Summary
Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.
Abstract
Die Differenzierung von Megakaryozyten (MK) umfasst eine Reihe endobiotischer Zyklen, die zu einer hochgradig polyploiden (sogar >64N reichenden) und extrem großen Zelle (40-60 μm) führen. Im Gegensatz zu dem schnell wachsenden Wissen über Megakaryopoese auf zellbiologischer und molekularer Ebene beschränkt sich die Charakterisierung der Megakaryopoese durch Durchflusszytometrie auf die Identifizierung reifer MKs mit linienspezifischen Oberflächenmarkern, während frühere MK-Differenzierungsstadien unerforscht bleiben. Hier präsentieren wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, die die Identifizierung aufeinanderfolgender MK-Differenzierungsstufen mit zunehmendem Ploidiestatus in menschlichen Primärquellen oder In-vitro-Kulturen mit einem Panel ermöglicht, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker integriert. Trotz ihrer Größe und Zerbrechlichkeit können MKs mit dem oben genannten Panel immunphänotypisiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter bestimmten Druck- und Düsendurchmesserbedingungen angereichert werden. Dieser Ansatz ermöglicht Multi-Omics-Studien mit dem Ziel, die Komplexität der Megakaryopoese und der Thrombozytenproduktion beim Menschen besser zu verstehen. Eine bessere Charakterisierung der Megakaryopoese kann für die Diagnose oder Prognose von abstammungsbedingten Pathologien und Malignitäten von grundlegender Bedeutung sein.
Introduction
Megakaryozyten (MKs) entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) nach einem komplexen Prozess namens Megakaryopoese, der hauptsächlich durch das Hormon Thrombopoietin (TPO) orchestriert wird. Die klassische Sicht der Megakaryopoese beschreibt die zelluläre Reise von HSCs durch eine Abfolge von hierarchischen Stadien engagierter Vorläufer und Vorläuferzellen, die letztendlich zu einem reifen MK führen. Während der Reifung erleben MKs mehrere Runden der Endomitose, entwickeln ein kompliziertes intrazelluläres Demarkationsmembransystem (DMS), das genügend Membranoberfläche für die Thrombozytenproduktion bietet, und produzieren und verpacken effizient die Fülle von Faktoren, die in den verschiedenen Granula enthalten sind, die von reifen Blutplättchen vererbt werden1,2,3. Infolgedessen sind reife MKs große Zellen (40-60 μm), die durch einen stark polyploiden Kern (bis >64N) gekennzeichnet sind. Jüngste Studien schlagen alternative Wege vor, auf denen sich HSCs in MKs differenzieren, die traditionelle Lineage-Commitment-Checkpoints als Reaktion auf bestimmte physiopathologischeBedingungenumgehen 4,5,6,7,8,9,10,11. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hämatopoetische Differenzierung zum reifen MK ein Kontinuum und ein adaptiver Prozess ist, der auf biologische Bedürfnisse reagiert.
Mit dem zunehmenden Wissen über die Zellbiologie und die molekularen Aspekte, die die Megakaryopoese12charakterisieren, beschränkt sich der Großteil der Forschung, die der Untersuchung des Prozesses durch Durchflusszytometrie gewidmet ist, auf die Identifizierung reifer MKs mit linienspezifischen Oberflächenmarkern(d. H. CD42A / B, CD41 / CD61), während frühere MK-Differenzierungsstadien unerforscht bleiben. Wir haben zuvor eine Strategie zur Inszenierung der Megakaryopoese in Mausknochenmark und knochenmarkabgeleiteten MK-Kulturen13,14dokumentiert, die wir angepasst und auf den Menschen angewendet haben15. Im vorliegenden Artikel zeigen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, die die Charakterisierung der Megakaryopoese von HSCs bis hin zu reifen MKs in menschlichen Primärquellen (Knochenmark -BM- und peripheres Blut -PB-) oder in vitro-Kulturen unter Verwendung eines Panels ermöglicht, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker (u.a. CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT und CD71) integriert. Trotz ihrer größe und Zerbrechlichkeit können MKs mit den oben genannten Zelloberflächenmarkern immunphänotypisiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter bestimmten Druck- und Düsendurchmesserbedingungen angereichert werden, um Zellrupturen und / oder Schäden zu minimieren. Diese Technik ermöglicht Multi-Omics-Ansätze mit dem Ziel, die Komplexität der Megakaryopoese und der Thrombozytenproduktion in der menschlichen Gesundheit und Krankheit besser zu verstehen. Bemerkenswert ist, dass es sich als nützliches Werkzeug zur Unterstützung der Diagnose und Prognose in einem klinischen Kontext wachsender Nachfrage ässt.
In diesem Manuskript dokumentieren wir eine Strategie zur Inszenierung der menschlichen Megakaryopoese mit einem Panel, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker aus Primärquellen integriert oder in vitroerzeugt. Zusätzlich stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer die bevorzugten Fraktionen und ausgereiften MKs zu sortieren (Abbildung 1). Dieser Schritt ist nicht beliebt, da er aufgrund der Größe und Zerbrechlichkeit von MKs technisch schwierig ist. Es wurde jedoch sowohl in Maus- als auch in menschlichen Knochenmarkproben zuvor und aufgrund des technologischen Fortschritts mit einem besseren Ergebnis jedes Mal16,17,18verwendet. Zu den primären Quellen des Menschen, bei denen MKs oder MK-Vorläufer untersucht werden können, gehören unter anderem Knochenmark, Nabelschnurblut und peripheres Blut. Die richtige Probenverarbeitung, um die relevante Zellfraktion für die Analyse an jeder Probe zu isolieren, ist von Bedeutung. Standardverfahren werden integriert, wobei einige Überlegungen zu berücksichtigen sind, wenn es um die Untersuchung der Megakaryopoese geht.
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Protocol
Vollblut- und Knochenmarkproben wurden gemäß der Deklaration von Helsinki von 1964 gewonnen und verarbeitet. Vollblutproben wurden von gesunden Spendern nach Erteilung der Einwilligung nach Aufklärung (ISPA) im Rahmen einer Studie gewonnen, die von unserem institutionellen medizinischen Ethikkomitee (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-) genehmigt wurde. Knochenmarkproben wurden aus Knochenmarkabwurfmaterial von Patienten gewonnen, die in der Abteilung für Hämatologie des Krankenhauses Clínico San Carlos (HCSC) behandelt wurden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des in diesem Manuskript dokumentierten Protokolls. Die primären menschlichen Quellen oder Primärkulturen, in denen die MK-Differenzierung durch Immunphänotypisierung inszeniert werden kann, sind angegeben. Diese Immunphänotypisierungsstrategie kann auf die Untersuchung des Prozesses in verschiedenen abstammungsbezogenen Pathologien oder Malignität in Primärquellen angewendet werden. Darüber hinaus ermöglicht es die Zellsortierung von MKs und Precursoren mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer, der die weitere Analyse angereicherter Fraktionen ermöglicht. Die verwendeten Bilder sind Teil von Servier Medical Art (SMART) by Servier und unter CC BY 3.0 lizenziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Vollblut- und Knochenmarkverarbeitung vor der Immunphänotypisierung
- Wenn Sie Vollblut (WB) aus Spenden als primäre Quelle verwenden, isolieren Sie optional die komponente der peripheren mononukleären Blutzelle (PBMC). Dies kann durch die Verwendung der Standardmäßigen differentiellen Zentrifugation in Kombination mit der Zelltrennung des Dichtegradienten erreicht werden, wie zuvor beschrieben15.
- Kurz gesagt, Zentrifugenblut bei 193 x g für 15 min (Bremse 3) bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie die obere Plasmafraktion und sammeln Sie den Buffy-Ring. 1:1 mit Phosphatpuffersalz (PBS)/Trinatriumcitratdihydrat (38 g/L, pH 7) puffern und vorsichtig ein Volumen von 25 mL auf 15 mL einer Dichtegradientenlösung (1,076 g/ml) in 50 ml Röhrchen pipetten.
- Zentrifuge für 20 min bei 1114 x g (Gaspedal 3, Bremse 3, Raumtemperatur). Entsorgen Sie die Plasmafraktion und sammeln Sie den PBMCs enthaltenden Buffy-Ring. Waschen Sie ihn durch Hinzufügen des gleichen PBS-Volumens, zentrifugieren Sie bei 435 x g für 5 min und resuspend in PBS für die weitere Verwendung.
- Alternativ können Sie eine WB-Probe (ca. 100 μL) zur Immunphänotypisierung nach dem Lysieren der roten Blutkörperchen (RBCs) und gründlichem Waschen verwenden.
- Kurz gesagt, 1:1 in eiskaltem RBC-Lysing-Puffer (4,15 gNH4Cl, 0,5 g KHCO3 und 18,5 mg EDTA (Triplex III) auf 500 mlH2O,pH 7,1-7,4) verdünnen. Warten Sie, bis die Zellsuspension translucid rot wird (3-5 min).
- Zentrifugieren Sie bei 435 x g für 5 min, bei 4 °C, und resuspendieren Sie die Zellen in PBS. Wiederholen Sie den Vorgang so oft wie nötig, um ein weißes Zellpellet zu erhalten.
- In ähnlicher Weise werden die aus dem Knochenmark gewonnenen Proben (Aspiration) direkt mit RBC-Lysingpuffer (siehe Punkt 1.2) und gründlichem Waschen verarbeitet, um mit einer klaren Einzelzellsuspension zu beginnen(Abbildung 1).
- Vermeiden Sie die Verwendung von Wirbeln zum Mischen von Proben während der Verarbeitung, da dies die zerbrechlichen MKs beschädigen kann.
HINWEIS: Dichtegradient zur Gewinnung von PBMCs kann im Vergleich zu RBC-lysiertem WB zu einer reichhaltigeren und saubereren Zellfraktion führen. Wir sollten jedoch bedenken, dass hochdichte, reife MKs in der "neutrophilen" Fraktion verloren gehen können. Dies wird in den repräsentativen Ergebnissen diskutiert.
- Vermeiden Sie die Verwendung von Wirbeln zum Mischen von Proben während der Verarbeitung, da dies die zerbrechlichen MKs beschädigen kann.
2. In-vitro-MK-Differenzierung von PBMCs
HINWEIS: MKs können in vitro von früheren Vorläufern wie CD34+ -Zellen, die in verschiedenen Primärquellen(z. B. WB / PBMCs, Nabelschnurblut, Knochenmark) vorhanden sind, und von iPSCs unterschieden werden. Es gibt verschiedene Protokolle, die zu diesem Zweck angewendet wurden. Hier verwenden wir eine von uns entwickelte Kulturmethode, die eine MK-Differenzierung von PBMCs ermöglicht, ohne dass cd34+ Vorläufer 15,19,20,21,22angereichert werden müssen.
- Dieses Protokoll besteht aus drei Kulturphasen, in denen die Konzentration von Thrombopoietin (TPO) allmählich auf Kosten von Wachstumsfaktoren ansteigt, die die Proliferation früherer Vorläufer (d. h.SCF, EPO) begünstigen, die allmählich abnehmen (Abbildung 2)15.
- Verwenden Sie für das Basismedium StemSpan SFEM, ergänzt mit 0,4% cholesterinreicher Lipidmischung und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Verwenden Sie für das Phase-I-Medium das Basismedium, das mit SCF (100 ng/ml), Erythropoietin (EPO, 0,5 U/ml) und Thrombopoietin (TPO, 30 ng/ml) ergänzt ist. Das Phase-II-Medium ist das Basismedium, ergänzt durch SCF (50 ng/ml), EPO (0,25 U/ml) und TPO (50 ng/ml). Verwenden Sie für das Phase-III-Medium das basisweise mit TPO (100 ng/ml) ergänzte Basismedium.
- Kultur-PBMCs im Phase-I-Medium. Platzieren Sie die PBMCs an Tag 6-8 in Phase II Medium und an Tag 9-12 platzieren Sie die PBMCs in Phase III Medium.
- Ersetzen Sie das Medium, indem Sie Zellen bei 435 x g für 5 min bei Raumtemperatur von Phase I bis Phase II und bei 95 x g für 5 min bei Raumtemperatur von Phase II bis Phase III zentrifugieren und in frischem Medium wieder aufbringen.
- Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5% CO2. In diesen Primärkulturen dauert die MK-Differenzierung 10-14 Tage, und Proben können zu verschiedenen Zeitpunkten während des Kulturzeitraums gezogen werden, um der MK-Differenzierung zu folgen.
- Verwenden Sie für das Basismedium StemSpan SFEM, ergänzt mit 0,4% cholesterinreicher Lipidmischung und 1% Penicillin / Streptomycin.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der PBMC-abgeleiteten MK-Kulturmethode. PBMCs von gesunden Spendern wurden nach dem von uns entwickelten Dreiphasenprotokoll kultiviert, um MK in vitro zu erzeugen (Schema angepasst von Salunkhe et al.). Gezeigt werden 15 Bilder, die an Tag 10 und Tag 13 der Kultur aufgenommen wurden. Die Bilder werden mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Probenentnahme: Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit für 5 min (95 x g) und resuspendieren Sie sie in PBS oder PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Für die Immunphänotypisierung beträgt die ideale Dichte 105-106 Zellen/100 μL (siehe Punkt 3.1). Abhängig vom Status der Kulturen(d.h. Vorhandensein von abgestorbenen Zellen, Trümmern usw.) können 1 oder 2 Wäschen erforderlich sein. Sammeln Sie Ihre Zellen zu den Zeitpunkten, die während der Kultur von Interesse sind.
3. Immunphänotypisierung der MK-Differenzierung - Inkubation mit einem Panel von Markiert-Antikörpern
- Inkubieren Sie die Zellproben mit einem Panel von markierten Antikörpern nach Standardverfahren und achten Sie bei der Verarbeitung von Megakaryozyten auf zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit (95 x g). Normalerweise inkubieren wir die Proben mit 1% BSA in PBS in Volumina von 100 μL bei 4 °C, 20 min, mit einem Bereich von 105-106 Zellen.
- Skalieren Sie bei Bedarf.
- Nach der Inkubation 5 ml 1% BSA in PBS hinzufügen, mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren (95 x g), den Überstand absaugen und die Probe in 2% BSA in PBS wieder auffüllen, um die MK-Lebensfähigkeit zu erhalten (2 ml). Fügen Sie 1-5 mM EDTA hinzu, um Zellzellaggregate (die natürlich in MK-Kulturen zu sehen sind) zu stören.
- Die Proben werden in ein 12 x 75 mm rundes Bodenrohr (FACS-Röhrchen) oder eine Platte gegeben und bis zur Durchflusszytometrie oder Zellsortierung im Dunkeln gehalten.
- Herstellung der einzelnen Antikörper und Antikörper-Panel-Mischungen; Aufbau des Durchflusszytometers:
- Titrieren Sie die Antikörper vor ihrer Verwendung, um die optimale Konzentration in den Antikörper-Panels zu bestimmen. Die optimale Konzentration von Antikörpern ist die niedrigste Konzentration, die sich deutlich von positiven von negativen Zellen trennt (und die Unterscheidung zwischengeschalteter Expressionsniveaus ermöglicht). Beispielsweise werden die meisten Antikörper in einer 1:200-Verdünnung (100 μg/ml) verwendet, sofern nicht anders titriert oder vom Hersteller angegeben.
- Sobald die Antikörpertitration bestimmt ist, bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung jedes Antikörpers vor. Diese Verdünnungen werden für die einfarbigen Kontrollen und für die Vorbereitung der Plattenmischungen verwendet. Die Verdünnungen und Plattenmischungen sind auch einen Monat nach der Zubereitung in Ordnung (bei 4 °C gelagert, es sei denn, die Herstellerangaben schließen diese Lagerbedingungen aus). Dies ermöglicht die Färbung von Proben mit der gleichen Platte über einen bestimmten Zeitraum.
- Verwenden Sie 10 μL pro 100 μL der 10-fachen Verdünnung sowohl für die einfarbigen Steuerungen als auch für den Panel-Mix.
- Verwenden Sie für die einfarbigen Kontrollen Antikörperaffinitätsperlen, die direkt nach Zugabe des Antikörpers gemessen werden können. Die einfarbigen Kontrollen sollten bei jedem Experiment gemessen werden, um eine korrekte Kompensationsanpassung (und Feinabstimmung nach der Messung mit der Analysesoftware) zu ermöglichen.
- Alternativ können Sie die einfarbigen Steuerelemente mit Zellproben ausführen. Die Perlen ermöglichen jedoch die schnelle Messung einer bestimmten Anzahl von Ereignissen, die je nach Antikörper/Oberflächenmarker an komplexen primären oder kultivierten Zellquellen möglicherweise nicht zu erhalten sind. Wir empfehlen auch, Zellproben, die mit "Fluorescence Minus One" (FMO) Panel-Mischungen gefärbt sind, durchzuführen, um die entsprechenden Kompensationseinstellungen einzurichten (vor dem Ausführen von Experimenten). Dies ist relevant, um Kompensationsprobleme sorgfältig zu identifizieren und insbesondere bei kultivierten MKs Autofluoreszenzinterferenzen zu identifizieren (die bei Verwendung von phenolrotem Kulturmedium vorliegen).
- Bereiten Sie je nach Anzahl der Proben genügend Volumen des Panel-Mixes vor, der die Antikörper des entworfenen Panels enthält. Die meisten unserer Panels enthalten sechs Antikörper (6-farbige Panels, siehe Tabellen 1-2).
- Verwenden Sie für diese Panels 488-nm- und 633-nm-Laser des Durchflusszytometers, jedoch können panels an andere technische Szenarien angepasst werden. Des Weiteren können die Kompensationsüberlegungen beim Einsatz von massenspektrometrischer Durchflusszytometrie oder Zytometern mit akustischer Fokussierungstechnologie entfällt.
- Farbstoffe zur Messung der Lebensfähigkeit können falsche Informationen über MKs geben, insbesondere wenn sie reifen. MKs sind sehr aktive Aufholzellen, und die Positivität mit Hoechst, 7-AAD oder PE spiegelt möglicherweise nicht immer den tatsächlichen Zelltod wider. Eine Alternative (wenn eine Messung des Zelltods erforderlich ist) könnte die Verwendung von Mitochondrienfärbungen (CMX Ros) oder Amin-reaktiven Farbstoffen (Zombie- oder Ghost-Farbstoffe) sein.
Tabelle 1: Hinweise zu Zelloberflächenmarkern der megakaryozyten Linie Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Antikörper-Panels Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
4. Ploidieanalyse kombiniert mit 6-Farben-Panels
- Für die Ploidieanalyse in Kombination mit einem 6-Farben-Antikörper-Panel fahren Sie mit der Fixierung und Permeabilisierung der Zellen nach der Inkubation mit dem Antikörper-Panel fort. Diese Strategie ermöglicht die Erhaltung der Oberflächenmarkerfärbung und gleichzeitig die Färbung der DNA von Zellen. Wir verwenden Hoechst 33342 zur Färbung der DNA, da sie mit dem verfügbaren violetten 405-nm-Laser visualisiert werden kann.
- Für 105-106 Zellen nach Inkubation mit dem Antikörperpanel Zentrifugenzellen (95 x g für 5 min), in 200 μL Fixationspuffer resuspendieren und 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Zentrifugenzellen wie oben angegeben, ein zweites Mal in 200 μL Fixationspuffer resuspendiert und weitere 10 Minuten bei RT inkubiert.
- Permeabilisierungspuffer mit 0,1% Triton X-100, 200 mg/ml RNase und 20 mg/ml Hoechst 33342 (Permeabilisierung Hoechst MIX) vorbereiten.
- Zentrifugenzellen wie oben, resuspendieren Sie sie in 300 μL der Permeabilisation Hoechst MIX und inkubieren Sie 30 min bei 37 °C. Dieser Schritt ist sehr wichtig, da für eine saubere Ploidiemessung RNA abgebaut werden muss.
- Nach der Inkubationszeit messen Sie die Proben direkt mit einem Durchflusszytometer. Andernfalls die Proben bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren. Messen Sie sie umgehend. Da diese Proben jedoch fixiert sind, kann die Messung sogar um 24-48 Stunden verzögert werden. Stellen Sie sicher, dass die Probe vor der Messung gründlich geflickt oder durch ein Zellsieb geleitet wird, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Morphometrische Parameter wie Forward und Side Scatter werden nach der Zellfixierung nicht beibehalten. Das Vorwärts-/Seitenstreudiagramm zeigt eine Schrumpfung der Zellverteilung nach der Fixierung. Die Oberflächenmarkerfärbung bleibt jedoch weitgehend erhalten, und die Gating-Strategie wird kaum verändert, so dass der Ploidiestatus in den verschiedenen Differenzierungsstadien, die durch Oberflächenmarkerkombinationen definiert sind, analysiert werden kann.
5. MK-Differenzierungsanalyse
HINWEIS: Wir haben gesehen, dass die Kombination von CD31/ CD71 es ermöglicht, eine Reihe von Gattern einzustellen, die verschiedenen Stufen der MK-Differenzierung entsprechen. Weiteres Backgating mit MK-spezifischen Markern ermöglicht die Trennung von reifen und unreifen MKs. Darüber hinaus verfeinert das Backgating zur Überprüfung des Vorhandenseins anderer verwendeter Marker oder zur Unterplatzierung der Populationen in den Vorwärts- / Seitenstreuachsen in frischen Proben die Bewertung der MK-Differenzierungsstufen und ermöglicht es, andere Zelltypen zu verwerfen, die auf denselben Populationen vorhanden sein könnten.
- Verwenden Sie ein Panel von Antikörpern, das frühe Vorläufermarker (KIT, CD34), gemeinsame Vorläufermarker (CD31, CD71) und Abstammungsmarker umfasst, von denen einige spezifisch sind (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI usw.) (siehe Tabellen 1-2). Die Verwendung von Lineage (Lin) Cocktail (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 und CD56) ermöglicht es auch, reife hämatopoetische Zellen "herauszufiltern", die der Analyse Rauschen hinzufügen könnten (bei der Auswahl derLin-Population). Als Beispiel werden wir die Analyse von MKs in PBMCs, Knochenmark und durch PBMC-abgeleitete Zellkulturen in den repräsentativen Ergebnissen durchgehen.
6. MK- und MK-Vorläuferzellensortierung
HINWEIS: Die gefärbten Zellen wurden auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer FACS Aria IIu analysiert und sortiert, der mit 488-nm- und 633-nm-Standard-Festkörperlasern mit der FACSDiva-Software ausgestattet ist. Zusätzlich wurden die Daten mit der FlowJo-Software und Cytobank (viSNE-Analyse) analysiert und präsentiert. Die Reinheit der sortierten Fraktionen wurde durch durch durchflusszytometrische Analyse jeder der sortierten Fraktionen bestätigt (Reinheit über 85%).
- Führen Sie die Zellsortierung so schnell wie möglich oder innerhalb von 1 Stunde nach der Antikörperinkubation durch, um eine Zellverschlechterung zu vermeiden.
- Filtern Sie die Probe mit einem 100 μm Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension und die Integrität von großem MK zu gewährleisten.
- Verwenden Sie eine 130-μm-Keramikdüse, einen Manteldruck, der auf 11 Pfund pro Quadratzoll (PSI) eingestellt ist, und die Drop-Drive-Frequenz auf 12 kHz, um den Strom in Tropfen zu unterteilen.
- Vor der Sortierung sterilisieren Sie die Düse, den Mantel und die Probenlinien, indem Sie eine 30-minütige Erfassung mit Penicillin / Streptomycin durchführen, das 1:5 in sterilem Wasser verdünnt wird, gefolgt von einer 10-minütigen Erfassung mit sterilem Wasser, um das verbleibende Dekontaminationsmittel zu entfernen.
- Sobald sich der Strom stabilisiert hat, stellen Sie die Drop-Delay mit empfohlenen Perlen ein, um im Feinabstimmungsmodus mehr als 97,5% der reflektierten Tropfen bei einer Durchflussrate von 400-1200 Ereignissen pro Sekunde zu sortieren.
- Vorbereitung der Entnahme-FACS-Röhrchen mit 500 μL 2% BSA in PBS. Der Prozentsatz der BSA kann auf bis zu 5-10% erhöht werden.
- Generieren Sie die Experimentvorlage mit den richtigen Kompensationsmatrixparametern.
- Laden Sie das FACS-Röhrchen in das Zytometer.
- Führen Sie eine Messung der Probe durch, um die gewünschten Gatter und die Reinheit der Zielzellpopulationen einzustellen. Behalten Sie den Datensatz aktiviert, um während der Zellsortierung bis zu 200.000 Ereignisse in den ausgewählten Populationstoren anzuzeigen.
- FACS Aria IIu ermöglicht die Trennung von bis zu 4 verschiedenen Zellpopulationen gleichzeitig. Erstellen Sie ein neues Sortierlayout und wählen Sie das Sammelgerät (4 Röhrchen) und den entsprechenden Präzisionsmodus (Zwischenmaske für Reinheit und Wiederherstellung wird empfohlen). Fügen Sie abschließend die Interessierenheit(en) zu jedem Sortierortfeld hinzu (Abbildung 3).
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Prinzips der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS). Die Partikel durchlaufen die 130 μm-Düse und werden gezwungen, sich durch die Anwendung von Vibrationen auf die Düse in einen Strom regelmäßiger Tröpfchen aufzulösen. Als nächstes werden die Tröpfchen vom Laser abgefragt (Analysepunkt) und die Signale werden verarbeitet, um die "Sortierentscheidung" zu treffen, indem eine Ladung auf diese Tröpfchen angewendet wird. Wenn ein Ladungströpfchen ein elektrostatisches Hochspannungsfeld (Detektionsplatte) passiert, wird es abgelenkt und in das entsprechende Sammelrohr eingesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Laden Sie die Sammelröhrchen und beginnen Sie mit der Sortierung der Zielpopulationen.
- Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen für 5 Minuten bei 95 x g und resuspendieren Sie das Zellpellet im entsprechenden Volumen von 2% BSA in PBS.
- Messen Sie erneut einen Bruchteil jeder sortierten Probe, um die Reinheit zu berechnen.
- Lagern Sie die Zellen für die weitere Verwendung angemessen. Sortierte Zellen können für zytologische und molekulare Analysen verwendet oder mit dem Ziel rekultiert werden, den Differenzierungsprozess einer ausgewählten Zellpopulation zu untersuchen.
7. Probenvorbereitung nach dem Sortieren
- Vorbereitung von Zytospinen für die zytologische Analyse mit einer Zytozentrifuge
- Bringen Sie sortierte Zellen auf ein einfach zu handhabendes Arbeitsvolumen von 100-200 μL. Berücksichtigen Sie, dass die Zelldichte jeweils von der sortierten Populationsausbeute abhängt.
- Legen Sie einen sauberen Schieber auf den Metallhalter und platzieren Sie eine Filteroberplatte. Denken Sie daran, den Objektträger und den Filter zu beschriften, um das Mischen von Proben zu vermeiden.
- Fügen Sie 100 μL PBS auf dem Filterloch gegen den Schlitten hinzu, damit der Filter auf dem Lochrand befeuchtet wird.
- Legen Sie den Trichter, schließen Sie den Metallhalter und legen Sie ihn an seiner Stelle in die Zentrifuge.
- Fügen Sie die Probe (100-200 μL) in den Trichter hinzu.
- Zentrifuge bei 36 x g für 5 Minuten. Die Cytospin-Objektträger können bei RT an der Luft trocknen (richtig abgedeckt, um Staub zu vermeiden) und können vor der Immunfärbung oder Histochemie 1 Woche lang bei RT aufbewahrt werden.
- Zur Immunfärbung
- Fixieren Sie Die Objektträger in 2% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in PBS und inkubieren Sie sie während 5 Minuten.
- Ein Bereich von 0,5-4% PFA in PBS kann verwendet werden. In unseren Händen verwenden wir 4%, um eine korrekte Fixierung von Geweben oder einigen Zelltypen zu erhalten, und 0,5% PFA in PBS ist ausreichend für Blutplättchen. Beim Einrichten dieser Technik muss der richtige Prozentsatz an PFA pro Zelltyp/Quelle optimiert werden.
- Inkubieren Sie 5 Minuten in PBS.
- Inkubieren Sie 5 min in 50% Ethanol (EtOH).
- Inkubieren Sie 5 min in 70% EtOH.
- In 70% EtOH bei -20ºC lagern.
- Bei der Durchführung der Immunfärbung rehydrieren und Standardverfahren befolgen (Permeabilisierung, Waschen, Blockieren, primäre und sekundäre Antikörperinkubationen, Konservierung usw.).
- Fixieren Sie Die Objektträger in 2% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in PBS und inkubieren Sie sie während 5 Minuten.
- Für die Zytochemie:
HINWEIS: Die Dias können mit May-Grünwald Giemsa Färbung oder der praktischen Färbung für jeden Zweck gefärbt werden. - Zur sofortigen morphologischen Untersuchung
- Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium auf die zellhaltige Stelle des Zytospins hinzu und legen Sie einen Coverlip.
- Halten Sie die Dias bei 4 °C nicht länger als eine Woche, es sei denn, sie sind versiegelt, was eine langfristige Lagerung auch bei RT ermöglicht.
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Representative Results
Knochenmark und Ploidie
In Abbildung 4zeigenwir eine repräsentative Immunphänotypisierungsanalyse der Megakaryopoese in BM-Proben (Aspiration) von Patienten. Bei der Darstellung der Zellfraktion gegen CD71 und CD31 haben wir sechs Hauptpopulationen einbezahlt: CD31- CD71- (rot), CD31- CD71+ (blau), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71Mid (hellgrün), CD31+ CD71+ (dunkelgrün) und CD31++ CD71Mid (Creme). Diese Populationen sind nicht immer an den gleichen Positionen vorhanden (unter Berücksichtigung konstanter Zytometereinstellungen), wie es zu sehen ist, und das sollte berücksichtigt werden. Dies könnte dem pathologischen Zustand und dem Knochenmarkstatus innewohnen. Das Backgating dieser sechs Populationen, die in Histogrammen gegen einen im Panel enthaltenen Reifungsmarker (CD42A/CD42B) und gegen die Vorwärtsstreuung überlagert sind, ist rechts dargestellt. Die Abbildung zeigt auch ein Diagramm gegen CD31/CD71, das eine Überlagerung der CD42B+ -Zellen mit dem gesamten zellularen Anteil darstellt, um die Verteilung der reiferen MKs zu visualisieren. Im Allgemeinen enthält die Population CD31- CD71- keine MKs oder Abstammungsvorläufer, stellt keine MK-Reifungsmarker dar und ist kleiner. Die CD31- CD71+ Population enthält hauptsächlich Zellen der erythroiden Linie, obwohl sie auch gemeinsame Abstammungsvorläufer enthalten kann, wie wir aus unseren Beobachtungen vermuten. Es bleibt negativ für MK-Reifungsmarker, und abhängig vom Anteil früherer oder späterer erythroider Zellen kann die Vorwärtsstreuung ebenfalls schwanken.
Zum Beispiel hat der Patient mit myelodysplastischem Syndrom (MDS) im Vergleich zu anderen Patienten einen größeren Anteil an unreifen(d.h.größeren) erythroiden Zellen. MK-Vorläufer und reife Zellen verteilen sich in den CD31+ -Zellen, mit einigen Variationen. Wie jedoch beim Vergleich der BM-Analyse für jede Pathologie zu sehen ist, gibt es einige konstante Merkmale. Reifere MKs sind in der CD31++ CD71-Mittelpopulation (Creme) vorhanden, und Pathologien, bei denen diese Reifung "blockiert" ist, umfassen Immunthrombozytopenie (ITP) und eine reaktive BM-Probe (mit zugrunde liegender Entzündung). Während beim Lymphompatienten ein Gleichgewicht zwischen frühen Vorstufen und späten MKs (Orange und Cream Gates) zu bestehen scheint, ist dieser Anteil beim MDS-Patienten (mit mehr "blockierten" Vorläufern) und beim Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) (mit reiferen MKs) verändert. Interessanterweise scheint die "Blockade" unterschiedlich zu sein, wenn man Pathologien untereinander vergleicht: Bei Pathologien, die mit der zugrunde liegenden Entzündung übereinstimmen, könnte die Blockade auf eine Kombination von Reifungsdefekten, Zerstörung(dhAutoimmunität) und Thrombozytenproduktion durch MK-Ruptur zurückzuführen sein.
Abbildung 4: Immunphänotyìng der Megakaryopoese in menschlichen Knochenmarkproben von Patienten mit unterschiedlichen Pathologien. Repräsentative Knochenmarkproben (BM) von Patienten mit Lymphom(d.h.normalem BM), myelodysplastischem Syndrom (MDS), akuter myeloischer Leukämie (AML), Immunthrombozytopenie (ITP) und einem Patienten mit einem reaktiven BM aufgrund einer Infektion wurden analysiert. Bei der Auftakte der zellulären Fraktion(d.h.nukleierter Zellen) gegen CD71 und CD31 haben wir sechs Hauptpopulationen gated: CD31- CD71- (rot), CD31- CD71+ (blau), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71mid (hellgrün), CD31+ CD71+ (dunkelgrün) und CD31++ CD71mid (creme). Diese Populationen sind nicht immer in den gleichen Positionen vorhanden (unter Berücksichtigung stetiger Zytometereinstellungen), wie es zu sehen ist, und das sollte berücksichtigt werden. Das Backgating dieser sechs Populationen, die in Histogrammen gegen einen im Panel enthaltenen Reifungsmarker (CD42A/CD42B) und gegen die Vorwärtsstreuung überlagert sind, ist rechts dargestellt. Die Abbildung zeigt auch ein Diagramm gegen CD31/CD71, das eine Überlagerung der CD42B+ -Zellen mit dem gesamten zellularen Anteil darstellt, um die Verteilung der reiferen MKs zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Als nächstes machten wir uns daran, den Ploidiestatus der oben genannten Populationen an menschlichen BM-Proben zu analysieren. Abbildung 5 zeigt einen zunehmenden Ploidiestatus innerhalb der CD31+ -Populationen, von dem wir erwarten, dass er für jeden pathologischen Kontext unterschiedlich und charakteristisch sein wird. Beachten Sie, dass aufgrund der in diesen Experimenten verwendeten Zellfixierung und Permeabilisierung die Punktdiagramme nicht vollständig mit denen von unfixierten, nicht permeabilisierten Proben vergleichbar sind (Abbildung 4).
Abbildung 5: Ploidieanalyse der auf der Grundlage der CD31/CD71-Expression ausgewählten Populationen in menschlichen BM-Proben. Repräsentative Knochenmarkproben (BM) von Patienten, bei denen akute myeloische Leukämie (AML) und Immunthrombozytopenie (ITP) diagnostiziert wurden. Bei der Auftakte der zellulären Fraktion(d.h.nukleierter Zellen) gegen CD71 und CD31 haben wir sechs Hauptpopulationen gated: CD31- CD71- (rot), CD31- CD71+ (blau), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71mid (hellgrün), CD31+ CD71+ (dunkelgrün) und CD31++ CD71mid (creme). Diese Populationen sind nicht immer in den gleichen Positionen vorhanden (unter Berücksichtigung stetiger Zytometereinstellungen), wie es zu sehen ist, und das sollte berücksichtigt werden. Die Rückführung dieser sechs in Histogrammen überlagerten Populationen gegen Hoechst 33342 zeigt den unterschiedlichen Ploidiestatus der Populationen und die allgemeine Tendenz, die Ploidie mit der Reifung zu erhöhen (obwohl MKs unabhängig vom Polyploidisierungsstatus die Reife erreichen können). Es werden Zahlen dargestellt, die den Toren im Punktdiagramm und den Histogrammüberlagerungen entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
PBMCs und Zellkultur
In Abbildung 6zeigen wir eine repräsentative Immunphänotypisierungsanalyse von PBMCs und der MK-Kultur mit diesen PBMCs an Tag 7 und Tag 11. Wir verwenden ein Panel mit dem Lin-Cocktail und zeigen den zellulären Anteil lebender Zellen vor und nach derLin-Selektion. Diese negative Selektion kann zum Verlust eines Teils der MKs führen, die beispielsweise CD14 mitexprimieren, aber sie ermöglicht auch eine verfeinerte Analyse. Bei der Darstellung derLin-Fraktion gegen CD71 und CD31 haben wir fünf Hauptpopulationen einbezahlt: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid und CD31++ CD71mid. Diese Populationen sind nicht immer an den gleichen Positionen vorhanden (unter Berücksichtigung konstanter Zytometereinstellungen), wie es zu sehen ist, und das sollte berücksichtigt werden. In diesem Fall sind die Unterschiede nicht nur dem individuellen Gesundheits- oder pathologischen Status inhärent, sondern auch der MK-Differenzierungsfähigkeit der Vorläufer in der PBMC-Fraktion. Das Backgating dieser fünf Populationen, die in Histogrammen gegen andere im Panel enthaltene Marker (KIT und CD42B) und gegen die Forward Scatter überlagert sind, ist rechts dargestellt. MK-Vorläufer und MKs in verschiedenen Stadien der Reifung befinden sich innerhalb der CD31+ -Populationen.
Abbildung 6: Immunphänotypisierung der Megakaryopoese während der MK-Zellkultur, einschließlich des PBMC-Ausgangsmaterials. Repräsentative Immunphänotypisierungsanalyse von PBMCs und der MK-Kultur mit diesen PBMCs an Tag 7 und Tag 11. Wir verwenden ein Panel mit dem Lin-Cocktail und zeigen die zelluläre Fraktion(d.h.kernhaltige Zellen) vor und nach der Lin-Selektion. Diese negative Selektion kann zum Verlust eines Teils der MKs führen, die beispielsweise CD14 mitexprimieren, aber sie ermöglicht auch eine verfeinerte Analyse. Bei der Darstellung der Lin-Fraktion gegen CD71 und CD31 haben wir fünf Hauptpopulationen einbestellt: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid und CD31++ CD71mid. Diese Populationen sind nicht immer in den gleichen Positionen vorhanden (unter Berücksichtigung stetiger Zytometereinstellungen), wie es zu sehen ist, und das sollte berücksichtigt werden. Das Backgating dieser fünf Populationen, die in Histogrammen gegen andere im Panel enthaltene Marker (KIT und CD42B) und gegen die Forward Scatter überlagert sind, ist rechts dargestellt. MK-Vorläufer und MKs in verschiedenen Stadien der Reifung befinden sich innerhalb der CD31+ -Populationen. Die Abbildung zeigt auch ein Diagramm gegen CD31/CD71, das eine Überlagerung der CD42B+ -Zellen mit dem gesamten zellularen Anteil darstellt, um die Verteilung der reiferen MKs zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 3: Populationsprozentsätze der Durchflusszytometrie-Analysen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
In PBMCs befinden sich MKs innerhalb des CD31++ CD71Mid Gate, obwohl ihre Größe nicht so groß ist, wie wir es bei kultivierten MKs gesehen haben. Dies kann auf eine der beiden folgenden Optionen zurückzuführen sein: MKs in PBMCs stellen einen Bruchteil unreifer MKs dar, die in den Kreislauf gelangen, oder einen Bruchteil reifer zirkulierender MKs, die die zytoplasmatische Komplexität verloren haben. Unsere Sortierexperimente legen nahe, dass Letzteres der Grund für diesen Größenunterschied sein könnte. Die Expression von CD42B, die diese Vorstellung unterstützt, ist in 100% der Zellen auf diesen Populationen nicht vorhanden (wie sie auch in BM-Proben in Abbildung 4zu sehen ist), wahrscheinlich aufgrund des Verlustes von Oberflächenmarkern bei der Bildung von Proplättchen und / oder Thrombozytenabwurf. In kultivierten Proben sind die MKs in den "reifen" Gattern jedoch fast 100% CD42B+und größer. Diese hypothetisierte zelluläre Dynamik sollte weiter untersucht und validiert werden.
Aufgrund der pleiotropen Effekte von TPO sind diese Kulturen heterogen und asynchron, was es per se schwierig macht, diskrete MK-Differenzierungsstadien weiter zu analysieren. 19,20 Nach der Expansion früherer Vorläufertiere werden MKs in verschiedenen Reifestadien von Tag 6-10 (oder früher, aufgrund der Spendervariabilität) in der Kultur erscheinen und allmählich an Zahl zunehmen, wenn die MK-Linien-gebundenen Zellen in Richtung MK reifen. Einige MKs durchlaufen eine terminale Differenzierung und beginnen mit der Bildung von Proplättchen. Gegen Ende der Kultur wird es zu einem allmählichen Anstieg des Zellverlustes aufgrund von "Milderung/Erschöpfung" nach Thrombozytenbildung und Thrombozytenabwurf oder Zelltod kommen (Abbildung 2).
Wenn TPO-Analoga anstelle von rekombinantem TPO verwendet werden, sollten die Konzentrationen getestet werden.
Die Quelle der Vorläufer (Erwachsener, Nabelschnurblut) wird die Kulturen konditionieren, da MKs aus Quellen verschiedener Entwicklungsstadien ihre eigenen Eigenschaften haben. Darüber hinaus werden Kulturen aus angereicherten CD34+ Vorläufern, während sie zu Beginn der Kultur homogener erscheinen, ein Stadium der Heterogenität und Asynchronität erreichen, sobald MK Engagement und Differenzierung beginnt19,20.
MK-Zellsortierung
In Abbildung 7zeigen wir eine repräsentative Gating-Strategie einer Probe von MK in vitro Kultur am Tag 10 der Differenzierung. Wenn wir die nukleierte Zellfraktion gegen CD31 und CD71 oder die Vorwärtsstreuung aufzeichnen, können wir zwei Hauptpopulationen unterscheiden, die durch das Vorhandensein oder Fehlen von CD31 gekennzeichnet sind.
Wenn wir die CD31+ -Fraktion gegen CD41 und CD71 auftakten, können wir vier Hauptpopulationen gaten: CD41- CD71- (1), CD41niedrige CD71+ (2), CD41niedrige CD71+++ (3) und CD41+++ CD71+ (4), in denen andere Oberflächenmarker (KIT und CD49B) differentiell exprimiert wurden, was die Identifizierung des MK-Kompartiments als CD41-hochpositive Zellen ermöglicht (Abbildung 7A). Die Reinheit der sortierten Fraktionen wird gezeigt, ebenso wie zytologische Färbungen von Zytospinen der sortierten Fraktionen.
Um das Zellpopulationsspektrum in PBMC-MK-Kulturen zu charakterisieren, wurde die viSNE-Analyse eingesetzt (Abbildung 7B). Die viSNE-Karte unterteilt Zellen in räumlich unterschiedliche Teilmengen basierend auf der Kombination von Markern, die sie ausdrücken. Jeder Punkt in der viSNE-Analyse stellt eine einzelne Zelle dar, die nach den Expressionsniveaus von CD31, CD42A, CD71 und KIT gefärbt ist.
Doppelt negative Zellen (CD31- und CD71-) sind hauptsächlich Restlymphozyten (Population 5), die unter diesen Bedingungen in der gesamten Kultur bestehen bleiben. Diese Population wurde in einer zweiten Runde der Zellsortierung unter Verwendung des verbleibenden Teils der Probe sortiert.
Gates 6 und 7 sindCD71-Zellen mit mittlerer und hoher Exprimierung, zu denen erythroide Vorläufer und möglicherweise andere Vorläufer gehören.
Wir müssen die technischen Schwierigkeiten berücksichtigen, die sich aus der zellheterogenen Natur dieser Kulturmethode und der klebrigen Natur reifer MKs ergeben, die dazu führt, dass reife MKs in Subpopulationen, in die sie nicht gehören, vorliegen (siehe Abschnitt Anmerkungen).
Abbildung 7: Immunphänotypische Analyse von 10-tägigen In-vitro-Kultur-MKs vorsortieren. A) Repräsentative Gating-Strategie mit CD31, CD41 und CD71, mit zwei Sortierrunden, was zu CD31+ Populationen 1-4 und CD31- Populationen 5-7 führt. Die Reinheit jeder sortierten Fraktion wurde nach der Sortierung analysiert und zusammen mit einer repräsentativen Mikrofotografie von gefärbten Zytospinen aus jeder sortierten Fraktion dargestellt. B) viSNE-Karte der PBMC-abgeleiteten MK-Kulturzellen vom Tag 10, gemessen durch Durchflusszytometrie. Die Karte wird unter Verwendung der Expressionsniveaus von CD31, CD42B, CD71 und KIT erstellt, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Nachsortierung
Die sortierten Populationen können mit verschiedenen Methoden analysiert werden, einschließlich zytologischer und molekularer Analyse durch Immunfluoreszenz (siehe Abschnitt 7), um die MK-Merkmale in einem spezifischen physiopathologischen Kontext zu bewerten oder den Prozess der Megakaryopoese besser zu untersuchen. Einige Beispiele sind in Abbildung 8 dargestellt.
Abbildung 8. MK-Analyse nach dem Sortieren. A) Zytologische Analyse des sortierten MK-Kompartiments aus einer 10-tägigen In-vitro-Kultur. Die May-Grünwald Giemsa-Färbung ermöglicht die Beobachtung von Schlüsselmerkmalen reifer MKs, d.h.Pseudopodenbildung (roter Pfeil), hochpolyploider MK (blauer Pfeil). B) Immunfluoreszenzanalyse. Die Zellen wurden mit dem anti-humanen von-Willebrand-Faktor (dargestellt in rot, sekundärer Antikörper Alexa Fluor 555 Goat Anti-Maus-IgG), anti-humanem CD31 oder Tandem-CD41/CD61 gefärbt, beide konjugiert mit FITC (grün dargestellt) und Kern-DNA wurde mit DAPI markiert (blau dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Bemerkungen:
MKs können aus unerwarteten Regionen sortiert werden, da zellen an ihre Membran anhaften können (Abbildung 9). Dieses Problem kann ein Problem sein, um hochreine Zellsubpopulationen zu erhalten. Um Zellzellaggregate zu minimieren, können den Panel-Mix-Puffern 1-5 mM EDTA hinzugefügt werden.
Darüber hinaus schlugen wir bei der Verwendung von WB als Ausgangsmaterial vor, entweder PBMCs oder Lysing RBCs zu erhalten, um die zelluläre Fraktion direkt zu verwenden. In Abbildung 10 zeigen wir die Durchflusszytometrie-Analyse der beiden Methoden. Auf der einen Seite haben wir bei der Analyse von RBCs und der Analyse des gesamten Zellkompartiments immer noch eine große Menge an Neutrophilen. Diese können mit einem bestimmten Marker (oder mit der Lin-Cocktail-Strategie) herausgefiltert werden. Wir können jedoch einige MKs aufgrund ihrer promiskuitiven Natur im Zusammenhang mit dem Oberflächenmarkerausdruck verlieren. Auf der anderen Seite ermöglicht uns die PBMC-Isolierung, sowohl Neutrophile als auch RBCs loszuwerden, obwohl wir die MKs mit höherer Dichte verlieren können(dhdiejenigen mit komplexeren zytoplasmatischen Merkmalen oder unreifer). Wie in Abbildung 10gezeigt, zeigen MKs aus lysiertem WB eine höhere Expression von Reifungsmarkern, die bei der Isolierung von PBMCs niedriger erscheint. Der Dichtegradient könnte zum Verlust der MKs führen, die noch ein komplexes Zytoplasma enthalten, während die in der PBMC-Fraktion enthaltenen bereits nach der Freisetzung von Blutplättchen im Kreislauf "erschöpft" sein könnten und somit den polyploiden Kern in einem weniger komplexen Zytoplasma erhalten. Sie sollten nicht mit unreifen MKs verwechselt werden. Jedes Verfahren hat seine Vor- und Nachteile.
Abbildung 9. Die klebrige Natur von MKs. MKs können in unerwarteten Toren gefunden werden, da sie Zellen an ihre Membran anbringen können. A-C) MKs sortiert in den Populationen 1 (B) und 5 (A und C), entsprechend der Gating-Strategie für die MK-Sortierung. Dieses Problem kann ein Problem sein, um hochreine Zellsubpopulationen zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10. Durchflusszytometrie Immunphänotypisierung von MKs aus PBMCs oder WB nach Lysing der RBCs. A) Gating-Strategie. B) Größe (FSC), zelluläre Komplexität (SSC) und Expression von CD42A, CD41, CD71 und KIT in MKs, wie in PBMCs oder WB identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der größte Teil der Forschung, die sich auf die Untersuchung der Megakaryopoese mittels Durchflusszytometrie konzentriert, beschränkt sich bisher auf die Identifizierung von MK-Untergruppen, die nur linienspezifische Oberflächenmarker(d. H.CD42A / CD42B, CD41 / CD61) verwenden, während frühere MK-Differenzierungsstadien schlecht untersucht wurden. Im vorliegenden Artikel zeigen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, um eine umfassende durchflusszytometrische Charakterisierung der menschlichen Megakaryopoese anzugehen. Insgesamt möchten wir den Nutzen der Kombination von MK-spezifischen und unspezifischen Oberflächenmarkern (Tabellen 1 und 2) im selben Durchflusszytometrie-Antikörperpanel für die Untersuchung der Megakaryopoese detaillierter hervorheben. Unser neuartiger Ansatz könnte als leistungsfähiges Werkzeug zur Unterstützung der Diagnose und/oder Prognose bei hämatologischen Erkrankungen dienen. Wir sind der Ansicht, dass die vorgestellten Panels und Kombinationen nicht endgültig sind. Wir haben ein sehr dynamisches Verhalten von Oberflächenmarkern in menschlichen Primärquellen (hauptsächlich in BM-Proben) beobachtet, das auch von der subjazenten Pathologie abhängt. Weitere Studien sind erforderlich, und hoffentlich wird die wissenschaftliche Gemeinschaft beginnen, diesen Ansatz auf Feedback mit Beobachtungen aus Studien anzuwenden, die sich auf eine einzelne Pathologie konzentrieren und wie das Megakaryopoese-Staging bei der Diagnose oder Prognose helfen kann. Die Implementierung einer kombinierten HSC- und MK-Charakterisierung in Primärgeweben ist unter Berücksichtigung der vielfältigen Wege für mk-Engagement, wie im Einleitungsabschnitt kommentiert, von Relevanz und weiterentwicklungswürdig. Die Tatsache, dass wir auch MKs in PBMCs nachweisen können, ist eine ziemliche Beobachtung. Wir gehen auch davon aus, dass die Analyse von MKs in dieser primären Quelle bei der Diagnose und Prognose von Krankheiten als sehr relevante Alternative zu BM-Aspiraten helfen wird, da die Extraktion einer Blutprobe nicht so invasiv ist. Auch dieser Aspekt erfordert Entwicklung.
Trotz der technischen Einschränkungen, die mit den biologischen Eigenschaften von MKs verbunden sind (Große Größe, osmotische Zerbrechlichkeit, Klebrigkeit), konnten wir verschiedene Reifestadien in mehreren menschlichen MK-Quellen sortieren, insbesondere in BM-, PBMCs- und PBMCs-abgeleiteten Zellkulturen. Zukünftige Studien werden durchgeführt, um die Besonderheiten der Megakaryopoese in anderen menschlichen Quellen wie Nabelschnurblut und in verschiedenen physiopathologischen Situationen zu analysieren. Darüber hinaus sollte das Differenzierungspotenzial jeder gated und sortierten Zellfraktion in koloniebildenden Einheiten (CFU) Assays von MK-Vorläufern (CFU-MK) bewertet werden, um das Differenzierungspotenzial jeder Population auf der Megakaryopoese-Reise objektiv zu bewerten. Während die technischen Einschränkungen überschritten werden, von denen einst angenommen wurde, dass sie die Art von reifen Megakaryozyten behindern, erfordert eine solche Notwendigkeit immer noch mehr Perfektion. Auf der einen Seite würde Einzelzell-Omics umfassende Studien bei der Anwendung der Immunphänotypisierungspanels ermöglichen, aber wenn eine physische Sortierung erforderlich ist, obwohl die Reinheit der sortierten Populationen über 85% liegt (basierend auf der Oberflächenmarkerexpression), müssen andere Variablen berücksichtigt werden, die immer noch schwer zu lösen sind. Wie bereits erwähnt, sind MK-Kulturen nicht synchron und sehr heterogen. MKs selbst sind promiskuitiv in der Oberflächenmarkerexpression und teilen Marker mit anderen myeloischen und nicht-myeloischen hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen. Darüber hinaus sind sie sehr schwer mit den morphometrischen Variablen (Forward und Side Scatter) zu gruppieren, da sie weit verteilt sind. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Anwendung zu verfeinern, aber mit gemeinsamen Anstrengungen sind wir näher daran, die Megakaryopoese einzugrenzen.
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Disclosures
Die Produktion von audiovisuellem Material wurde von BD Biosciences unterstützt.
Acknowledgments
Wir danken Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo und Begoña García Méndez (HUCA) sowie Paloma Cerezo, Almudena Payero und María de la Poveda-Colomo (HCSC) für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch Medical Grants (Roche SP200221001) an A.B., ein RYC-Stipendium (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) und einem I+D 2017 Grant (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien und Fondos FEDER) an L.G., ein Severo Ochoa Grant (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanien) bis P.M.-B. und ein intramurales Postdoc-Stipendium 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Spanien) an A.A.-H. Wir danken Reinier van der Linden für den Austausch seines Wissens (und seiner Zeit), insbesondere seiner klugen Ratschläge zur mehrfarbigen Mischung aus markierten Antikörpern und zur Vorbereitung der einfarbigen Perlenkontrolle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
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