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Biology

मानव प्राथमिक स्रोतों से मानव एमकेएस की इम्यूनोफेनोटाइपिंग और सेल छंटाई या हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर्स से विट्रो में विभेदित

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62569
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1, 4, 5, 1,6
1Platelet Research Lab, Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias (ISPA), 2Flow Cytometry and Cell Sorting Platform (ISPA), 3Clinical Diagnosis Laboratory - Dept. of Hematology, Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), 4Department of Hematology, Hospital Universitario Severo Ochoa (HUSO), 5Department of Hematology, Instituto de Investigación Sanitaria San Carlos (IdISSC), Hospital Clínico San Carlos (HCSC), 6Dept. of Medicine, University of Oviedo

Summary

यहां, हम मेगाकारेयोसाइट भेदभाव के लक्षण वर्णन के लिए एक इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं, और दिखाते हैं कि कैसे यह रणनीति फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टर के साथ विभिन्न चरणों में मेगाकारियोसाइट्स की छंटाई की अनुमति देती है। पद्धति मानव प्राथमिक ऊतकों पर लागू की जा सकती है, लेकिन विट्रो मेंसंस्कृति में उत्पन्न मेगाकारियोसाइट्स के लिए भी।

Abstract

मेगाकारियोसाइट (एमके) भेदभाव में कई एंडोमाइटिक चक्र शामिल हैं जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक पॉलीप्लाइड (यहां तक कि >64N तक पहुंचना) और बेहद बड़ी कोशिका (40-60 माइक्रोन) होती है। सेल जीव विज्ञान और आणविक स्तर पर मेगाकैरियोपोइसिस में तेजी से बढ़ते ज्ञान के विपरीत, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मेगाकार्योपोइसिस का लक्षण वर्णन वंश-विशिष्ट सतह मार्कर का उपयोग करके परिपक्व एमकेएस की पहचान तक सीमित है, जबकि पहले एमके भेदभाव चरण बेरोज़गार रहते हैं। यहां, हम एक इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति पेश करते हैं जो लगातार एमके भेदभाव चरणों की पहचान की अनुमति देता है, बढ़ती प्लॉयडी स्थिति के साथ, मानव प्राथमिक स्रोतों में या विट्रो संस्कृतियों में एमके विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर को एकीकृत करने वाले पैनल के साथ। इसके आकार और कमजोरी के बावजूद, एमके को उपरोक्त पैनल का उपयोग करके इम्यूनोफेनोटाइप किया जा सकता है और दबाव और नोजल व्यास की विशिष्ट परिस्थितियों में फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई द्वारा समृद्ध किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण मनुष्यों में मेगाकारियोपोइसिस और प्लेटलेट उत्पादन की जटिलता को बेहतर ढंग से समझने के उद्देश्य से मल्टी-ओमिक्स अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। मेगाकार्योपोइसिस का बेहतर लक्षण वर्णन वंश से संबंधित विकृतियों और द्रोह के निदान या पूर्वानुमान में मौलिक हो सकता है।

Introduction

मेगाकारियोपिटसिट्स (एमकेएस) मेगाकारियोपोइसिस नामक एक जटिल प्रक्रिया के बाद हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) से विकसित होता है, जिसे मुख्य रूप से हार्मोन थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) द्वारा करवाया जाता है। मेगाकार्योपोइसिस का शास्त्रीय दृष्टिकोण एचएससी से सेलुलर यात्रा का वर्णन प्रतिबद्ध जनक और अग्रदूत कोशिकाओं के पदानुक्रमित चरणों के उत्तराधिकार के माध्यम से करता है, जो अंततः एक परिपक्व एमके के लिए अग्रणी होता है। परिपक्वता के दौरान, एमके्स एंडोमाइटोसिस के कई दौरों का अनुभव करते हैं, एक जटिल इंट्रासेलुलर सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) विकसित करते हैं, जो प्लेटलेट उत्पादन के लिए पर्याप्त झिल्ली सतह प्रदान करता है, और परिपक्व प्लेटलेट्स1,2,3द्वारा विरासत में मिली विभिन्न कणिकाओं में निहित कारकों की अधिकता का कुशलतापूर्वक उत्पादन और पैक करता है। नतीजतन, परिपक्व एमके बड़ी कोशिकाएं (40-60 माइक्रोन) हैं जो अत्यधिक पॉलीप्लाइड नाभिक (यहां तक कि >64N तक पहुंचने) की विशेषता हैं। हाल के अध्ययनों से उन वैकल्पिक मार्गों का सुझाव मिलता है जिनके द्वारा एचएससी कुछ फिजियो-पैथोलॉजिकल स्थितियों 4 , 5,6,7,8,9,10,11के जवाब में पारंपरिक वंश प्रतिबद्धता चौकियों को दरकिनार करतेहुएएमकेएस में अंतर करते हैं । इन निष्कर्षों पर प्रकाश डाला है कि परिपक्व एमके के प्रति हेमेटोपोइटिक भेदभाव एक सातत्य और अनुकूली प्रक्रिया है जो जैविक जरूरतों का जवाब देती है।

सेल जीव विज्ञान और मेगाकैरियोपॉजिस12की विशेषता वाले आणविक पहलुओं पर बढ़ते ज्ञान के साथ, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रक्रिया के अध्ययन के लिए समर्पित अधिकांश शोध वंश-विशिष्ट सतह मार्कर(यानी, सीडी 42ए/बी, सीडी 41/सीडी 61) का उपयोग करके परिपक्व एमके की पहचान तक सीमित हैं, जबकि पहले एमके विभेद चरण अनएक्सप्लोरे गए रहते हैं। हमने पहले माउस बोन मैरो और बोन मैरो-व्युत्पन्न एमके संस्कृतियों13, 14में मेगाकार्योपोइस को मंचित करने की रणनीति का दस्तावेजीकरण किया था, जिसे हमने मनुष्यों के लिए अनुकूलित और लागू किया है15। वर्तमान लेख में हम एक इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति दिखाते हैं जो मानव प्राथमिक स्रोतों (बोन मैरो-बीएम-एंड पेरिफेरल ब्लड-पीबी-) या विट्रो संस्कृतियों में एमके विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर (सीडी 61, सीडी 42बी, सीडी 49बी, सीडी 31, किट और सीडी 71) में, एचएससी से परिपक्व एमकेएस तक मेगाकैरियोपॉइसिस के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। अपने बड़े आकार और कमजोरी के बावजूद, MKs ऊपर उल्लिखित सेल सतह मार्कर का उपयोग कर इम्यूनोफेनोटाइप किया जा सकता है और फ्लोरेसेंस द्वारा समृद्ध-दबाव और नोजल व्यास की विशिष्ट परिस्थितियों में सेल टूटना और/ यह तकनीक मानव स्वास्थ्य और रोग में मेगाकारियोपोसिस और प्लेटलेट उत्पादन की जटिलता को बेहतर ढंग से समझने के उद्देश्य से बहु-ओमिक्स दृष्टिकोणों की सुविधा प्रदान करती है। उल्लेखनीय है, यह बढ़ती मांग के नैदानिक संदर्भ में निदान और पूर्वानुमान सहायता के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में पेश करेगा।

इस पांडुलिपि में हम प्राथमिक स्रोतों से एमके-विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर को एकीकृत करने वाले पैनल के साथ मानव मेगाकैरियोपोइसिस को मंचित करने या विट्रो मेंउत्पन्न करने की रणनीति का दस्तावेजीकरण करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टर, पसंदीदा अंशों और परिपक्व एमकेएस(चित्र 1)के साथ सॉर्ट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह कदम लोकप्रिय नहीं है, क्योंकि एमकेएस के बड़े आकार और कमजोरी के कारण यह तकनीकी रूप से मुश्किल है। हालांकि, इसे पहले माउस और मानव अस्थि मज्जा के नमूनों में नियोजित किया गया है, और तकनीकी उन्नति के कारण, हर बार16,17,18बेहतर परिणाम के साथ। मानव प्राथमिक स्रोत जहां एमकेएस या एमके अग्रदूतों का अध्ययन किया जा सकता है, उनमें बोन मैरो, कॉर्ड ब्लड और परिधीय रक्त शामिल हैं। प्रत्येक नमूने पर विश्लेषण के लिए प्रासंगिक सेल अंश को अलग करने के लिए उचित नमूना प्रसंस्करण महत्वपूर्ण है। मेगाकारियोपोइसिस के अध्ययन पर लक्ष्य रखते समय कुछ विचारों के साथ मानक प्रक्रियाओं को शामिल किया जाता है।

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Protocol

हेलसिंकी की 1 9 64 की घोषणा के अनुसार पूरे रक्त और अस्थि मज्जा के नमूने प्राप्त किए गए थे और संसाधित किए गए थे। सूचित सहमति (आईएसपीए) देने के बाद स्वस्थ रक्त नमूनों से पूरे रक्त नमूने प्राप्त किए गए, जो हमारी संस्थागत चिकित्सा नैतिक समिति (अस्पताल Universitario सेंट्रल डी Asturias-HUCA-) द्वारा अनुमोदित अध्ययन के भीतर थे । बोन मैरो के नमूने अस्पताल क्लिनिको सैन कार्लोस (एचसीएससी) के हेमेटोलॉजी विभाग में प्रबंधित रोगियों की अस्थि मज्जा एस्पिरेट डिस्कार्ड सामग्री से प्राप्त किए गए थे।

Figure 1
चित्र 1:इस पांडुलिपि में प्रलेखित प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्राथमिक मानव स्रोतों या प्राथमिक संस्कृतियों जहां एमके भेदभाव इम्यूनोफेनोटाइपिंग का उपयोग करके मंचन किया जा सकता है संकेत दिया जाता है। इस इम्यूनोफेनोटाइपिंग रणनीति को प्राथमिक स्रोतों में विभिन्न वंश से संबंधित विकृतियों या द्रोह में प्रक्रिया के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह एक फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टर के साथ एमकेएस और अग्रदूतों की सेल छंटाई संभव बनाता है, जो समृद्ध अंशों के आगे विश्लेषण की अनुमति देता है। इस्तेमाल की गई छवियां सर्वियर द्वारा सर्वियर मेडिकल आर्ट (स्मार्ट) का हिस्सा हैं और सीसी बाय 3.0 के तहत लाइसेंस प्राप्त हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. इम्यूनोफेनोटाइपिंग से पहले पूरे रक्त और अस्थि मज्जा प्रसंस्करण

  1. प्राथमिक स्रोत के रूप में दान से पूरे रक्त (डब्ल्यूबी) का उपयोग करते समय, वैकल्पिक रूप से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (पीबीएमसी) घटक को अलग करते हैं। यह मानक अंतर अपकेंद्रित्र घनत्व ढाल सेल जुदाई के साथ संयुक्त का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि पहले15वर्णित है ।
    1. संक्षेप में, कमरे के तापमान पर 15 मिनट (ब्रेक 3) के लिए 193 x g पर अपकेंद्रित्र रक्त। ऊपरी प्लाज्मा अंश त्यागें और बफी अंगूठी इकट्ठा करें। पतला 1:1 फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) /ट्राइसोडियम साइट्रेट डिहाइड्रेट (38 ग्राम/एल, पीएच 7) बफर और पिपेट के साथ 50 मीटर ट्यूबों में डेंसिटी ग्रेडिएंट सॉल्यूशन (1.076 ग्राम/एमएल) के 15 एमएल के शीर्ष पर 25 एमएल की मात्रा सावधानी से।
    2. 1114 x g (त्वरक 3, ब्रेक 3, कमरे का तापमान) पर 20 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। प्लाज्मा अंश को त्यागें और पीबीएमसीसी युक्त बफी रिंग को इकट्ठा करें। पीबीएस की एक ही मात्रा जोड़कर धोएं, 5 मिनट के लिए 435 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें, और आगे के उपयोग के लिए पीबीएस में रिसिपेंड करें।
  2. वैकल्पिक रूप से, लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और पूरी तरह से धोने के बाद इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए डब्ल्यूबी नमूना (लगभग 100 माइक्रोल) का उपयोग करें।
    1. संक्षेप में, बर्फ ठंड आरबीसी में पतला 1:1 बफर (एनएच 4 सीएल का4.15ग्राम, केएचसीओ3 का 0.5 ग्राम और 18.5 मिलीग्राम ईडीटीए (ट्रिपलएक्स III) से 500 मिलीएल तक एच 2 ओ, पीएच 7.1-7.4) । जब तक सेल निलंबन पारदर्शी लाल (3-5 मिनट) हो जाता है रुको।
    2. 5 मिनट के लिए 435 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, 4 डिग्री सेल्सियस पर, और पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। एक सफेद सेल गोली प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में कई बार के रूप में प्रक्रिया दोहराएं।
  3. इसी तरह, आरबीसी lysing बफर (बिंदु 1.2 देखें) और पूरी तरह से धोने के साथ बोन मैरो (आकांक्षा) से प्राप्त नमूनों को सीधे संसाधित करें, जैसा कि एक स्पष्ट एकल-कोशिका निलंबन(चित्रा 1)के साथ शुरू होता है।
    1. प्रसंस्करण के दौरान नमूनों को मिलाने के लिए भंवर के उपयोग से बचें, क्योंकि यह नाजुक एमकेएस को नुकसान पहुंचा सकता है। ट्यूब को फ्लिकिंग या उलटा करके मिलाएं।
      नोट: पीबीएमसी प्राप्त करने के लिए घनत्व ढाल आरबीसी-lysed पश्चिम बंगाल की तुलना में एक अमीर और क्लीनर सेल अंश में परिणाम हो सकता है । हालांकि, हमें यह ध्यान में रखना चाहिए कि उच्च घनत्व, परिपक्व एमके "न्यूट्रोफिल" अंश में खो सकता है। इस पर प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा करेंगे।

2. पीबीएमसी से इन विट्रो एमके भेदभाव

नोट: एमकेएस को पहले के अग्रदूतों से विट्रो में अंतर किया जा सकता है, जैसे सीडी 34+ कोशिकाएं, विभिन्न प्राथमिक स्रोतों में मौजूद(यानी, डब्ल्यूबी/पीबीएमसी, कॉर्ड ब्लड, बोन मैरो) और आईपीएससी से । इस उद्देश्य के लिए अलग-अलग प्रोटोकॉल लागू किए गए हैं। यहां, हम हमारे द्वारा विकसित एक संस्कृति विधि का उपयोग करते हैं जो पीबीएमसी से एमके भेदभाव की अनुमति देता है, सीडी 34+ अग्रदूत15,19,20, 21, 22के लिए समृद्ध होने की आवश्यकताकेबिना।

  1. इस प्रोटोकॉल में तीन संस्कृति चरण होते हैं, जहां थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) की एकाग्रता धीरे-धीरे पहले के अग्रदूत(यानीएससीएफ, ईपीओ) के प्रसार के पक्ष में विकास कारकों की कीमत पर बढ़ती है, जो धीरे-धीरे कम हो जाती है(चित्र 2)15।
    1. आधार माध्यम के लिए, कोलेस्ट्रॉल समृद्ध लिपिड मिश्रण और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.4% के साथ पूरक StemSpan SFEM का उपयोग करें।
      1. चरण-1 माध्यम के लिए, एससीएफ (100 एनजी/एमएल), एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ, 0.5 यू/एमएल) और थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ, 30 एनजी/एमएल) के साथ पूरक आधार माध्यम का उपयोग करें। द्वितीय चरण माध्यम एससीएफ (50 एनजी/एमएल), ईपीओ (025 यू/एमएल) और टीपीओ (50 एनजी/एमएल) के साथ आधार माध्यम है। तीसरे चरण के माध्यम के लिए टीपीओ (100 एनजी/एमएल) के साथ आधार माध्यम का उपयोग करें।
    2. फेज-1 मीडियम में कल्चर पीबीएमसी। दिन 6-8 में, पीबीएमसी को द्वितीय चरण में रखें, और दिन 9-12 में पीबीएमसी को तीसरे चरण के माध्यम में रखें।
    3. चरण 1 से चरण द्वितीय तक कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 435 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं द्वारा मध्यम की जगह, और चरण द्वितीय से तीसरे चरण तक कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 95 x ग्राम पर, और उन्हें ताजा माध्यम में पुनर्व्यय।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिकाओं, 5% सीओ2. इन प्राथमिक संस्कृतियों में, एमके भेदभाव 10-14 दिनों तक रहता है, और नमूने संस्कृति अवधि के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर तैयार किए जा सकते हैं, जैसा कि एमके भेदभाव का पालन करने के लिए।

Figure 2
चित्रा 2:पीबीएमसी-व्युत्पन्न एमके संस्कृति विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। स्वस्थ दानदाताओं से पीबीएमसी को हमारे द्वारा विकसित तीन चरण प्रोटोकॉल के अनुसार सुसंस्कृत किया गया था ताकि एमके इन विट्रो (सालुंखे एट अल से अनुकूलित योजना) उत्पन्न हो सके। 15 संस्कृति के दिन 10 और दिन 13 में ली गई तस्वीरें दिखाई जाती हैं । चित्र 20X उद्देश्य के साथ लिए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. नमूना संग्रह: 5 मिनट (95 x ग्राम) के लिए कम गति वाले अपकेंद्रित्र को लागू करके कोशिकाओं को धोएं और उन्हें पीबीएस या पीबीएस में फिर से खर्च करें जिसमें 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)। इम्यूनोफेनोटाइपिंग के लिए, आदर्श घनत्व 105 -106 कोशिकाएं/100 माइक्रोल (बिंदु 3.1 देखें)। संस्कृतियों की स्थिति(यानी, मृत कोशिकाओं, मलबे, आदि की उपस्थिति) के आधार पर, 1 या 2 वॉश की आवश्यकता हो सकती है। संस्कृति के दौरान ब्याज के समय-बिंदुओं पर अपनी कोशिकाओं को इकट्ठा करें।

3. एमके भेदभाव का इम्यूनोफेनोटाइपिंग - टैग-एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ इनक्यूबेशन

  1. मानक प्रक्रियाओं के बाद टैग-एंटीबॉडी के पैनल के साथ सेल नमूनों को इनक्यूबेट करें, मेगाकारियोसाइट्स को संसाधित करते समय कम गति (95 x ग्राम) पर अपकेंद्रित्र पर ध्यान दे रहे हैं। हम सामान्य रूप से 105-106 कोशिकाओं की सीमा के साथ 4 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट पर 100 माइक्रोन की मात्रा में पीबीएस में 1% बीएसए के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करते हैं।
  2. जब आवश्यक हो तो स्केल करें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस में 1% बीएसए का 5 एमएल जोड़ें, कम गति (95 x ग्राम) पर अपकेंद्रित्र, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और एमके व्यवहार्यता (2 मिलीएल) को संरक्षित करने के लिए पीबीएस में 2% बीएसए में नमूना फिर से खर्च करें। सेल-सेल समुच्चय (जो स्वाभाविक रूप से एमके संस्कृतियों में देखे जाते हैं) को बाधित करने के लिए 1-5 एमएम ईडीटीए जोड़ें।
  4. नमूनों को 12 x 75 मिमी राउंड बॉटम ट्यूब (FACS ट्यूब) या प्लेट में स्थानांतरित करें, उन्हें प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण या सेल छंटाई तक अंधेरे में रखें।
  5. एकल एंटीबॉडी और एंटीबॉडी पैनल की तैयारी घोला जा सकता है; प्रवाह साइटोमीटर की स्थापना:
    1. एंटीबॉडी पैनलों में इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए उनके उपयोग से पहले एंटीबॉडी को टिट्रेट करें। एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता सबसे कम एकाग्रता है जो नकारात्मक कोशिकाओं से स्पष्ट रूप से सकारात्मक को अलग करती है (और अभिव्यक्ति के मध्यवर्ती स्तरों के भेद की अनुमति देती है)। एक उदाहरण के रूप में, अधिकांश एंटीबॉडी का उपयोग 1:200 कमजोर पड़ने (स्टॉक 100 μg/l) में किया जाता है जब तक कि अन्यथा निर्माता द्वारा टिटरेट या इंगित न किया जाए।
    2. एक बार एंटीबॉडी टिटरेशन निर्धारित हो जाने के बाद, प्रत्येक एंटीबॉडी का 10x कमजोर पड़ने की तैयारी करें। इन कमजोर पड़ने का उपयोग एकल रंग नियंत्रण के लिए और पैनल मिक्स तैयार करने के लिए किया जाता है। कमजोर पड़ने और पैनल घोला जा सकता है तैयारी के बाद भी एक महीने के उपयोग के लिए ठीक कर रहे है (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, जब तक निर्माता के संकेत इन भंडारण शर्तों को बाधित) । यह एक समय अवधि के माध्यम से एक ही पैनल के साथ नमूनों के धुंधला की अनुमति देता है।
    3. एकल रंग नियंत्रण के लिए और पैनल मिश्रण के लिए 10x कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोन प्रति 10 μL का उपयोग करें।
      1. एकल रंग नियंत्रण के लिए, एंटीबॉडी आत्मीयता मोतियों का उपयोग करें, जिसे एंटीबॉडी जोड़ने के बाद सीधे मापा जा सकता है। एकल रंग नियंत्रण हर प्रयोग के साथ मापा जाना चाहिए, उचित मुआवजा समायोजन की अनुमति देने के लिए (और ठीक ट्यूनिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ बाद माप) ।
      2. वैकल्पिक रूप से, सेल-नमूनों के साथ एकल रंग नियंत्रण करें। हालांकि, मोती घटनाओं की एक दी गई संख्या है, जो, एंटीबॉडी के आधार पर/ हम उचित क्षतिपूर्ति सेटिंग्स (प्रयोगों को चलाने से पहले) स्थापित करने के लिए "फ्लोरेसेंस माइनस वन" (एफएमओ) पैनल के साथ दाग सेल नमूनों को चलाने की सलाह भी देते हैं। यह उचित रूप से मुआवजे की समस्याओं की पहचान करने के लिए प्रासंगिक है, और विशेष रूप से, सुसंस्कृत एमके में, ऑटोफ्लोरेसेंस हस्तक्षेप की पहचान करने के लिए (जो फिनोल लाल युक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग करते हुए मौजूद होगा)।
    4. पैनल मिश्रण की पर्याप्त मात्रा तैयार करें, नमूनों की संख्या के आधार पर, डिजाइन किए गए पैनल की एंटीबॉडी युक्त। हमारे अधिकांश पैनलों में छह एंटीबॉडी (6-रंग पैनल, टेबल 1-2देखें) शामिल हैं।
    5. इन पैनलों के लिए, प्रवाह साइटोमीटर के 488-एनएम और 633-एनएम लेजर का उपयोग करें, हालांकि, पैनलों को अन्य तकनीकी परिदृश्यों के अनुकूल किया जा सकता है। इसके अलावा, ध्वनिक ध्यान देने वाली तकनीक के साथ मास-स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री या साइटोमीटर का उपयोग करते समय मुआवजे के विचारों का निराकरण किया जा सकता है।
      1. व्यवहार्यता को मापने के लिए रंजक एमकेएस के बारे में झूठी जानकारी दे सकते हैं, खासकर जब वे परिपक्व होते हैं। एमके बहुत सक्रिय कोशिकाओं को बढ़ा रहे हैं, और Hoechst, 7-AAD या पीई के साथ सकारात्मकता, हमेशा वास्तविक सेल मौत को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है । एक विकल्प (यदि सेल डेथ माप की आवश्यकता है) माइटोकॉन्ड्रिया दाग (सीएमएक्स रोस) या अमीन प्रतिक्रियाशील रंगों (ज़ोंबी या भूत रंग) का उपयोग हो सकता है।

तालिका 1: मेगाकैरियोसाइटिक वंश के सेल सतह मार्कर पर नोट्स कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 2: एंटीबॉडी पैनल कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

4. 6 रंग पैनलों के साथ संयुक्त प्लॉयड विश्लेषण

  1. प्लॉयडी विश्लेषण के लिए, 6-रंग एंटीबॉडी पैनल के संयोजन में, एंटीबॉडी पैनल के साथ इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं के निर्धारण और पारीकरण के साथ आगे बढ़ें। यह रणनीति कोशिकाओं के डीएनए के धुंधला होने की अनुमति देते हुए सतह मार्कर धुंधला के संरक्षण की अनुमति देगी। हम डीएनए दाग करने के लिए Hoechst 33342 का उपयोग करें, क्योंकि यह उपलब्ध वायलेट 405-एनएम लेजर के साथ कल्पना की जा सकती है।
  2. 105 -106 कोशिकाओं के लिए, एंटीबॉडी पैनल, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (5 मिनट के लिए 95 x ग्राम) के साथ इनक्यूबेशन के बाद, 200 माइक्रोन में पुनर्व्यवस व्यय फिक्सेशन बफर और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट में इनक्यूबेट।
  3. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के रूप में ऊपर संकेत दिया, २०० μL निर्धारण बफर में एक दूसरी बार के लिए फिर से निलंबित कर दिया, और आरटी में एक और 10 मिनट इनक्यूबेट ।
  4. 0.1% ट्राइटन एक्स-100, 200 मिलीग्राम/एमएल आरएनएसई और 20 मिलीग्राम/एमएल होचस्ट 33342 (परमीबिलाइजेशन होचस्ट मिक्स) वाले परमेबिलाइजेशन बफर तैयार करें।
  5. ऊपर के रूप में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, उन्हें पारमेबिलाइजेशन होचस्ट मिक्स के 300 माइक्रोल में फिर से खर्च करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट को इनक्यूबेट करें। यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि, एक साफ प्लॉयड माप प्राप्त करने के लिए, आरएनए को अपमानित किया जाना चाहिए ।
  6. इनक्यूबेशन समय के बाद, नमूनों को सीधे प्रवाह साइटोमीटर के साथ मापें। अन्यथा, नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, अंधेरे में। उन्हें तुरंत मापें। हालांकि, चूंकि ये नमूने तय हैं, इसलिए माप में 24-48 घंटे की भी देरी हो सकती है। सुनिश्चित करें कि नमूना मापने से पहले अच्छी तरह से झटका है, या एक सेल छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए, एक एकल सेल निलंबन को आश्वस्त करने के लिए ।
    1. सेल निर्धारण के बाद फॉरवर्ड और साइड स्कैटर जैसे मॉर्फोमेट्रिक पैरामीटर नहीं बनाए जाते हैं। फॉरवर्ड/साइड स्कैटर प्लॉट निर्धारण के बाद सेल डिस्ट्रीब्यूशन का सिकुड़न दिखाएगा। हालांकि, सतह मार्कर धुंधला ज्यादातर संरक्षित है, और गेटिंग रणनीति मुश्किल से बदल जाता है, सतह मार्कर संयोजनों द्वारा परिभाषित भेदभाव के विभिन्न चरणों में प्लॉयडी स्थिति के विश्लेषण की अनुमति देता है।

5. एमके भेदभाव विश्लेषण

नोट: हमने देखा है कि CD31/CD71 का संयोजन कई गेट्स सेट करने की अनुमति देता है जो एमके भेदभाव के विभिन्न चरणों के अनुरूप हैं। इसके अलावा एमके-विशिष्ट मार्कर के साथ बैक-गेटिंग परिपक्व और अपरिपक्व एमकेएस के पृथक्करण की अनुमति देता है। इसके अलावा, ताजा नमूनों में, इस्तेमाल किए गए अन्य मार्कर की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए बैक-गेटिंग, या आबादी को फॉरवर्ड/साइड स्कैटर कुल्हाड़ियों में रखने के लिए, एमके भेदभाव चरणों के आकलन को परिष्कृत करता है और अन्य सेल प्रकारों को त्यागने की अनुमति देता है जो एक ही आबादी पर मौजूद हो सकते हैं।

  1. एंटीबॉडी के एक पैनल का उपयोग करें जिसमें शुरुआती अग्रदूत मार्कर (किट, सीडी 34), आम अग्रदूत मार्कर (सीडी 31, सीडी 71), और वंश मार्कर शामिल हैं, उनमें से कुछ विशिष्ट (सीडी 42ए/सीडी42बी, सीडी 49बी, सीडी 41/सीडी61, CLEC2, GPVI, आदि) (टेबल 1-2देखें)। वंश (लिन) कॉकटेल (सीडी 3, सीडी 14, सीडी 16, सीडी 19, सीडी 20, और सीडी 56) का उपयोग, परिपक्व हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को "फ़िल्टर" करने की अनुमति देता है जो विश्लेषण में शोर जोड़ सकते हैं (लिन- जनसंख्या का चयन करते समय)। एक उदाहरण के रूप में, हम प्रतिनिधि परिणामों में पीबीएमसी, बोन मैरो और पीबीएमसी-व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों के माध्यम से एमकेएस के विश्लेषण के माध्यम से जाएंगे।

6. एमके और एमके अग्रदूत सेल छंटाई

नोट: दाग कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया और एक फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टर FACS Aria IIu पर हल किया गया 488-एनएम और 633-एनएम मानक ठोस-राज्य लेजर FACSDiva सॉफ्टवेयर का उपयोग कर से सुसज्जित; डेटा का अतिरिक्त विश्लेषण किया गया और फ्लोजो सॉफ्टवेयर और साइटोबैंक (viSNE विश्लेषण) का उपयोग करके प्रस्तुत किया गया। क्रमबद्ध अंशों की शुद्धता की पुष्टि प्रत्येक क्रमबद्ध अंशों (85% से ऊपर शुद्धता) के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा की गई थी।

  1. सेल खराब होने से बचने के लिए एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के 1 घंटे के भीतर जितनी जल्दी हो सके सेल छंटाई करें।
  2. एकल सेल निलंबन और बड़े एमके की अखंडता को आश्वस्त करने के लिए 100 माइक्रोन सेल छलनी के साथ नमूने को फ़िल्टर करें।
  3. एक 130-μm सिरेमिक नोजल का उपयोग करें, एक म्यान दबाव प्रति वर्ग इंच (PSI) और ड्रॉप ड्राइव आवृत्ति 12 kHz के लिए सेट करने के लिए बूंदों में धारा को तोड़ने के लिए सेट दबाव ।
  4. छंटाई से पहले, बाँझ पानी में 1:5 पतला पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 30 मिनट के अधिग्रहण का प्रदर्शन करके नोजल, म्यान और नमूना लाइनों को निष्फल करें, जिसके बाद शेष विसंदूषण को हटाने के लिए बाँझ पानी के साथ 10 मिनट का अधिग्रहण किया गया।
  5. एक बार जब स्ट्रीम स्थिर हो जाती है, तो अनुशंसित मोतियों के साथ ड्रॉप-देरी को समायोजित करें ताकि प्रति सेकंड 400-1200 घटनाओं की प्रवाह दर पर 97.5% से अधिक परावर्तित बूंदों को ठीक ट्यून मोड में सॉर्ट किया जा सके।
  6. पीबीएस में 2% बीएसए के 500 माइक्रोन के साथ कलेक्शन एफएस ट्यूब तैयार करें। बीएसए का प्रतिशत 5-10 फीसद तक बढ़ाया जा सकता है।
  7. उचित मुआवजा मैट्रिक्स मापदंडों के साथ प्रयोग टेम्पलेट उत्पन्न करें।
  8. साइटोमीटर में FACS ट्यूब लोड करें।
  9. लक्षित कोशिका आबादी के वांछित द्वार और शुद्धता निर्धारित करने के लिए नमूने का माप करें। सेल-छंटाई के दौरान चयनित जनसंख्या द्वारों में 200,000 घटनाओं को दिखाने के लिए सक्रिय रिकॉर्ड बनाए रखें।
  10. FACS Aria IIu एक ही समय में 4 विभिन्न सेल आबादी को अलग करने की अनुमति देता है। एक नई तरह लेआउट बनाएं और संग्रह डिवाइस (4 ट्यूब) और उचित सटीक मोड (शुद्धता और वसूली के मध्यवर्ती मुखौटा की सिफारिश की है) का चयन करें। अंत में, प्रत्येक प्रकार के स्थान क्षेत्र(चित्र 3)में रुचि की जनसंख्या (ओं) जोड़ें।

Figure 3
चित्र 3:फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के सिद्धांत का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कण 130 माइक्रोन-नोजल से गुजरते हैं और नोजल में कंपन के आवेदन के कारण नियमित बूंदों की धारा में टूटने के लिए मजबूर होते हैं। इसके बाद, बूंदों को लेजर (विश्लेषण के बिंदु) द्वारा पूछताछ की जाती है और संकेतों को उन बूंदों पर चार्ज लगाकर 'सॉर्ट निर्णय' देने के लिए संसाधित किया जाता है। जब एक चार्ज ड्रॉपलेट एक उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रोस्टैटिक फील्ड (डिटेक्शन प्लेट) से गुजरता है, तो इसे विक्षेपित और संबंधित संग्रह ट्यूब में एकत्र किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. संग्रह ट्यूब लोड करें और लक्षित आबादी को सॉर्ट करना शुरू करें।
  2. 95 x g पर 5 मिनट के लिए संग्रह ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और पीबीएस में 2% बीएसए की उचित मात्रा में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  3. शुद्धता की गणना करने के लिए प्रत्येक हल किए गए नमूने का एक अंश फिर से मापें।
  4. आगे के उपयोग के लिए उचित रूप से कोशिकाओं को स्टोर करें। क्रमबद्ध कोशिकाओं का उपयोग साइटोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, या चयनित कोशिका आबादी की भेदभाव प्रक्रिया का अध्ययन करने के उद्देश्य से फिर से संस्कारी हो सकता है।

7. पोस्ट-सॉर्ट सैंपल तैयार करना

  1. साइटोसेंट्रफ्यूज के साथ साइटोलॉजिकल विश्लेषण के लिए साइटोस्पिन तैयार करना
    1. 100-200 μL की एक आसान करने के लिए संभाल काम की मात्रा के लिए हल कोशिकाओं लाओ । ध्यान रखें कि सेल घनत्व प्रत्येक मामले में हल की गई जनसंख्या उपज पर निर्भर करेगा।
    2. मेटल होल्डर पर क्लीन स्लाइड रखें और फिल्टर टॉप रखें। नमूनों को मिलाने से बचने के लिए स्लाइड और फ़िल्टर को लेबल करना याद रखें।
    3. स्लाइड के खिलाफ फिल्टर छेद पर 100 μL PBS जोड़ें, तो फिल्टर छेद रिम पर humidified हो जाता है।
    4. कीप रखें, मेटल होल्डर को बंद करें और उसे सेंट्रलाइज में अपने स्पॉट पर रखें।
    5. कीप के अंदर नमूना (100-200 माइक्रोन) जोड़ें।
    6. 5 मिनट के लिए 36 x g पर सेंट्रलाइज। साइटोस्पिन स्लाइड्स को आरटी में सूखी हवा देने की अनुमति दी जा सकती है (धूल को रोकने के लिए ठीक से कवर किया गया) और इम्यूनोदाते या हिस्टोकेमिस्ट्री से पहले 1 सप्ताह के लिए आरटी में रखा जा सकता है।
  2. इम्यूनोदाता के लिए
    1. पीबीएस में पतला 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में स्लाइड फिक्स करें और 5मिनट के दौरान इनक्यूबेट करें।
      1. पीबीएस में 0.5-4% पीएफए की एक सीमा का उपयोग किया जा सकता है। हमारे हाथों में, हम ऊतकों या कुछ सेल प्रकारों का उचित निर्धारण प्राप्त करने के लिए 4% का उपयोग करते हैं, और पीबीएस में 0.5% पीएफए प्लेटलेट्स के लिए पर्याप्त है। इस तकनीक को स्थापित करते समय पीएफए के सही प्रतिशत के लिए प्रति सेल प्रकार/स्रोत अनुकूलन की आवश्यकता होती है ।
    2. पीबीएस में 5 मिनट इनक्यूबेट।
    3. 50% इथेनॉल (एटोह) में 5 मिनट इनक्यूबेट करें।
    4. 70% एटोह में 5 मिनट इनक्यूबेट।
    5. -20ºC पर 70% EtOH में स्टोर करें।
    6. इम्यूनोस्टेटिंग, रीहाइड्रेट करते समय, और मानक प्रक्रियाओं (पारमेबिलाइजेशन, धोने, अवरुद्ध, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, संरक्षण, आदि) का पालन करें।
  3. साइटोकेमिस्ट्री के लिए:
    नोट: स्लाइड मई-Grünwald Giemsa धुंधला या प्रत्येक उद्देश्य के लिए सुविधाजनक धुंधला के साथ दाग जा सकता है ।
  4. तत्काल आकृति विज्ञान परीक्षा के लिए
    1. साइटोस्पिन के सेल युक्त स्थान पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें और एक कवरलिप रखें।
    2. स्लाइड्स को एक हफ्ते से ज्यादा समय तक नहीं, जब तक सील न किया जाए, जो आरटी में भी लॉन्ग-टर्म स्टोरेज की अनुमति देता है । बढ़ते मध्यम निर्धारण आरटी में दीर्घकालिक भंडारण की अनुमति देता है ।

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Representative Results

बोन मैरो और प्लॉयडी
चित्र 4में, हम रोगियों से बीएम नमूनों (आकांक्षा) में मेगाकारियोपोइसिस का एक प्रतिनिधि इम्यूनोफेनोटाइपिंग विश्लेषण दिखाते हैं। CD71 और CD31 के खिलाफ सेलुलर अंश की साजिश रचते समय, हमने छह मुख्य आबादी को गेट किया है: सीडी 31- सीडी 71- (लाल), सीडी 31- सीडी 71+ (नीला), सीडी 31+ सीडी 71- (नारंगी), सीडी 31+ सीडी 71मध्य (हल्के हरे), सीडी 31+ सीडी 71+ (गहरे हरे) और सीडी 31++ सीडी 71मिड (क्रीम)। ये आबादी हमेशा एक ही स्थिति (निरंतर साइटोमीटर सेटिंग्स को ध्यान में रखते हुए) में मौजूद नहीं होती है, जैसा कि इसे देखा जा सकता है, और इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह रोग की स्थिति और अस्थि मज्जा की स्थिति के लिए अंतर्निहित हो सकता है। वापस-गेटिंग इन छह आबादी एक परिपक्वता पैनल (CD42A/CD42B) में निहित मार्कर के खिलाफ हिस्टोग्राम में मढ़ा, और आगे तितर बितर करने के लिए, सही पर दिखाया गया है । यह आंकड़ा CD31/CD71 के खिलाफ एक साजिश को भी दिखाता है जिसमें कुल सेलुलर अंश के साथ CD42B+ कोशिकाओं के ओवरले को दर्शाया गया है ताकि अधिक परिपक्व एमकेएस के वितरण की कल्पना की जा सके । सामान्य शब्दों में, जनसंख्या सीडी 31- सीडी 71- एमके या वंश अग्रदूत शामिल नहीं है, एमके परिपक्वता मार्कर पेश नहीं करता है, और आकार में छोटा है। CD31- CD71+ जनसंख्या में मुख्य रूप से एरिथ्रोइड वंश की कोशिकाएं होती हैं, हालांकि इसमें आम वंश अग्रदूत भी हो सकते हैं, जैसा कि हम अपनी टिप्पणियों से परिकल्पना करते हैं। यह एमके परिपक्वता मार्कर के लिए नकारात्मक रहता है, और पहले या बाद में एरिथ्रोइड कोशिकाओं के अनुपात के आधार पर, फॉरवर्ड स्कैटर में भी उतार-चढ़ाव हो सकता है।

उदाहरण के तौर पर मायलोडिसप्लास्टिक सिंड्रोम (एमडीएस) के मरीज में अन्य मरीजों की तुलना में अपरिपक्व(यानीबड़ी) एरिथ्रोइड कोशिकाओं का बड़ा अनुपात होता है। एमके जनक और परिपक्व कोशिकाएं CD31+ कोशिकाओं में वितरित होंगी, जिसमें कुछ भिन्नता होगी। हालांकि, जैसा कि प्रत्येक विकृति पर बीएम विश्लेषण की तुलना करते हुए देखा जा सकता है, कुछ निरंतर विशेषताएं हैं। सीडी 31+ + सीडी 71मध्य आबादी (क्रीम) में अधिक परिपक्व एमके मौजूद हैं, और विकृतियों जहां यह परिपक्वता "अवरुद्ध" है, उसमें प्रतिरक्षा थ्रोम्बोसाइटोपेनिया (आईटीपी) और एक प्रतिक्रियाशील बीएम नमूना (अंतर्निहित सूजन के साथ) शामिल हैं। जबकि लिंफोमा रोगी में प्रारंभिक अग्रदूतों और देर से एमकेएस (नारंगी और क्रीम गेट्स) के बीच एक संतुलन प्रतीत होता है, यह अनुपात एमडीएस रोगी (अधिक "अवरुद्ध" अग्रदूत के साथ) और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) रोगी (अधिक परिपक्व एमकेके के साथ) में बदल जाता है। ब्याज की, "नाकाबंदी" आपस में विकृतियों की तुलना अलग लगती है: अंतर्निहित सूजन के साथ सहमति देने वाली विकृतियों में नाकाबंदी परिपक्वता दोषों, विनाश(यानी,ऑटोआईयुनिटी) और एमके टूटना द्वारा प्लेटलेट उत्पादन के संयोजन के कारण हो सकती है।

Figure 4
चित्र 4:विभिन्न विकृतियों वाले रोगियों से मानव अस्थि मज्जा के नमूनों में मेगाकारियोपोइसिस का इम्यूनोफेनोटाइंग। लिम्फोमा(यानीसामान्य बीएम), माइलोडीप्लास्टिक सिंड्रोम (एमडीएस), एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल), इम्यून थ्रोम्बोसाइटोपेनिया (आईटीपी) और संक्रमण के कारण प्रतिक्रियाशील बीएम वाले मरीज से निदान किए गए रोगियों से प्रतिनिधि बोन मैरो (बीएम) के नमूनों का विश्लेषण किया गया । CD71 और CD31 के खिलाफ सेलुलर अंश(यानी,नाभिक कोशिकाओं) की साजिश रचते समय, हमने छह मुख्य आबादी को गेट किया है: सीडी 31- सीडी 71- (लाल), सीडी 31- सीडी 71+ (नीला), सीडी 31+ सीडी 71- (नारंगी), सीडी 31 + सीडी 71 मध्य (हल्के हरे), सीडी 31+ सीडी 71 + + (डार्क ग्रीन) और सीडी 31 + सीडी +71 (डार्क ग्रीन) । ये आबादी हमेशा एक ही स्थिति (स्थिर साइटोमीटर सेटिंग्स को ध्यान में रखते हुए) में मौजूद नहीं होती है, जैसा कि इसे देखा जा सकता है, और इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। वापस-गेटिंग इन छह आबादी एक परिपक्वता पैनल (CD42A/CD42B) में निहित मार्कर के खिलाफ हिस्टोग्राम में मढ़ा, और आगे तितर बितर करने के लिए, सही पर दिखाया गया है । यह आंकड़ा CD31/CD71 के खिलाफ एक साजिश को भी दर्शाता है जिसमें कुल सेलुलर अंश के साथ CD42B+ कोशिकाओं के ओवरले को दर्शाया गया है ताकि अधिक परिपक्व एमकेएस के वितरण की कल्पना की जा सके । डॉट प्लॉट में गेट्स से मेल खाने वाले नंबर और हिस्टोग्राम ओवरले को दर्शाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हम अगले मानव बीएम नमूनों पर उपर्युक्त आबादी की प्लॉयडी स्थिति का विश्लेषण करने के लिए तैयार हैं। चित्रा 5 CD31+ आबादी के भीतर एक बढ़ती ploidy स्थिति से पता चलता है, कि हम उंमीद अलग और प्रत्येक रोग संदर्भ के लिए विशेषता होगी । ध्यान दें कि इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सेल निर्धारण और पारमेबिलाइजेशन के कारण, डॉट प्लॉट पूरी तरह से अनसर्गेड, अनपरेमबिलाइज्ड नमूनों(चित्रा 4)के बराबर नहीं हैं।

Figure 5
चित्रा 5:मानव बीएम नमूनों में CD31/CD71 अभिव्यक्ति के आधार पर चयनित आबादी का Ploidy विश्लेषण । एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) और इम्यून थ्रोम्बोसाइटोपेनिया (आईटीपी) से निदान किए गए रोगियों से प्रतिनिधि बोन मैरो (बीएम) नमूने। CD71 और CD31 के खिलाफ सेलुलर अंश(यानी,नाभिक कोशिकाओं) की साजिश रचते समय, हमने छह मुख्य आबादी को गेट किया है: सीडी 31- सीडी 71- (लाल), सीडी 31- सीडी 71+ (नीला), सीडी 31+ सीडी 71- (नारंगी), सीडी 31 + सीडी 71 मध्य (हल्के हरे), सीडी 31+ सीडी 71 + + (डार्क ग्रीन) और सीडी 31 + सीडी +71 (डार्क ग्रीन) । ये आबादी हमेशा एक ही स्थिति (स्थिर साइटोमीटर सेटिंग्स को ध्यान में रखते हुए) में मौजूद नहीं होती है, जैसा कि इसे देखा जा सकता है, और इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। वापस-गेटिंग इन छह आबादी Hoechst 33342 के खिलाफ हिस्टोग्राम में मढ़ा आबादी की विभिन्न प्लॉयडी स्थिति से पता चलता है, और परिपक्वता के साथ प्लॉयडी बढ़ाने की सामान्य प्रवृत्ति (हालांकि एमके पॉलीलोइडाइजेशन स्थिति से स्वतंत्र रूप से परिपक्वता तक पहुंच सकते हैं)। डॉट प्लॉट और हिस्टोग्राम ओवरले में फाटकों से मेल खाने वाले नंबरों को दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पीबीएमसी और सेल कल्चर
चित्र 6में, हम 7 और 11 दिन में उन पीबीएमसी के साथ सेट पीबीएमसी और एमके संस्कृति का एक प्रतिनिधि इम्यूनोफेनोटाइपिंग विश्लेषण दिखाते हैं। हम लिन कॉकटेल युक्त एक पैनल का उपयोग करते हैं, और हम लिन- चयन से पहले और बाद में जीवित कोशिकाओं के सेलुलर अंश दिखाते हैं। इस नकारात्मक चयन के परिणामस्वरूप एमकेएस सह-व्यक्त करने के कुछ अंश का नुकसान हो सकता है, उदाहरण के लिए, सीडी 14, लेकिन यह अधिक परिष्कृत विश्लेषण की भी अनुमति देता है। CD71 और CD31 के खिलाफ लिन- अंश की साजिश रचते समय, हमने पांच मुख्य आबादी को गेट किया: सीडी 31- सीडी 71-सीडी 31- सीडी 71+ ,सीडी 31+ सीडी 71-, सीडी 31+ सीडी 71मध्य और सीडी 31++ सीडी 71मिड। ये आबादी हमेशा एक ही स्थिति (निरंतर साइटोमीटर सेटिंग्स को ध्यान में रखते हुए) में मौजूद नहीं होती है, जैसा कि इसे देखा जा सकता है, और इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस मामले में, मतभेद न केवल व्यक्तिगत स्वास्थ्य या रोग की स्थिति के लिए अंतर्निहित हैं, बल्कि पीबीएमसी अंश में अग्रदूतों की एमके भेदभाव क्षमता के लिए भी हैं। पैनल (किट और सीडी 42B) में निहित अन्य मार्कर के खिलाफ हिस्टोग्राम में मढ़ा इन पांच आबादी वापस-गेटिंग, और आगे तितर बितर करने के लिए, सही पर दिखाया गया है । परिपक्वता के विभिन्न चरणों में एमके अग्रदूत और एमके सीडी 31+ आबादी के भीतर हैं।

Figure 6
चित्र 6:एमके सेल संस्कृति के दौरान मेगाकार्योपोइसिस की इम्यूनोफेनोटाइपिंग, जिसमें शुरुआती पीबीएमसी सामग्री शामिल है। 7 और 11 दिन में उन पीबीएमसी के साथ पीबीएमसी और एमके संस्कृति का प्रतिनिधि इम्यूनोफेनोटाइपिंग विश्लेषण। हम लिन कॉकटेल युक्त पैनल का उपयोग करतेहैं,और हम लिन-चयन से पहले और बाद में सेलुलर अंश (यानी, नाभिक कोशिकाओं) को दिखाते हैं। इस नकारात्मक चयन के परिणामस्वरूप एमकेएस सह-व्यक्त करने के कुछ अंश का नुकसान हो सकता है, उदाहरण के लिए, सीडी 14, लेकिन यह अधिक परिष्कृत विश्लेषण की भी अनुमति देता है। CD71 और CD31 के खिलाफ लिन-अंश की साजिश रचते समय, हमने पांच मुख्य आबादी को गेट किया: सीडी 31- सीडी 71-सीडी 31- सीडी 71+, सीडी 31+ सीडी 71-, सीडी 31+ सीडी 71मध्य और सीडी 31++ सीडी 71मिड। ये आबादी हमेशा एक ही स्थिति (स्थिर साइटोमीटर सेटिंग्स को ध्यान में रखते हुए) में मौजूद नहीं होती है, जैसा कि इसे देखा जा सकता है, और इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। पैनल (किट और सीडी 42B) में निहित अन्य मार्कर के खिलाफ हिस्टोग्राम में मढ़ा इन पांच आबादी वापस-गेटिंग, और आगे तितर बितर करने के लिए, सही पर दिखाया गया है । परिपक्वता के विभिन्न चरणों में एमके अग्रदूत और एमके सीडी 31+ आबादी के भीतर हैं। यह आंकड़ा CD31/CD71 के खिलाफ एक साजिश को भी दर्शाता है जिसमें कुल सेलुलर अंश के साथ CD42B+ कोशिकाओं के ओवरले को दर्शाया गया है ताकि अधिक परिपक्व एमकेएस के वितरण की कल्पना की जा सके । डॉट प्लॉट में गेट्स से मेल खाने वाले नंबर और हिस्टोग्राम ओवरले को दर्शाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 3: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण की जनसंख्या प्रतिशत कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पीबीएमसी में, एमके सीडी 31+ + सीडी 71मिड गेट के भीतर हैं, हालांकि उनका आकार उतना बड़ा नहीं है जितना कि हमने सुसंस्कृत एमके के साथ देखा है। यह या तो दो निम्नलिखित विकल्पों में से एक के कारण हो सकता है: पीबीएमसी में एमके्स अपरिपक्व एमकेएस के एक अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं जो परिसंचरण में प्रवेश करते हैं, या परिपक्व परिसंचरण एमके का एक अंश है जिसने साइटोप्लाज्मिक जटिलता खो दी है। हमारे तरह के प्रयोगों का सुझाव है कि बाद कि आकार अंतर समझा कारण हो सकता है । इस धारणा का समर्थन, CD42B की अभिव्यक्ति, उन आबादी पर कोशिकाओं के १००% में मौजूद नहीं है (के रूप में यह भी चित्रा 4में बीएम नमूनों में देखा जा सकता है), शायद प्रॉपलेट गठन और पर सतह मार्कर के नुकसान के कारण और/ हालांकि, सुसंस्कृत नमूनों में, "परिपक्व" फाटकों में एमकेएस, लगभग 100% सीडी 42बी+हैं, और आकार में बड़े हैं। इन परिकल्पना सेलुलर गतिशीलता को आगे अध्ययन और मान्य किया जाना चाहिए।

टीपीओ के प्लियोट्रोपिक प्रभावों के कारण, ये संस्कृतियां विषम और अतुल्यकालिक हैं, जो प्रति से असतत एमके भेदभाव चरणों का विश्लेषण करना मुश्किल बनाती हैं। 19,20 पहले के जनकों के विस्तार के बाद, विभिन्न परिपक्वता चरणों में एमकेएस संस्कृति में 6-10 दिन (या पहले, दाता परिवर्तनशीलता के कारण) दिखाई देगा और धीरे-धीरे संख्या में वृद्धि करेगा क्योंकि एमके वंश-प्रतिबद्ध कोशिकाएं एमके की ओर परिपक्व होती हैं। कुछ एमके टर्मिनल भेदभाव से गुजरेंगे और प्रोपलेट्स बनाना शुरू करेंगे। संस्कृति के अंत में, प्रोपलेटेलेट गठन और प्लेटलेट शेडिंग या सेल डेथ(चित्रा 2)के बाद "विस्तार/थकावट" के कारण सेल हानि की क्रमिक वृद्धि होगी।

यदि रीकॉम्बिनेंट टीपीओ के बजाय टीपीओ एनालॉग का उपयोग कर रहे हैं, तो सांद्रता का परीक्षण किया जाना चाहिए।

जनकों का स्रोत (वयस्क, गर्भनाल रक्त) संस्कृतियों को हालत देगा, क्योंकि विभिन्न विकासात्मक चरणों के स्रोतों से एमके की अपनी विशेषताएं हैं। इसके अलावा, समृद्ध CD34+ जनकों से संस्कृतियां, संस्कृति की शुरुआत में अधिक सजातीय दिखाई देती हैं, एमके प्रतिबद्धता और भेदभाव19,20शुरू होने के बाद विषमता और समानता के चरण तक पहुंच जाएंगी।

एमके सेल छंटाई
चित्रा 7में, हम भेदभाव के दिन 10 में एमके इन विट्रो संस्कृति के नमूने की एक प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति दिखाते हैं। CD31 और CD71, या फॉरवर्ड स्कैटर के खिलाफ नाभिक कोशिका अंश की साजिश रचते समय, हम सीडी 31 की उपस्थिति या अनुपस्थिति की विशेषता वाली दो मुख्य आबादी को अलग कर सकते हैं।

CD41 और CD71 के खिलाफ CD31+ अंश की साजिश रचते समय, हम चार मुख्य आबादी गेट कर सकते हैं: CD41- CD71- (1), CD41कम सीडी 71+ (2), सीडी 41कम सीडी 71+++++++++3) और सीडी 41+++++ सीडी 71+ (4), जिसमें अन्य सतह मार्कर (किट और सीडी 49बी) को अलग-अलग व्यक्त किया गया था, जिससे एमके डिब्बे की पहचान सीडी 41 अत्यधिक सकारात्मक सेल(चित्रा 7)के रूप में की गई थी। हल किए गए अंशों की शुद्धता दिखाई जाती है, साथ ही सॉर्ट किए गए अंशों के साइटोस्पिन के साइटोलॉजिकल स्टेनिंग्स भी दिखाई जाती हैं।

पीबीएमसी-एमके संस्कृतियों में सेल जनसंख्या स्पेक्ट्रम की विशेषता के लिए, viSNE विश्लेषण(चित्रा 7B) नियोजितकिया गया था। viSNE नक्शा कोशिकाओं को उन मार्कर के संयोजन के आधार पर स्थानिक रूप से अलग सबसेट में अलग करता है जो वे व्यक्त करते हैं। viSNE विश्लेषण में प्रत्येक बिंदु CD31, CD42A, सीडी 71 और किट के अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार रंगीन एक व्यक्तिगत सेल का प्रतिनिधित्व करता है।

डबल नकारात्मक कोशिकाओं (CD31- और CD71-)मुख्य रूप से अवशिष्ट लिम्फोसाइट्स (जनसंख्या 5) है कि इन स्थितियों में संस्कृति भर में बनी रहती है. इस आबादी को नमूने के शेष अंश का उपयोग करके सेल छंटाई के दूसरे दौर में हल किया गया है।

गेट्स 6 और 7 सीडी 71मध्य और उच्च व्यक्त कोशिकाएं हैं, जिनमें एरिथ्रोइड प्रोजेनिटर और संभावित रूप से अन्य अग्रदूत शामिल हैं।

हमें इस संस्कृति विधि की कोशिका विषम प्रकृति और परिपक्व एमकेएस की चिपचिपा प्रकृति के कारण तकनीकी कठिनाइयों को ध्यान में रखना चाहिए जिसके परिणामस्वरूप उप-आबादी में परिपक्व एमके की उपस्थिति होती है जहां वे संबंधित नहीं हैं (टिप्पणी अनुभाग देखें)।

Figure 7
चित्रा 7: विट्रो संस्कृति एमकेएस में 10-दिवसीय इम्यूनोफेनोटिक विश्लेषण को प्री-सॉर्ट करें। ए) CD31, CD41 और CD71 का उपयोग कर प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति, दो छंटाई दौर के साथ, CD31+ आबादी 1-4 और CD31 में जिसकेपरिणामस्वरूप-आबादी 5-7 । छंटाई के बाद प्रत्येक हल किए गए अंश की शुद्धता का विश्लेषण किया गया था, और प्रत्येक क्रमबद्ध अंश से दाग साइटोस्पिन के प्रतिनिधि माइक्रोफोटोग्राफ के साथ चित्रित किया गया है। ख) प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा दिन 10 पीबीएमसी-व्युत्पन्न एमके संस्कृति कोशिकाओं का viSNE नक्शा । नक्शा CD31, CD42B, सीडी 71 और किट के अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग कर बनाया गया है, के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पोस्ट-सॉर्ट प्रोसेसिंग
एक विशिष्ट फिजियो-पैथोलॉजिकल संदर्भ में एमके सुविधाओं का मूल्यांकन करने के लिए, या मेगाकारियोपोइसिस की प्रक्रिया का बेहतर अध्ययन करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (धारा 7 देखें) द्वारा साइटोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण सहित विभिन्न तरीकों से हल की गई आबादी का विश्लेषण किया जा सकता है। चित्र 8में कुछ उदाहरण प्रस्तुत किए गए हैं .

Figure 8
चित्रा 8। पोस्ट सॉर्ट एमके विश्लेषण। ए) विट्रो संस्कृति में 10 दिन से हल एमके डिब्बे का साइटोलॉजिकल विश्लेषण । मई-ग्रुनवाल्ड गिम्सा स्टेनिंग परिपक्व एमकेएस की प्रमुख विशेषताओं के अवलोकन की अनुमति देता है, यानी,छद्म गठन (लाल तीर), अत्यधिक पॉलीप्लाइड एमके (नीला तीर)। ख) इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। कोशिकाओं को एंटी-ह्यूमन वॉन विलेब्रांड फैक्टर (लाल, माध्यमिक एंटीबॉडी एलेक्सा फ्लोर 555 बकरी एंटी-माउस आईजीजी में दिखाया गया), एंटी-ह्यूमन सीडी 31 या टैंडेम सीडी 41/सीडी61 के साथ दाग दिया गया था, दोनों फिटसी के साथ संयुग्मित (हरे रंग में दिखाया गया) और परमाणु डीएनए को डीएपीआई (नीले रंग में दिखाया गया) के साथ लेबल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

टिप्पणियां:
एमकेएस को अप्रत्याशित क्षेत्रों से हल किया जा सकता है क्योंकि कोशिकाओं को उनकी झिल्ली(चित्रा 9)में कोशिकाओं को संलग्न करने की क्षमता है। यह समस्या उच्च शुद्धता सेल उपआबादी प्राप्त करने के लिए एक समस्या हो सकती है। सेल-सेल एग्रीगेट को कम करने के लिए, पैनल मिक्स बफ़र्स में 1-5 एमएम ईडीटीए जोड़ा जा सकता है।

इसके अलावा, शुरू की गई सामग्री के रूप में पश्चिम बंगाल का उपयोग करते समय, हमने सीधे सेलुलर अंश का उपयोग करने के लिए पीबीएमसी प्राप्त करने या आरबीसी को lysing करने का प्रस्ताव किया। चित्रा 10 में हम दो पद्धतियों का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण दिखाते हैं। एक तरफ, जब आरबीसी को lysing और पूरे सेलुलर डिब्बे का विश्लेषण, हम अभी भी न्यूट्रोफिल की एक बड़ी राशि है । इन्हें एक विशिष्ट मार्कर (या लिन कॉकटेल रणनीति का उपयोग करके) के साथ फ़िल्टर किया जा सकता है। हालांकि, हम सतह मार्कर अभिव्यक्ति से संबंधित उनकी संकीर्ण प्रकृति के कारण कुछ MKs खो सकते हैं । दूसरी ओर, पीबीएमसी अलगाव हमें न्यूट्रोफिल के साथ-साथ आरबीसी से छुटकारा पाने की अनुमति देगा, हालांकि हम उच्च घनत्व(यानी,अधिक जटिल साइटोप्लाज्मिक सुविधाओं या अधिक अपरिपक्व) वाले एमके को खो सकते हैं। जैसा कि चित्रा 10में दिखाया गया है, lysed पश्चिम बंगाल से MKs परिपक्वता मार्कर की एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाते हैं, जो पीबीएमसी को अलग करते समय कम दिखाई देता है। घनत्व ढाल एमके के नुकसान में परिणाम हो सकता है जिसमें अभी भी एक जटिल साइटोप्लाज्म होता है, जबकि पीबीएमसी अंश में निहित लोग, प्लेटलेट्स जारी करने के बाद संचलन में पहले से ही "समाप्त" हो सकते हैं, और इस प्रकार कम जटिल साइटोप्लाज्म के भीतर पॉलीप्लाइड नाभिक को बनाए रखते हैं। उन्हें अपरिपक्व एमकेएस के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए। प्रत्येक प्रक्रिया के अपने फायदे और इसकी कमियां हैं।

Figure 9
चित्रा 9। एमकेएस की चिपचिपा प्रकृति। एमके्स अपनी झिल्ली को कोशिकाओं को संलग्न करने की क्षमता के कारण अप्रत्याशित फाटकों में पाया जा सकता है। ए-सी) एमके छंटाई के लिए गेटिंग रणनीति के अनुसार, एमके आबादी 1 (बी) और 5 (ए और सी) में हल किया गया। यह समस्या उच्च शुद्धता सेल उपआबादी प्राप्त करने के लिए एक समस्या हो सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10। आरबीसी को lysing के बाद पीबीएमसीसी या डब्ल्यूबी से एमकेएस के फ्लो साइटोमेट्री इम्यूनोफेनोटाइपिंग। ए) गेटिंग रणनीति । B) आकार (एफएससी), सेलुलर जटिलता (एसएससी) और सीडी 42ए, सीडी 41, सीडी 71 और एमकेएस में किट की अभिव्यक्ति जैसा कि पीबीएमएमसी या डब्ल्यूबी में पहचाना गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मेगाकैरियोपॉजिस के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करने वाले अधिकांश शोध केवल वंश-विशिष्ट सतह मार्कर(यानी,सीडी 42ए/सीडी 42बी, सीडी 41/सीडी61) का उपयोग करके एमके सबसेट की पहचान तक सीमित हैं, जबकि पहले एमके विभेदन चरणों की खराब जांच की गई है । वर्तमान लेख में हम मानव मेगाकारियोपोइसिस के व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री लक्षण वर्णन को संबोधित करने के लिए एक इम्यूनोफेनोटीपिंग रणनीति दिखाते हैं। कुल मिलाकर, हम अधिक विस्तृत तरीके से मेगाकार्योपोइसिस के अध्ययन के लिए एक ही प्रवाह साइटोमेट्री एंटीबॉडी पैनल में एमके विशिष्ट और गैर-विशिष्ट सतह मार्कर (टेबल 1 और 2) के संयोजन की उपयोगिता को उजागर करना चाहते हैं। हमारा उपन्यास दृष्टिकोण हीमेटोलॉजिकल विकारों में निदान और/या पूर्वानुमान की सहायता के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में काम कर सकता है । हम मानते हैं कि प्रस्तुत पैनल और संयोजन निश्चित नहीं हैं। हमने मानव प्राथमिक स्रोतों (मुख्य रूप से बीएम नमूनों में) में सतह मार्कर का एक बहुत ही गतिशील व्यवहार देखा है, जो सबजैसेंट पैथोलॉजी पर भी निर्भर है। अधिक अध्ययनों की आवश्यकता है, और उम्मीद है कि वैज्ञानिक समुदाय इस दृष्टिकोण को लागू करना शुरू कर देगा क्योंकि एक ही विकृति पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों से टिप्पणियों के साथ प्रतिक्रिया के लिए और कैसे मेगाकारियोपोइसिस मंचन निदान या पूर्वानुमान में सहायता कर सकता है। प्राथमिक ऊतकों में संयुक्त एचएससी और एमके लक्षण वर्णन का कार्यान्वयन, एमके प्रतिबद्धता के लिए विविध मार्गों पर विचार करते हुए, जैसा कि परिचय अनुभाग में टिप्पणी की गई है, प्रासंगिकता और आगे की घटनाओं के लायक है। तथ्य यह है कि हम भी पीबीएमसी में एमकेएस का पता लगाने में सक्षम हैं, काफी अवलोकन है । हम यह भी परिकल्पना करते हैं कि इस प्राथमिक स्रोत में एमकेएस का विश्लेषण रोग निदान और पूर्वानुमान में सहायता करेगा, बीएम एस्पिरेट्स के लिए एक बहुत ही प्रासंगिक विकल्प के रूप में, क्योंकि रक्त नमूने का निष्कर्षण आक्रामक नहीं है। उस पहलू के लिए भी विकास की आवश्यकता है ।

एमकेएस (बड़े आकार, ऑमोटिक कमजोरी, चिपचिपाहट) की जैविक विशेषताओं से जुड़ी तकनीकी सीमाओं के बावजूद हम कई मानव एमके स्रोतों में विशेष रूप से बीएम, पीबीएमसी और पीबीएमसीएस-व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों में विभिन्न परिपक्वता चरणों को सॉर्ट करने में सक्षम थे। गर्भनाल रक्त और विभिन्न फिजियो-पैथोलॉजिकल स्थितियों जैसे अन्य मानव स्रोतों में मेगाकारियोपोइसिस की विशिष्टताओं का विश्लेषण करने के लिए भविष्य के अध्ययन किए जाएंगे। इसके अलावा, प्रत्येक गेटेड और सॉर्ट सेल अंश की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीआईएफयू) में एमके जनकों (सीएलयू-एमके) में किया जाना चाहिए ताकि मेगाकार्योपोइस यात्रा में प्रत्येक आबादी की विभेदन क्षमता का निष्पक्ष रूप से आकलन किया जा सके। तकनीकी सीमाओं को पार करते हुए जो एक बार परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स की तरह बाधा के रूप में सोचा गया था, ऐसी आवश्यकता अभी भी अधिक पूर्णता की मांग करती है। एक तरफ, इम्यूनोफेनोटाइपिंग पैनलों को लागू करते समय एकल-सेल ओमिक्स व्यापक अध्ययनों की अनुमति देगा, लेकिन यदि भौतिक प्रकार की आवश्यकता होती है, तो सॉर्ट की गई आबादी की शुद्धता 85% से ऊपर है (सतह मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर), अन्य चरों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जिन्हें हल करना अभी भी मुश्किल है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, एमके संस्कृतियां समकालिक नहीं हैं और बहुत विषम हैं। एमके स्वयं सतह मार्कर अभिव्यक्ति में संकीर्ण हैं, अन्य माइलॉयड और गैर-माइलॉयड हेमेटोपोइटिक और गैर-हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के साथ मार्कर साझा करते हैं। इसके अलावा, उन्हें मॉर्फोमेट्रिक चर (फॉरवर्ड और साइड स्कैटर) के साथ क्लस्टर करना बहुत मुश्किल है क्योंकि वे व्यापक रूप से वितरित करते हैं। इस एप्लिकेशन को परिष्कृत करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है, लेकिन सहयोगात्मक प्रयासों के साथ, हम मेगाकारियोपोइसिस को संकीर्ण करने के करीब हैं।

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Disclosures

ऑडियोविजुअल सामग्री उत्पादन बीडी बायोसाइंसेज द्वारा समर्थित था।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए मार्कोस पेरेज बैस्टररेचेया, लोरेना रोड्रिगेज लोरेंजो और बेगोना गार्सिया मेंडेज़ (एचयूसीए) और पालोमा सेरेज़ो, अलमुडेना पेएरो और मारिया डी ला पोवेद-कोलोमो (एचसीएससी) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को आंशिक रूप से चिकित्सा अनुदान (Roche SP200221001) द्वारा A.B., एक RYC फैलोशिप (RYC-2013-12587) के लिए समर्थित किया गया था; मिनिस्टरियो डी इकोनी वाई प्रतिस्पर्धी, स्पेन) और एक आई + डी 2017 अनुदान (SAF2017-85489-P; मिनिस्टरियो डी सिन्सिया, इनोवासिओन वाई यूनीवर्सिडेस, स्पेन और फोडोस फेडरर) एलजी, एक सेवरो ओचोआ ग्रांट (पीए-20-पीएफ-बीपी19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades डेल प्रिंसिपाडो डी Asturias, स्पेन) पी.M-बी के लिए और एक इंट्राम्यूरल पोस्टडॉक्टोरल ग्रांट 2018 (फंडासिओन पैरा ला इन्वेस्टिगासिओन वाई ला इनोवासिओन बायोसांइटारिया डी एस्टुरियस - फिनबा, ओविडो, स्पेन) से एए-एच। हम अपने ज्ञान (और समय) को साझा करने के लिए Reinier वान डेर लिंडेन का शुक्रिया अदा करते हैं, विशेष रूप से बहु-रंग टैग-एंटीबॉडी पैनल मिश्रण और एकल रंग मनका नियंत्रण तैयारी पर उनकी बुद्धिमान सलाह।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
130 micron Nozzle BD 643943 required for MK sorting
5810R Centrifuge Eppendorf Cell isolation and washes
A-4-62 Swing Bucket Rotor Eppendorf Cell isolation and washes
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge ELITech Group Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa
CO2 Incubator Galaxy 170 S Eppendorf Cell Incubation
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermo Scientific To prepare cytospins
FACSAria IIu sorter BD Lasers 488-nm and 633-nm
FACSCanto II flow cytometer BD Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm
Olympus Microscope BX 41 Olympus Microphotographs
Olympus Microscope BX 61 Olympus Microphotographs
Zoe Fluorescent Cell Imager BioRad Microphotographs
To obtain PBMCs
Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum Sigma-Aldrich L4646 or similar
Lymphoprep Stem Cell Technologies #07801 or similar
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 or similar
Recombinant human Erythropoietin (EPO)  R&D Systems 287-TC-500 or similar
Recombinant human stem cell factor (SCF) Thermo Fisher Scientific, Gibco™ PHC2115 or similar
Recombinant human thrombopoietin (TPO) Thermo Fisher Scientific, Gibco™ PHC9514 or TPO receptor agonists
StemSpan SFEM Stem Cell Technologies #09650
Flow Cytometry Analyses
Bovine Serum Albumin Merck A7906-100G or similar
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD 552843 Antibodies for human cells are generally from mouse.
BD Cytofix/Cytoperm BD 554714 or similar
BD FACS Accudrop Beads BD 345249
CD31 AF-647 BD 561654 Mouse anti-human
CD31 FITC Immunostep 31F-100T
CD34 FITC BD 555821 Mouse anti-human
CD41 PE BD 555467 Mouse anti-human
CD41 PerCP-Cy5.5 BD 333148 Mouse anti-human
CD42A APC Immunostep 42AA-100T We observed unspecific binding... that needs to be assessed
CD42A PE BD 558819 Mouse anti-human
CD42B PerCP Biolegend 303910 Mouse anti-human
CD49B PE BD 555669 Mouse anti-human
CD61 FITC BD 555753 Mouse anti-human
CD71 APC-Cy7 Biolegend 334109 Mouse anti-human
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Human BD Fc Block BD 564219 Fc blocking - control
KIT PE-Cy7 Biolegend 313212 Mouse anti-human
Lineage Cocktail 2 FITC BD 643397 Mouse anti-human
RNAse Merck R6513 or similar
Triton X-500 Merck 93443-500ML or similar
Cell strainers for sorting
CellTrics Filters 100 micrometers Sysmex 04-004-2328 Cell strainers
Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols  - unless otherwise specified.

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 174
मानव प्राथमिक स्रोतों से मानव एमकेएस की इम्यूनोफेनोटाइपिंग और सेल छंटाई या हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर्स से <em>विट्रो में</em> विभेदित
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Acebes-Huerta, A.,… More

Acebes-Huerta, A., Martínez-Botía, P., Martín Martín, C., Bernardo, Á., Rodríguez, A. R., Vicente-Ayuso, M. C., Benavente Cuesta, C., Gutiérrez, L. Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors. J. Vis. Exp. (174), e62569, doi:10.3791/62569 (2021).

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