Summary
Her presenterer vi en immunofenotypingsstrategi for karakterisering av megakaryocyttdifferensiering, og viser hvordan denne strategien tillater sortering av megakaryocytter på forskjellige stadier med en fluorescensaktivert cellesortering. Metodikken kan brukes på humant primærvev, men også på megakaryocytter generert i kultur in vitro.
Abstract
Megakaryocytt (MK) differensiering omfatter en rekke endomitotiske sykluser som resulterer i en svært polyploid (når enda >64N) og ekstremt stor celle (40-60 μm). I motsetning til den raskt økende kunnskapen i megakaryopoiesis på cellebiologi og molekylært nivå, er karakteriseringen av megakaryopoiesis ved strømningscytometri begrenset til identifisering av modne MKs ved hjelp av avstamningsspesifikke overflatemarkører, mens tidligere MK-differensieringsstadier forblir uutforskede. Her presenterer vi en immunofenotypingsstrategi som gjør det mulig å identifisere påfølgende MK-differensieringsstadier, med økende ploidystatus, i menneskelige primære kilder eller in vitro-kulturer med et panel som integrerer MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører. Til tross for størrelsen og skjørheten kan MKs immunofenotypes ved hjelp av det ovennevnte panelet og berikes av fluorescensaktivert cellesortering under bestemte forhold med trykk- og dysediameter. Denne tilnærmingen letter multi-Omics studier, med sikte på å bedre forstå kompleksiteten i megakaryopoiesis og blodplateproduksjon hos mennesker. En bedre karakterisering av megakaryopoiesis kan utgjøre grunnleggende i diagnosen eller prognosen for avstamningsrelaterte patologier og malignitet.
Introduction
Megakaryocytter (MKs) utvikler seg fra hematopoietiske stamceller (HSC) etter en kompleks prosess kalt megakaryopoiesis, som er orkestrert hovedsakelig av hormonet trombopoietin (TPO). Den klassiske utsikten over megakaryopoiesis beskriver den cellulære reisen fra HSC gjennom en rekke hierarkiske stadier av engasjerte forfedre og forløperceller, noe som til slutt fører til en moden MK. Under modning opplever MKs flere runder med endomitose, utvikler et intrikat intracellulært avgrensningsmembransystem (DMS), som gir nok membranoverflate til blodplateproduksjon, og produserer og pakker effektivt mengden faktorer som finnes i de forskjellige granulatene arvet av modne blodplater1,2,3. Som et resultat er modne MKs store celler (40-60 μm) preget av en svært polyploid kjerne (når enda >64N). Nyere studier antyder alternative ruter der HSC skiller seg ut i MK-er som omgår tradisjonelle avstamningsforpliktelseskontroller som svar på visse fysio-patologiske forhold4,5,6,7,8,9,10,11. Disse funnene fremhever at hematopoietisk differensiering mot den modne MK er en kontinuums- og adaptiv prosess som responderer på biologiske behov.
Med den økende kunnskapen om cellebiologien og de molekylære aspektene som karakteriserer megakaryopoiesis12, er det meste av forskningen dedikert til studiet av prosessen ved flowcytometri begrenset til identifisering av modne MKs ved hjelp av avstamningsspesifikke overflatemarkører (dvs. CD42A / B, CD41 / CD61), mens tidligere MK-differensieringsstadier forblir uutforskede. Vi har tidligere dokumentert en strategi for å iscenesette megakaryopoiesis i musebenmarg og benmargsavledede MK-kulturer13,14, som vi har tilpasset og brukt på mennesker15. I den nåværende artikkelen viser vi en immunofenotypingsstrategi som gjør det mulig å karakterisere megakaryopoiesis, fra HSC-er til modne MKs, i menneskelige primære kilder (benmarg -BM- og perifert blod -PB-) eller in vitrokulturer ved hjelp av et panel som integrerer MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT og CD71, blant andre). Til tross for sin store størrelse og skjørhet, kan MKs immunofenotypes ved hjelp av ovennevnte celleoverflatemarkører og berikes av fluorescensaktivert cellesortering under bestemte forhold med trykk- og dysediameter for å minimere cellebrudd og / eller skade. Denne teknikken letter multi-Omics tilnærminger, med sikte på å bedre forstå kompleksiteten av megakaryopoiesis og blodplateproduksjon i menneskers helse og sykdom. Bemerkelsesverdig vil det utgjøre et nyttig verktøy for å hjelpe diagnose og prognose i en klinisk sammenheng med økende etterspørsel.
I dette manuskriptet dokumenterer vi en strategi for å iscenesette menneskelige megakaryopoiesis med et panel som integrerer MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører fra primære kilder eller generert in vitro. I tillegg tilbyr vi en protokoll for sortering, med en fluorescensaktivert cellesortering, de foretrukne fraksjonene og modne MK-er (figur 1). Dette trinnet er ikke populært, da det er teknisk vanskelig på grunn av den store størrelsen og skjørheten til MKs. Imidlertid har den blitt brukt både i muse- og menneskelige benmargsprøver tidligere, og på grunn av teknologisk fremgang, med et bedre resultat hver gang16,17,18. Menneskelige primærkilder der MKs eller MK forløpere kan studeres inkluderer blant annet benmarg, ledningsblod og perifert blod. Riktig prøvebehandling for å isolere den relevante cellefraksjonen for analyse på hvert utvalg er viktig. Standardprosedyrer er innlemmet, med noen hensyn å ta når man tar sikte på studiet av megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele blod- og benmargsprøver ble innhentet og behandlet i samsvar med Helsinkideklarasjonen i 1964. Hele blodprøver ble innhentet fra friske givere etter å ha gitt informert samtykke (ISPA), i en studie godkjent av vår institusjonelle medisinske etiske komité (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Benmargsprøver ble hentet fra benmarg aspirert kasseringsmateriale av pasienter som ble administrert ved hematologiens avdeling ved Hospital Clínico San Carlos (HCSC).
Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollen som er dokumentert i dette manuskriptet. De primære menneskelige kildene eller primærkulturene der MK-differensiering kan iscenesettes ved hjelp av immunofenotyping er indikert. Denne immunofenotypingsstrategien kan brukes på studiet av prosessen i forskjellige avledningsrelaterte patologier eller malignitet i primære kilder. I tillegg gjør det mulig cellesortering av MKs og forløpere med en fluorescensaktivert cellesortering, noe som tillater videre analyse av berikede fraksjoner. Bilder som brukes er en del av Servier Medical Art (SMART) av Servier og er lisensiert under CC BY 3.0. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Behandling av fullblod og benmarg før immunofenotyping
- Når du bruker fullblod (WB) fra donasjoner som primærkilde, må du eventuelt isolere den perifere blodmonykleære cellekomponenten (PBMC). Dette kan oppnås ved å bruke standard differensial sentrifugering kombinert med tetthet gradient celle separasjon, som tidligere beskrevet15.
- Kort sagt, sentrifuger blod ved 193 x g i 15 min (brems 3) ved romtemperatur. Kast den øvre plasmafraksjonen og samle opp buffyringen. Fortynn 1:1 med fosfatbuffersallin (PBS)/Trisodium Citrate Dihydrate (38 g/L, pH 7) buffer og pipette forsiktig et volum på 25 ml på toppen av 15 ml tetthetsgradientløsning (1,076 g/ml) i 50 ml rør.
- Sentrifuge i 20 min ved 1114 x g (akselerator 3, bremse 3, romtemperatur). Kast plasmafraksjonen og samle opp buffyringen som inneholder PBMCer. Vask ved å legge til samme volum PBS, sentrifuge ved 435 x g i 5 minutter, og resuspend i PBS for videre bruk.
- Alternativt kan du bruke en WB-prøve (rundt 100 μL) for immunofenotyping etter å ha lyset de røde blodcellene (RBC) og grundig vasking.
- Kort sagt, fortynn 1:1 i iskald RBC lysing buffer (4,15 g NH4Cl, 0,5 g KHCO3 og 18,5 mg EDTA (triplex III) til 500 ml H2O, pH 7,1-7,4). Vent til celleopphenget blir gjennomsiktig rødt (3-5 min).
- Sentrifuge ved 435 x g i 5 min, ved 4 °C, og resuspender cellene i PBS. Gjenta prosedyren så mange ganger som nødvendig for å få en hvit cellepellet.
- På samme måte behandler du prøvene som er hentet fra benmarg (aspirasjon) direkte med RBC lysingbuffer (se punkt 1.2) og grundig vasking, for å begynne med en klar encellet suspensjon (Figur 1).
- Unngå bruk av virveling for å blande prøver under behandling, da det kan skade de skjøre MK-ene. Bland ved å flikke eller invertere røret.
MERK: Tetthetsgradient for å oppnå PBMCer kan resultere i en rikere og renere cellefraksjon sammenlignet med RBC-lysed WB. Vi bør imidlertid huske på at høy tetthet, modne MKs kan gå tapt i "nøytrofil" fraksjonen. Dette vil bli diskutert i de representative resultatene.
- Unngå bruk av virveling for å blande prøver under behandling, da det kan skade de skjøre MK-ene. Bland ved å flikke eller invertere røret.
2. In vitro MK differensiering fra PBMCs
MERK: MKs kan differensieres in vitro fra tidligere forløpere, for eksempel CD34+ celler, som finnes i forskjellige primære kilder (dvs. WB / PBMCer, ledningsblod, benmarg) og fra iPSCer. Det finnes forskjellige protokoller som er brukt på denne enden. Her bruker vi en kulturmetode utviklet av oss som tillater MK-differensiering fra PBMCer, uten behov for berikelse for CD34+ forløpere15,19,20,21,22.
- Denne protokollen består av tre kulturfaser, hvor konsentrasjonen av trombopoietin (TPO) gradvis øker på bekostning av vekstfaktorer som favoriserer spredning av tidligere forløpere (dvs., SCF, EPO), som gradvis reduseres (Figur 2)15.
- For basismediet, bruk StemSpan SFEM supplert med 0,4% kolesterolrik lipidblanding og 1% Penicillin / Streptomycin.
- For fase I-mediet bruker du basismediet supplert med SCF (100 ng/ml), Erythropoietin (EPO, 0,5 U/ml) og Trombopoietin (TPO, 30 ng/ml). Fase II-mediet er basismediet supplert med SCF (50 ng/ml), EPO (0,25 U/ml) og TPO (50 ng/ml). For fase III-mediet bruker du basismediet supplert med TPO (100 ng/ml).
- Kultur PBMCs i fase I medium. På dag 6-8 plasserer du PBMCene i fase II-mediet, og på dag 9-12 plasserer du PBMCene i fase III-mediet.
- Bytt medium med sentrifugeringsceller på 435 x g i 5 minutter ved romtemperatur fra fase I til fase II, og ved 95 x g i 5 minutter ved romtemperatur fra fase II til fase III, og resuspending dem i friskt medium.
- Kulturceller i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2. I disse primærkulturene varer MK-differensiering 10-14 dager, og prøver kan tegnes på forskjellige tidspunkter gjennom kulturperioden, for å følge MK-differensiering.
- For basismediet, bruk StemSpan SFEM supplert med 0,4% kolesterolrik lipidblanding og 1% Penicillin / Streptomycin.
Figur 2: Skjematisk representasjon av den PBMC-avledede MK-kulturmetoden. PBMCer fra friske givere ble dyrket i henhold til trefaseprotokollen utviklet av oss for å generere MK in vitro (ordning tilpasset fra Salunkhe et al). 15 Bilder tatt på dag 10 og dag 13 av kulturen vises. Bilder er tatt med et 20X mål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Eksempelsamling: Vask celler ved å bruke lavhastighets sentrifugering i 5 min (95 x g) og resuspend dem i PBS eller PBS som inneholder 1% av bovint serumalbumin (BSA). For immunofenotyping er den ideelle tettheten 105-106 celler / 100 μL (se punkt 3.1). Avhengig av kulturens status(dvs. tilstedeværelse av døde celler, rusk, etc.), kan det være nødvendig med 1 eller 2 vasker. Samle cellene dine på tidspunktene av interesse under kulturen.
3. Immunofenotyping av MK differensiering - inkubasjon med et panel av tagged-antistoffer
- Inkuber celleprøvene med et panel av taggede antistoffer etter standardprosedyrer, og vær oppmerksom på sentrifuger ved lav hastighet (95 x g) ved behandling av megakaryocytter. Vi inkuberer normalt prøvene med 1% BSA i PBS i volumer på 100 μL ved 4 °C, 20 min, med et område på 105-106 celler.
- Skaler opp når det er nødvendig.
- Etter inkubasjon, tilsett 5 ml 1% BSA i PBS, sentrifuger ved lav hastighet (95 x g), aspirer supernatanten og resuspend prøven i 2% BSA i PBS for å bevare MK levedyktighet (2 ml). Tilsett 1-5 mM EDTA for å forstyrre cellecellemengder (som naturlig ses i MK-kulturer).
- Overfør prøver til et 12 x 75 mm rundt bunnrør (FACS-rør) eller plate, og hold dem i mørket til strømningscytometrianalyse eller cellesortering.
- Fremstilling av de enkle antistoffene og antistoffpanelet blander seg; sette opp strømningscytometeret:
- Titrat antistoffene før bruk for å bestemme den optimale konsentrasjonen i antistoffpanelene. Den optimale konsentrasjonen av antistoffer er den laveste konsentrasjonen som skiller klart positiv fra negative celler (og tillater distinksjon av mellomliggende uttrykksnivåer). Som et eksempel brukes de fleste antistoffene i en 1:200 fortynning (lager 100 μg / ml) med mindre annet er titrert eller indikert av produsenten.
- Når antistofftitreringen er bestemt, lag en 10x fortynning av hvert antistoff. Disse fortynningene brukes til enkeltfargekontrollene og for å forberede panelblandingene. Fortynningene og panelblandingene er fine for bruk selv en måned etter tilberedning (lagret ved 4 °C, med mindre produsentens indikasjoner utelukker disse lagringsforholdene). Dette gjør det mulig å fargelegge prøver med samme panel gjennom en tidsperiode.
- Bruk 10 μL per 100 μL av 10x fortynning både for enkeltfargekontrollene og for panelblandingen.
- For enkeltfargekontrollene, bruk antistoff affinitet perler, som kan måles direkte etter tilsetning av antistoffet. Enkeltfargekontrollene bør måles for hvert eksperiment, for å tillate riktig kompensasjonsjustering (og finjustering etter måling med analyseprogramvaren).
- Du kan også utføre kontrollene med én farge med celleeksempler. Perlene tillater imidlertid rask måling av et gitt antall hendelser, som, avhengig av antistoffet / overflatemarkøren, kanskje ikke er mulig å oppnå på komplekse primære eller kultiverte cellekilder. Vi anbefaler også å kjøre celleprøver farget med "Fluorescence Minus One" (FMO) panelblandinger for å sette opp de riktige kompensasjonsinnstillingene (før du kjører eksperimenter). Dette er relevant for å nøye identifisere kompensasjonsproblemer, og spesielt i dyrkede MKs, for å identifisere autofluorescence interferens (som vil være til stede hvis du bruker kulturmedium som inneholder fenolrød).
- Forbered nok volum av panelblandingen, avhengig av antall prøver, som inneholder antistoffene til det designede panelet. De fleste av panelene våre har seks antistoffer (6-fargers paneler, se tabell 1-2).
- For disse panelene bruker du 488 nm og 633 nm lasere av strømningscytometeret, men paneler kan tilpasses andre tekniske scenarier. Videre kan kompensasjonshensynene motvirkes ved bruk av massespektrometribasert strømningscytometri eller cytometere med akustisk fokuseringsteknologi.
- Fargestoffer for måling av levedyktighet kan gi falsk informasjon om MKs, spesielt når de modnes. MKs er veldig aktive uptaking celler, og positivitet med Hoechst, 7-AAD eller PE, kanskje ikke alltid reflektere faktisk celledød. Et alternativ (hvis måling av celledød er nødvendig) kan være bruk av mitokondrier flekker (CMX Ros) eller amin reaktive fargestoffer (Zombie eller Ghost fargestoffer).
Tabell 1: Merknader om celleoverflatemarkører for megakaryocytisk avledning Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Antistoffpaneler Klikk her for å laste ned denne tabellen.
4. Ploidy analyse kombinert med 6-fargers paneler
- For ploidy analyse, i kombinasjon med et 6-fargers antistoffpanel, fortsett med fiksering og permeabilisering av celler etter inkubasjon med antistoffpanelet. Denne strategien vil tillate bevaring av overflatemarkøren farging, samtidig som farging av DNA av celler. Vi bruker Hoechst 33342 til å flekke DNA, da det kan visualiseres med den tilgjengelige fiolette 405-nm laseren.
- For 105-106 celler, etter inkubasjon med antistoffpanelet, sentrifugeceller (95 x g i 5 min), resuspend i 200 μL fikseringsbuffer og inkubere 10 min ved romtemperatur (RT).
- Sentrifugeceller som angitt ovenfor, resuspendert for andre gang i 200 μL fikseringsbuffer, og inkuber ytterligere 10 minutter ved RT.
- Forbered permeabiliseringsbuffer, som inneholder 0,1% Triton X-100, 200 mg / ml RNase og 20 mg / ml Hoechst 33342 (permeabilisering Hoechst MIX).
- Sentrifuger celler som ovenfor, resuspend dem i 300 μL av permeabilisering Hoechst MIX og inkubere 30 min ved 37 °C. Dette trinnet er veldig viktig, siden RNA må for å oppnå en ren ploidymåling for å få en ren ploidy-måling, degraderes.
- Etter inkubasjonstiden måler du prøver direkte med et strømningscytometer. Ellers holder du prøvene ved 4 °C, i mørket. Mål dem raskt. Men siden disse prøvene er faste, kan målingen forsinkes selv 24-48 timer. Pass på at prøven flikkes grundig før måling, eller passerer gjennom en cellesil, for å sikre en enkelt celle suspensjon.
- Morfometriske parametere som Forward og Side Scatter opprettholdes ikke etter cellefiksering. Fremover/Side-punkttegningen viser en krymping av cellefordelingen etter fiksering. Imidlertid er overflatemarkørfargingen for det meste bevart, og gatingstrategien er knapt endret, slik at analysen av ploidy-statusen på de forskjellige stadiene av differensiering definert av overflatemarkørkombinasjoner.
5. MK differensieringsanalyse
MERK: Vi har sett at kombinasjonen av CD31/CD71 gjør det mulig å stille inn en rekke porter som tilsvarer ulike stadier av MK-differensiering. Ytterligere back-gating med MK-spesifikke markører gjør det mulig å separere modne og umodne MKs. Videre, i ferske prøver, back-gating for å verifisere tilstedeværelsen av andre markører som brukes, eller å plassere populasjonene i Fremover / Side Scatter-aksene, foredler vurderingen av MK-differensieringsstadier og gjør det mulig å kaste andre celletyper som kan være til stede på samme populasjoner.
- Bruk et panel med antistoffer som inneholder tidlige forløpermarkører (KIT, CD34), vanlige forløpermarkører (CD31, CD71) og avstamningsmarkører, noen av dem spesifikke (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI osv.) (se tabell 1-2). Bruken av Lineage (Lin) cocktail (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 og CD56), gjør det også mulig å "filtrere ut" modne hematopoietiske celler som kan legge til støy i analysen (når du velger Lin- populasjonen). Som et eksempel vil vi gå gjennom analysen av MKs i PBMCs, benmarg og gjennom PBMC-avledede cellekulturer i de representative resultatene.
6. MK og MK forløper celle sortering
MERK: De fargede cellene ble analysert og sortert på en fluorescensaktivert cellesortering FACS Aria IIu utstyrt med 488-nm og 633-nm standard solid state lasere ved hjelp av FACSDiva programvare; data ble i tillegg analysert og presentert ved hjelp av FlowJo-programvare og Cytobank (viSNE-analyse). Renhet av sorterte brøker ble bekreftet ved strømningscytometrianalyse av hver av de sorterte fraksjonene (renhet over 85%).
- Utfør cellesortering så snart som mulig eller innen 1 time etter antistoffinkubasjon for å unngå celleforringelse.
- Filtrer prøven med en 100 μm cellesil for å sikre encellet suspensjon og integriteten til stor MK.
- Bruk en keramisk dyse på 130 μm, et hylsetrykk satt til 11 pund per kvadrattomme (PSI) og drop-drive-frekvensen satt til 12 kHz for å bryte strømmen i dråper.
- Før sortering, steriliser dysen, hylsen og prøvelinjene ved å utføre et 30 min oppkjøp med Penicillin / Streptomycin fortynnet 1:5 i sterilt vann, etterfulgt av et 10 min oppkjøp med sterilt vann for å fjerne gjenværende dekontaminant.
- Når strømmen har stabilisert seg, justerer du drop-forsinkelsen med anbefalte perler for å sortere i finjusteringsmodus mer enn 97,5% av de reflekterte fallene med en strømningshastighet på 400-1200 hendelser per sekund.
- Forbered oppsamlings-FACS-rør med 500 μL 2% BSA i PBS. Prosentandelen av BSA kan økes opptil 5-10%.
- Generer eksperimentmalen med de riktige kompensasjonsmatriseparameterne.
- Last FACS-røret inn i cytometeret.
- Utfør et mål for prøven for å angi ønskede porter og renhet for målcellepopulasjonene. Oppretthold posten som er aktivert for å vise opptil 200 000 hendelser i de valgte populasjonsportene under cellesorteringen.
- FACS Aria IIu tillater separasjon av opptil 4 forskjellige cellepopulasjoner samtidig. Opprett et nytt sorteringsoppsett og velg oppsamlingsenheten (4 rør) og passende presisjonsmodus (mellommaske av renhet og gjenoppretting anbefales). Til slutt legger du til populasjonen(e) av interesse for hvert sorteringsstedsfelt (Figur 3).
Figur 3: Skjematisk fremstilling av prinsippet om fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Partiklene går gjennom 130 μm-dysen og blir tvunget til å bryte opp i en strøm av vanlige dråper på grunn av påføring av vibrasjon til dysen. Deretter blir dråpene forhørt av laseren (analysepunkt) og signalene behandles for å gi ''sorteringsbeslutningen' ved å bruke en kostnad på disse dråpene. Når en ladedråpe passerer gjennom et høyspenningselektaktisk felt (deteksjonsplate), avbøyes den og samles inn i det tilsvarende oppsamlingsrøret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Last inn oppsamlingsrørene og begynn å sortere målpopulasjonene.
- Sentrifuger oppsamlingsrørene i 5 minutter ved 95 x g og resuspender cellepelleten i riktig volum 2% BSA i PBS.
- Mål igjen en brøkdel av hvert sortert utvalg for å beregne renheten.
- Lagre celler på riktig måte for videre bruk. Sorterte celler kan brukes til cytologiske og molekylære analyser, eller kan rekultureres med sikte på å studere differensieringsprosessen til en valgt cellepopulasjon.
7. Klargjøring av ettersortering av utvalg
- Forbereder cytospiner for cytologisk analyse med en cytocentrifuge
- Bring sorterte celler til et arbeidsvolum som er lett å håndtere på 100-200 μL. Ta hensyn til at celletettheten vil avhenge av den sorterte populasjonsutbyttet i hvert tilfelle.
- Sett en ren sklie på metallholderen og plasser en filterplate. Husk å merke lysbildet og filteret for å unngå blanding av prøver.
- Tilsett 100 μL PBS på filterhullet mot lysbildet, slik at filteret blir fuktet på hullkanten.
- Plasser trakten, lukk metallholderen og plasser den på stedet i sentrifugen.
- Legg til prøven (100-200 μL) inne i trakten.
- Sentrifuge ved 36 x g i 5 minutter. Cytospin lysbildene kan lufttørke ved RT (riktig dekket for å forhindre støv) og kan holdes på RT i 1 uke før immunostaining eller histokjemi.
- For immunstaining
- Fest lysbilder i 2% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS og inkuber under 5min.
- En rekkevidde på 0,5-4% PFA i PBS kan brukes. I våre hender bruker vi 4% for å oppnå riktig fiksering av vev eller noen celletyper, og 0,5% PFA i PBS er tilstrekkelig for blodplater. Når du konfigurerer denne teknikken, krever riktig prosentandel av PFA optimalisering per celletype /kilde.
- Inkuber 5 min i PBS.
- Inkuber 5 min i 50% etanol (EtOH).
- Inkuber 5 min i 70% EtOH.
- Oppbevars i 70% EtOH ved -20ºC.
- Når du utfører immunostaining, rehydrerer og følger standardprosedyrer (permeabilisering, vasking, blokkering, primære og sekundære antistoffinkubasjoner, bevaring, etc).
- Fest lysbilder i 2% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS og inkuber under 5min.
- For cytokjemi:
MERK: Skliene kan farges med May-Grünwald Giemsa-farging eller den praktiske fargingen for hvert formål. - For umiddelbar morfologiundersøkelse
- Tilsett en dråpe monteringsmedium på det celleholdige punktet på cytospinnen og legg en dekslelip.
- Hold lysbildene ved 4 °C ikke lenger enn en uke, med mindre de er forseglet, noe som gjør det mulig å lagre på lang sikt selv ved RT. Montering av middels fiksering tillater langvarig lagring hos RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benmarg og ploidy
I figur 4viservi en representativ immunofenotypingsanalyse av megakaryopoiesis i BM-prøver (aspirasjon) fra pasienter. Når vi plotter den cellulære fraksjonen mot CD71 og CD31, har vi inngjerdet seks hovedpopulasjoner: CD31- CD71- (rød), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (oransje), CD31+ CD71midt (lysegrønn), CD31+ CD71+ (mørkegrønn) og CD31++ CD71midt (krem). Disse populasjonene er ikke alltid til stede i de samme stillingene (vurderer konstante cytometerinnstillinger), som det kan ses, og det bør tas i betraktning. Dette kan være iboende for den patologiske tilstanden og benmargsstatusen. Back-gating disse seks populasjonene lagt i histogrammer mot en modningsmarkør som finnes i panelet (CD42A / CD42B), og til Forward Scatter, vises til høyre. Figuren viser også et plott mot CD31/CD71 som viser et overlegg av CD42B+ -cellene med den totale cellulære brøkdelen for å visualisere fordelingen av de mer modne MK-ene. Generelt sett inneholder populasjonen CD31- CD71- ikke MKs eller avstamningsforløpere, presenterer ikke MK modningsmarkører, og er mindre i størrelse. CD31- CD71+ befolkningen inneholder hovedsakelig celler av erythroid avstamning, selv om den også kan inneholde vanlige avstamning forløpere, som vi hypoteser fra våre observasjoner. Det forblir negativt for MK modningsmarkører, og avhengig av andelen tidligere eller senere erythroid celler, fremover scatter kan variere også.
Som et eksempel har myelodysplastisk syndrom (MDS) pasient en større andel umodne (dvs.større) erythroidceller, sammenlignet med andre pasienter. MK-forfedre og modne celler vil distribueres i CD31+ cellene, med en viss variasjon. Imidlertid, som det kan ses sammenligne BM-analysen på hver patologi, er det noen konstante funksjoner. Mer modne MKs er til stede i CD31++ CD71midtpopulasjonen (krem), og patologier der denne modningen er "blokkert" inkluderer Immun trombocytopeni (ITP) og en reaktiv BM-prøve (med underliggende betennelse). Mens det i lymfompasienten ser ut til å være en likevekt mellom tidlige forløpere og sene MKs (oransje og kremporter), endres denne andelen hos MDS-pasienten (med mer "blokkerte" forløpere) og hos den akutte myeloide leukemi (AML) pasienten (med mer modne MKs). Av interesse synes "blokaden" å være forskjellig sammenlignet med patologier blant seg selv: i patologier som er sammenfallende med underliggende betennelse, kan blokaden skyldes en kombinasjon av modningsfeil, ødeleggelse (dvs.autoimmunitet) og blodplateproduksjon ved MK-brudd.
Figur 4: Immunofenotyìng av megakaryopoiesis i humane benmargsprøver fra pasienter med forskjellige patologier. Representative benmargsprøver (BM) fra pasienter diagnostisert med lymfom (dvs., normal BM), myelodysplastisk syndrom (MDS), akutt myeloid leukemi (AML), immuntrombocytopeni (ITP) og en pasient med reaktiv BM på grunn av en infeksjon ble analysert. Når vi plotter den cellulære fraksjonen (dvs.kjerneceller) mot CD71 og CD31, har vi inngjerdet seks hovedpopulasjoner: CD31- CD71- (rød), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (oransje), CD31+ CD71midt (lysegrønn), CD31+ CD71+ (mørkegrønn) og CD31++ CD71midt (krem). Disse populasjonene er ikke alltid til stede i de samme posisjonene (vurderer stabile cytometerinnstillinger), som det kan ses, og det bør tas i betraktning. Back-gating disse seks populasjonene lagt i histogrammer mot en modningsmarkør som finnes i panelet (CD42A / CD42B), og til Forward Scatter, vises til høyre. Figuren viser også et plott mot CD31/CD71 som viser et overlegg av CD42B+ -cellene med den totale cellulære brøkdelen for å visualisere fordelingen av de mer modne MK-ene. Tall som samsvarer med portene i prikkplottet og histogramoverleggene er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vi bestemte oss deretter for å analysere ploidy-statusen til de ovennevnte populasjonene på humane BM-prøver. Figur 5 viser en økende ploidystatus innenfor CD31+ populasjoner, at vi forutser vil være forskjellige og karakteristiske for hver patologiske kontekst. Legg merke til at på grunn av cellefiksering og permeabilisering som brukes i disse eksperimentene, er prikkplottene ikke helt sammenlignbare med de uløste, unpermeabiliserte prøvene (Figur 4).
Figur 5: Ploidyanalyse av populasjonene som er valgt ut fra CD31/CD71-uttrykk, i humane BM-prøver. Representative benmargsprøver (BM) fra pasienter diagnostisert med akutt myeloid leukemi (AML) og immuntrombocytopeni (ITP). Når vi plotter den cellulære fraksjonen (dvs.kjerneceller) mot CD71 og CD31, har vi inngjerdet seks hovedpopulasjoner: CD31- CD71- (rød), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (oransje), CD31+ CD71midt (lysegrønn), CD31+ CD71+ (mørkegrønn) og CD31++ CD71midt (krem). Disse populasjonene er ikke alltid til stede i de samme posisjonene (vurderer stabile cytometerinnstillinger), som det kan ses, og det bør tas i betraktning. Back-gating disse seks populasjonene lagt i histogrammer mot Hoechst 33342 viser de forskjellige ploidy status av befolkningene, og den generelle tendensen til å øke ploidy med modning (selv om MKs kan nå modenhet uavhengig av polyploidisering status). Tall som samsvarer med portene i prikkplottet og histogramoverleggene er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
PBMCer og cellekultur
I figur 6viser vi en representativ immunofenotypingsanalyse av PBMCer og MK-kulturen som er satt med disse PBMCene på dag 7 og dag 11. Vi bruker et panel som inneholder Lin-cocktailen, og vi viser den cellulære brøkdelen av levende celler før og etter Lin- utvalg. Dette negative valget kan føre til tap av en brøkdel av MKs samtidig uttrykke, for eksempel CD14, men det tillater også en mer raffinert analyse. Når vi tegnet lin- brøk mot CD71 og CD31, har vi inngjerdet fem hovedpopulasjoner: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71midt og CD31++ CD71midt. Disse populasjonene er ikke alltid til stede i de samme stillingene (vurderer konstante cytometerinnstillinger), som det kan ses, og det bør tas i betraktning. I dette tilfellet er forskjellene ikke bare iboende i den enkelte helse eller patologisk status, men også til MK-differensieringskapasiteten til forløperne i PBMC-fraksjonen. Back-gating disse fem populasjonene lagt i histogrammer mot andre markører som finnes i panelet (KIT og CD42B), og til Forward Scatter, vises til høyre. MK forløpere og MKs på ulike stadier av modning er innenfor CD31+ populasjoner.
Figur 6: Immunofenotyping av megakaryopoiesis under MK-cellekulturen, inkludert det første PBMC-materialet. Representativ immunofenotyping analyse av PBMCs og MK kultur satt med disse PBMCs på dag 7 og dag 11. Vi bruker et panel som inneholder Lin-cocktailen, og vi viser den cellulære brøkdelen (dvs.nukleerte celler) før og etter Lin-merking. Dette negative valget kan føre til tap av en brøkdel av MKs samtidig uttrykke, for eksempel CD14, men det tillater også en mer raffinert analyse. Når vi plottet Lin-brøken mot CD71 og CD31, har vi inngjerdet fem hovedpopulasjoner: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71midt og CD31++ CD71midt. Disse populasjonene er ikke alltid til stede i de samme posisjonene (vurderer stabile cytometerinnstillinger), som det kan ses, og det bør tas i betraktning. Back-gating disse fem populasjonene lagt i histogrammer mot andre markører som finnes i panelet (KIT og CD42B), og til Forward Scatter, vises til høyre. MK forløpere og MKs på ulike stadier av modning er innenfor CD31+ populasjoner. Figuren viser også et plott mot CD31/CD71 som viser et overlegg av CD42B+ -cellene med den totale cellulære brøkdelen for å visualisere fordelingen av de mer modne MK-ene. Tall som samsvarer med portene i prikkplottet og histogramoverleggene er avbildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 3: Befolkningsprosenter for flytcytometrianalyser Klikk her for å laste ned denne tabellen.
I PBMCer er MK-er innenfor CD31++ CD71midtporten, selv om størrelsen ikke er så stor som vi har sett med kultiverte MKs. Dette kan skyldes ett av de to følgende alternativene: MK-er i PBMCer representerer en brøkdel av umodne MK-er som kommer inn i sirkulasjonen, eller en brøkdel av modne sirkulerende MKs som har mistet cytoplasmisk kompleksitet. Våre sorteringseksperimenter tyder på at sistnevnte kan være grunnen til å forklare den størrelsesforskjellen. Støtter denne forestillingen, uttrykket av CD42B, er ikke til stede i 100% av cellene på disse populasjonene (som det også kan ses i BM-prøver i figur 4), sannsynligvis på grunn av tap av overflatemarkører ved proplateletdannelse og / eller blodplateutskillelse. Men i kultiverte prøver er MK-ene i de "modne" portene nesten 100% CD42B+, og større i størrelse. Disse hypotesede cellulære dynamikkene bør studeres og valideres videre.
På grunn av de pleiotrope effektene av TPO er disse kulturene heterogene og asynkrone, noe som i seg selv gjør det vanskelig å analysere diskrete MK-differensieringsstadier ytterligere. 19,20 Etter utvidelsen av tidligere forfedre, vil MKs på forskjellige modningsstadier vises i kulturen fra dag 6-10 (eller tidligere på grunn av donorvariabilitet) og vil gradvis øke i antall etter hvert som MK-avstamningsrelaterte celler modnes mot MK. Noen MKs vil gjennomgå terminal differensiering og begynne å danne proplatelets. Mot slutten av kulturen vil det være en gradvis økning av celletap på grunn av "ekstenuasjon/ utmattelse" etter proplateletdannelse og blodplateutskillelse eller celledød (figur 2).
Ved bruk av TPO-analoger i stedet for rekombinant TPO, bør konsentrasjonene testes.
Kilden til forfedre (voksen, ledningsblod) vil kondisjonere kulturene, da MKs fra kilder til forskjellige utviklingsstadier har sine egne egenskaper. Videre vil kulturer fra beriket CD34+ forfedre, mens de virker mer homogene i begynnelsen av kulturen, nå et stadium av heterogenitet og asynkronitet når MK-engasjement og differensiering begynner19,20.
MK-cellesortering
I figur 7viser vi en representativ gatingstrategi for et utvalg av MK in vitro-kultur på dag 10 av differensiering. Når du tegner den nukleerte cellefraksjonen mot CD31 og CD71, eller Forward Scatter, kan vi skille to hovedpopulasjoner preget av tilstedeværelsen eller fraværet av CD31.
Når du tegner inn CD31+ brøken mot CD41 og CD71, vi kan gate fire hovedpopulasjoner: CD41- CD71- (1), CD41lav CD71+ (2), CD41lav CD71+++ (3) og CD41+++ CD71+ (4), der andre overflatemarkører (KIT og CD49B) ble uttrykt differensialt, slik at identifikasjonen av MK-rommet som CD41 svært positive celler (Figur 7A). Renheten av de sorterte fraksjonene er vist, samt cytostologiske flekker av cytospins av de sorterte fraksjonene.
For å karakterisere cellepopulasjonsspekteret i PBMC-MK-kulturer ble viSNE-analyse brukt (Figur 7B). viSNE-kartet deler celler inn i romlig forskjellige delsett basert på kombinasjonen av markører de uttrykker. Hvert punkt i viSNE-analysen representerer en individuell celle farget i henhold til uttrykksnivåene til CD31, CD42A, CD71 og KIT.
Doble negative celler (CD31- og CD71-) er hovedsakelig gjenværende lymfocytter (populasjon 5) som vedvarer gjennom hele kulturen under disse forholdene. Denne populasjonen er sortert i en andre runde med cellesortering ved hjelp av den gjenværende delen av utvalget.
Port 6 og 7 er CD71midt- og høy uttrykkende celler, som inkluderer erythroid forfedre og potensielt andre forløpere.
Vi må ta hensyn til de tekniske vanskelighetene på grunn av cellen heterogen natur av denne kulturmetoden og den klebrige naturen til modne MKs som resulterer i tilstedeværelse av modne MKs i subpopulations der de ikke hører hjemme (se kommentarfeltet).
Figur 7: Forhåndssorter immunofenotypisk analyse av 10-dagers in vitrokultur MKs. A) Representativ gating strategi ved hjelp av CD31, CD41 og CD71, med to sorteringsrunder, noe som resulterer i CD31+ populasjoner 1-4 og CD31- populasjoner 5-7. Renheten til hver sorterte brøkdel ble analysert etter sortering, og er avbildet sammen med en representativ mikrofotograf av fargede cytospiner fra hver sortert brøkdel. B) viSNE-kart over dag 10 PBMC-avledede MK-kulturceller målt ved strømningscytometri. Kartet er bygget ved hjelp av uttrykksnivåene til CD31, CD42B, CD71 og KIT, målt ved strømningscytometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ettersorteringsbehandling
De sorterte populasjonene kan analyseres ved ulike metoder, inkludert cytologisk og molekylær analyse ved immunfluorescens (se avsnitt 7) for å evaluere MK-funksjonene i en bestemt fysio-patologisk kontekst, eller for bedre å studere prosessen med megakaryopoiesis. Noen eksempler presenteres i figur 8.
Figur 8. Ettersorter MK-analyse. A) Cytologisk analyse av sortert MK-rom fra en 10-dagers in vitrokultur. May-Grünwald Giemsa farging tillater observasjon av viktige trekk ved modne MKs, dvs., pseudopoddannelse (rød pil), svært polyploid MK (blå pil). B) Immunfluorescensanalyse. Celler ble farget med antimenneskelig von Willebrand-faktor (vist i rødt, sekundært antistoff Alexa Fluor 555 Geit antimus IgG), antimenneskelig CD31 eller tandem CD41/CD61, begge konjugert med FITC (vist i grønt) og kjernefysisk DNA ble merket med DAPI (vist i blått). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Merknader:
MK-er kan sorteres fra uventede områder på grunn av kapasiteten til å feste celler til membranen (Figur 9). Dette problemet kan være et problem for å få høy renhet celle subpopulations. For å minimere cellecellemengder kan 1-5 mM EDTA legges til panelsammensetningsbufferne.
Videre, når vi bruker WB som startmateriale, foreslo vi enten å skaffe PBMCer eller lyse RBCer for å bruke mobilfraksjonen direkte. I figur 10 viser vi strømningscytometrianalyse av de to metodene. På den ene siden, når vi lyser RBCer og analyserer hele mobilrommet, har vi fortsatt en stor mengde nøytrofiler. Disse kan filtreres ut med en bestemt markør (eller ved hjelp av Lin cocktail-strategien). Vi kan imidlertid miste noen MK-er på grunn av deres promiskuøse natur relatert til overflatemarkøruttrykk. På den annen side vil PBMC-isolasjon tillate oss å kvitte seg med nøytrofiler så vel som RBCer, selv om vi kan miste MK-ene med høyere tetthet (dvs., de med mer komplekse cytoplasmiske egenskaper eller mer umodne). Som vist i figur 10viser MKs fra lysed WB et høyere uttrykk for modningsmarkører, som vises lavere når du isolerer PBMCer. Tetthetsgradienten kan føre til tap av MK-ene som fortsatt inneholder en kompleks cytoplasma, mens de som finnes i PBMC-fraksjonen, allerede kan være "utmattet" i sirkulasjonen etter frigjøring av blodplater, og dermed opprettholde polyploidkjernen i en mindre kompleks cytoplasma. De bør ikke forveksles med umodne MKs. Hver prosedyre har sine fordeler og ulemper.
Figur 9. Den klissete naturen til MKs. MKs finnes i uventede porter på grunn av deres evne til å feste celler til membranen. A-C) MKs sortert i populasjoner 1 (B) og 5 (A og C), i henhold til gating strategien for MK sortering. Dette problemet kan være et problem for å få høy renhet celle subpopulations. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10. Flow cytometri immunofenotyping av MKs fra PBMCs eller WB etter lysing RBC. A) Gating strategi. B) Størrelse (FSC), cellulær kompleksitet (SSC) og uttrykk for CD42A, CD41, CD71 og KIT i MK-er som identifisert i PBMCer eller WB. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det meste av forskningen som fokuserer på studiet av megakaryopoiesis ved flowcytometri er til dags dato begrenset til identifisering av MK-delsett ved hjelp av bare avstamningsspesifikke overflatemarkører (dvs.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), mens tidligere MK-differensieringsstadier har blitt dårlig undersøkt. I den nåværende artikkelen viser vi en immunofenotyping strategi for å adressere en omfattende strømning cytometri karakterisering av menneskelig megakaryopoiesis. Totalt sett vil vi fremheve nytten av å kombinere MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører (tabell 1 og 2) i samme strømningscytometri antistoffpanel for studiet av megakaryopoiesis på en mer detaljert måte. Vår nye tilnærming kan fungere som et kraftig verktøy for å hjelpe diagnose og/eller prognose i hematologiske lidelser. Vi anser at de presenterte panelene og kombinasjonene ikke er definitive. Vi har observert en svært dynamisk oppførsel av overflatemarkører i menneskelige primære kilder (hovedsakelig i BM-prøver), som også er avhengig av subjacent patologien. Flere studier er nødvendig, og forhåpentligvis vil det vitenskapelige samfunnet begynne å bruke denne tilnærmingen på tilbakemeldinger med observasjoner fra studier som fokuserer på en enkelt patologi og hvordan megakaryopoiesis iscenesettelse kan hjelpe ved diagnose eller prognose. Implementeringen av kombinert HSC- og MK-karakterisering i primærvev, med tanke på de ulike rutene for MK-engasjement som kommentert i introduksjonsseksjonen, er relevant og verdt av videre utvikling. Det faktum at vi også er i stand til å oppdage MKs i PBMCs er ganske observasjon. Vi hypoteser også at analysen av MKs i denne primære kilden vil hjelpe til med sykdomsdiagnose og prognose, som et svært relevant alternativ til BM-aspirater, siden utvinning av en blodprøve ikke er så invasiv. Det aspektet krever også utvikling.
Til tross for de tekniske begrensningene knyttet til de biologiske egenskapene til MKs (stor størrelse, osmotisk skjørhet, klebrighet) var vi i stand til å sortere forskjellige modningsstadier i flere menneskelige MK-kilder, spesielt i BM, PBMCer og PBMCs-avledede cellekulturer. Fremtidige studier vil bli utført for å analysere egenskapene til megakaryopoiesis i andre menneskelige kilder som ledningsblod og i forskjellige fysio-patologiske situasjoner. I tillegg bør differensieringspotensialet til hver inngjerdede og sorterte cellefraksjon evalueres i kolonidannende enhet (CFU) analyser av MK-forfedre (CFU-MK) for objektivt å vurdere differensieringspotensialet til hver befolkning i megakaryopoiesis-reisen. Mens overgår de tekniske begrensningene som en gang ble tenkt å hindre den slags modne megakaryocytter, krever en slik nødvendighet fortsatt mer perfeksjon. På den ene siden vil encellede omics tillate omfattende studier når du bruker immunofenotypingspanelene, men hvis fysisk sortering er nødvendig, til tross for renheten til de sorterte populasjonene er over 85% (basert på overflatemarkøruttrykk), må andre variabler tas i betraktning, som fortsatt er vanskelige å løse. Som nevnt er MK-kulturer ikke synkrone og er veldig heterogene. MKs selv er promiskuøse i overflatemarkøruttrykk, og deler markører med andre myeloide og ikke-myeloide hematopoietiske og ikke-hematopoietiske celler. Videre er de svært vanskelige å klynge med de morfometriske variablene (Forward and Side Scatter) når de distribuerer mye. Videre studier er nødvendig for å avgrense denne applikasjonen, men med samarbeidsarbeid er vi nærmere å begrense megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Audiovisuell materialproduksjon ble støttet av BD Biosciences.
Acknowledgments
Vi takker Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo og Begoña García Méndez (HUCA) og Paloma Cerezo, Almudena Payero og María de la Poveda-Colomo (HCSC) for teknisk støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Medical Grants (Roche SP200221001) til A.B., et RYC-stipend (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spania) og et I+D 2017-stipend (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spania og Fondos FEDER) til L.G., en Severo Ochoa Grant (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spania) til P.M.-B. og et intramuralt postdoktorstipend 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Spania) til A.A.-H. Vi takker Reinier van der Linden for å ha delt sin kunnskap (og tid), spesielt hans kloke råd om flerfarget tagged-antistoff panel blanding og single-color perle kontroll forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
