). هذا هو ذات الصلة لتحديد بعناية مشاكل التعويض، وخاصة، في MKs مثقف، لتحديد التداخل autofluorescence (والتي سوف تكون موجودة إذا باستخدام ثقافة المتوسطة التي تحتوي على الفينول الأحمر).
- إعداد ما يكفي من حجم مزيج لوحة، اعتمادا على عدد من العينات، التي تحتوي على الأجسام المضادة من لوحة مصممة. معظم لوحات لدينا تشمل ستة أجسام مضادة (لوحات 6 ألوان، انظر الجداول 1-2).
- لهذه اللوحات، استخدم الليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر من مقياس التدفق الخلوي، ومع ذلك، يمكن تكييف لوحات لسيناريوهات تقنية أخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن تجنب اعتبارات التعويض عند استخدام قياس الخلايا التدفقي القائم على الطيف الكتلي أو مقاييس الخلايا باستخدام تكنولوجيا التركيز الصوتي.
- الأصباغ لقياس الجدوى قد تعطي معلومات خاطئة بشأن MKs، وخصوصا عندما تنضج. MKs هي خلايا نشطة جدا، والإيجابية مع Hoechst، 7-AAD أو PE، قد لا تعكس دائما الموت الفعلي للخلايا. بديل (إذا كان قياس موت الخلية مطلوبا) قد يكون استخدام بقع الميتوكوندريا (CMX Ros) أو الأصباغ التفاعلية أمين (غيبوبة أو الأصباغ الشبح).
الجدول 1: ملاحظات على علامات سطح الخلية من النسب megakaryocytic الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 2: لوحات الأجسام المضادة يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
4. تحليل Ploidy جنبا إلى جنب مع لوحات 6 ألوان
- لتحليل ploidy، بالاشتراك مع لوحة الأجسام المضادة 6 ألوان، والمضي قدما في تثبيت و permeabilization من الخلايا بعد الحضانة مع لوحة الأجسام المضادة. ستسمح هذه الاستراتيجية بالحفاظ على تلطيخ علامة السطح ، مع السماح بتلطيخ الحمض النووي للخلايا. نحن نستخدم Hoechst 33342 لتلطخ الحمض النووي ، حيث يمكن تصوره باستخدام الليزر البنفسجي 405 نانومتر المتاح.
- ل105-106 خلايا، بعد الحضانة مع لوحة الأجسام المضادة، وخلايا الطرد المركزي (95 × ز لمدة 5 دقائق)، وإعادة الإنفاق في 200 ميكروغرام من العازلة التثبيت واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- خلايا الطرد المركزي كما هو مبين أعلاه، أعيد إنفاقها للمرة الثانية في 200 ميكرولتر تثبيت العازلة، واحتضان آخر 10 دقيقة في RT.
- إعداد permeabilization العازلة، التي تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100، 200 ملغم / مل RNase و 20 ملغم / مل Hoechst 33342 (permeabilization Hoechst MIX).
- خلايا الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه، وإعادة إنفاقها في 300 ميكرولتر من permeabilization Hoechst MIX واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. هذه الخطوة مهمة جدا، لأنه من أجل الحصول على قياس حيلة نظيفة، الجيش الملكي النيبالي يجب أن تتحلل.
- بعد وقت الحضانة، قم بقياس العينات مباشرة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. وإلا، احتفظ بالعينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، في الظلام. قياسها على الفور. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه العينات ثابتة ، يمكن تأخير القياس حتى 24-48 ساعة. تأكد من أن العينة يتم النقر عليها جيدا قبل القياس ، أو تمريرها من خلال مصفاة الخلية ، لضمان تعليق خلية واحدة.
- لا يتم الاحتفاظ المعلمات Morphometric مثل الأمام وجانب مبعثر بعد تثبيت الخلية. سوف تظهر مؤامرة إلى الأمام / الجانب مبعثر انكماش توزيع الخلية بعد التثبيت. ومع ذلك ، يتم الحفاظ على تلطيخ علامة السطح في الغالب ، وبالكاد يتم تغيير استراتيجية اللغات ، مما يسمح بتحليل حالة الحيلة في المراحل المختلفة من التمايز التي تحددها تركيبات علامات السطح.
5. تحليل التمايز MK
ملاحظة: لقد رأينا أن الجمع بين CD31/CD71 يسمح لتعيين عدد من البوابات التي تتوافق مع مراحل مختلفة من التمايز MK. مزيد من الظهر gating مع علامات MK محددة يسمح الفصل بين MKs ناضجة وغير ناضجة. وعلاوة على ذلك، في عينات جديدة، العودة إلى gating للتحقق من وجود علامات أخرى تستخدم، أو لوضع السكان في محاور مبعثر إلى الأمام / الجانب، وصقل تقييم مراحل التمايز MK ويسمح لتجاهل أنواع الخلايا الأخرى التي يمكن أن تكون موجودة على نفس المجموعات السكانية.
- استخدم لوحة من الأجسام المضادة التي تتضمن علامات السلائف المبكرة (KIT، CD34)، وعلامات السلائف الشائعة (CD31، CD71)، وعلامات النسب، وبعضها محدد (CD42A/CD42B، CD49B، CD41/CD61، CLEC2، GPVI، إلخ) (انظر الجداول 1-2). استخدام النسب (لين) كوكتيل (CD3، CD14، CD16، CD19، CD20، وCD56)، كما يسمح ل "تصفية" خلايا الدم الناضجة التي قد تضيف ضجيجا إلى التحليل (عند اختيار لين- السكان). وكمثال على ذلك، سنمر بتحليل مك في مركبات ثنائي الفينيل متعدد الكلور ونخاع العظام ومن خلال ثقافات الخلايا المشتقة من PBMC في النتائج التمثيلية.
6. MK و MK فرز الخلايا السليفة
ملاحظة: تم تحليل الخلايا الملطخة وفرزها على مضان تنشيط خلية فرز FACS Aria IIu مجهزة 488 نانومتر و 633 نانومتر معيار ليزر الحالة الصلبة باستخدام برنامج FACSDiva; بالإضافة إلى ذلك تم تحليل البيانات وعرضها باستخدام برنامج FlowJo و Cytobank (تحليل viSNE). تم تأكيد نقاء الكسور المفرزة من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي لكل جزء من الكسور المفرزة (النقاء فوق 85٪).
- إجراء فرز الخلايا في أقرب وقت ممكن أو في غضون ساعة واحدة بعد حضانة الأجسام المضادة من أجل تجنب تدهور الخلايا.
- تصفية العينة مع مصفاة الخلية 100 ميكرومتر لضمان تعليق خلية واحدة وسلامة MK كبيرة.
- استخدم فوهة خزفية 130 ميكرومتر، وضغط غمد تم ضبطه على 11 رطلا لكل بوصة مربعة (PSI) وتردد محرك الأقراص المنسدل الذي تم ضبطه على 12 كيلوهرتز لكسر التيار إلى قطرات.
- قبل الفرز، قم بتعقيم الفوهة، الغمد، وخطوط العينة من خلال إجراء عملية استحواذ 30 دقيقة مع البنسلين / ستريبتومايسين المخفف 1:5 في الماء العقيم، يليه اكتساب 10 دقيقة مع الماء العقيم لإزالة إزالة التلوث المتبقية.
- بمجرد استقرار الدفق ، قم بضبط تأخير الإسقاط مع الخرز الموصى به من أجل الفرز في وضع الضبط الدقيق أكثر من 97.5٪ من الانخفاضات المنعكسة بمعدل تدفق 400-1200 حدث في الثانية.
- إعداد أنابيب FACS جمع مع 500 ميكرولتر من 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني. يمكن زيادة نسبة BSA إلى 5-10٪.
- إنشاء قالب التجربة مع معلمات مصفوفة التعويض المناسبة.
- تحميل أنبوب FACS في مقياس الخلايا.
- إجراء قياس للعينة لتعيين البوابات المطلوبة ونقاء مجموعات الخلايا المستهدفة. الاحتفاظ السجل تنشيط لإظهار الأحداث حتى 200,000 في بوابات السكان المحددة أثناء فرز الخلية.
- يسمح FACS Aria IIu بفصل ما يصل إلى 4 مجموعات خلايا مختلفة في نفس الوقت. إنشاء تخطيط فرز جديد وحدد جهاز جمع (4 أنابيب) ووضع الدقة المناسبة (ينصح قناع وسيطة من النقاء والاسترداد). وأخيرا، أضف السكان (السكان) ذات الأهمية لكل حقل موقع فرز(الشكل 3).
الشكل 3:التمثيل التخطيطي لمبدأ فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS). تمر الجسيمات عبر فوهة 130 ميكرومتر وتضطر إلى التفكك إلى تيار من القطرات العادية بسبب تطبيق الاهتزاز على الفوهة. بعد ذلك ، يتم استجواب القطرات بواسطة الليزر (نقطة التحليل) وتتم معالجة الإشارات لإعطاء قرار الفرز "" عن طريق تطبيق شحنة على تلك القطرات. عندما تمر قطرة شحن عبر حقل كهربائي عالي الجهد (لوحة الكشف) ، يتم تحويلها وجمعها في أنبوب التجميع المقابل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تحميل أنابيب جمع والبدء في فرز السكان المستهدفة.
- الطرد المركزي أنابيب جمع لمدة 5 دقائق في 95 × ز وإعادة إنفاق بيليه الخلية في الحجم المناسب من 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
- قياس مرة أخرى جزء صغير من كل عينة فرزها، لحساب النقاء.
- تخزين الخلايا بشكل مناسب لمزيد من الاستخدام. يمكن استخدام الخلايا المفرزة للتحليلات الخلوية والجزيئية، أو يمكن إعادة استزراعها بهدف دراسة عملية التفريق بين مجموعة مختارة من الخلايا.
7. إعداد عينة ما بعد الفرز
- إعداد السيتوسبينات للتحليل الخلوي باستخدام جهاز طرد خلوي
- جلب الخلايا المفرزة إلى حجم عمل سهل المعالجة من 100-200 ميكرولتر. خذ بعين الاعتبار أن كثافة الخلية ستعتمد على العائد السكاني المفرز في كل حالة.
- ضع شريحة نظيفة على حامل المعدن وضع أعلى فلتر. تذكر تسمية الشريحة والفلتر لتجنب خلط العينات.
- أضف 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على فتحة الفلتر مقابل الشريحة، بحيث يتم ترطيب الفلتر على حافة الثقب.
- ضع القمع، أغلق حامل المعدن وضعه على مكانه في جهاز الطرد المركزي.
- أضف العينة (100-200 ميكرولتر) داخل القمع.
- جهاز طرد مركزي عند 36 x g لمدة 5 دقائق. يمكن السماح لشرائح السيتوسبين بتجفيف الهواء في RT (مغطاة بشكل صحيح لمنع الغبار) ويمكن الاحتفاظ بها في RT لمدة أسبوع واحد قبل التصبغ المناعي أو الكيمياء الهستوكيميائية.
- لاحتواء المناعة
- إصلاح الشرائح في 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني واحتضان خلال 5min.
- ويمكن استخدام مجموعة من 0.5-4٪ PFA في برنامج تلفزيوني. في أيدينا، ونحن نستخدم 4٪ للحصول على التثبيت السليم للأنسجة أو بعض أنواع الخلايا، و 0.5٪ PFA في برنامج تلفزيوني يكفي للصفائح الدموية. عند إعداد هذه التقنية، تتطلب النسبة المئوية الصحيحة من PFA التحسين لكل نوع/مصدر خلية.
- احتضان 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
- احتضان 5 دقائق في الإيثانول 50٪ (EtOH).
- احتضان 5 دقائق في 70٪ EtOH.
- يخزن في 70٪ EtOH عند -20 درجة مئوية.
- عند تنفيذ التأزيم المناعي، إعادة الترطيب، واتباع الإجراءات القياسية (permeabilization، وغسل، ومنع، والحضانات الأجسام المضادة الأولية والثانوية، والحفاظ على، الخ).
- إصلاح الشرائح في 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني واحتضان خلال 5min.
- للكيمياء الخلوية:
ملاحظة: يمكن أن تكون ملطخة الشرائح مع May-Grünwald Giemsa تلطيخ أو تلطيخ مريحة لكل غرض. - لفحص مورفولوجيا فوري
- إضافة قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة على بقعة تحتوي على الخلية من السيتوسبين ووضع غطاء.
- احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع، ما لم تكن مختومة، مما يسمح بالتخزين طويل الأجل حتى في RT. يسمح التثبيت المتوسط المتصاعد بالتخزين طويل الأجل في RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نخاع العظم و بلويدي
في الشكل 4، نعرض تحليل مناعي تمثيلي ل megakaryopoiesis في عينات BM (الطموح) من المرضى. عند رسم كسر الخلوية ضد CD71 وCD31، لدينا بوابات ستة السكان الرئيسيين: CD31- CD71- (الأحمر)، CD31- CD71+ (الأزرق)، CD31+ CD71- (البرتقالي)، CD31+ CD71منتصف (الأخضر الفاتح)، CD31+ CD71+ (الأخضر الداكن) وCD31++ CD71منتصف (كريم). هذه المجموعات السكانية ليست موجودة دائما في نفس المواقف (النظر في إعدادات قياس الخلايا المستمر)، كما يمكن أن ينظر إليه، وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. قد يكون هذا ملازما للحالة المرضية وحالة نخاع العظم. يظهر على اليمين إعادة ربط هذه المجموعات السكانية الستة المتراكبة في المدرجات التكرارية بعلامة النضج الواردة في اللوحة (CD42A/CD42B)، وإلى مبعثر الأمام. يظهر الشكل أيضا مؤامرة ضد CD31/CD71 تصور تراكب الخلايا CD42B+ مع الكسر الخلوي الكلي لتصور توزيع MKs أكثر نضجا. بشكل عام ، لا يحتوي السكان CD31- CD71- على MKs أو سلائف النسب ، ولا يقدم علامات نضوج MK ، وهو أصغر في الحجم. يحتوي CD31- CD71+ population بشكل رئيسي على خلايا سلالة الغدة الدرقية ، على الرغم من أنه يمكن أن يحتوي أيضا على سلائف نسب شائعة ، كما نفترض من ملاحظاتنا. فإنه لا يزال سلبيا لعلامات النضج MK، واعتمادا على نسبة الخلايا الإريثرويد في وقت سابق أو في وقت لاحق، قد تتقلب مبعثر إلى الأمام كذلك.
على سبيل المثال ، فإن مريض متلازمة خلل التنسج النخاعي (MDS) لديه نسبة أكبر من خلايا الغدة الدرقية غير الناضجة(أيأكبر) ، مقارنة بالمرضى الآخرين. سوف توزيع السلف MK والخلايا الناضجة في خلايا CD31+ ، مع بعض الاختلاف. ومع ذلك ، كما يمكن رؤيته يقارن تحليل BM على كل علم أمراض ، هناك بعض الميزات الثابتة. توجد MKs أكثر نضجا في CD31++ CD71منتصف السكان (كريم) ، وتشمل الأمراض التي يتم فيها "حظر" هذا النضج نقص الصفيح المناعي (ITP) وعينة BM تفاعلية (مع التهاب كامن). بينما في المريض سرطان الغدد الليمفاوية يبدو أن هناك توازنا بين السلائف في وقت مبكر وMKs في وقت متأخر (بوابات البرتقال وكريم)، يتم تغيير هذه النسبة في المريض MDS (مع أكثر "منعت" السلائف) وفي سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) المريض (مع MKs أكثر نضجا). من الفائدة ، يبدو أن "الحصار" مختلف مقارنة الأمراض فيما بينها: في الأمراض التي تتفق مع الالتهاب الأساسي ، قد يكون الحصار بسبب مزيج من عيوب النضج ، والتدمير(أيالمناعة الذاتية) وإنتاج الصفائح الدموية عن طريق تمزق MK.
الشكل 4: Immunophenotyìng من megakaryopoiesis في عينات نخاع العظام البشرية من المرضى الذين يعانون من أمراض مختلفة. تم تحليل عينات نخاع العظم التمثيلي (BM) من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الغدد الليمفاوية(أيBM العادي) ومتلازمة خلل التنسج النخاعي (MDS) وسرطان الدم النخاعي الحاد (AML) والجلطات المناعية (ITP) والمريض المصاب ب BM التفاعلي بسبب العدوى. عند رسم كسر الخلوية(أي، الخلايا النووية) ضد CD71 و CD31 ، قمنا بوابة ستة مجموعات رئيسية : CD31-- CD71-- (الأحمر) ، CD31-- CD71+ (الأزرق) ، CD31+ CD71-- (البرتقالي) ، CD31+ CD71منتصف (الضوء الأخضر) ، CD31+ CD71+ (الأخضر الداكن) وCD31+ + CD71منتصف (كريم). هذه المجموعات السكانية ليست موجودة دائما في نفس المواقف (النظر في إعدادات السيتومتر ثابت)، كما يمكن أن ينظر إليه، وأنه ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. يظهر على اليمين إعادة ربط هذه المجموعات السكانية الستة المتراكبة في المدرجات التكرارية بعلامة النضج الواردة في اللوحة (CD42A/CD42B)، وإلى مبعثر الأمام. يظهر الشكل أيضا مؤامرة ضد CD31/CD71 تصور تراكبا للخلايا CD42B+ مع إجمالي الكسر الخلوي لتصور توزيع MKs الأكثر نضجا. يتم تصوير الأرقام المطابقة للبوابات في مؤامرة النقطة وتراكبات المدرج التكراري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
شرعنا بعد ذلك في تحليل حالة الحيلة للسكان المذكورين أعلاه على عينات BM البشرية. يظهر الشكل 5 حالة حيلة متزايدة داخل CD31+ populations ، التي نتوقع أنها ستكون مختلفة ومميزة لكل سياق مرضي. لاحظ أنه نظرا لتثبيت الخلية وpermeabilization المستخدمة في هذه التجارب، والمؤامرات نقطة لا يمكن مقارنتها تماما لتلك التي من عينات غير ثابتة، غير قابلة للتدبير (الشكل 4).
الشكل 5:تحليل Ploidy للسكان المختارين استنادا إلى تعبير CD31/CD71 ، في عينات BM البشرية. عينات نخاع العظم التمثيلي (BM) من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الدم النخاعي الحاد (AML) وقلة الدم المناعية (ITP). عند رسم كسر الخلوية(أي، الخلايا النووية) ضد CD71 و CD31 ، قمنا بوابة ستة مجموعات رئيسية : CD31-- CD71-- (الأحمر) ، CD31-- CD71+ (الأزرق) ، CD31+ CD71-- (البرتقالي) ، CD31+ CD71منتصف (الضوء الأخضر) ، CD31+ CD71+ (الأخضر الداكن) وCD31+ + CD71منتصف (كريم). هذه المجموعات السكانية ليست موجودة دائما في نفس المواقف (النظر في إعدادات السيتومتر ثابت)، كما يمكن أن ينظر إليه، وأنه ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. العودة إلى gating هذه المجموعات السكانية الستة مضافا إليها في المدرجات التكرارية ضد Hoechst 33342 يظهر حالة ploidy مختلفة من السكان ، والميل العام لزيادة ploidy مع النضج (على الرغم من أن MKs يمكن أن تصل إلى مرحلة النضج بشكل مستقل عن حالة تعدد التوزيع). يتم تصوير الأرقام المطابقة للبوابات في مؤامرة النقطة وتراكبات الرسم البياني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
PBMCs وثقافة الخلية
في الشكل 6، نعرض تحليل مناعة تمثيلية من PBMCs وثقافة MK تعيين مع تلك PBMCs في اليوم 7 واليوم 11. نحن نستخدم لوحة تحتوي على كوكتيل لين، ونحن نظهر الكسر الخلوي من الخلايا الحية قبل وبعد لين- الاختيار. قد يؤدي هذا الاختيار السلبي إلى فقدان جزء من MKs المشاركة في التعبير ، على سبيل المثال ، CD14 ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل أكثر دقة. عند رسم لين-- كسر ضد CD71 وCD31 ، ونحن بوابات خمسة مجموعات رئيسية : CD31-- CD71--، CD31-- CD71+، CD31+ CD71--، CD31+ CD71منتصف وCD31++ CD71منتصف. هذه المجموعات السكانية ليست موجودة دائما في نفس المواقف (النظر في إعدادات قياس الخلايا المستمر)، كما يمكن أن ينظر إليه، وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. في هذه الحالة ، لا تكون الاختلافات متأصلة فقط في الحالة الصحية الفردية أو المرضية ، ولكن أيضا في قدرة التمايز MK للسلائف في كسر PBMC. يظهر على اليمين إعادة ربط هذه المجموعات السكانية الخمسة المتراكبة في المدرجات التكرارية بعلامات أخرى موجودة في اللوحة (KIT وCD42B)، وإلى مبعثر الأمام. السلائف MK وMKs في مراحل مختلفة من النضج هي ضمن CD31+ السكان.
الشكل 6: مناعة من megakaryopoiesis خلال ثقافة الخلية MK، بما في ذلك المواد PBMC البداية. تحليل مناعة تمثيلية من PBMCs وثقافة MK تعيين مع تلك PBMCs في اليوم 7 واليوم 11. نحن نستخدم لوحة تحتوي على كوكتيل لين، ونعرض الكسر الخلوي(أيالخلايا النووية) قبل وبعد اختيار لين. قد يؤدي هذا الاختيار السلبي إلى فقدان جزء من MKs المشاركة في التعبير ، على سبيل المثال ، CD14 ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل أكثر دقة. عند رسم لين - كسر ضد CD71 و CD31، ونحن بوابات خمسة السكان الرئيسيين: CD31- CD71-، CD31- CD71+، CD31+ CD71-، CD31+ CD71منتصف وCD31++ CD71 منتصف. هذه المجموعات السكانية ليست موجودة دائما في نفس المواقف (النظر في إعدادات السيتومتر ثابت)، كما يمكن أن ينظر إليه، وأنه ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. يظهر على اليمين إعادة ربط هذه المجموعات السكانية الخمسة المتراكبة في المدرجات التكرارية بعلامات أخرى موجودة في اللوحة (KIT وCD42B)، وإلى مبعثر الأمام. السلائف MK وMKs في مراحل مختلفة من النضج هي ضمن CD31+ السكان. يظهر الشكل أيضا مؤامرة ضد CD31/CD71 تصور تراكبا للخلايا CD42B+ مع إجمالي الكسر الخلوي لتصور توزيع MKs الأكثر نضجا. يتم تصوير الأرقام المطابقة للبوابات في مؤامرة النقطة وتراكبات المدرج التكراري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 3: النسب المئوية للسكان من تحليل قياس التدفق الخلوي يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
في PBMCs، MKs داخل بوابةمنتصف CD31++ CD71، على الرغم من أن حجمها ليس كبيرا كما رأينا مع MKs مثقف. قد يكون هذا بسبب أي من الخيارين التاليين: تمثل MKs في PBMCs جزءا صغيرا من MKs غير الناضجة التي تدخل الدورة الدموية ، أو جزءا صغيرا من MKs الناضجة المتداولة التي فقدت التعقيد السيتوبلازمي. تجارب الفرز لدينا تشير إلى أن هذا الأخير قد يكون السبب في تفسير هذا الفرق في الحجم. دعم هذا المفهوم، والتعبير عن CD42B، ليست موجودة في 100٪ من الخلايا على تلك المجموعات السكانية (كما يمكن أن ينظر إليه أيضا في عينات BM في الشكل 4)،وربما يرجع ذلك إلى فقدان علامات السطح على تشكيل البروسبليت و / أو سفك الصفائح الدموية. ومع ذلك ، في عينات مثقفة ، و MKs في بوابات "ناضجة" ، هي تقريبا 100 ٪ CD42B+، وأكبر في الحجم. وينبغي مواصلة دراسة هذه الديناميات الخلوية المفترضة والتحقق من صحتها.
نظرا للآثار الجنبية ل TPO ، فإن هذه الثقافات غير متجانسة وغير متزامنة ، مما يجعل من الصعب في حد ذاتها مواصلة تحليل مراحل التمايز المنفصلة ل MK. 19،20 بعد التوسع في السلف في وقت سابق ، سوف تظهر MKs في مراحل النضج المختلفة في الثقافة من اليوم 6-10 (أو قبل ذلك ، بسبب تقلب المانحين) وستزداد تدريجيا في الأعداد مع نضوج الخلايا الملتزمة بنسب MK نحو MK. بعض MKs سيخضع للتمييز النهائي والبدء في تشكيل proplatelets. قرب نهاية الثقافة، سيكون هناك زيادة تدريجية في فقدان الخلايا بسبب "التنضح / الإرهاق" بعد تشكيل الصفائح الدموية وذرف الصفائح الدموية أو موت الخلية(الشكل 2).
إذا كان استخدام نظائرها TPO بدلا من TPO المؤتلف، ينبغي اختبار التركيزات.
مصدر السلف (الكبار، دم الحبل السري) سوف شرط الثقافات، كما MKs من مصادر مراحل النمو المختلفة لها خصائصها الخاصة. وعلاوة على ذلك، فإن الثقافات من الثقافات من CD34+ السلف المخصب، في حين تظهر أكثر تجانسا في بداية الثقافة، وسوف تصل إلى مرحلة من التغايرية والتزامن مرة واحدة التزام MK والتمايز يبدأ19،20.
فرز الخلايا MK
في الشكل 7، نعرض استراتيجية تمثيلية من عينة من MK في الثقافة المختبرية في اليوم 10 من التمايز. عند رسم كسر الخلية النواة ضد CD31 و CD71، أو مبعثر إلى الأمام، يمكننا التمييز بين مجموعتين رئيسيتين تتميز بوجود أو غياب CD31.
عند رسم CD31+ الكسر مقابل CD41 و CD71، يمكننا بوابة أربعة مجموعات رئيسية: CD41- CD71- (1)، CD41 CD71منخفضة + (2)، CD41 CD71منخفضة +++ (3) وCD41+++ CD71+ +(4)، والتي تم التعبير عن علامات سطح أخرى (KIT وCD49B) بشكل متفاوت، مما يسمح بتحديد المقصورة MK كخلايا CD41 إيجابية للغاية(الشكل 7A). يظهر نقاء الكسور المفرزة ، وكذلك البقع الخلوية للسيتوسبينات للكسور المفرزة.
من أجل توصيف طيف سكان الخلية في ثقافات PBMC-MK ، تم استخدام تحليل viSNE(الشكل 7B). تفصل خريطة viSNE الخلايا إلى مجموعات فرعية متميزة مكانيا استنادا إلى مجموعة العلامات التي تعبر عنها. تمثل كل نقطة في تحليل viSNE خلية فردية ملونة وفقا لمستويات التعبير CD31 و CD42A و CD71 و KIT.
الخلايا السلبية المزدوجة (CD31- و CD71-هي أساسا الخلايا الليمفاوية المتبقية (السكان 5) التي تستمر في جميع أنحاء الثقافة في هذه الظروف. تم فرز هذه المجموعة السكانية في جولة ثانية من فرز الخلايا باستخدام الكسر المتبقي من العينة.
البوابتان 6 و7 هما خلايا متوسطةوعالية التعبير من CD71، والتي تشمل سجود الغدة الدرقية، وربما السلائف الأخرى.
يجب أن نأخذ في الاعتبار الصعوبات التقنية بسبب الطبيعة غير المتجانسة للخلية لطريقة الثقافة هذه والطبيعة اللزجة للمجهرات المتعددة الناضجة التي تؤدي إلى وجود MKs ناضجة في السكان الفرعيين حيث لا ينتمون (انظر قسم الملاحظات).
الشكل 7: تحليل ما قبل الفرز المناعي لمدة 10 أيام في المختبر الثقافة MKs. أ) استراتيجية التمثيل gating باستخدام CD31، CD41 و CD71، مع جولتين الفرز، مما أدى إلى CD31+ السكان 1-4 وCD31- السكان 5-7. تم تحليل نقاء كل كسر مفروز بعد الفرز ، ويصور جنبا إلى جنب مع صورة مصغرة تمثيلية من السيتوسبينات الملطخة من كل كسر مفروز. ب) خريطة viSNE لليوم 10 خلايا ثقافة MK المشتقة من PBMC تقاس بقياس التدفق الخلوي. تم تصميم الخريطة باستخدام مستويات التعبير CD31 وCD42B وCD71 و KIT، كما تقاس بقياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
معالجة ما بعد الفرز
يمكن تحليل المجموعات السكانية المفرزة بطرق مختلفة ، بما في ذلك التحليل الخلوي والجزيئي عن طريق الفلورة المناعية (انظر القسم 7) من أجل تقييم ميزات MK في سياق معين من الفيزيولوجيا المرضية ، أو لدراسة أفضل لعملية megakaryopoiesis. وترد بعض الأمثلة في الشكل 8.
الشكل 8. تحليل MK بعد الفرز. أ) التحليل الخلوي لمقصورة MK المفرزة من ثقافة المختبر لمدة 10 أيام. مايو غرونوالد Giemsa تلطيخ يسمح بالملاحظة من السمات الرئيسية للMKs ناضجة، أي،تشكيل pseudopod (السهم الأحمر)، متعدد الأضلاع للغاية MK (السهم الأزرق). ب) تحليل الفلورة المناعية. كانت الخلايا ملطخة بعامل فون ويلبراند المضاد للإنسان (يظهر في الجسم المضاد الثانوي الأحمر Alexa Fluor 555 Goat anti-mouse IgG) أو CD31 المضاد للإنسان أو CD41/CD61 ، وكلاهما مرتبط ب FITC (يظهر باللون الأخضر) وتم تسمية الحمض النووي مع DAPI (يظهر باللون الأزرق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظات:
يمكن فرز MKs من مناطق غير متوقعة بسبب القدرة على إرفاق الخلايا بغشاءها(الشكل 9). يمكن أن تكون هذه المشكلة مشكلة للحصول على الخلايا ذات النقاء العالي subpopulations. لتقليل تجميعات خلايا الخلية، يمكن إضافة EDTA 1-5 mM إلى مخازن المزج لوحة.
وعلاوة على ذلك، عند استخدام البنك الدولي كمادة البداية، اقترحنا إما الحصول على PBMCs أو lysing RBCs لاستخدام كسر الخلوية مباشرة. في الشكل 10 نعرض تحليل تدفق قياس الخلايا للمنهجيتين. من ناحية، عند تحلل RBCs وتحليل المقصورة الخلوية بأكملها، لا يزال لدينا كمية كبيرة من العدلات. ويمكن تصفية هذه مع علامة محددة (أو باستخدام استراتيجية كوكتيل لين). ومع ذلك، قد نفقد بعض MKs بسبب طبيعتها المنحرفة المتعلقة بتعبير علامة السطح. من ناحية أخرى، سوف تسمح لنا عزلة PBMC بالتخلص من العدلات وكذلك RBCs، على الرغم من أننا قد نفقد MKs بكثافة أعلى(أيتلك التي تحتوي على ميزات سيتوبلازمية أكثر تعقيدا أو أكثر غير ناضجة). كما هو موضح في الشكل 10، MKs من البنك الدولي lysed تظهر تعبيرا أعلى من علامات النضج ، والتي تظهر أقل عند عزل PBMCs. قد يؤدي تدرج الكثافة إلى فقدان MKs التي لا تزال تحتوي على سيتوبلازم معقد ، في حين أن تلك الموجودة في كسر PBMC ، قد تكون بالفعل "منهكة" في الدورة الدموية بعد إطلاق الصفائح الدموية ، وبالتالي الحفاظ على نواة متعددة الأضلاع داخل سيتوبلازم أقل تعقيدا. وينبغي عدم الخلط بينها وبين MKs غير ناضجة. كل إجراء له مزاياه وعيوبه.
الشكل 9. الطبيعة اللزجة ل MKs. يمكن العثور على MKs في بوابات غير متوقعة بسبب قدرتها على ربط الخلايا بغشاءها. أ-ج) تم فرز MKs في السكان 1 (B) و 5 (A و C) ، وفقا لاستراتيجية gating لفرز MK. يمكن أن تكون هذه المشكلة مشكلة للحصول على الخلايا ذات النقاء العالي subpopulations. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10. تدفق الخلايا المناعية من MKs من PBMCs أو البنك الدولي بعد lysing RBCs. أ) استراتيجية جاتينغ. ب) الحجم (FSC) ، والتعقيد الخلوي (SSC) والتعبير عن CD42A و CD41 و CD71 و KIT في MKs كما هو محدد في PBMCs أو البنك الدولي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معظم البحوث التي تركز على دراسة megakaryopoiesis عن طريق قياس التدفق الخلوي يقتصر حتى الآن على تحديد مجموعات فرعية MK باستخدام علامات سطح النسب فقط محددة(أي، CD42A/CD42B ، CD41/CD61) ، في حين تم فحص مراحل التمايز MK في وقت سابق بشكل سيئ. في هذه المقالة نعرض استراتيجية مناعة لمعالجة توصيف التدفق الشامل لقياس الخلايا من megakaryopoiesis الإنسان. عموما، نود أن تسليط الضوء على فائدة الجمع بين MK علامات سطح محددة وغير محددة (الجدولين 1 و 2) في نفس لوحة الأجسام المضادة قياس التدفق لدراسة megakaryopoiesis بطريقة أكثر تفصيلا. يمكن أن يكون نهجنا الجديد بمثابة أداة قوية للمساعدة في التشخيص و / أو التكهن في الاضطرابات الدموية. ونرى أن الأفرقة والتوليفات المعروضة ليست نهائية. لقد لاحظنا سلوكا ديناميكيا جدا للعلامات السطحية في المصادر الأولية البشرية (بشكل رئيسي في عينات BM) ، والذي يعتمد أيضا على علم الأمراض تحت السنة. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات ، ونأمل أن يبدأ المجتمع العلمي في تطبيق هذا النهج فيما يتعلق بالتغذية المرتدة مع ملاحظات من دراسات تركز على علم أمراض واحد وكيف يمكن أن يساعد تنظيم الهياكل الضخمة في التشخيص أو التكهن. إن تنفيذ توصيف HSC و MK المشترك في الأنسجة الأولية ، بالنظر إلى الطرق المتنوعة لالتزام MK كما تم تعليقه في قسم المقدمة ، له أهمية ويستحق المزيد من التطورات. وحقيقة أننا قادرون أيضا على الكشف عن المهام متعددة البروم في مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم هي ملاحظة تماما. كما نفترض أن تحليل MKs في هذا المصدر الأساسي سيساعد في تشخيص المرض وتشخيصه ، كبديل وثيق الصلة ب BM aspirates ، لأن استخراج عينة الدم ليس غازيا. ويتطلب هذا الجانب أيضا التنمية.
على الرغم من القيود التقنية المرتبطة بالخصائص البيولوجية للMKs (الحجم الكبير، هشاشة التناضح، الالتصاق) تمكنا من فرز مراحل النضج المختلفة في العديد من مصادر MK البشرية، وتحديدا في BM، PBMCs وثقافات الخلايا المشتقة من PBMCs. سيتم إجراء دراسات مستقبلية من أجل تحليل خصائص الهواة الضخمة في المصادر البشرية الأخرى مثل دم الحبل السري وفي حالات مرضية فيزيو مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم إمكانات التفريق لكل كسر خلية مسور ومفرز في مقايسات وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) لذريات MK (CFU-MK) لتقييم إمكانات التمايز لكل مجموعة سكانية في رحلة megakaryopoiesis بشكل موضوعي. في حين تجاوز القيود التقنية التي كان يعتقد مرة واحدة لعرقلة هذا النوع من megakaryocytes ناضجة، مثل هذه الضرورة لا تزال تتطلب المزيد من الكمال. فمن ناحية، فإن بيئة الوميض أحادية الخلية ستسمح بإجراء دراسات شاملة عند تطبيق لوحات الفينوتينوبينج المناعية، ولكن إذا كان هناك حاجة إلى الفرز المادي، على الرغم من أن نقاء المجموعات السكانية المفرزة أعلى من 85٪ (استنادا إلى تعبير علامة السطح)، فيجب أخذ المتغيرات الأخرى في الاعتبار، والتي لا يزال من الصعب حلها. كما ذكرنا، ثقافات MK ليست متزامنة وغير متجانسة للغاية. MKs أنفسهم منحرفة في التعبير عن علامة السطح، وتبادل علامات مع غيرها من الخلايا المايلويد وغير النخاعي الدموي وغير الهيماتوبويتية. وعلاوة على ذلك، من الصعب جدا أن تتجمع مع المتغيرات المورفومترية (الأمام والمبعثر الجانبي) لأنها توزع على نطاق واسع. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحسين هذا التطبيق، ولكن مع الجهود التعاونية، ونحن أقرب إلى تضييق megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم دعم إنتاج المواد السمعية البصرية من قبل BD Biosciences.
Acknowledgments
ونشكر ماركوس بيريز باستريشيا ولورينا رودريغيز لورينزو وبغونا غارسيا منديز وبالوما سيريزو وألمودينا باييرو وماريا دي لا بوفيدا - كولومو على الدعم التقني. وقد دعم هذا العمل جزئيا من المنح الطبية (Roche SP200221001) إلى A.B، وهي زمالة RYC (RYC-2013-12587؛ الوزير دي إيكونوميا إي سيفيبيتفيداد، إسبانيا) ومنحة I+D 2017 (SAF2017-85489-P؛ الوزير دي سيينسيا، إنوفاسيون إي يونيفرسيدادس، إسبانيا وفودوس فيدر) إلى L.G. ، منحة سيفيرو أوتشوا (PA-20-PF-BP19-014؛ كونسيجيريا دي سيينسيا، إنوفاسيون إي يونيفرسيدادس ديل برينسيبيادو دي أستورياس، إسبانيا) إلى بي.M-ب. ومنحة ما بعد الدكتوراه داخل المنظمة لعام 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Spain) إلى A.A.-H. نشكر رينييه فان دير ليندن لتقاسم معرفته (والوقت)، وخاصة نصيحته الحكيمة على متعدد الألوان الموسومة الأجسام المضادة لوحة مزيج ومتعددة اللون حبة التحكم إعداد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
