Summary
ここでは、巨核球分化の特徴付けに関する免疫型付け戦略を紹介し、その戦略が蛍光活性化細胞選別機を用いて異なる段階で巨核球を選別する方法を示す。この方法論はヒトの一次組織に適用できるが、 インビトロの培養で生成された巨核球にも適用できる。
Abstract
巨核球(MK)分化は、非常に多倍(>64Nに達する)および非常に大きな細胞(40-60 μm)をもたらす多くのエンドミトティックサイクルを包含する。細胞生物学と分子レベルでの巨核代の急速な知識とは対照的に、フローサイトメトリーによる巨核生物の特徴付けは、系統特異的な表面マーカーを用いた成熟したMCの同定に限定される一方、以前のMK分化段階は未踏のままである。ここでは、MK特異的および非特異的な表面マーカーを含むパネルを用いたヒトの一次源または インビトロ 培養において、連続したMK分化段階の同定を可能にする免疫フェノタイピング戦略を提示する。その大きさと脆弱性にもかかわらず、MKは上記のパネルを使用して免疫フェノタイプすることができ、圧力およびノズル直径の特定の条件下で蛍光活性化細胞選別によって濃縮される。このアプローチは、ヒトにおける巨核代と血小板産生の複雑性をよりよく理解することを目的として、マルチオミックス研究を促進する。巨核代の特徴付けが良いと、系統関連の病理や悪性腫瘍の診断や予後に根本的なものとなる可能性があります。
Introduction
巨核球(MC)は、主にホルモントロンボポエチン(TPO)によって調整される巨核球症と呼ばれる複雑なプロセスに続いて、造血幹細胞(HSC)から発症する。巨核代の古典的な見解は、HSCからの細胞の旅を、コミットされた前駆細胞および前駆細胞の階層的な段階の連続を通して記述し、最終的には成熟したMKにつながる。成熟の間、MKはエンドミドーシスの複数のラウンドを経験し、血小板産生のための十分な膜表面を提供する複雑な細胞内境界膜系(DMS)を開発し、成熟した血小板1、2、3によって受け継がれる異なる顆粒に含まれる多数の因子を効率的に生成し、パックする。その結果、成熟したMKは、高倍数核(>64Nにも達する)を特徴とする大細胞(40〜60μm)です。最近の研究では、HSCが特定の生理病理学的状態4、5、6、7、8、9、10、11に応答して従来の系統コミットメントチェックポイントをバイパスしてMKに分化する代替ルートを示唆している。これらの知見は、成熟したMKに対する造血性分化が生物学的ニーズに対応する連続的かつ適応的なプロセスであることを強調している。
細胞生物学に関する知識の増加と巨核代種症12の分子的側面に関する知識が高まる中、フローサイトメトリーによるプロセスの研究に特化した研究のほとんどは、系統特異的な表面マーカー(CD42A/B、CD41/CD61)を用いた成熟したMCの同定に限定されているが、MK分化段階は未踏のままである。我々は以前に、ヒト15に適応し、適用してきたマウス骨髄および骨髄由来MK培養13、14において巨核代を上演する戦略を文書化した。本稿では、ヒトの主要なソース(骨髄-BM-および末梢血-PB-)またはMK特異的および非特異的表面マーカー(CD61、CD42B、CD49B、CD31、CD71)を組み込んだパネルを用いたインビトロ培養物において、HSCから成熟したMCまで、巨核化の特徴を可能にする免疫フェノタイピング戦略を示す。MKは、大きなサイズと脆弱性にもかかわらず、上記の細胞表面マーカーを使用して免疫整形され、細胞の破裂や損傷を最小限に抑えるために、圧力とノズル径の特定の条件下で蛍光活性化細胞選別によって濃縮することができます。この技術は、人間の健康と病気における巨核代と血小板産生の複雑さをよりよく理解することを目的として、マルチオミクスのアプローチを促進する。注目に値する、それは需要の増大の臨床文脈で診断と予後を助けるために有用なツールとして提起する。
この原稿では、MK特異的および非特異的な表面マーカーを主要なソースまたは生成されたインビトロから統合したパネルを用いて、ヒト巨核代を上演する戦略を文書化する。さらに、蛍光活性化細胞選別機、好ましい分数および成熟したMKを用いて、並べ替えプロトコルを提供します(図1)。この手順は、サイズが大きく、また、MK の脆弱性が大きいため、技術的に難しいため、一般的ではありません。しかし、それは以前マウスとヒト骨髄サンプルの両方で採用されており、技術の進歩により、毎回16、17、18より良い結果が得られます。MCまたはMK前駆体を研究できるヒトの主要な情報源には、骨髄、臍帯血および末梢血などが含まれる。各サンプルの分析のために関連する細胞分数を分離するための適切なサンプル処理が重要です。標準的な手順を組み込み、巨大核代の研究を目指す際に考慮すべきいくつかの考慮事項があります。
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Protocol
全血および骨髄サンプルは、1964年のヘルシンキ宣言に従って取得され、処理された。全血サンプルは、私たちの機関医療倫理委員会(病院Universituniversitario Central deアストゥリアス-HUCA-)によって承認された研究の中で、インフォームド・コンセント(ISPA)を与えた後、健康なドナーから得られました。骨髄サンプルは、病院クリニコ・サン・カルロス(HCSC)の血液学部で管理された患者の骨髄吸入捨て物質から得られた。
図1: 本稿に記載されているプロトコルの概略図 免疫フェノタイピングを用いてMK分化を行うことができる主要なヒト源または主要培養物が示されている。この免疫型付け戦略は、一次源における異なる系統関連病理または悪性腫瘍におけるプロセスの研究に適用することができる。さらに、蛍光活性化細胞選別機を用いたMKや前駆体の細胞分類が可能となり、濃縮された分画のさらなる分析が可能になる。使用されるイメージは、セルヴィエによるセルヴィエメディカルアート(SMART)の一部であり、CC BY 3.0の下でライセンスされています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. 免疫原型入力前の全血および骨髄処理
- 寄付からの全血(WB)を主要な供給源として使用する場合、必要に応じて末梢血単核細胞(PBMC)成分を単離する。これは、前述の15のように、密度勾配細胞分離と組み合わせた標準微分遠心分離を使用することによって達成することができる。
- 簡単に言えば、遠心分離機の血液を室温で15分間193xg(ブレーキ3)で行う。上部のプラズマ分を捨てて、バフィーリングを収集します。リン酸緩衝塩水(PBS)/クエン酸二水和物三ナトリウム(38 g/L、pH 7)バッファーとピペットを50 mLチューブに15 mLの密度勾配溶液(1.076 g/mL)の上に慎重に25 mLの体積で希釈します。
- 1114 x gで20分間の遠心分離機(加速器3、ブレーキ3、室温)。プラズマの分数を捨ててPBMCを含むバフィーリングを回収し、同じ量のPBSを加えて洗浄し、435 x gで5分間遠心分離器を加え、さらに使用するためにPBSで再中断します。
- あるいは、赤血球(RBC)を洗浄し、徹底的に洗浄した後の免疫フェノタイピングには、WBサンプル(約100μL)を使用します。
- 簡単に言えば、氷冷RBCライジングバッファー(NH4Clの4.15 g、KHCO3 の0.5g、EDTA(トリプレックスIII)の18.5 mgをH2Oの500 mL、pH 7.1-7.4で1:1希釈する。細胞懸濁液が半透明になるまで待つ(3-5分)。
- 遠心分離機を5分間435xgで、4°Cで、PBS中の細胞を再懸濁した。白い細胞ペレットを得るために必要な回数だけ手順を繰り返します。
- 同様に、骨髄(吸引)から得られたサンプルをRBCのライジングバッファ(ポイント1.2を参照)と徹底的な洗浄で直接処理し、明確な単一細胞懸濁液で始まるように(図1)。
- それは壊れやすいMKを損傷する可能性があるため、処理中にサンプルを混合するために渦の使用を避けてください。
注: PBMCs を得るための密度勾配は、RBC-lysed WB と比較して、より豊かで、よりクリーンな細胞分画をもたらす可能性があります。しかし、高密度で成熟したMKは「好中球」の分数で失われる可能性があることを念頭に置く必要があります。これは代表結果で説明します。
- それは壊れやすいMKを損傷する可能性があるため、処理中にサンプルを混合するために渦の使用を避けてください。
2. PBMC からのインビトロ MK の分化
注:MCは、CD34+細胞などの以前の前駆体、異なる主要なソース(すなわち、WB/PBMCs、臍帯血、骨髄)およびiPSCとの間で分化することができる。このエンドに適用されているさまざまなプロトコルがあります。ここでは、CD34+前駆体15、19、20、21、22に対する濃縮を必要とせずに、PBMCとMKの分化を可能にする、私たちが開発した培養方法を使用します。
- このプロトコルは、トロンボポエチン(TPO)の濃度が徐々に増加する3つの培養相で構成され、以前の前駆体(すなわち、SCF、EPO)の増殖を支持する成長因子を犠牲にして徐々に増加する(図2)15。
- 基礎培地の場合は、コレステロール豊富な脂質ミックスの0.4%と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったStemSpan SFEMを使用してください。
- フェーズI培地では、SCF(100 ng/mL)、エリスロポエチン(EPO、0.5 U/mL)、トロンボポエチン(TPO、30 ng/mL)を添加したベーシス培地を使用してください。フェーズII培地は、SCF(50 ng/mL)、EPO(0.25 U/mL)およびTPO(50 ng/mL)を添加した基礎培地です。フェーズIII培地の場合は、TPO(100 ng/mL)を添加した基底媒体を使用します。
- 第I相培地中の培養PBMC。6~8日目に、PBMCをフェーズII培地に入れ、9~12日目には第III相培地にPBMCsを配置します。
- 培地は、第I相から第II相までの室温で435 x gの遠心分離機を室温で5分間、95 x gで第II相から第III相まで室温で5分間交換し、新鮮な培地で再懸濁します。
- 培養細胞は37°Cで培養器中、5%CO2.これらの主要な培養では、MK分化は10〜14日間続き、サンプルは、MK分化に従うように、培養期間を通じて異なる時点で描くことができる。
- 基礎培地の場合は、コレステロール豊富な脂質ミックスの0.4%と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったStemSpan SFEMを使用してください。
図2:PBMC由来MK培養法の概略図健常ドナーからのPBMCは、MK in vitro(Salunkheらから適応したスキーム)を生成するために開発された3相プロトコルに従って培養した。10日目と13日目の文化で撮影された15枚の写真が示されています。写真は20倍の目的で撮影されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- サンプルコレクション:5分間(95 x g)の低速遠心を適用して細胞を洗浄し、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSまたはPBSで再中断します。免疫フェノタイピングの場合、理想的な密度は105-106細胞/100 μL(ポイント3.1参照)です。培養の状況(すなわち、死細胞、破片等の存在)によっては、1または2の開行が必要となる場合がある。培養中に関心のある時点でセルを収集します。
MK分化の免疫フェノタイピング - タグ付き抗体のパネルを用いたインキュベーション
- 標準的な手順に従ってタグ付き抗体のパネルで細胞サンプルをインキュベートし、巨核球を処理する際に低速(95 x g)で遠心分離機に注意を払います。我々は通常、105-106細胞の範囲で、4°C、20分で100 μLの体積でPBSで1%BSAでサンプルをインキュベートします。
- 必要に応じてスケールアップします。
- インキュベーション後、PBSに1%BSAの5mLを加え、低速(95xg)で遠心分離機、上清を吸引し、サンプルをPBSで2%BSAに再懸濁してMK生存率(2mL)を維持した。1-5 mM EDTA を加えて、細胞細胞凝集体を破壊します(これは当然MK培養で見られます)。
- サンプルを12 x 75 mmの丸底管(FACSチューブ)またはプレートに移し、フローサイトメトリー解析または細胞選別まで暗闇の中に保管します。
- 単一抗体と抗体パネルの混合物の調製;フローサイトメーターの設定:
- 抗体パネルの最適濃度を決定するために使用する前に抗体を活性化します。抗体の最適濃度は、明らかに陽性と陰性細胞を分離する最も低い濃度です(そして、中間レベルの発現の区別が可能です)。一例として、抗体のほとんどは、特に製造業者によって滴定または示されていない限り、1:200希釈(ストック100 μg/mL)で使用されます。
- 抗体滴定が決定されたら、各抗体の10x希釈を調製する。これらの希釈は、単色コントロールとパネルミックスの準備に使用されます。希釈剤およびパネルミックスは、製造後1ヶ月でも使用できます(メーカーの適応がこれらの貯蔵条件を妨げない限り、4°Cで保存)。これにより、同じパネルでサンプルを一定期間染色できます。
- シングルカラーコントロールとパネルミックスの両方に10x希釈100 μLあたり10μLを使用します。
- 単色コントロールでは、抗体アフィニティービーズを使用し、抗体を添加した後に直接測定することができます。適切な補正調整(および分析ソフトウェアによる後の測定の微調整)を可能にするために、単色コントロールは実験ごとに測定する必要があります。
- または、セルサンプルを使用して単色コントロールを実行します。しかし、ビーズは、抗体/表面マーカーによっては、複雑な一次または培養細胞源では得られない可能性がある、所定の数のイベントの迅速な測定を可能にする。また、「蛍光マイナス1」(FMO)パネルミックスで染色された細胞サンプルを実行して、適切な補正設定を設定することをお勧めします(実験を実行する前)。これは、補償の問題を慎重に特定すること、特に培養されたMKにおいて、自己蛍光干渉(フェノールレッドを含む培養培地を使用する場合に存在する)を同定するために関連する。
- サンプル数に応じて、設計されたパネルの抗体を含むパネルミックスの十分な量を準備する。私たちのパネルのほとんどは6つの抗体を含みます(6色パネル、 表1-2を参照)。
- これらのパネルでは、フローサイトメーターの488nmおよび633nmレーザーを使用しますが、パネルは他の技術的なシナリオに適応することができます。さらに、質量分析ベースのフローサイトメトリーまたは音響焦点技術を用いたサイトメーターを使用する場合、補償の考慮事項を回避することができます。
- 生存率を測定するための色素は、特に成熟した場合、MKに関する誤った情報を与える可能性があります。MKは非常に活性な取り込み細胞であり、Hoechst、7-AADまたはPEの陽性は、常に実際の細胞死を反映するとは限らないかもしれません。別の方法(細胞死測定が必要な場合)は、ミトコンドリア染色(CMX Ros)またはアミン反応性染料(ゾンビまたはゴースト染料)の使用である可能性があります。
表1:巨核細胞系の細胞表面マーカーに関する注意事項この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:抗体パネルこの 表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
4. 6色パネルと組み合わせたプロイディ分析
- 6色の抗体パネルと組み合わせて、プロイディ分析のために、抗体パネルでインキュベーションした後の細胞の固定および透過性を進めます。この戦略は、細胞のDNAの染色を可能にしながら、表面マーカー染色の保存を可能にする。私たちは、利用可能なバイオレット405nmレーザーで視覚化することができるので、DNAを染色するためにHoechst 33342を使用しています。
- 105-106細胞の場合、抗体パネルでインキュベーションした後、遠心分離細胞(95 x g 5分間)、200 μLの固定バッファーに再懸濁し、室温(RT)で10分間インキュベートする。
- 上記のように遠心分離細胞は、200 μL固定バッファーで2度目の再懸濁、RTで10分間インキュベートする。
- 0.1%トリトンX-100、200mg / mL RNaseおよび20 mg/mL Hoechst 33342(パーメアビライゼーションHoechst MIX)を含むパーメアビライゼーションバッファーを準備します。
- 上記のように遠心分離細胞は、透過性の300μLで再懸濁し、37°Cで30分間インキュベートする。 このステップは非常に重要であり、それ以来、クリーンな策略測定を得るためには、RNAを分解しなければならない。
- インキュベーション時間の後、フローサイトメーターで直接サンプルを測定します。それ以外の場合は、暗い状態で4°Cに保存してください。速やかに測定します。しかし、これらのサンプルは固定されているので、測定は24〜48時間でも遅れさせることができる。測定前にサンプルを十分にフリックするか、細胞ストレーナーを通過して、単一の細胞懸濁液を確実に確保してください。
- [前方]や[側面散布図]などのモーフォメトリック パラメータは、セルの固定後に維持されません。前方/側面散布図は、固定後の細胞分布の収縮を示します。しかし、表面マーカー染色はほとんど保存されており、格言戦略はほとんど変更されず、表面マーカーの組み合わせによって定義される異分化の異なる段階での策略状態の分析が可能になります。
5. MK分化分析
注:CD31/CD71の組み合わせにより、MKの異なるステージに対応するゲートを設定することができます。MK特異的マーカーを使用したさらにバックガッティングにより、成熟したMKと未熟なMKの分離が可能になります。さらに、新鮮なサンプルでは、使用される他のマーカーの存在を確認するためにバックゴーティング、または前方/側面散乱軸に母集団を配置するために、MK分化段階の評価を洗練し、同じ集団に存在する可能性のある他の細胞タイプを廃棄することができます。
- 初期前駆体マーカー(KIT、CD34)、一般的な前駆体マーカー(CD31、CD71)、および系統マーカーを含む抗体のパネルを使用し、それらのうちのいくつかは特異的である(CD42A/CD42B、CD49B、CD41/CD61、CLEC2、GPVIなど)( 表1-2を参照)。リネージュ(Lin)カクテル(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、およびCD56)の使用は、分析にノイズを追加する可能性のある成熟した造血細胞を「フィルタリング」することを可能にします(Lin- Populationを選択する場合)。例として、代表的な結果においてPBMC、骨髄、PBMC由来細胞培養を通じてのMCの分析を行います。
6. MKおよびMK前駆細胞分類
注:染色された細胞は、FACSDivaソフトウェアを使用して488 nmおよび633nm標準固体レーザーを搭載した蛍光活性化細胞選別機FACS Aria IIuで分析され、ソートされました。データは、FlowJo ソフトウェアとサイトバンク (viSNE 分析) を使用して、さらに分析および提示されました。ソートされた分画の純度は、各ソートされた分画(純度85%以上)のフローサイトメトリー分析によって確認された。
- 細胞の劣化を避けるために、抗体インキュベーション後、できるだけ早く、または1時間以内に細胞の選別を行います。
- 100 μmのセルストレーナーでサンプルをフィルターし、単一セルの懸濁液と大きなMKの完全性を保証します。
- 130μmのセラミックノズル、1平方インチあたり11ポンド(PSI)に設定されたシース圧力、ドロップ駆動周波数を12 kHzに設定して、流れを滴に分解します。
- 選別する前に、ペニシリン/ストレプトマイシンを滅菌水で1:5希釈して30分の取得を行い、続いて滅菌水で10分取得して残りのデコンタミン剤を除去し、ノズル、シース、およびサンプルラインを殺菌します。
- ストリームが安定したら、推奨されるビーズでドロップ遅延を調整し、反射されたドロップの 97.5% 以上を 1 秒あたり 400 ~ 1200 イベントの流量で微調整モードで並べ替えます。
- PBSで2%BSAの500 μLのコレクションFACSチューブを準備します。BSAの割合は5-10%まで増加させることができる。
- 適切な補正マトリックス パラメータを使用して実験テンプレートを生成します。
- FACSチューブをサイトメーターにロードします。
- サンプルの測定を行い、目的の細胞集団の必要なゲートと純度を設定します。セルの並べ替え中に、選択した人口ゲートに最大 200,000 個のイベントを表示するためにアクティブ化されたレコードを維持します。
- FACSのアリアリIIuは同時に4つまでの異なった細胞集団の分離を可能にする。新しいソートレイアウトを作成し、収集装置(4チューブ)と適切な精度モード(純度と回復の中間マスクをお勧めします)を選択します。最後に、目的の母集団を各並べ替え場所フィールドに追加します (図 3)。
図3:蛍光活性化細胞選別(FACS)の原理の概略図 粒子は130 μmノズルを通過し、ノズルに振動を加えるために規則的な液滴の流れに分解することを余儀なくされる。次に、液滴はレーザー(分析ポイント)によって尋問され、信号はそれらの液滴に電荷を適用することによって「ソート決定」を与えるために処理されます。電荷液滴が高電圧静電場(検出プレート)を通過すると、それは偏向され、対応する回収管に集められます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- コレクション チューブをロードし、ターゲットの集団を並べ替え始めます。
- 95 x gで5分間の回収管を遠心分離し、PBS中の適切な体積2%BSAで細胞ペレットを再懸濁する。
- 再び各ソートされたサンプルの一部を測定し、純度を計算する。
- さらなる使用のために適切にセルを保存します。選別された細胞は、細胞学的および分子的分析に使用することができ、または選択した細胞集団の分化プロセスを研究することを目的として再培養することができる。
7. ソート後のサンプル準備
- 細胞遠心分離機による細胞分析のためのサイトスピンの準備
- 並べ替えられた細胞を、100~200 μLの扱いやすい作業量に持ち込みます。細胞密度は、それぞれの場合に分類された母集団収量に依存することを考慮に入れてください。
- 金属ホルダーにきれいなスライドを置き、フィルタートップを置きます。サンプルを混合しないように、スライドとフィルターにラベルを付けることを忘れないでください。
- フィルター穴に100 μL PBSをスライドに加え、ホールリムでフィルターを加湿します。
- 漏斗を置き、金属ホルダーを閉じて遠心分離機のその場所に置きます。
- 漏斗の中にサンプル(100-200 μL)を加えます。
- 遠心分離機は36 x gで5分間。細胞スピンスライドは、RTで空気乾燥(粉塵を防止するために適切に覆われている)にすることができ、免疫染色または細胞化学の前に1週間RTで保つことができます。
- 免疫染色用
- PBSで希釈した2%パラホルムアルデヒド(PFA)でスライドを固定し、5分間インキュベートします。
- PBS中の0.5〜4%のPFAの範囲が使用されてもよい。私たちの手では、組織またはいくつかの細胞タイプの適切な固定を得るために4%を使用し、PBSの0.5%PFAは血小板のために十分です。この手法を設定する場合、PFA の適切な割合では、セルの種類/ソースあたりの最適化が必要になります。
- PBSで5分インキュベート。
- 50%エタノール(EtOH)で5分間インキュベートします。
- 70%のEtOHで5分インキュベート。
- -20ºCで70%のEtOHで保管してください。
- 免疫染色を行う場合、水分補給、および標準的な手順(透過、洗浄、ブロッキング、一次および二次抗体インキュベーション、保存など)に従ってください。
- PBSで希釈した2%パラホルムアルデヒド(PFA)でスライドを固定し、5分間インキュベートします。
- 細胞化学の場合:
注:スライドは、May-Grünwald Giemsa染色または各目的に便利な染色で染色できます。 - 即時形態検査のため
- 細胞を含む細胞のスポットに取り付け媒体を1滴加え、カバースリップを置きます。
- 密封しない限り、スライドを1週間以上4°Cに保ち、RTでも長期保存が可能です。
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Representative Results
骨髄と策略
図4では、患者からのBMサンプル(吸引)における巨核代の代表的な免疫型解析を示す。CD71とCD31に対して細胞分数をプロットする際には、CD31- CD71- (赤)、CD31 - CD71+ (青)、CD31 + CD71- (オレンジ)、CD31+ CD71+ CD71+ CD71 + (濃い緑色) および CD31++ CD71ミッドクリーム (CD31 +CD71ミッドクリーム) の 6 つの主要な集団をゲートしました。これらの集団は、常に同じ位置に存在するとは限らない(一定のサイトメーター設定を考慮して)、それが見ることができるように、それは考慮されるべきです。これは、病理学的状態と骨髄の状態に固有の可能性があります。パネルに含まれる成熟マーカー(CD42A/CD42B)とフォワードスキャッターに対してヒストグラムに重ね合ったこれらの6つの集団をバックガッティングすると、右側に示されています。この図は、CD31/CD71に対するプロットを示し、より成熟したMKの分布を視覚化するセル全体の画分を持つCD42B+ 細胞のオーバーレイを示しています。一般に、集団CD31-CD71-は、MKまたは系統前駆体を含まない、MK成熟マーカーを提示しない、およびサイズが小さい。CD31- CD71+集団は主にエリスロイド系統の細胞を含んでいるが、我々の観察から仮説を立てるように、共通の系統前駆体を含むこともできる。これは、MK成熟マーカーに対して陰性のままであり、以前または後のエリスロイド細胞の割合に応じて、前方散乱も同様に変動する可能性があります。
例として、骨髄異形成症候群(MDS)患者は、他の患者と比較して、未熟な(すなわち、より大きい)赤血球細胞の割合が大きい。MK前駆細胞および成熟細胞は、CD31+細胞に分布し、いくつかのバリエーションを有する。しかし、各病理に関するBM分析を比較することが分かるように、いくつかの一定の特徴がある。より成熟したMCはCD31++CD71中期集団(クリーム)に存在し、この成熟が「ブロック」される病理には、免疫血小板減少症(ITP)および反応性BMサンプル(基礎的な炎症を伴う)が含まれる。リンパ腫患者では、初期前駆体と後期のMK(オレンジとクリームの門)との間に均衡があるようだが、この割合はMDS患者(より「ブロックされた」前駆体を有する)および急性骨髄性白血病(AML)患者(より成熟したMKを有する)で変化する。興味深いのは、その間で「封鎖」は病理学を比較する異なっているようです:基礎的な炎症と一致する病理では、閉塞は成熟欠陥、破壊(すなわち、自己免疫)およびMK破裂による血小板産生の組み合わせによるものかもしれない。
図4:異なる病理患者からのヒト骨髄サンプルにおける巨核球体の免疫原性リンパ腫と診断された患者(すなわち、正常なBM)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性骨髄性白血病(AML)、免疫性血小板減少症(ITP)および感染による反応性BM患者からの代表的な骨髄(BM)サンプルを分析した。CD71およびCD31に対して細胞画分(すなわち、有核細胞)をプロットする場合、CD31- CD71- (赤)、CD31 - CD71+(青)、CD31 +CD71 +CD71ミッド(ライトグリーン)、CD31+CD71+CD71ミッド(濃緑色)、CD31+ CD71+CD31(濃緑色)の6つの主要集団をゲートしました。 これらの集団は、常に同じ位置に存在するとは限らない(安定したサイトメーターの設定を考慮して)、それが見ることができるように、それは考慮されるべきです。パネルに含まれる成熟マーカー(CD42A/CD42B)とフォワードスキャッターに対してヒストグラムに重ね合ったこれらの6つの集団をバックガッティングすると、右側に示されています。この図は、CD31/CD71に対するプロットを示し、より成熟したMKの分布を視覚化するセル全体の画分を持つCD42B+ 細胞のオーバーレイを描いたもので、ドットプロットのゲートとヒストグラムのオーバーレイに一致する数字が描かれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
我々は次に、ヒトBMサンプルに関する上記の集団の略奪的な状態を分析することに着手した。図5は、CD31+集団内の増加する策略状態を示しており、病理学的文脈ごとに異なる特性が予測される。これらの実験で使用される細胞固定化と透過性のために、ドットプロットは未固定の非透過性サンプルのものと完全に匹敵しないことに注意してください(図4)。
図5:ヒトBMサンプルにおけるCD31/CD71発現に基づいて選択された集団のプロイド解析急性骨髄性白血病(AML)および免疫血小板減少症(ITP)と診断された患者からの代表的な骨髄(BM)サンプル。CD71およびCD31に対して細胞画分(すなわち、有核細胞)をプロットする場合、CD31- CD71- (赤)、CD31 - CD71+(青)、CD31 +CD71 +CD71ミッド(ライトグリーン)、CD31+CD71+CD71ミッド(濃緑色)、CD31+ CD71+CD31(濃緑色)の6つの主要集団をゲートしました。 これらの集団は、常に同じ位置に存在するとは限らない(安定したサイトメーターの設定を考慮して)、それが見ることができるように、それは考慮されるべきです。Hoechst 33342に対してヒストグラムに重ね合ったこれらの6つの集団をバックゴーティングすると、集団の異なる策略状態と、成熟とともに策略を増加させる一般的な傾向が示されています(ただし、MKは多重化状態とは無関係に成熟に達する可能性があります)。ドットプロットのゲートとヒストグラムのオーバーレイに一致する数字が描かれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
PBMCsと細胞培養
図6では、7日目および11日目にPBMCおよびMK培養セットの代表的な免疫フェノタイピング分析を示す。私たちは、リンカクテルを含むパネルを使用し、我々はリン - 選択の前後に生細胞の細胞分率を示しています。この負の選択は、CD14 などの MK の一部の部分を失う可能性がありますが、より洗練された分析も可能です。リン- CD71とCD31に対する分数をプロットする際に、5つの主要な集団をゲートしました:CD31- CD71-、CD31- CD71+CD31+ CD71 + CD71-、CD31+ CD71ミッドとCD31++ CD71.これらの集団は、常に同じ位置に存在するとは限らない(一定のサイトメーター設定を考慮して)、それが見ることができるように、それは考慮されるべきです。この場合、違いは、個々の健康または病理学的状態に固有であるだけでなく、PBMC画分における前駆体のMK分化能力にも固有である。パネルに含まれる他のマーカー(KITおよびCD42B)に対してヒストグラムに重ね合ったこれらの5つの集団をバックガッティングし、前方散乱に、右側に示されている。成熟の異なる段階でMK前駆体とMKはCD31+集団内にあります。
図6:MK細胞培養中の巨核代の免疫型の免疫型(開始PBMC物質を含む)PBMCおよびMK培養物の代表的な免疫平型分析は、7日目および11日目にこれらのPBMCに設定された。Linカクテルを含むパネルを使用し、リン選択の前後の細胞分画(すなわち有核細胞)を示します。この負の選択は、CD14 などの MK の一部の部分を失う可能性がありますが、より洗練された分析も可能です。CD71 と CD31 に対して Lin- 分数をプロットする場合、CD31- CD71-、 CD31- CD71+CD31+ CD71- 、CD31+ CD71ミッド、CD31++ CD71 の5つの主要な集団をゲートしました。これらの集団は、常に同じ位置に存在するとは限らない(安定したサイトメーターの設定を考慮して)、それが見ることができるように、それは考慮されるべきです。パネルに含まれる他のマーカー(KITおよびCD42B)に対してヒストグラムに重ね合ったこれらの5つの集団をバックガッティングし、前方散乱に、右側に示されている。成熟の異なる段階でMK前駆体とMKはCD31+集団内にあります。この図は、CD31/CD71に対するプロットを示し、より成熟したMKの分布を視覚化するセル全体の画分を持つCD42B+ 細胞のオーバーレイを描いたもので、ドットプロットのゲートとヒストグラムのオーバーレイに一致する数字が描かれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表3:フローサイトメトリー分析の母集団割合この 表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
PBMCでは、MCはCD31++CD71ミッドゲート内にありますが、そのサイズは培養されたMKで見たほど大きくはありません。これは、次の 2 つのオプションのいずれかである可能性があります: PBMC の MK は循環に入る未熟な MC の一部、または細胞質の複雑さを失った成熟した循環 MK の一部を表します。私たちの並べ替え実験は、後者がそのサイズの違いを説明する理由であるかもしれないことを示唆しています。この概念を支持するCD42Bの発現は、プロ血小板形成および/または血小板脱落時の表面マーカーの喪失のために、それらの集団上の細胞の100%に存在しない(図4のBMサンプルでも見られるように)。しかし、培養サンプルでは、「成熟した」ゲート内のMKは、ほぼ100%CD42B+、およびサイズが大きい。これらの仮説細胞ダイナミクスはさらに研究され、検証されるべきです.
TPOの多雄性作用により、これらの培養は異種かつ非同期であり、それ以上の個別のMK分化段階の分析を困難にする。19,20以前の前駆物質の拡張に続いて、異なる成熟段階のMKは6-10日目(またはドナー変動のために)から培養物に現れ、MK系統コミット細胞がMKに向かって成熟するにつれて徐々に数が増加する。一部のMKは末端分化を受け、プロ血トの形成を開始します。培養の終わりに向かって、プロ血小板形成および血小板脱落または細胞死後の「伸び/疲労」による細胞喪失の段階的な増加が起こるだろう(図2)。
組換えTPOの代わりにTPO類似体を使用する場合、濃度をテストする必要があります。
異なる発達段階の供給源からのMKは独自の特徴を有するので、前駆者(成人、臍帯血)の供給源は、文化を条件付けします。さらに、濃縮されたCD34+前駆体からの培養は、培養の初めにはより均質に見えるが、MKのコミットメントと分化が始まると異質性とアシンクロニシティの段階に達するだろう19,20。
MKセルソート
図7では、分化10日目におけるMKインビトロ培養のサンプルの代表的な格言戦略を示す。CD31およびCD71、または前方散乱に対して有核細胞分画をプロットする場合、CD31の有無を特徴とする2つの主な集団を区別することができる。
CD41 および CD71 に対して CD31 +分数をプロットする場合、 CD41- CD71- (1)、CD41低CD71 +(2)、CD41低CD71++++CD71+(4)の4つの主要集団をゲートすることができ、他の表面マーカー(KITおよびCD49B)を差し出して発現させ、MKコンパートメントをCD41高陽性細胞として識別することを可能にする(図7A)。ソートされた分画の純度は、並び替えられた分数のサイトスピンの細胞学的染色と同様に示される。
PBMC-MK培養における細胞母集団スペクトルを特徴付けるために、viSNE分析が採用された(図7B)。viSNE マップは、表現するマーカーの組み合わせに基づいて、セルを空間的に異なるサブセットに分離します。viSNE分析の各点は、CD31、CD42A、CD71およびKITの発現レベルに従って着色された個々の細胞を表す。
二重陰性細胞(CD31-およびCD71-)は、主にこれらの条件で培養中に持続する残留リンパ球(母集団5)である。 この母集団は、サンプルの残りの部分を使用して、セルの並べ替えの第 2 ラウンドで並べ替えられています。
ゲート6および7はCD71中および 高発現細胞であり、エリスロイド前駆腫および潜在的に他の前駆体を含む。
この培養法の細胞異種性と、それらが属していない亜集団に成熟したMKが存在する成熟したMKの粘着性に起因する技術的な困難を考慮する必要があります(備考セクションを参照)。
図7:10日間のインビトロ培養MKの事前並べ替え免疫平種分析A) CD31、CD41、CD71を使用した代表的な格言戦略は、2つのソートラウンドを伴い、その結果、CD31+集団1〜4およびCD31-集団5-7になる。各ソートされた分率の純度を選別後に分析し、各ソートされた分数から染色されたサイトスピンの代表的なマイクロ写真と共に描かれている。B)10日目のviSNEマップは、フローサイトメトリーで測定されたPBMC由来MK培養細胞である。このマップは、フローサイトメトリーで測定された CD31、CD42B、CD71、KIT の発現レベルを使用して構築されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
並べ替え後処理
並べ替えられた集団は、特定の生理病理学的文脈におけるMK特徴を評価したり、巨核代行のプロセスをよりよく研究するために、免疫蛍光による細胞学的および分子的分析(セクション7を参照)を含むさまざまな方法によって分析することができる。いくつかの例を図8に示します。
図 8.ソート後の MK 分析。A) 10日間のインビトロ 培養からソートされたMKコンパートメントの細胞学的分析。May-グリュンヴァルト・ギムサ染色は、成熟したMK、 すなわち疑似ポッド形成(赤い矢印)、高倍数MK(青い矢印)の主要な特徴を観察することを可能にする。 B) 免疫蛍光分析.細胞は抗ヒトフォン・ヴィルブランド因子(赤、二次抗体アレクサFluor 555ヤギ抗マウスIgGで示される)、抗ヒトCD31またはタンデムCD41/CD61、FITC(緑色で示される)と共役し、核DNAはDAPI(青色で示される)で標識した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
備考：
MK は、細胞を膜に取り付ける能力により、予期しない領域からソートできます (図 9)。この問題は、高純度の細胞の亜集団を得るために問題になる可能性があります。セル・セルの凝集を最小限に抑えるために、1-5 mM EDTAをパネルミックスバッファーに追加することができます。
さらに、出発材料としてWBを用いた場合、PBMCsを得るか、細胞分率を直接使用するようにRBCをライシングすることを提案した。 図10 では、2つの方法論のフローサイトメトリー分析を示す。一方で、RBCを溶かして細胞区画全体を分析する場合、我々はまだ大量の好中球を持っています。これらは、特定のマーカーでフィルタリングすることができます(またはLinカクテル戦略を使用)。しかし、サーフェスマーカーの表現に関連する無差別な性質のために、いくつかのMKを失う可能性があります。一方、PBMCの単離は、高密度(すなわち、より複雑な細胞質特徴またはより未熟なもの)を持つMKを失うかもしれないが、我々はRbcsと同様に好中球を取り除くことを可能にする。 図10に示すように、LYSED WBからのMKは、PBMCsを単離するとより低く見える成熟マーカーの高い発現を示す。密度勾配は、まだ複雑な細胞質を含むMCの損失をもたらす可能性がありますが、PBMC画分に含まれるものは、血小板を放出した後の循環ですでに「疲れ果てている」可能性があり、したがって、より複雑でない細胞質内で多倍体核を維持する。彼らは未熟なMKと混同してはいけません。各手順には、その利点とその欠点があります。
図 9.MKの粘着性の性質。 MKは、細胞を膜に取り付ける能力のために予期せぬゲートで見つけることができます。 A-C) MK は、MK の並べ替えの格言戦略に従って、集団 1 (B) と 5 (A と C) で並べ替えられます。この問題は、高純度の細胞の亜集団を得るために問題になる可能性があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10.BVCをライシングした後のPBMCまたはWBからのMKのフローサイトメトリー免疫フェノタイピング。A) ギャティング戦略。 B) サイズ(FSC)、細胞の複雑さ(SSC)およびCD42A、CD41、CD71およびKITの発現は、PBMCまたはWBで識別されるように、MCで。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
フローサイトメトリーによる巨核生物の研究に焦点を当てた研究のほとんどは、系統特異的な表面マーカー(すなわち、CD42A/CD42B、CD41/CD61)のみを使用したMKサブセットの同定に限定され、以前のMK分化段階は十分に検討されていません。本稿ではヒト巨核代の包括的なフローサイトメトリー特性解析に取り組む免疫フェノタイピング戦略を示す。全体として、MK特異的および非特異的な表面マーカー(表1および2)を同じフローサイトメトリー抗体パネルに組み合わせることの有用性を、より詳細な方法で巨大核化の研究に向けて強調したいと思います。私たちの新しいアプローチは、造疫性疾患の診断および/または予後を支援するための強力なツールとして役立つ可能性があります。提示されたパネルと組み合わせは決定的ではないと考えています。我々は、人間の一次源(主にBMサンプル)における表面マーカーの非常に動的な挙動を観察した。より多くの研究が必要であり、うまくいけば、科学界は、単一の病理に焦点を当てた研究からの観察と、巨核球形成が診断または予後にどのように役立つかに関するフィードバックに関して、このアプローチを適用し始めるでしょう。導入セクションで述べられているMKコミットメントの多様なルートを考慮して、主要組織におけるHSCとMKの特性を組み合わせた実装は、関連性とさらなる発展の価値があります。また、PBMCの中でMCを検出できることは、かなりの観察です。また、血液サンプルの抽出は侵襲的ではないため、この主要なソースのMKの分析は、BM吸引に非常に関連する代替手段として、疾患診断と予後に役立つと仮定しています。その側面には開発も必要です。
MKの生物学的特性(大きなサイズ、浸透性の脆弱性、粘着性)に関連する技術的な制限にもかかわらず、我々はいくつかのヒトMK源、特にBM、PBMCsおよびPBMCs由来細胞培養において異なる成熟段階を選別することができた。今後の研究は、臍帯血や異なる物理病理学的状況における他のヒト源における巨核代の特異性を分析するために行われる。さらに、各ゲートおよびソートされた細胞分画の分化ポテンシャルは、MK前駆物質(CFU-MK)のコロニー形成ユニット(CFU)アッセイで評価され、巨大核化の旅における各集団の分化ポテンシャルを客観的に評価する必要があります。かつて成熟した巨核球の種類を妨げると考えられていた技術的な限界を超えながら、そのような必要性はまだより完璧を要求します。一方で、単一細胞Omicsは免疫フェノタイピングパネルを適用する際に包括的な研究を可能にしますが、物理的な並べ替えが必要な場合、ソートされた集団の純度が85%を超えているにもかかわらず(表面マーカー発現に基づいて)、他の変数を考慮する必要があり、まだ解決が困難です。前述のように、MK カルチャは同期的ではなく、非常に異種です。MK自体は表面マーカー発現において無差別であり、他の骨髄性および非骨髄造血細胞および非造血細胞とマーカーを共有する。さらに、それらは広く分布する形態素変数(前方および側面散乱)とのクラスター化が非常に困難です。このアプリケーションを改良するにはさらなる研究が必要ですが、共同で取り組むことで、私たちは巨大核生物を絞り込むのに近づいています。
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Disclosures
視聴覚材料の生産は、BDバイオサイエンスによってサポートされました。
Acknowledgments
マルコス・ペレス・バステルレチェア、ロレナ・ロドリゲス・ロレンツォ、ベゴーニャ・ガルシア・メンデス(HUCA)、パロマ・セレッソ、アルムデナ・パエロ、マリア・デ・ラ・ポベダ=コロモ(HCSC)に技術サポートを感謝します。この研究は、A.B.、RYCフェローシップ(RYC-2013-12587)への医療助成金(ロシュSP200221001)によって部分的にサポートされました。デ・エコノミア・イ・コンペティティビダード、スペイン)とI +D 2017助成金(SAF2017-85489-P;シエンシア大臣、イノバシオン・イ・ウニバーシダーデス、スペイン、フォンドス・フェデエル)からセベロ・オチョア・グラント(PA-20-PF-BP19-014)までコンセヘリア・デ・シエンシア,イノバシオン・イ・ウニヴェルシダーデス・デル・プリンシパド・デ・アストゥリアス州)からP.M.-Bへ。そして、A.A.-Hへの壁内ポスドク助成金2018(フンダシオン・パラ・ラ・インベスティガシオン・イ・ラ・イノバシオン・ビバイサニタリア・デ・アストゥリアス - FINBA、オビエド、スペイン)。私たちは、彼の知識(と時間)、特にマルチカラータグ付き抗体パネルミックスと単色ビーズ制御製剤に関する彼の賢明なアドバイスを共有してくれたライニエ・ファン・デル・リンデンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
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