Summary
Her præsenterer vi en immunophenotyping strategi for karakterisering af megakaryocyt differentiering, og viser, hvordan denne strategi tillader sortering af megakaryocytter på forskellige stadier med en fluorescens-aktiveret cellesortering. Metoden kan anvendes på humane primære væv, men også til megakaryocytter genereret i kultur in vitro.
Abstract
Megakaryocyte (MK) differentiering omfatter en række endomitotiske cyklusser, der resulterer i en meget polyploid (nå selv >64N) og ekstremt store celle (40-60 μm). I modsætning til den hurtigt stigende viden i megakaryopoiesis på cellebiologi og molekylært niveau er karakteriseringen af megakaryopoiesis ved flowcytometry begrænset til identifikation af modne MKs ved hjælp af afstamningsspecifikke overflademarkører, mens tidligere MK-differentieringsstadier forbliver uudforskede. Her præsenterer vi en immunophenotyping strategi, der gør det muligt at identificere successive MK differentieringsstadier, med stigende ploidy status, i menneskets primære kilder eller in vitro kulturer med et panel, der integrerer MK specifikke og ikke-specifikke overflade markører. På trods af sin størrelse og skrøbelighed kan MKs immunophenotyped ved hjælp af ovennævnte panel og beriget med fluorescensaktiveret cellesortering under særlige betingelser for tryk og dysedymeter. Denne tilgang letter multi-Omics undersøgelser med det formål bedre at forstå kompleksiteten af megakaryopoiesis og blodpladeproduktion hos mennesker. En bedre karakterisering af megakaryopoiesis kan udgøre grundlæggende i diagnosen eller prognosen for afstamning-relaterede patologier og malignitet.
Introduction
Megakaryocytter (MKs) udvikler sig fra hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) efter en kompleks proces kaldet megakaryopoiesis, som hovedsageligt orkestreres af hormonet thrombopoietin (TPO). Den klassiske opfattelse af megakaryopoiesis beskriver den cellulære rejse fra HSC'er gennem en række hierarkiske stadier af engagerede forfædre og prækursorceller, hvilket i sidste ende fører til en moden MK. Under modning oplever MKs flere runder af endomitose, udvikler et indviklet intracellulært afgrænsningsmembransystem (DMS), som giver nok membranoverflade til pladeproduktion og effektivt producerer og pakker overfloden af faktorer, der er indeholdt i de forskellige granulater arvet af modne blodplader1,2,3. Som følge heraf er modne MKs store celler (40-60 μm) karakteriseret ved en meget polyploid kerne (når selv >64N). Nylige undersøgelser tyder på alternative ruter,hvorved HSC'er differentierer sig til MKs uden om traditionelle kontrolpunkter for trinvise forpligtelser som reaktion på visse fysiopatologiske tilstande4,5,6,7,8,9,10,11. Disse fund fremhæver, at hæmatopoietisk differentiering mod den modne MK er en kontinuum og adaptiv proces, der reagerer på biologiske behov.
Med den stigende viden om cellebiologien og de molekylære aspekter, der karakteriserer megakaryopoiesis12, er det meste af forskningen dedikeret til studiet af processen ved flowcytometry begrænset til identifikation af modne MKs ved hjælp af afstamningsspecifikke overflademarkører (dvs. CD42A / B, CD41/CD61), mens tidligere MK-differentieringsstadier forbliver uudforskede. Vi har tidligere dokumenteret en strategi for at iscenesætte megakaryopoiesis i mus knoglemarv og knoglemarv-afledte MK kulturer13,14, som vi har tilpasset og anvendt til mennesker15. I denne artikel viser vi en immunophenotyping strategi, der gør det muligt karakterisering af megakaryopoiesis, fra HSC'er til modne MKs, i menneskets primære kilder (knoglemarv -BM- og perifert blod -PB-) eller in vitro kulturer ved hjælp af et panel, der integrerer MK specifikke og ikke-specifikke overflademarkører (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT og CD71, blandt andre). På trods af sin store størrelse og skrøbelighed kan MKs immunohenotyped ved hjælp af ovennævnte celleoverflademarkører og beriget med fluorescensaktiveret cellesortering under særlige forhold med tryk og dysedymeter for at minimere cellebrud og / eller skade. Denne teknik letter multi-Omics tilgange, med det formål bedre at forstå kompleksiteten af megakaryopoiesis og blodplader produktion i menneskers sundhed og sygdom. Bemærkelsesværdigt, vil det udgøre som et nyttigt redskab til at støtte diagnose og prognose i en klinisk sammenhæng med stigende efterspørgsel.
I dette manuskript dokumenterer vi en strategi for at iscenesætte menneskelige megakaryopoiesis med et panel, der integrerer MK-specifikke og ikke-specifikke overflademarkører fra primære kilder eller genereres in vitro. Derudover leverer vi en protokol til sortering med en fluorescensaktiveret cellesortering, de foretrukne fraktioner og modne MKs (Figur 1). Dette trin er ikke populært, da det er teknisk vanskeligt på grund af MKs's store størrelse og skrøbelighed. Det har dog været ansat både i muse- og human knoglemarvsprøver tidligere og på grund af teknologiske fremskridt med et bedre resultat hver gang16,17,18. Menneskelige primære kilder, hvor MKs eller MK prækursorer kan studeres omfatter knoglemarv, navlestrengsblod og perifert blod, blandt andre. Den korrekte prøvebehandling til isolering af den relevante cellefraktion til analyse af hver prøve er vigtig. Standardprocedurer indarbejdes med nogle overvejelser, der skal tages i betragtning, når man sigter mod undersøgelsen af megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev udtaget og behandlet fuldblods- og knoglemarvsprøver i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen fra 1964. Fuldblodsprøver blev udtaget fra raske donorer efter at have givet informeret samtykke (ISPA) i en undersøgelse godkendt af vores institutionelle medicinske etiske udvalg (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Knoglemarvsprøver blev fremstillet af knoglemarvssugudsmidsmateriale fra patienter, der blev forvaltet på Dept. of Hematology på Hospitalet Clínico San Carlos (HCSC).
Figur 1: Skematisk gengivelse af protokollen dokumenteret i dette manuskript. De primære menneskelige kilder eller primære kulturer, hvor MK differentiering kan iscenesættes ved hjælp af immunophenotyping er angivet. Denne immunophenotyping strategi kan anvendes til studiet af processen i forskellige afstamning-relaterede patologier eller malignitet i primære kilder. Derudover gør det det muligt at sortere MKs og prækursorer med en fluorescensaktiveret cellesortering, hvilket muliggør yderligere analyse af berigede fraktioner. De anvendte billeder er en del af Servier Medical Art (SMART) af Servier og er licenseret under CC BY 3.0. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Behandling af fuldblod og knoglemarv inden immunophenotyping
- Når du bruger fuldb (WB) fra donationer som en primær kilde, eventuelt isolere perifere blod mononuklear celle (PBMC) komponent. Dette kan opnås ved hjælp af standard differential centrifugering kombineret med tæthedsgradientcelleadskillelse, som tidligere beskrevet15.
- Kort sagt, centrifuge blod ved 193 x g i 15 min (bremse 3) ved stuetemperatur. Kassér den øverste plasmafraktion og saml buffy ringen. 1:1 fortyndes med fosfatbuffersalt (PBS)/Trisodium Citrate Dihydrat (38 g/L, pH 7) buffer og pipetter forsigtigt et volumen på 25 ml oven på 15 ml af en massefyldegradientopløsning (1,076 g/mL) i 50 ml rør.
- Centrifuge i 20 minutter ved 1114 x g (accelerator 3, bremse 3, stuetemperatur). Plasmafraktionen kasseres, og den buffy ring, der indeholder PBMCs. Vask ved at tilsætte det samme volumen PBS, centrifuge ved 435 x g i 5 min. og genbruges i PBS til videre brug.
- Alternativt kan du bruge en WB-prøve (ca. 100 μL) til immunophenotyping efter lysing af de røde blodlegemer (RBC) og grundig vask.
- Kort sagt fortyndes 1:1 i iskold RBC lysingsbuffer (4,15 g NH4Cl, 0,5 g KHCO3 og 18,5 mg EDTA (triplex III) til 500 mL H2O, pH 7,1-7,4). Vent, indtil celleophænget bliver gennemsigtigt (3-5 min).
- Centrifuge ved 435 x g i 5 min ved 4 °C og opbruges cellerne i PBS. Gentag proceduren så mange gange som nødvendigt for at opnå en hvid celle pellet.
- På samme måde behandles prøverne fra knoglemarv (aspiration) direkte med RBC-lysingsbuffer (se punkt 1.2) og grundig vask, så de begynder med en klar enkeltcelleophæng (figur 1).
- Undgå brug af hvirvler til at blande prøver under behandlingen, da det kan beskadige de skrøbelige MKs. Bland ved at svirpe eller vende røret.
BEMÆRK: Tæthedsgradient for at opnå PBMCs kan resultere i en rigere og renere cellefraktion sammenlignet med RBC-lyset WB. Vi bør dog huske på, at høj densitet, modne MKs kan gå tabt i "neutrofil" fraktion. Dette vil blive drøftet i de repræsentative resultater.
- Undgå brug af hvirvler til at blande prøver under behandlingen, da det kan beskadige de skrøbelige MKs. Bland ved at svirpe eller vende røret.
2. In vitro MK differentiering fra PBMCs
BEMÆRK: MKs kan differentieres in vitro fra tidligere prækursorer, såsom CD34+ celler, der findes i forskellige primære kilder(dvs. WB / PBMCs, navlestrengsblod, knoglemarv) og fra iPSCs. Der er forskellige protokoller, der er blevet anvendt til dette formål. Her bruger vi en kulturmetode udviklet af os, der tillader MK differentiering fra PBMCs, uden behov for berigelse til CD34+ prækursorer15,19,20,21,22.
- Denne protokol består af tre kulturfaser, hvor koncentrationen af thrombopoietin (TPO) gradvist stiger på bekostning af vækstfaktorer, der favoriserer spredning af tidligere prækursorer (dvs.SCF, EPO), som gradvist falder (figur 2)15.
- For basismediet skal du bruge StemSpan SFEM suppleret med 0,4% af kolesterolrig lipidblanding og 1% Penicillin / Streptomycin.
- For fase I-mediet skal der anvendes basismediet suppleret med SCF (100 ng/mL), Erythropoietin (EPO, 0,5 U/mL) og Thrombopoietin (TPO, 30 ng/mL). Fase II-mediet er basismediet suppleret med SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) og TPO (50 ng/mL). For fase III-mediet skal basismediet suppleres med TPO (100 ng/mL).
- Kultur-PBMCs i fase I-mediet. På dag 6-8 skal PBMCs placeres i fase II-mediet, og på dag 9-12 placeres PBMCs i fase III-mediet.
- Medium erstattes af centrifugeringsceller ved 435 x g i 5 minutter ved stuetemperatur fra fase I til fase II og ved 95 x g i 5 minutter ved stuetemperatur fra fase II til fase III, og genanvendeligt i frisk medium.
- Dyrkningsceller i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2. I disse primære kulturer varer MK-differentiering 10-14 dage, og prøver kan udtages på forskellige tidspunkter i hele kulturperioden for at følge MK-differentiering.
- For basismediet skal du bruge StemSpan SFEM suppleret med 0,4% af kolesterolrig lipidblanding og 1% Penicillin / Streptomycin.
Figur 2: Skematisk repræsentation af den PBMC-afledte MK-kulturmetode. PBMCs fra sunde donorer blev dyrket i henhold til de tre-fasede protokol udviklet af os til at generere MK in vitro (ordning tilpasset fra Salunkhe et al). 15 Billeder taget på dag 10 og dag 13 af kultur er vist. Billeder er taget med et 20X mål. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Prøvesamling: Vask cellerne ved at anvende lavhastigheds centrifugering i 5 min (95 x g) og genbrug dem i PBS eller PBS, der indeholder 1% af kvægserumalbumin (BSA). For immunophenotyping er den ideelle massefylde 105-106 celler/100 μL (se punkt 3.1). Afhængigt af kulturernes status(dvs. tilstedeværelse af døde celler, snavs osv.) kan der være behov for 1 eller 2 vask. Saml dine celler på de tidspunkter af interesse under kultur.
3. Immunophenotyping af MK differentiering - inkubation med et panel af mærkede antistoffer
- Inkuber celleprøverne med et panel af mærkede antistoffer efter standardprocedurer, idet der lægges vægt på centrifuge ved lav hastighed (95 x g), når megakaryocytter behandles. Vi inkuberer normalt prøverne med 1% BSA i PBS i mængder på 100 μL ved 4 °C, 20 min. med et interval på 105-106 celler.
- Skaler op, når det er nødvendigt.
- Efter inkubation tilsættes 5 mL 1% BSA i PBS, centrifuge ved lav hastighed (95 x g), aspirere supernatanten og genbruge prøven i 2% BSA i PBS for at bevare MK levedygtighed (2 mL). Tilføj 1-5 mM EDTA for at forstyrre cellecelleaggregater (som naturligt ses i MK-kulturer).
- Prøver overføres til et 12 x 75 mm rundt bundrør (FACS-rør) eller en plade, og de opbevares i mørke, indtil der foretages cytometrianalyse eller cellesortering.
- Fremstilling af enkeltantistoffer og antistofpanelblandinger; opsætning af flowcytometeret:
- Titrere antistofferne, før de anvendes, for at bestemme den optimale koncentration i antistofpanelerne. Den optimale koncentration af antistoffer er den laveste koncentration, der adskiller klart positiv fra negative celler (og tillader sondring af mellemliggende niveauer af udtryk). F.eks. anvendes de fleste antistoffer i en fortynding på 1:200 (bestand 100 μg/mL), medmindre fabrikanten på anden måde titrerede eller angav det.
- Når antistoftitreringen er bestemt, skal du forberede en 10x fortynding af hvert antistof. Disse fortyndinger bruges til enkeltfarvekontrollerne og til forberedelse af panelblandingerne. Fortyndingerne og panelblandingerne er fine til brug selv en måned efter tilberedningen (opbevares ved 4 °C, medmindre fabrikantens indikationer udelukker disse opbevaringsforhold). Dette gør det muligt at farvning af prøver med det samme panel gennem en periode.
- Brug 10 μL pr. 100 μL af 10x fortyndingen både til enkeltfarvekontrollerne og til panelblandingen.
- Til enkeltfarvekontrollerne skal du bruge antistofaffinitetsperler, som kan måles direkte efter tilsætning af antistoffet. Enkeltfarvekontrollerne skal måles ved hvert eksperiment for at muliggøre korrekt kompensationsjustering (og finjustering efter måling med analysesoftwaren).
- Du kan også udføre kontrolelementerne med en enkelt farve med celleeksempler. Perlerne gør det dog muligt hurtigt at måle et givet antal hændelser, som afhængigt af antistof-/overflademarkøren muligvis ikke er muligt at opnå på komplekse primære eller dyrkede cellekilder. Vi anbefaler også at køre celleprøver, der er farvet med "Fluorescens Minus One" (FMO) panelblandinger for at oprette de relevante kompensationsindstillinger (før du kører eksperimenter). Dette er relevant, for omhyggeligt at identificere kompensationsproblemer, og især i dyrkede MKs, at identificere autofluorescens interferens (som vil være til stede, hvis du bruger kultur medium, der indeholder phenol rød).
- Forbered nok volumen af panelblandingen, afhængigt af antallet af prøver, der indeholder antistofferne i det designede panel. De fleste af vores paneler omfatter seks antistoffer (6-farvepaneler, se tabel 1-2).
- Til disse paneler skal du bruge 488-nm og 633-nm lasere af flowcytometeret, men paneler kan tilpasses andre tekniske scenarier. Desuden kan kompensationsovervejelser undgås, når der anvendes massespektrometribaseret flowcytometry eller cytometer med akustisk fokuseringsteknologi.
- Farvestoffer til måling af levedygtighed kan give falske oplysninger om MKs, især når de modnes. MKs er meget aktive ophaling celler, og positivitet med Hoechst, 7-AAD eller PE, måske ikke altid afspejler faktiske celledød. Et alternativ (hvis celledødsmåling er påkrævet) kan være brugen af mitokondrier pletter (CMX Ros) eller amin reaktive farvestoffer (Zombie eller Ghost farvestoffer).
Tabel 1: Noter om celleoverflademarkører for den megakaryote afstamning Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Antistofpaneler Klik her for at downloade denne tabel.
4. Ploidy analyse kombineret med 6-farve paneler
- For ploidy analyse, i kombination med en 6-farve antistof panel, fortsætte med fiksering og gennemtrængning af celler efter inkubation med antistof panel. Denne strategi vil gøre det muligt at bevare overflademarkøren farvning, samtidig med at farvning af DNA af celler. Vi bruger Hoechst 33342 til at plette DNA, da det kan visualiseres med den tilgængelige violette 405-nm laser.
- For 105-106 celler, efter inkubation med antistofpanelet, centrifugeceller (95 x g i 5 min), opsuges i 200 μL fikseringsbuffer og inkuberes 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Centrifugeceller som angivet ovenfor, genbruges for anden gang i 200 μL fikseringsbuffer og inkuberes yderligere 10 min ved RT.
- Forbered permeabiliseringsbuffer, der indeholder 0,1% Triton X-100, 200 mg/mL RNase og 20 mg/mL Hoechst 33342 (permeabilization Hoechst MIX).
- Centrifugecellerne som ovenfor, opbruges i 300 μL af permeabilisationen Hoechst MIX og inkuberes 30 min ved 37 °C. Dette trin er meget vigtigt, da RNA skal nedbrydes for at opnå en ren ploidy-måling.
- Efter inkubationstiden måles prøverne direkte med et flowcytometer. Ellers skal prøverne opbevares ved 4 °C i mørke. Mål dem hurtigt. Men da disse prøver er faste, kan målingen forsinkes selv 24-48 timer. Sørg for, at prøven er knipset grundigt før måling, eller passeret gennem en celle si, for at sikre en enkelt celle suspension.
- Morometriske parametre som f.eks. Afbildningen Fremad/Side-punkt viser en formindskelse af cellefordelingen efter fiksering. Overflademarkørens farvning bevares dog for det meste, og gatingstrategien ændres næppe, hvilket gør det muligt at analysere ploidy-status på de forskellige differentieringsstadier, der er defineret af overflademarkørkombinationer.
5. Analyse af differentiering af MK
BEMÆRK: Vi har set, at kombinationen af CD31/CD71 gør det muligt at indstille en række porte, der svarer til forskellige stadier af MK differentiering. Yderligere back-gating med MK-specifikke markører gør det muligt at udskille modne og umodne MKs. I friske prøver forfiner back-gating for at kontrollere tilstedeværelsen af andre anvendte markører eller for at placere populationerne i frem/side scatter-akserne desuden vurderingen af MK-differentieringsstadier og gør det muligt at kassere andre celletyper, der kan være til stede på de samme populationer.
- Brug et panel af antistoffer, der indeholder tidlige prækursormarkører (KIT, CD34), almindelige prækursorer (CD31, CD71) og afstamningsmarkører, hvoraf nogle er specifikke (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI osv.) (se tabel 1-2). Brugen af Lineage (Lin) cocktail (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, og CD56), gør det også muligt at "filtrere" modne hæmatopoietiske celler, der kan tilføje støj til analysen (ved valg af Lin- befolkning). Som et eksempel vil vi gennemgå analysen af MKs i PBMCs, knoglemarv og gennem PBMC-afledte cellekulturer i de repræsentative resultater.
6. Sortering af MK- og MK-prækursorer
BEMÆRK: De farvede celler blev analyseret og sorteret på en fluorescens-aktiveret cellesortering FACS Aria IIu udstyret med 488-nm og 633-nm standard solid state lasere ved hjælp af FACSDiva software; data blev desuden analyseret og præsenteret ved hjælp af FlowJo-software og Cytobank (viSNE-analyse). Renheden af sorterede fraktioner blev bekræftet ved flowcytometrianalyse af hver af de sorterede fraktioner (renhed over 85%).
- Udfør cellesortering så hurtigt som muligt eller inden for 1 time efter antistofinkubation for at undgå celleforringelse.
- Prøven filtreres med en 100 μm cellestuger for at sikre suspension af en enkelt celle og integriteten af store MK.
- Brug en 130-μm keramisk dyse, en kappe tryk indstillet til 11 pounds per kvadrattomme (PSI) og drop-drive frekvens indstillet til 12 kHz at bryde strømmen i dråber.
- Før sortering steriliseres dysen, kappen og prøvelinjerne ved at udføre en 30 minutters erhvervelse med Penicillin / Streptomycin fortyndet 1:5 i sterilt vand efterfulgt af en 10 minutters erhvervelse med sterilt vand for at fjerne resterende dekontaminant.
- Når strømmen er stabiliseret, skal du justere drop-forsinkelsen med anbefalede perler for at sortere i finjusteret tilstand mere end 97,5% af de reflekterede fald med en strømningshastighed på 400-1200 hændelser i sekundet.
- Forbered opsamling FACS rør med 500 μL på 2% BSA i PBS. Procentdelen af BSA kan øges op til 5-10%.
- Generer eksperimentskabelonen med de korrekte kompensationsmatrixparametre.
- Indlæs FACS-røret i cytometeret.
- Udfør en måling af prøven for at indstille de ønskede porte og renheden af målcellepopulationerne. Vedligehold den post, der er aktiveret, så den viser op til 200.000 hændelser i de valgte populationsporte under cellesortering.
- FACS Aria IIu tillader adskillelse af op til 4 forskellige cellepopulationer på samme tid. Opret et nyt sorteringslayout, og vælg indsamlingsenheden (4 rør) og passende præcisionstilstand (mellemliggende maske af renhed og gendannelse anbefales). Endelig skal du føje de populationer, der er af interesse, til hvert sorteringslokationsfelt (figur 3).
Figur 3: Skematisk gengivelse af princippet om fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Partiklerne går gennem 130 μm-dysen og er tvunget til at bryde op i en strøm af regelmæssige dråber på grund af anvendelsen af vibrationer på dysen. Dernæst afhøres dråberne af laseren (analysepunkt), og signalerne behandles for at give ''sorteringsbeslutningen' ved at anvende en afgift på disse dråber. Når en ladedråbe passerer gennem et højspændingselektrostatfelt (detektionsplade), afbøjes den og opsamles i det tilsvarende opsamlingsrør. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Indlæs opsamlingsrørene, og begynd at sortere målpopulationerne.
- Opsamlingsrørene centrifuges i 5 minutter ved 95 x g, og cellepillen opbruges i det relevante volumen på 2 % BSA i PBS.
- Mål igen en brøkdel af hver sorteret prøve for at beregne renheden.
- Gem celler korrekt til videre brug. Sorterede celler kan bruges til cytologiske og molekylære analyser eller kan rekultureres med det formål at studere differentieringsprocessen for en udvalgt cellepopulation.
7. Prøveforberedelse efter sortering
- Forberedelse af cytospins til cytoologisk analyse med en cytocentrifuge
- Sorterede celler bringes op på et arbejdsvolumen, der er nemt at håndtere, på 100-200 μL. Tag i betragtning, at celletætheden vil afhænge af det sorterede befolkningsudbytte i hvert enkelt tilfælde.
- Placer en ren rutsjebane på metalholderen, og placer en filterplade. Husk at mærke diaset og filteret for at undgå at blande prøver.
- Der tilsættes 100 μL PBS på filterhullet mod rutsjebanen, så filteret bliver befugtet på hulkanten.
- Placer tragten, luk metalholderen og læg den på sin plads i centrifuge.
- Prøven (100-200 μL) tilsættes inde i tragten.
- Centrifuge ved 36 x g i 5 minutter. Cytospin-rutsjebanerne kan få lov til at lufttørre ved RT (korrekt dækket for at forhindre støv) og kan opbevares på RT i 1 uge før immunostaining eller histochemistry.
- Til immunostaining
- Fastgør dias i 2% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS og inkuber i løbet af 5 minutter.
- Der kan anvendes et interval på 0,5-4% PFA i PBS. I vores hænder bruger vi 4% til at opnå korrekt fiksering af væv eller nogle celletyper, og 0,5% PFA i PBS er tilstrækkelig til blodplader. Når denne teknik indstilles, kræver den rigtige procentdel af PFA optimering pr. celletype/kilde.
- Inkuber 5 min i PBS.
- Inkuber 5 min i 50% ethanol (EtOH).
- Inkuber 5 min i 70% EtOH.
- Opbevares i 70% EtOH ved -20ºC.
- Når immunostaining udføres, rehydreres og følges standardprocedurer (gennemtrængning, vask, blokering, primære og sekundære antistofinkubationer, konservering osv.).
- Fastgør dias i 2% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS og inkuber i løbet af 5 minutter.
- For cytokemi:
BEMÆRK: Rutsjebanerne kan farves med May-Grünwald Giemsa farvning eller bekvem farvning til hvert formål. - Til øjeblikkelig morfologiundersøgelse
- Tilføj en dråbe monteringsmedium på den celleholdige plet af cytospinen, og placer en coverlip.
- Hold dias ved 4 °C ikke længere end en uge, medmindre forseglet, hvilket giver mulighed for langtidsopbevaring selv ved RT. Montering medium fiksering giver mulighed for langsigtet opbevaring på RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Knoglemarv og ploidy
I figur 4viservi en repræsentativ immunophenotypinganalyse af megakaryopoiesis i BM-prøver (aspiration) fra patienter. Når vi planlægger den cellulære fraktion mod CD71 og CD31, har vi gated seks hovedpopulationer: CD31- CD71- (rød), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71midt (lysegrøn), CD31+ CD71+ (mørkegrøn) og CD31++ CD71midt (creme). Disse populationer er ikke altid til stede i de samme positioner (under hensyntagen til konstante cytometerindstillinger), som det kan ses, og det bør tages i betragtning. Dette kan være forbundet med den patologiske tilstand og knoglemarvsstatus. Back-gating disse seks populationer overlejret i histogrammer mod en modning markør indeholdt i panelet (CD42A/CD42B), og til Forward Scatter, er vist til højre. Figuren viser også et plot mod CD31/CD71, der viser et overlejring af CD42B+ celler med den samlede cellulære fraktion for at visualisere fordelingen af de mere modne MKs. Generelt indeholder populationen CD31- CD71- ikke MKs eller afstamningsprækursorer, præsenterer ikke MK-modningsmarkører og er mindre i størrelse. CD31- CD71+ populationen indeholder hovedsageligt celler af erythroid afstamning, selv om det også kan indeholde fælles afstamning prækursorer, som vi hypotese fra vores observationer. Det forbliver negativt for MK-modningsmarkører, og afhængigt af andelen af tidligere eller senere erythroidceller kan den forreste scatter også svinge.
Som et eksempel har myelodysplastisk syndrom (MDS) patient en større andel af umodne (dvs.større) erythroidceller sammenlignet med andre patienter. MK stamfadere og modne celler vil distribuere i CD31+ celler, med en vis variation. Men som det kan ses at sammenligne BM-analysen på hver patologi, er der nogle konstante træk. Mere modne MKs er til stede i CD31++ CD71mid population (creme), og patologier, hvor denne modning er "blokeret" omfatter Immune Thrombocytopenia (ITP) og en reaktiv BM prøve (med underliggende inflammation). Mens der i lymfom patienten synes der at være en balance mellem tidlige prækursorer og sene MKs (orange og fløde porte), denne andel er ændret i MDS patienten (med mere "blokeret" prækursorer) og i akut myeloid leukæmi (AML) patient (med mere modne MKs). Af interesse synes "blokaden" at være anderledes at sammenligne patologier indbyrdes: i patologier, der er i enige med underliggende betændelse, kan blokaden skyldes en kombination af modningsfejl, ødelæggelse (dvs.autoimmunitet) og blodpladeproduktion af MK-brud.
Figur 4:Immunophenotyìng af megakaryopoiesis i humane knoglemarvsprøver fra patienter med forskellige patologier. Repræsentative knoglemarvsprøver (BM) fra patienter diagnosticeret med lymfom (dvs.normal BM), myelodysplastisk syndrom (MDS), akut myeloid leukæmi (AML), immuntrombocytopeni (ITP) og en patient med en reaktiv BM på grund af en infektion blev analyseret. Når vi plotter den cellulære fraktion (dvs.nukleerede celler) mod CD71 og CD31, har vi gated seks hovedpopulationer: CD31- CD71- (rød), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71midt (lysegrøn), CD31+ CD71+ (mørkegrøn) og CD31++ CD71midt (creme). Disse populationer er ikke altid til stede i de samme positioner (under hensyntagen til stabile cytometerindstillinger), som det kan ses, og det bør tages i betragtning. Back-gating disse seks populationer overlejret i histogrammer mod en modning markør indeholdt i panelet (CD42A/CD42B), og til Forward Scatter, er vist til højre. Figuren viser også et plot mod CD31/CD71, der viser en overlejring af CD42B+ celler med den samlede cellulære fraktion for at visualisere fordelingen af de mere modne MKs. Tal, der matcher portene i prikplottet, og histogrammets overlejringer er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi satte os derefter for at analysere ploidy status for de ovennævnte populationer på menneskelige BM prøver. Figur 5 viser en stigende ploidy status inden for CD31+ populationer, som vi forudser vil være forskellige og karakteristiske for hver patologisk sammenhæng. Bemærk, at på grund af den cellefiksering og gennemtrængning, der anvendes i disse forsøg, er prikplotterne ikke helt sammenlignelige med dem, der findes i ikke-fastgjorte, ikke-gennemregnede prøver (Figur 4).
Figur 5: Ploidy analyse af de udvalgte populationer baseret på CD31/CD71 udtryk, i humane BM prøver. Repræsentativ knoglemarv (BM) prøver fra patienter diagnosticeret med akut myeloid leukæmi (AML) og immun trombocytopeni (ITP). Når vi plotter den cellulære fraktion (dvs.nukleerede celler) mod CD71 og CD31, har vi gated seks hovedpopulationer: CD31- CD71- (rød), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71midt (lysegrøn), CD31+ CD71+ (mørkegrøn) og CD31++ CD71midt (creme). Disse populationer er ikke altid til stede i de samme positioner (under hensyntagen til stabile cytometerindstillinger), som det kan ses, og det bør tages i betragtning. Back-gating disse seks populationer overlejret i histogrammer mod Hoechst 33342 viser de forskellige ploidy status af befolkningen, og den generelle tendens til at øge ploidy med modning (selv om MKs kan nå modenhed uafhængigt af polyploidization status). Tal, der matcher portene i prikplottet, og histogrammets overlejringer er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
PBMCs og cellekultur
I figur 6viser vi en repræsentativ immunophenotypinganalyse af PBMCs og MK-kulturen, der er indstillet med disse PBMCs på dag 7 og dag 11. Vi bruger et panel, der indeholder Lin cocktail, og vi viser den cellulære brøkdel af levende celler før og efter Lin- udvælgelse. Denne negative udvælgelse kan resultere i tab af en brøkdel af MKs co-udtrykke, for eksempel, CD14, men det giver også en mere raffineret analyse. Når vi plotter Lin- fraktion mod CD71 og CD31, gated vi fem hovedpopulationer: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71midt og CD31++ CD71midt. Disse populationer er ikke altid til stede i de samme positioner (under hensyntagen til konstante cytometerindstillinger), som det kan ses, og det bør tages i betragtning. I dette tilfælde er forskellene ikke kun uløseligt forbundet med den individuelle sundheds- eller patologiske status, men også med prækursorernes differentieringskapacitet i MK i PBMC-fraktionen. Back-gating disse fem populationer overlejret i histogrammer mod andre markører, der er indeholdt i panelet (KIT og CD42B), og til Forward Scatter, er vist til højre. MK-prækursorer og MKs på forskellige modningsstadier er inden for CD31+ populationerne.
Figur 6: Immunophenotyping af megakaryopoiesis under MK cellekultur, herunder start PBMC materiale. Repræsentativ immunophenotyping analyse af PBMCs og MK kultur, der med disse PBMCs på dag 7 og dag 11. Vi bruger et panel, der indeholder Lin cocktail, og vi viser den cellulære fraktion(dvs.nukleerede celler) før og efter Lin-udvælgelse. Denne negative udvælgelse kan resultere i tab af en brøkdel af MKs co-udtrykke, for eksempel, CD14, men det giver også en mere raffineret analyse. Når vi plottede Lin-fraktionen mod CD71 og CD31, gated vi fem hovedpopulationer: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid og CD31++ CD71mid. Disse populationer er ikke altid til stede i de samme positioner (under hensyntagen til stabile cytometerindstillinger), som det kan ses, og det bør tages i betragtning. Back-gating disse fem populationer overlejret i histogrammer mod andre markører, der er indeholdt i panelet (KIT og CD42B), og til Forward Scatter, er vist til højre. MK-prækursorer og MKs på forskellige modningsstadier er inden for CD31+ populationerne. Figuren viser også et plot mod CD31/CD71, der viser en overlejring af CD42B+ celler med den samlede cellulære fraktion for at visualisere fordelingen af de mere modne MKs. Tal, der matcher portene i prikplottet, og histogrammets overlejringer er afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 3: Befolkningsprocenter for flowcytometrianalyser Klik her for at downloade denne tabel.
I PBMCs, er MKs inden for CD31++ CD71midten gate, selv om deres størrelse ikke er så stor, som vi har set med kulturperler MKs. Dette kan skyldes enten en af følgende to muligheder: MKs i PBMCs repræsenterer en brøkdel af umodne MKs, der kommer ind i omløb, eller en brøkdel af modne cirkulerende MKs, der har mistet cytoplasmisk kompleksitet. Vores slags eksperimenter tyder på, at sidstnævnte kan være årsagen til at forklare denne størrelsesforskel. Til støtte for dette begreb er udtrykket af CD42B ikke til stede i 100% af cellerne på disse populationer (som det også kan ses i BM-prøver i figur 4), sandsynligvis på grund af tab af overflademarkører ved proplateletdannelse og / eller blodpladeafgivelse. Men i kultiverede prøver, MKs i "modne" porte, er næsten 100% CD42B+, og større i størrelse. Disse hypotese cellulære dynamik bør undersøges nærmere og valideres.
På grund af de pleiotropiske virkninger af TPO er disse kulturer heterogene og asynkrone, hvilket i sig selv gør det vanskeligt yderligere at analysere diskrete MK-differentieringsstadier. 19,20 Efter udvidelsen af tidligere forfædre, MKs på forskellige modning faser vil blive vist i kulturen fra dag 6-10 (eller tidligere, på grund af donor variation) og vil gradvist stige i antal som MK afstamning-forpligtede celler modnes mod MK. Nogle MKs vil gennemgå terminal differentiering og begynde at danne proplatelets. Mod slutningen af kulturen vil der ske en gradvis forøgelse af celletabet på grund af "ekstenuation/udmattelse" efter proplateletdannelse og blodpladeafgivelse eller celledød (figur 2).
Hvis der anvendes TPO-analoger i stedet for rekombinant TPO, bør koncentrationerne testes.
Kilden til forfædre (voksen, navlestrengsblod) vil betingelse kulturerne, som MKs fra kilder til forskellige udviklingsstadier har deres egne egenskaber. Desuden vil kulturer fra beriget CD34+ forfædre, mens de fremstår mere homogene i begyndelsen af kulturen, nå et stadium af heterogenitet og asynkronitet, når MK-engagement og differentiering begynder19,20.
Sortering af MK-celler
I figur 7viser vi en repræsentativ gating-strategi for en stikprøve af MK in vitro-kultur på dag 10 i differentiering. Når vi plotter den nukleerede cellefraktion mod CD31 og CD71 eller Fremad scatter, kan vi skelne mellem to hovedpopulationer, der er karakteriseret ved tilstedeværelsen eller fraværet af CD31.
Når cd31+ brøken afbildes i forhold til CD41 og CD71, vi kan gate fire vigtigste populationer: CD41- CD71- (1), CD41lav CD71+ (2), CD41lav CD71+++ (3) og CD41+++ CD71+ (4), hvor andre overflade markører (KIT og CD49B) blev udtrykt forskelligt, så identifikationen af MK rum som CD41 meget positive celler (Figur 7A). Renheden af de sorterede fraktioner er vist, samt cytologiske pletter af cytospins af de sorterede fraktioner.
For at karakterisere cellepopulationsspektret i PBMC-MK-kulturer blev viSNE-analyse anvendt (Figur 7B). ViSNE-kortet adskiller celler i rumligt adskilte delsæt baseret på kombinationen af markører, som de udtrykker. Hvert punkt i viSNE-analysen repræsenterer en individuel celle, der er farvet i henhold til udtryksniveauerne i CD31, CD42A, CD71 og KIT.
Dobbelt negative celler (CD31- og CD71-) er hovedsageligt resterende lymfocytter (befolkning 5), der fortsætter i hele kulturen under disse forhold. Denne population er sorteret i en anden cellesorteringsrunde ved hjælp af den resterende del af stikprøven.
Gates 6 og 7 er CD71mellem- og højudsigelsesceller, som omfatter erythroid stamfadere og potentielt andre prækursorer.
Vi skal tage højde for de tekniske vanskeligheder på grund af cell heterogen karakter af denne kultur metode og den klæbrige karakter af modne MKs, der resulterer i tilstedeværelsen af modne MKs i delpopulationer, hvor de ikke hører hjemme (se bemærkninger afsnit).
Figur 7:Præsorterings immunophenotypisk analyse af 10-dages in vitro-kultur MKs. A) Repræsentativ gating strategi ved hjælp af CD31, CD41 og CD71, med to sorteringsrunder, hvilket resulterer i CD31+ populationer 1-4 og CD31- populationer 5-7. Renheden af hver sorteret fraktion blev analyseret efter sortering og afbildes sammen med et repræsentativt mikrofotobillede af farvede cytospiner fra hver sorteret fraktion. B) viSNE kort over dag 10 PBMC-afledte MK-kulturceller målt ved flowcytometry. Kortet er bygget ved hjælp af udtryksniveauerne cd31, CD42B, CD71 og KIT, målt ved flowcytometry. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efterbehandling efter sortering
De sorterede populationer kan analyseres ved forskellige metoder, herunder cytologiske og molekylære analyser ved immunfluorescens (se afsnit 7) for at evaluere MK-funktionerne i en specifik fysio-patologisk kontekst eller for bedre at studere processen med megakaryopoiesis. Nogle eksempler er vist i figur 8.
Figur 8. Post-sort MK analyse. A) Cytologisk analyse af sorteret MK rum fra en 10-dages in vitro kultur. May-Grünwald Giemsa farvning gør det muligt at observere centrale træk ved modne MKs, dvspseudopod dannelse (rød pil), meget polyploid MK (blå pil). B) Immunfluorescensanalyse. Celler blev plettet med anti-human von Willebrand faktor (vist i rødt, sekundært antistof Alexa Fluor 555 Goat anti-mouse IgG), anti-human CD31 eller tandem CD41/CD61, begge konjugeret med FITC (vist med grønt) og nukleart DNA var mærket med DAPI (vist med blåt). Klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærkninger:
MKs kan sorteres fra uventede områder på grund af evnen til at fastgøre celler til deres membran (Figur 9). Dette problem kan være et problem at få høj renhed celle subpopulationer. For at minimere cellecelleaggregater kan der føjes 1-5 mM EDTA til panelblandingsbufferne.
Desuden foreslog vi, når vi brugte WB som udgangsmateriale, enten at få PBMCs eller lysing RBCs til at bruge den cellulære fraktion direkte. I figur 10 viser vi flowcytometrianalyse af de to metoder. På den ene side, når vi lyser RBC'er og analyserer hele cellulærrummet, har vi stadig en stor mængde neutrofiler. Disse kan filtreres ud med en bestemt markør (eller ved hjælp af Lin cocktail strategi). Vi kan dog miste nogle MKs på grund af deres promiskuøse karakter relateret til overflademarkørudtryk. På den anden side vil PBMC isolation give os mulighed for at slippe af med neutrofiler samt RBCs, selvom vi kan miste MKs med højere tæthed(dvs.dem med mere komplekse cytoplasmiske træk eller mere umodne). Som vist i figur 10viser MKs fra lysed WB et højere udtryk for modningsmarkører, som vises lavere ved isolering af PBMCs. Massefyldegradienten kan resultere i tab af MKs, der stadig indeholder et komplekst cytoplasma, mens dem, der er indeholdt i PBMC-fraktionen, måske allerede er "udmattede" i omløb efter frigivelse af blodplader og dermed opretholder polyploidekernen inden for et mindre komplekst cytoplasma. De bør ikke forveksles med umodne MKs. Hver procedure har sine fordele og ulemper.
Figur 9. Den klæbrige karakter af MKs. MKs kan findes i uventede porte på grund af deres evne til at fastgøre celler til deres membran. A-C) MKs sorteret i populationer 1 (B) og 5 (A og C), i henhold til gating strategi for MK sortering. Dette problem kan være et problem at få høj renhed celle subpopulationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. Flow cytometri immunophenotyping af MKs fra PBMCs eller WB efter lysing RBCs. A) Gating strategi. B) Størrelse (FSC), cellulær kompleksitet (SSC) og udtryk for CD42A, CD41, CD71 og KIT i MKs som identificeret i PBMCs eller WB. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det meste af forskningen med fokus på studiet af megakaryopoiesis ved flowcytometri er til dato begrænset til identifikation af MK-delsæt, der kun bruger afstamningsspecifikke overflademarkører (dvs.CD42A/CD42B, CD41/CD61), mens tidligere MK-differentieringsstadier er blevet dårligt undersøgt. I denne artikel viser vi en immunophenotyping strategi for at løse en omfattende flow cytometri karakterisering af menneskelige megakaryopoiesis. Samlet set vil vi gerne fremhæve nytten af at kombinere MK specifikke og ikke-specifikke overflademarkører (tabel 1 og 2) i samme flow cytometri antistof panel til undersøgelse af megakaryopoiesis på en mere detaljeret måde. Vores nye tilgang kan tjene som et effektivt redskab til at hjælpe diagnose og / eller prognose i hæmatologiske lidelser. Vi mener ikke, at de præsenterede paneler og kombinationer er endelige. Vi har observeret en meget dynamisk opførsel af overflademarkører i menneskelige primære kilder (hovedsageligt i BM-prøver), som også er afhængig af den subjacent patologi. Flere undersøgelser er påkrævet, og forhåbentlig vil det videnskabelige samfund begynde at anvende denne tilgang til feedback med observationer fra undersøgelser med fokus på en enkelt patologi, og hvordan megakaryopoiesis iscenesættelse kan støtte ved diagnose eller prognose. Implementeringen af kombineret HSC- og MK-karakterisering i primært væv i betragtning af de forskellige veje for MK-engagement som kommenteret i introduktionsafsnittet er relevant og værd for yderligere udvikling. Det faktum, at vi også er i stand til at opdage MKs i PBMCs er noget af en observation. Vi har også hypotese, at analysen af MKs i denne primære kilde vil støtte i sygdom diagnose og prognose, som et meget relevant alternativ til BM aspirater, da ekstraktion af en blodprøve ikke er så invasiv. Dette aspekt kræver også udvikling.
På trods af de tekniske begrænsninger forbundet med de biologiske egenskaber ved MKs (stor størrelse, osmotisk skrøbelighed, klæbrighed) var vi i stand til at sortere forskellige modningsstadier i flere menneskelige MK-kilder, specifikt i BM, PBMCs og PBMCs-afledte cellekulturer. Fremtidige undersøgelser vil blive udført for at analysere de særlige forhold i megakaryopoiesis i andre menneskelige kilder såsom navlestrengsblod og i forskellige fysio-patologiske situationer. Desuden bør differentieringspotentialet for hver indhegnet og sorteret cellefraktion evalueres i kolonidannende enhedsanalyser (CFU) af MK-forfædre (CFU-MK) med henblik på objektivt at vurdere hver befolknings differentieringspotentiale i megakaryopoiesis-rejsen. Mens overgår de tekniske begrænsninger, der engang blev anset for at hindre den slags modne megakaryocytter, kræver en sådan nødvendighed stadig mere perfektion. På den ene side ville omik med en enkelt celle tillade omfattende undersøgelser, når de anvender immunophenotypingpanelerne, men hvis fysisk sortering er påkrævet, på trods af renheden af de sorterede populationer er over 85% (baseret på overflademarkørudtryk), skal der tages hensyn til andre variabler, som stadig er vanskelige at løse. Som nævnt er MK-kulturer ikke synkrone og er meget heterogene. MKs selv er promiskuøs i overfladen markør udtryk, deling markører med andre myeloide og ikke-myeloid hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske celler. Desuden er de meget vanskelige at gruppere med de morfometriske variabler (Forward og Side Scatter), da de distribuerer bredt. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forfine denne ansøgning, men med en samarbejdsindsats er vi tættere på at indsnævre megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Audiovisuel materialeproduktion blev støttet af BD Biosciences.
Acknowledgments
Vi takker Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo og Begoña García Méndez (HUCA) og Paloma Cerezo, Almudena Payero og María de la Poveda-Colomo (HCSC) for teknisk support. Dette arbejde blev delvist støttet af Medical Grants (Roche SP200221001) til A.B., et RYC-stipendium (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) og et I+D 2017-tilskud (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien og Fondos FEDER) til L.G., et Severo Ochoa-tilskud (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanien) til P.M.-B. og et intramuralt postdoc-tilskud 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Spanien) til A.A.-H. Vi takker Reinier van der Linden for at dele sin viden (og tid), især hans kloge råd om multi-farve mærkede-antistof panel mix og enkelt-farve perle kontrol forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
