Summary
Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.
Abstract
A diferenciação de megacariócito (MK) abrange uma série de ciclos endomitóticos que resultam em uma célula altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N) e extremamente grande (40-60 μm). Ao contrário do rápido crescimento do conhecimento em megacaripoiesis na biologia celular e no nível molecular, a caracterização da megacariopoiese por citometria de fluxo limita-se à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos da linhagem, enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping que permite a identificação de estágios sucessivos de diferenciação de MK, com status ploidy crescente, em fontes primárias humanas ou culturas in vitro com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK. Apesar de seu tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando o painel acima mencionado e enriquecidos pela triagem celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal. Essa abordagem facilita estudos multi-Omics, com o objetivo de entender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas em humanos. Uma melhor caracterização da megacaritopoiese pode representar fundamental no diagnóstico ou prognóstico de patologias e malignidade relacionadas à linhagem.
Introduction
Os megacariócitos (MKs) desenvolvem-se a partir de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) seguindo um processo complexo chamado megacariiopoiese, que é orquestrado principalmente pelo hormônio trombopoietina (TPO). A visão clássica da megacaripoiese descreve a jornada celular dos HSCs através de uma sucessão de estágios hierárquicos de progenitores comprometidos e células precursoras, levando finalmente a um MK maduro. Durante a maturação, os MKs experimentam múltiplas rodadas de endomitose, desenvolvem um intrincado sistema de membrana intracelular (DMS), que fornece superfície de membrana suficiente para a produção de plaquetas, e produzem e embalam eficientemente a infinidade de fatores que estão contidos nos diferentes grânulos herdados pelas plaquetas maduras1,2,3. Como resultado, MKs maduros são células grandes (40-60 μm) caracterizadas por um núcleo altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N). Estudos recentes sugerem rotas alternativas pelas quais os HSCs se diferenciam em MKs contornando os pontos de verificação tradicionais de compromisso de linhagem em resposta a certas condições fisio-patológicas4,5,6,7,8,9,10,11. Esses achados destacam que a diferenciação hematopoiética em relação ao MK maduro é um processo contínuo e adaptativo que responde às necessidades biológicas.
Com o crescente conhecimento sobre a biologia celular e os aspectos moleculares caracterizando a megacariopoiese12, a maioria das pesquisas dedicadas ao estudo do processo por citometria de fluxo estão limitadas à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja, CD42A/B, CD41/CD61), enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Documentamos anteriormente uma estratégia para encenar megacaripoiesis em medula óssea de camundongos e culturas MK derivadas da medula óssea13,14, que adaptamos e aplicamos aos humanos15. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteca que permite a caracterização da megacariiopoiese, dos HSCs aos MKs maduros, em fontes primárias humanas (medula óssea -BM e sangue periférico -PB-) ou culturas in vitro utilizando um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT e CD71, entre outros). Apesar de seu grande tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando os marcadores de superfície celular acima mencionados e enriquecidos pela classificação celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal para minimizar a ruptura celular e/ou danos. Essa técnica facilita abordagens multi-Omics, com o objetivo de compreender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas na saúde humana e na doença. Vale ressaltar que será uma ferramenta útil para auxiliar o diagnóstico e o prognóstico em um contexto clínico de crescente demanda.
Neste manuscrito documentamos uma estratégia para encenar megacaripoiesis humanas com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK de fontes primárias ou gerados in vitro. Além disso, fornecemos um protocolo para classificar, com um classificador celular ativado por fluorescência, as frações preferidas e MKs maduros(Figura 1). Este passo não é popular, pois é tecnicamente difícil devido ao grande tamanho e fragilidade dos MKs. No entanto, tem sido empregado tanto em amostras de camundongos quanto de medula óssea humana anteriormente, e devido ao avanço tecnológico, com melhor resultado a cada vez16,17,18. Fontes primárias humanas onde mks ou precursores mk podem ser estudados incluem medula óssea, sangue do cordão umbilical e sangue periférico, entre outros. O processamento adequado da amostra para isolar a fração celular relevante para análise em cada amostra é de importância. Os procedimentos padrão são incorporados, com algumas considerações a serem consideradas ao mirar no estudo da megacaripoiese.
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Protocol
Amostras de sangue e medula óssea inteiras foram obtidas e processadas de acordo com a Declaração de Helsinque de 1964. Amostras de sangue integrais foram obtidas de doadores saudáveis após o consentimento informado (ISPA), dentro de um estudo aprovado pelo nosso comitê de ética médica institucional (Hospital Universitário Central de Astúrias -HUCA-). Amostras de medula óssea foram obtidas a partir do material de descarte aspirado de medula óssea de pacientes administrados no Departamento de Hematologia do Hospital Clínico São Carlos (HCSC).
Figura 1: Representação esquemática do protocolo documentado neste manuscrito. As principais fontes humanas ou culturas primárias onde a diferenciação de MK pode ser encenada usando imunofenofoteping são indicadas. Essa estratégia de imunofenofoteping pode ser aplicada ao estudo do processo em diferentes patologias relacionadas à linhagem ou malignidade em fontes primárias. Além disso, torna possível a classificação celular de MKs e precursores com um classificador celular ativado por fluorescência, o que permite uma análise mais aprofundada de frações enriquecidas. As imagens utilizadas fazem parte da Servier Medical Art (SMART) da Servier e são licenciadas sob CC BY 3.0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Processamento total de sangue e medula óssea antes da imunofenofoteping
- Ao usar sangue inteiro (WB) de doações como fonte primária, isole opcionalmente o componente do fábula mononuclear de sangue periférico (PBMC). Isso pode ser alcançado usando centrifugação diferencial padrão combinada com separação de células gradientes de densidade, como descrito anteriormente15.
- Resumindo, centrífuga sangue a 193 x g por 15 min (freio 3) à temperatura ambiente. Descarte a fração de plasma superior e colete o anel de buffy. Diluir 1:1 com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS)/Dihidrato citrato de trisódico (38 g/L, pH 7) tampão e pipeta cuidadosamente um volume de 25 mL em cima de 15 mL de uma solução de gradiente de densidade (1,076 g/mL) em tubos de 50 mL.
- Centrifugar por 20 min a 1114 x g (acelerador 3, freio 3, temperatura ambiente). Descarte a fração de plasma e colete o anel de buffy contendo PBMCs. Lave adicionando o mesmo volume de PBS, centrífuga a 435 x g por 5 min e resuspend em PBS para uso posterior.
- Alternativamente, use uma amostra de WB (cerca de 100 μL) para imunofenofonping após a linchação dos glóbulos vermelhos (RBCs) e lavagem completa.
- Em suma, diluir 1:1 no tampão de lise RBC frio (4,15 g de NH4Cl, 0,5 g de KHCO3 e 18,5 mgs de EDTA (triplex III) a 500 mL de H2O, pH 7.1-7.4). Aguarde até que a suspensão celular fique vermelha (3-5 min).
- Centrifugar a 435 x g por 5 min, a 4 °C, e resuspensar as células em PBS. Repita o procedimento quantas vezes for necessário para obter uma pelota de célula branca.
- Da mesma forma, processe diretamente as amostras obtidas a partir da medula óssea (aspiração) com tampão de lise RBC (ver ponto 1.2) e lavagem completa, para começar com uma suspensão unicelular clara(Figura 1).
- Evite o uso de vórtice para misturar amostras durante o processamento, pois pode danificar os MKs frágeis. Misture piscando ou invertendo o tubo.
NOTA: O gradiente de densidade para obter PBMCs pode resultar em uma fração celular mais rica e limpa em comparação com o WB rbc-lysed. No entanto, devemos ter em mente que MKs maduros de alta densidade podem ser perdidos na fração "neutrófilo". Isso será discutido nos resultados representativos.
- Evite o uso de vórtice para misturar amostras durante o processamento, pois pode danificar os MKs frágeis. Misture piscando ou invertendo o tubo.
2. Diferenciação in vitro de MK dos PBMCs
NOTA: Os MKs podem ser diferenciados in vitro de precursores anteriores, como células CD34+ presentes em diferentes fontes primárias(ou seja, WB/PBMCs, sangue do cordão umbilical, medula óssea) e de iPSCs. Existem diferentes protocolos que foram aplicados a este fim. Aqui, utilizamos um método de cultura desenvolvido por nós que permite a diferenciação de MK dos PBMCs, sem a necessidade de enriquecer para CD34+ precursores15,19,20,21,22.
- Este protocolo consiste em três fases culturais, onde a concentração de trombopoietina (TPO) aumenta gradualmente em detrimento de fatores de crescimento que favorecem a proliferação de precursores anteriores (ou seja,SCF, EPO), que gradualmente diminuem (Figura 2)15.
- Para o meio base, utilize StemSpan SFEM complementado com 0,4% de mistura lipídica rica em colesterol e 1% penicilina/estreptomicina.
- Para o meio de fase I, utilize o meio de base suplementado com SCF (100 ng/mL), Eritropoietina (EPO, 0,5 U/mL) e Trombopoietina (TPO, 30 ng/mL). O meio de fase II é o médio-base suplementado com SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) e TPO (50 ng/mL). Para o meio da Fase III, utilize o meio de base suplementado com TPO (100 ng/mL).
- CULTURA PBMCs em fase I médio. No dia 6-8, coloque os PBMCs em média fase II, e no dia 9-12 coloquem os PBMCs na Fase III do meio.
- Substitua o meio por centrifugadores de células a 435 x g por 5 min à temperatura ambiente da Fase I à Fase II, e a 95 x g por 5 min à temperatura ambiente da Fase II à Fase III, e resumem-nas em meio fresco.
- Células de cultura em uma incubadora a 37 °C, 5% CO2. Nessas culturas primárias, a diferenciação de MK dura de 10 a 14 dias, e as amostras podem ser sorteadas em diferentes momentos ao longo do período cultural, para acompanhar a diferenciação de MK.
- Para o meio base, utilize StemSpan SFEM complementado com 0,4% de mistura lipídica rica em colesterol e 1% penicilina/estreptomicina.
Figura 2: Representação esquemática do método de cultura MK derivado do PBMC. Os PBMCs de doadores saudáveis foram cultivados de acordo com o protocolo trifásico desenvolvido por nós para gerar MK in vitro (esquema adaptado de Salunkhe et al). 15 Fotos tiradas no dia 10 e dia 13 de cultura são mostradas. As fotos são tiradas com um objetivo de 20X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coleta de amostras: Lave as células aplicando centrifugação de baixa velocidade por 5 min (95 x g) e resuspense-as em PBS ou PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA). Para imunofenofoteping, a densidade ideal é de 105-106 células/100 μL (ver ponto 3.1). Dependendo do estado das culturas (ou seja, a presença de células mortas, detritos, etc.), podem ser necessárias 1 ou 2 lavagens. Colete suas células nos pontos de interesse durante a cultura.
3. Imunofenoftipagem da diferenciação MK - incubação com um painel de anticorpos marcados
- Incubar as amostras de células com um painel de anticorpos marcados seguindo os procedimentos padrão, prestando atenção à centrífuga em baixa velocidade (95 x g) ao processar megacariócitos. Normalmente incubamos as amostras com 1% de BSA em PBS em volumes de 100 μL a 4 °C, 20 min, com uma faixa de 105-106 células.
- Aumente quando necessário.
- Após a incubação, adicione 5 mL de 1% de BSA no PBS, centrífuga em baixa velocidade (95 x g), aspire o supernasal e resuspense a amostra em 2% BSA no PBS para preservar a viabilidade MK (2 mL). Adicione 1-5 mM EDTA para interromper agregados de células celulares (que são naturalmente vistos nas culturas MK).
- Transfira amostras para um tubo de fundo redondo de 12 x 75 mm (tubo FACS) ou placa, mantendo-as no escuro até a análise da citometria de fluxo ou a classificação celular.
- Preparação das misturas de anticorpos e anticorpos únicos; configuração do citómetro de fluxo:
- Titular os anticorpos antes de seu uso para determinar a concentração ideal nos painéis de anticorpos. A concentração ideal de anticorpos é a menor concentração que separa claramente positivo das células negativas (e permite a distinção dos níveis intermediários de expressão). Como exemplo, a maioria dos anticorpos são usados em uma diluição de 1:200 (estoque de 100 μg/mL) a menos que de outra forma titulado ou indicado pelo fabricante.
- Uma vez determinada a titulação do anticorpo, prepare uma diluição de 10x de cada anticorpo. Estas diluições são usadas para os controles de cor única e para o preparo das misturas do painel. As diluições e misturas de painel são boas para uso mesmo um mês após a preparação (armazenadas a 4 °C, a menos que as indicações do fabricante impeçam essas condições de armazenamento). Isso permite a coloração de amostras com o mesmo painel durante um período de tempo.
- Use 10 μL por 100 μL da diluição de 10x tanto para os controles de cor única quanto para a mistura do painel.
- Para os controles de cor única, use contas de afinidade de anticorpos, que podem ser medidas diretamente após a adição do anticorpo. Os controles de cor única devem ser medidos a cada experimento, para permitir o ajuste adequado da compensação (e ajuste fino pós-medição com o software de análise).
- Alternativamente, realize os controles de cor única com amostras de células. No entanto, as contas permitem a medição rápida de um determinado número de eventos, que, dependendo do marcador de anticorpos/superfície, pode não ser possível obter em complexas fontes celulares primárias ou cultivadas. Também aconselhamos executar amostras de células manchadas com misturas de painel "Fluorescence Minus One" (FMO) para configurar as configurações de compensação apropriadas (antes de executar experimentos). Isso é relevante para identificar cuidadosamente problemas de compensação e, especialmente, em MKs cultos, identificar interferências de autofluorescência (que estarão presentes se usarem meio de cultura contendo vermelho fenol).
- Prepare o volume suficiente da mistura do painel, dependendo do número de amostras, contendo os anticorpos do painel projetado. A maioria dos nossos painéis inclui seis anticorpos (painéis de 6 cores, ver Tabelas 1-2).
- Para estes painéis, utilize lasers de 488 nm e 633 nm do citômetro de fluxo, no entanto, os painéis podem ser adaptados a outros cenários técnicos. Além disso, as considerações de compensação podem ser obviadas ao usar citometria de fluxo baseada em especttrometria de massa ou citómetros com tecnologia de foco acústico.
- Corantes para medir a viabilidade podem dar informações falsas sobre MKs, especialmente quando amadurecem. MKs são células de uptaking muito ativas, e a positividade com Hoechst, 7-AAD ou PE, pode nem sempre refletir a morte celular real. Uma alternativa (se for necessária a medição da morte celular) pode ser o uso de manchas de mitocôndrias (CMX Ros) ou corantes reativos de amina (corantes zumbis ou fantasmas).
Tabela 1: Notas sobre marcadores de superfície celular da linhagem megacariocítica Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Painéis de anticorpos Clique aqui para baixar esta Tabela.
4. Análise de ploidy combinada com painéis de 6 cores
- Para análise ploidy, em combinação com um painel de anticorpos de 6 cores, proceda com fixação e permeabilização das células após a incubação com o painel de anticorpos. Essa estratégia permitirá a preservação da coloração do marcador de superfície, permitindo a coloração do DNA das células. Usamos hoechst 33342 para manchar DNA, pois pode ser visualizado com o laser violeta 405 nm disponível.
- Para 105-106 células, após a incubação com o painel de anticorpos, células centrífugas (95 x g por 5 min), resuspend em 200 μL de tampão de fixação e incubar 10 min à temperatura ambiente (RT).
- Células centrífugas como indicado acima, resuspensadas pela segunda vez em 200 μL tampão de fixação, e incubar outros 10 min no RT.
- Prepare o tampão de permeabilização, contendo 0,1% Triton X-100, 200 mg/mL RNase e 20 mg/mL Hoechst 33342 (permeabilização Hoechst MIX).
- Centrífugas como acima, resuspenque-as em 300 μL da permeabilização Hoechst MIX e incubar 30 min a 37 °C. Esse passo é muito importante, pois, para obter uma medição de ploidy limpa, o RNA tem que ser degradado.
- Após o tempo de incubação, meça amostras diretamente com um citómetro de fluxo. Caso contrário, mantenha as amostras a 4 °C, no escuro. Meça-os prontamente. No entanto, como essas amostras são fixas, a medição pode ser adiada até mesmo de 24 a 48 horas. Certifique-se de que a amostra é bem vista antes da medição, ou passada através de um coador de células, para garantir uma única suspensão celular.
- Parâmetros morfométricos como Forward e Side Scatter não são mantidos após a fixação celular. O gráfico dispersão para frente/lado mostrará um encolhimento da distribuição celular após a fixação. No entanto, a coloração do marcador de superfície é principalmente preservada, e a estratégia de gating é mal alterada, permitindo a análise do status ploidy nos diferentes estágios de diferenciação definidos por combinações de marcadores de superfície.
5. Análise de diferenciação mk
NOTA: Vimos que a combinação de CD31/CD71 permite definir uma série de portões que correspondem a diferentes estágios de diferenciação de MK. Mais retrocesso com marcadores específicos de MK permite a separação de MKs maduros e imaturos. Além disso, em amostras frescas, back-gating para verificar a presença de outros marcadores utilizados, ou para colocar as populações nos eixos de dispersão dianteira/lateral, refina a avaliação dos estágios de diferenciação de MK e permite descartar outros tipos de células que poderiam estar presentes nas mesmas populações.
- Use um painel de anticorpos que inclui marcadores precursores iniciais (KIT, CD34), marcadores precursores comuns (CD31, CD71) e marcadores de linhagem, alguns deles específicos (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, etc) (ver Tabelas 1-2). O uso do coquetel Lineage (Lin) (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 e CD56), também permite "filtrar" células hematopoiéticas maduras que podem adicionar ruído à análise (ao selecionar o Lin- população). Como exemplo, passaremos pela análise de MKs em PBMCs, medula óssea e através de culturas celulares derivadas do PBMC nos resultados representativos.
6. Classificação de células precursoras MK e MK
NOTA: As células manchadas foram analisadas e classificadas em um classificador de células ativado pela fluorescência FACS Aria IIu equipado com lasers de estado sólido padrão de 488 nm e 633 nm usando o software FACSDiva; os dados foram ainda analisados e apresentados utilizando-se o software FlowJo e o Cytobank (análise viSNE). A pureza das frações classificadas foi confirmada pela análise de citometria de fluxo de cada uma das frações classificadas (pureza acima de 85%).
- Realize a triagem celular o mais rápido possível ou dentro de 1 hora após a incubação de anticorpos, a fim de evitar a deterioração celular.
- Filtre a amostra com um filtro de célula de 100 μm para garantir a suspensão de célula única e a integridade de MK grande.
- Use um bocal cerâmico de 130 μm, uma pressão de baia definida para 11 libras por polegada quadrada (PSI) e a frequência de unidade de gota definida para 12 kHz para quebrar o fluxo em gotas.
- Antes da triagem, esterilize as linhas de bocal, bainha e amostra, realizando uma aquisição de 30 minutos com penicilina/estreptomicina diluída 1:5 em água estéril, seguida por uma aquisição de 10 minutos com água estéril para remover o descontaminante restante.
- Uma vez estabilizado o fluxo, ajuste o drop-delay com contas recomendadas, a fim de classificar no modo de sintonia fina mais de 97,5% das quedas refletidas a uma taxa de fluxo de 400-1200 eventos por segundo.
- Prepare a coleta de tubos FACS com 500 μL de 2% de BSA em PBS. O percentual de BSA pode ser aumentado em até 5-10%.
- Gere o modelo de experimento com os parâmetros adequados da matriz de compensação.
- Carregue o tubo FACS no citômetro.
- Realize uma medição da amostra para definir os portões desejados e a pureza das populações celulares-alvo. Mantenha o registro ativado para mostrar até 200.000 eventos nos portões da população selecionada durante a triagem celular.
- FACS Aria IIu permite a separação de até 4 populações celulares diferentes ao mesmo tempo. Crie um novo layout de classificação e selecione o dispositivo de coleta (4 tubos) e o modo de precisão apropriado (recomenda-se máscara intermediária de pureza e recuperação). Por fim, adicione a população de interesse a cada campo de localização de classificação(Figura 3).
Figura 3: Representação esquemática do princípio da classificação celular ativada pela fluorescência (FACS). As partículas passam pelo bocal de 130 μm e são forçadas a se dividir em um fluxo de gotículas regulares devido à aplicação de vibração no bocal. Em seguida, as gotículas são interrogadas pelo laser (ponto de análise) e os sinais são processados para dar a "decisão do tipo" aplicando uma carga a essas gotículas. Quando uma gotícula de carga passa por um campo eletrostático de alta tensão (placa de detecção), ela é desviada e coletada no tubo de coleta correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Carregue os tubos de coleta e comece a classificar as populações-alvo.
- Centrifugar os tubos de coleta por 5 minutos a 95 x g e resuspensar a pelota celular no volume apropriado de 2% de BSA em PBS.
- Meça novamente uma fração de cada amostra classificada, para calcular a pureza.
- Armazene células adequadamente para uso posterior. As células classificadas podem ser utilizadas para análises citológicas e moleculares, ou podem ser reeducinadas com o objetivo de estudar o processo de diferenciação de uma população celular selecionada.
7. Preparação da amostra pós-classificação
- Preparando citospins para análise citológica com um citocentrifuge
- Leve células classificadas para um volume de trabalho fácil de lidar de 100-200 μL. Leve em consideração que a densidade celular dependerá do rendimento populacional ordenado em cada caso.
- Coloque um slide limpo no suporte de metal e coloque uma parte superior do filtro. Lembre-se de rotular o slide e o filtro para evitar misturar amostras.
- Adicione 100 PBS μL no orifício do filtro contra o slide, para que o filtro seja umidificado na borda do orifício.
- Coloque o funil, feche o suporte de metal e coloque-o em seu local na centrífuga.
- Adicione a amostra (100-200 μL) dentro do funil.
- Centrifugar a 36 x g por 5 minutos. Os slides de citospin podem ser autorizados a secar no RT (devidamente coberto para evitar poeira) e podem ser mantidos em RT por 1 semana antes da imunostaining ou histoquímica.
- Para imunostaining
- Corrija slides em 2% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS e incubar durante 5min.
- Pode-se utilizar uma faixa de 0,5-4% de PFA no PBS. Em nossas mãos, usamos 4% para obter a fixação adequada de tecidos ou alguns tipos de células, e 0,5% pfa em PBS é suficiente para plaquetas. Ao configurar essa técnica, a porcentagem certa de PFA requer otimização por tipo/fonte celular.
- Incubar 5 min na PBS.
- Incubar 5 min em 50% de etanol (EtOH).
- Incubar 5 min em 70% EtOH.
- Armazenar em 70% EtOH a -20ºC.
- Ao realizar a imunostainação, reidratar e seguir procedimentos padrão (permeabilização, lavagem, bloqueio, incubações de anticorpos primários e secundários, preservação, etc).
- Corrija slides em 2% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS e incubar durante 5min.
- Para citoquímica:
NOTA: Os slides podem ser manchados com a coloração may-Grünwald Giemsa ou a mancha conveniente para cada finalidade. - Para exame de morfologia imediata
- Adicione uma gota de meio de montagem no ponto contendo célula do citospin e coloque uma mancha de cobertura.
- Mantenha slides a 4 °C não mais do que uma semana, a menos que selado, o que permite armazenamento a longo prazo mesmo no RT. A fixação média de montagem permite o armazenamento a longo prazo no RT.
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Representative Results
Medula Óssea e Ploidy
Na Figura 4, mostramos uma análise representativa de imunofenofoteping de megacaripoiese em amostras de BM (aspiração) de pacientes. Ao traçar a fração celular contra CD71 e CD31, temos fechado seis populações principais: CD31- CD71- (vermelho), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (laranja), CD31+ CD71mid (verde claro), CD31+ CD71+ (verde escuro) e CD31++ CD71mid (creme). Essas populações nem sempre estão presentes nas mesmas posições (considerando as constantes configurações de cictómetro), como pode ser visto, e isso deve ser levado em conta. Isso pode ser inerente à condição patológica e ao estado da medula óssea. As seis populações sobrepostas em histogramas contra um marcador de maturação contido no painel (CD42A/CD42B) e na dispersão dianteira, são mostradas à direita. A figura também mostra um enredo contra CD31/CD71 representando uma sobreposição das células CD42B+ com a fração celular total para visualizar a distribuição dos MKs mais maduros. Em termos gerais, a população CD31- CD71- não contém MKs ou precursores de linhagem, não apresenta marcadores de maturação MK e é menor em tamanho. A população CD31- CD71+ contém principalmente células da linhagem eritróida, embora também possa conter precursores comuns de linhagem, como hipóteses de nossas observações. Permanece negativo para marcadores de maturação MK, e dependendo da proporção de células eritróides anteriores ou posteriores, o Dispersão Para a Frente também pode flutuar.
Como exemplo, o paciente com síndrome mielodesplásica (SMD) tem uma proporção maior de células eritróides imaturas (ou seja,maiores), em comparação com outros pacientes. Progenitores MK e células maduras serão distribuídos nas células CD31+, com alguma variação. No entanto, como se pode ver comparando a análise de BM em cada patologia, existem algumas características constantes. MKs mais maduros estão presentes na populaçãomédia CD31++ CD71 (creme), e patologias onde essa maturação é "bloqueada" incluem Trombocitopenia Imune (ITP) e uma amostra de BM reativo (com inflamação subjacente). Enquanto no paciente com linfoma parece haver um equilíbrio entre precursores precoces e MKs tardios (portões de laranja e creme), essa proporção é alterada no paciente com MDS (com precursores mais "bloqueados") e no paciente com leucemia mielóide aguda (LMA) (com MKs mais maduros). De interesse, o "bloqueio" parece ser diferente comparando patologias entre si: em patologias que concorrem com inflamação subjacente o bloqueio pode ser devido a uma combinação de defeitos de maturação, destruição(ou seja,autoimunidade) e produção de plaquetas por ruptura de MK.
Figura 4: Imunofenotyìng de megacariopoiesis em amostras de medula óssea humana de pacientes com diferentes patologias. Foram analisadas amostras representativas de medula óssea (MM) de pacientes diagnosticados com linfoma(ou seja,BM normal), síndrome mielodsplásica (SM), leucemia mielóide aguda (LMA), trombocitopenia imunológica (ITP) e paciente com BM reativo devido a uma infecção. Ao traçar a fração celular (ou seja,células nucleadas) contra CD71 e CD31, temos fechado seis populações principais: CD31- CD71- (vermelho), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (laranja), CD31+ CD71médio (verde claro), CD31+ CD71+ (verde escuro) e CD31++ CD71(mid cream). Essas populações nem sempre estão presentes nas mesmas posições (considerando as configurações estáveis do cicômetro), como se pode ver, e isso deve ser levado em conta. As seis populações sobrepostas em histogramas contra um marcador de maturação contido no painel (CD42A/CD42B) e na dispersão dianteira, são mostradas à direita. A figura também mostra um enredo contra CD31/CD71 representando uma sobreposição das células CD42B+ com a fração celular total para visualizar a distribuição dos MKs mais maduros. Números que correspondem aos portões na trama de pontos e as sobreposições de histograma são retratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em seguida, partimos para analisar o estado ploidy das populações acima mencionadas em amostras de BM humanas. A Figura 5 mostra um status ploidy crescente dentro das populações CD31+ que prevemos ser diferente e característico para cada contexto patológico. Note-se que devido à fixação celular e permeabilização utilizada nesses experimentos, as parcelas de pontos não são completamente comparáveis às de amostras não fixas e não permeabilizadas(Figura 4).
Figura 5: Análise ploidy das populações selecionadas com base na expressão CD31/CD71, em amostras de BM humanas. Amostras representativas de medula óssea (MMC) de pacientes diagnosticados com leucemia mielóide aguda (LMA) e trombocitopenia imunológica (ITP). Ao traçar a fração celular (ou seja,células nucleadas) contra CD71 e CD31, temos fechado seis populações principais: CD31- CD71- (vermelho), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (laranja), CD31+ CD71médio (verde claro), CD31+ CD71+ (verde escuro) e CD31++ CD71(mid cream). Essas populações nem sempre estão presentes nas mesmas posições (considerando as configurações estáveis do cicômetro), como se pode ver, e isso deve ser levado em conta. O retrocesso dessas seis populações sobrepostas em histogramas contra Hoechst 33342 mostra o status ploidy diferente das populações, e a tendência geral de aumentar a ploidia com a maturação (embora os MKs possam atingir a maturidade independentemente do status de poliploidização). Números que correspondem aos portões do gráfico de pontos e as sobreposições de histograma são retratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
PBMCs e Cultura Celular
Na Figura 6,mostramos uma análise representativa de imunofenofoteping dos PBMCs e da cultura MK definida com esses PBMCs no dia 7 e dia 11. Usamos um painel contendo o coquetel Lin, e mostramos a fração celular de células vivas antes e depois de Lin- seleção. Essa seleção negativa pode resultar na perda de alguma fração de MKs co-expressando, por exemplo, CD14, mas também permite uma análise mais refinada. Ao traçar o Lin- fração contra CD71 e CD31, emcoramos cinco populações principais: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid e CD31++ CD71mid. Essas populações nem sempre estão presentes nas mesmas posições (considerando as constantes configurações de cictómetro), como pode ser visto, e isso deve ser levado em conta. Neste caso, as diferenças não são inerentes apenas à saúde individual ou ao estado patológico, mas também à capacidade de diferenciação de MK dos precursores na fração PBMC. Retrotâneo essas cinco populações sobrepostas em histogramas contra outros marcadores contidos no painel (KIT e CD42B), e no Forward Scatter, é mostrado à direita. Precursores de MK e MKs em diferentes estágios de maturação estão dentro das populações CD31+
Figura 6: Imunofenoftipagem de megacariopoiesis durante a cultura celular MK, incluindo o material pbmc inicial. Análise representativa de imunofenofonping de PBMCs e da cultura MK definida com esses PBMCs no dia 7 e dia 11. Usamos um painel contendo o coquetel Lin, e mostramos a fração celular (ou seja,células nucleadas) antes e depois de Lin-seleção. Essa seleção negativa pode resultar na perda de alguma fração de MKs co-expressando, por exemplo, CD14, mas também permite uma análise mais refinada. Ao traçar a fração de Lin contra CD71 e CD31, emcostou cinco populações principais: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid e CD31++ CD71mid. Essas populações nem sempre estão presentes nas mesmas posições (considerando as configurações estáveis do cicômetro), como se pode ver, e isso deve ser levado em conta. Retrotâneo essas cinco populações sobrepostas em histogramas contra outros marcadores contidos no painel (KIT e CD42B), e no Forward Scatter, é mostrado à direita. Precursores de MK e MKs em diferentes estágios de maturação estão dentro das populações CD31+ A figura também mostra um enredo contra CD31/CD71 representando uma sobreposição das células CD42B+ com a fração celular total para visualizar a distribuição dos MKs mais maduros. Números que correspondem aos portões na trama de pontos e as sobreposições de histograma são retratados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 3: Percentuais populacionais de análises de citometria de fluxo Clique aqui para baixar esta Tabela.
Em PBMCs, os MKs estão dentro do cd31++ CD71no meio do portão, embora seu tamanho não seja tão grande quanto vimos com MKs cultos. Isso pode ser devido a uma das duas opções a seguir: MKs em PBMCs representam uma fração de MKs imaturos que entram na circulação, ou uma fração de MKs maduros circulantes que perderam a complexidade citoplasmática. Nossos experimentos sugerem que este último pode ser a razão para explicar essa diferença de tamanho. Apoiando essa noção, a expressão de CD42B não está presente em 100% das células dessas populações (como também pode ser vista em amostras de MM na Figura 4), provavelmente devido à perda de marcadores superficiais na formação de proplatos e/ou derramamento de plaquetas. No entanto, em amostras cultas, os MKs nos portões "maduros", são quase 100% CD42B+, e maiores em tamanho. Essas dinâmicas celulares hipotéticas devem ser mais estudadas e validadas.
Devido aos efeitos pleiotrópicos do TPO, essas culturas são heterogêneas e assíncronas, o que, por si só, dificulta a análise das discretas etapas de diferenciação de MK. 19,20 Após a expansão de progenitores anteriores, os MKs em diferentes estágios de maturação aparecerão na cultura a partir do dia 6-10 (ou anterior, devido à variabilidade dos doadores) e aumentarão gradualmente em número à medida que as células comprometidas com linhagem MK amadurecerem em direção ao MK. Alguns MKs passarão por diferenciação terminal e começarão a formar proplatelets. No final da cultura, haverá um incremento gradual da perda celular devido à "atenuação/exaustão" após a formação de propolatos e derramamento de plaquetas ou morte celular(Figura 2).
Se usar análogos TPO em vez de TPO recombinante, as concentrações devem ser testadas.
A fonte de progenitores (adulto, sangue do cordão umbilical) condicionará as culturas, pois os MKs de fontes de diferentes estágios de desenvolvimento têm suas próprias características. Além disso, culturas de CD34+ progenitores enriquecidos, aparecendo mais homogêneas no início da cultura, chegarão a um estágio de heterogeneidade e assincronicidade quando o compromisso e diferenciação do MK começarem 19,20.
Classificação celular MK
Na Figura 7,mostramos uma estratégia representativa de uma amostra da cultura in vitro MK no dia 10 de diferenciação. Ao traçar a fração celular nucleada contra CD31 e CD71, ou a Dispersão dianteira, podemos distinguir duas populações principais caracterizadas pela presença ou ausência de CD31.
Ao traçar a fração CD31+ contra CD41 e CD71, podemos portão quatro principais populações: CD41- CD71- (1), CD41low CD71+ (2), CD41low CD71+++ (3) e CD41+++ CD71+ (4), em que outros marcadores de superfície (KIT e CD49B) foram expressos diferencialmente, permitindo a identificação do compartimento MK como células CD41 altamente positivas(Figura 7A). A pureza das frações classificadas é mostrada, bem como manchas citológicas de citospins das frações classificadas.
Para caracterizar o espectro populacional celular nas culturas PBMC-MK, utilizou-se a análise viSNE(Figura 7B). O mapa viSNE separa as células em subconjuntos espacialmente distintos com base na combinação de marcadores que eles expressam. Cada ponto na análise viSNE representa uma célula individual colorida de acordo com os níveis de expressão de CD31, CD42A, CD71 e KIT.
Células duplas negativas (CD31- e CD71-) são principalmente linfócitos residuais (população 5) que persistem em toda a cultura nessas condições. Esta população foi classificada em uma segunda rodada de classificação celular usando a fração restante da amostra.
Os portões 6 e 7 são célulasde expressagem média e alta cd71, que incluem progenitores eritróides e, potencialmente, outros precursores.
Devemos levar em conta as dificuldades técnicas devido à natureza heterogênea celular deste método cultural e à natureza pegajosa dos MKs maduros que resulta na presença de MKs maduros em subpopulações onde não pertencem (ver seção observações).
Figura 7: Análise imunofenofípica pré-classificada de 10 dias de cultura in vitro MKs. A) Estratégia representativa de gating utilizando CD31, CD41 e CD71, com duas rodadas de classificação, resultando em CD31+ populações 1-4 e CD31- populações 5-7. A pureza de cada fração classificada foi analisada após a classificação, e é retratada juntamente com uma microfotografia representativa de citospins manchados de cada fração classificada. B) mapa viSNE do dia 10 células de cultura MK derivadas do PBMC medidos pela citometria de fluxo. O mapa é construído utilizando os níveis de expressão de CD31, CD42B, CD71 e KIT, medidos pela citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Processamento pós-classificação
As populações classificadas podem ser analisadas por diferentes métodos, incluindo análise citológica e molecular por imunofluorescência (ver seção 7) a fim de avaliar as características do MK em um contexto fisio-patológico específico, ou para estudar melhor o processo de megacariopoiese. Alguns exemplos são apresentados na Figura 8.
Figura 8. Análise mk pós-classificação. A) Análise citológica do compartimento MK ordenado de uma cultura in vitro de 10 dias. A coloração de May-Grünwald Giemsa permite a observação de características-chave de MKs maduros, ou seja,formação de pseudopod (seta vermelha), MK altamente poliploide (seta azul). B) Análise de imunofluorescência. As células foram manchadas com o fator anti-humano von Willebrand (mostrado em vermelho, anticorpo secundário Alexa Fluor 555 Goat anti-mouse IgG), CD31 anti-humano ou tandem CD41/CD61, ambos conjugados com FITC (mostrado em verde) e DNA nuclear foi rotulado com DAPI (mostrado em azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Observações:
Os MKs podem ser classificados a partir de regiões inesperadas devido à capacidade de anexar células à sua membrana(Figura 9). Este problema pode ser um problema para obter subpopulações de células de alta pureza. Para minimizar os agregados de células celulares, 1-5 mM EDTA pode ser adicionado aos buffers de mixagem do painel.
Além disso, ao usar o WB como material inicial, propusemos a obtenção de PBMCs ou rbcs de lise para usar diretamente a fração celular. Na Figura 10 mostramos a análise da citometria de fluxo das duas metodologias. Por um lado, ao analisar RBCs e analisar todo o compartimento celular, ainda temos uma grande quantidade de neutrófilos. Estes podem ser filtrados com um marcador específico (ou usando a estratégia de coquetel Lin). No entanto, podemos perder alguns MKs devido à sua natureza promíscua relacionada à expressão do marcador de superfície. Por outro lado, o isolamento do PBMC nos permitirá nos livrar de neutrófilos, bem como de RBCs, embora possamos perder os MKs com maior densidade (ou seja,aqueles com características citoplasmáticas mais complexas ou mais imaturos). Como mostrado na Figura 10,MKs de WB lysed mostram uma expressão maior de marcadores de maturação, que aparece mais baixo ao isolar PBMCs. O gradiente de densidade pode resultar na perda dos MKs que ainda contêm um citoplasma complexo, enquanto os contidos na fração PBMC, podem já estar "esgotados" na circulação após a liberação de plaquetas, mantendo assim o núcleo poliploide dentro de um citoplasma menos complexo. Eles não devem ser confundidos com MKs imaturos. Cada procedimento tem suas vantagens e desvantagens.
Figura 9. A natureza pegajosa dos MKs. MKs podem ser encontrados em portões inesperados devido à sua capacidade de anexar células à sua membrana. A-C) MKs classificados nas populações 1 (B) e 5 (A e C), de acordo com a estratégia de gating para classificação MK. Este problema pode ser um problema para obter subpopulações de células de alta pureza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Imunofenoftipagem de citometria de fluxo de MKs de PBMCs ou WB após a lise dos RBCs. A) Estratégia de gating. B) Tamanho (FSC), complexidade celular (SSC) e expressão de CD42A, CD41, CD71 e KIT em MKs como identificados em PBMCs ou WB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A maior parte da pesquisa com foco no estudo da megacariopoiese por citometria de fluxo é até hoje limitada à identificação de subconjuntos MK usando apenas marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja,CD42A/CD42B, CD41/CD61), enquanto estágios anteriores de diferenciação de MK foram mal examinados. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteping para abordar uma caracterização abrangente da citometria de fluxo da megacariopoiese humana. No geral, gostaríamos de destacar a utilidade de combinar marcadores de superfície específicos e não específicos MK (Tabelas 1 e 2) no mesmo painel de anticorpos de citometria de fluxo para o estudo da megacariopoiese de forma mais detalhada. Nossa nova abordagem pode servir como uma poderosa ferramenta para auxiliar o diagnóstico e/ou prognóstico em distúrbios hematológicos. Consideramos que os painéis e combinações apresentados não são definitivos. Observamos um comportamento muito dinâmico de marcadores superficiais em fontes primárias humanas (principalmente em amostras de MM), que também depende da patologia subjacente. Mais estudos são necessários e, esperançosamente, a comunidade científica começará a aplicar essa abordagem quanto ao feedback com observações de estudos focados em uma única patologia e como a encenação da megacariopoiese pode ajudar no diagnóstico ou prognóstico. A implementação da caracterização combinada de HSC e MK em tecidos primários, considerando as diversas rotas para o compromisso de MK, conforme comentado na seção de introdução, é de relevância e valor de desenvolvimentos adicionais. O fato de também sermos capazes de detectar MKs em PBMCs é uma observação e tanto. Também há a hipótese de que a análise de MKs nesta fonte primária ajudará no diagnóstico e prognóstico da doença, como uma alternativa muito relevante aos aspiradores de BM, uma vez que a extração de uma amostra de sangue não é tão invasiva. Esse aspecto também requer desenvolvimento.
Apesar das limitações técnicas associadas às características biológicas dos MKs (grande tamanho, fragilidade osmótica, pegajosa) conseguimos classificar diferentes estágios de maturação em várias fontes humanas de MK, especificamente em culturas celulares derivadas de BM, PBMCs e PBMCs. Estudos futuros serão realizados com o objetivo de analisar as peculiaridades da megacariopoiese em outras fontes humanas, como sangue do cordão umbilical e em diferentes situações fisio-patológicas. Além disso, o potencial de diferenciação de cada fração celular fechada e classificada deve ser avaliado em ensaios da Unidade de Formação de Colônias (UFC) de progenitores de MK (CFU-MK) para avaliar objetivamente o potencial de diferenciação de cada população na jornada de megacaripoiese. A menos que supere as limitações técnicas que antes eram pensadas para impedir o tipo de megacaiócitos maduros, tal necessidade ainda exige mais perfeição. Por um lado, a Omics unicelular permitiria estudos abrangentes ao aplicar os painéis de imunofenofoteping, mas se o tipo físico for necessário, apesar da pureza das populações classificadas estar acima de 85% (com base na expressão do marcador de superfície), outras variáveis precisam ser levadas em conta, que ainda são difíceis de resolver. Como mencionado, as culturas MK não são síncronas e são muito heterogêneas. Os MKs em si são promíscuos na expressão de marcadores de superfície, compartilhando marcadores com outras células hematopoiéticas e não mieloides. Além disso, são muito difíceis de agrupar com as variáveis morfométricas (Dispersão dianteira e lateral) à medida que se distribuem amplamente. Mais estudos são necessários para refinar essa aplicação, mas com esforços colaborativos, estamos mais perto de reduzir a megacaripoiese.
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Disclosures
A produção de material audiovisual foi apoiada pela BD Biosciences.
Acknowledgments
Agradecemos a Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo e Begoña García Méndez (HUCA) e Paloma Cerezo, Almudena Payero e María de la Poveda-Colomo (HCSC) pelo apoio técnico. Este trabalho foi parcialmente apoiado por Bolsas Médicas (Roche SP200221001) para A.B., uma bolsa da RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha) e uma subvenção I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espanha e Fondos FEDER) para L.G., um Subsídio Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Astúrias, Espanha) para P.M.-B. e uma bolsa de pós-doutorado intramuros 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Astúrias - FINBA, Oviedo, Espanha) para A.A.-H. Agradecemos a Reinier van der Linden por compartilhar seu conhecimento (e tempo), especialmente seus sábios conselhos sobre a mistura de painel de anticorpos com várias cores e a preparação do controle de contas de cor única.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
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