Summary
Burada, megakaryosit farklılaşmasının karakterizasyonu için bir immünofenotyping stratejisi sunuyoruz ve bu stratejinin floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcısı ile megakaryositlerin farklı aşamalarda sıralanmasına nasıl izin verdiğini gösteriyoruz. Metodoloji insan birincil dokularına uygulanabilir, aynı zamanda kültür in vitroundaüretilen megakaryositlere de uygulanabilir.
Abstract
Megakaryosit (MK) farklılaşması, yüksek poliploid (hatta >64N'ye) ve son derece büyük bir hücreye (40-60 μm) neden olan bir dizi endomitotik döngüyü kapsar. Hücre biyolojisi ve moleküler düzeyde megakaryopoeziste hızla artan bilginin aksine, megakaryopoezisin akış sitometrisi ile karakterizasyonu, olgun MK'lerin soyuna özgü yüzey belirteçleri kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıdır, daha önceki MK farklılaşma aşamaları ise keşfedilmemiştir. Burada, insan birincil kaynaklarında veya in vitro kültürlerde art arda gelen MK farklılaşma aşamalarının, MK spesifik ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini entegre eden bir panelle tanımlanmasını sağlayan bir immünofenomileme stratejisi sunuyoruz. Boyutuna ve kırılganlığına rağmen, MK'ler yukarıda belirtilen panel kullanılarak immünofenotipe edilebilir ve belirli basınç ve nozül çapı koşulları altında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile zenginleştirilebilir. Bu yaklaşım, insanlarda megakaryopoez ve trombosit üretiminin karmaşıklığını daha iyi anlamak amacıyla çoklu Omics çalışmalarını kolaylaştırır. Megakaryopoezisin daha iyi nitelendirmesi, soyla ilgili patolojilerin ve malignitenin tanısında veya prognozunda temel teşkil edebilir.
Introduction
Megakaryositler (MKs), özellikle trombopoietin (TPO) hormonu tarafından düzenlenen megakaryopoezis adı verilen karmaşık bir sürecin ardından hematopoetik kök hücrelerden (HSC' ler) gelişir. Megakaryopoezis'in klasik görünümü, HSC'lerden, taahhüt edilen ataların ve öncü hücrelerin hiyerarşik aşamalarının ardışık olarak ardışık olarak hücresel yolculuğunu açıklar ve sonuçta olgun bir MK'ye yol açan. Olgunlaşma sırasında, MK'ler birden fazla endokatoz turu yaşar, trombosit üretimi için yeterli membran yüzeyi sağlayan karmaşık bir hücre içi sınır membran sistemi (DMS) geliştirir ve olguntrombositler1,2,3tarafından miras kalan farklı granüllerde bulunan faktörlerin bolluğunu verimli bir şekilde üretir ve paketler. Sonuç olarak, olgun MK'ler oldukça poliploid bir çekirdekle karakterize edilen büyük hücrelerdir (40-60 μm) (>64N'ye bile ulaşır). Son çalışmalar, HSC'lerin belirli fizyo-patolojik koşullara yanıt olarak geleneksel soy taahhüt kontrol noktalarını atlayarak MK'lere farklılık gösterdiği alternatif rotalar önermektedir4,5,6,7,8,9,10,11. Bu bulgular, olgun MK'ya karşı hematopoetik farklılaşmanın biyolojik ihtiyaçlara cevap veren sürekli ve uyarlanabilir bir süreç olduğunu vurgulamaktadır.
Hücre biyolojisi ve megakaryopoezis12'yikarakterize eden moleküler yönler hakkında artan bilgi ile, sürecin akış sitometrisi ile incelenmesine adanmış araştırmaların çoğu, olgun MK'lerin soyuna özgü yüzey belirteçleri (cd42A /B, CD41 / CD61) kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıdır, daha önceki MK farklılaşma aşamaları ise keşfedilmemiştir. Daha önce megakaryopoez'i fare kemik iliği ve kemik iliği türevi MK kültürlerinde sahneleme stratejisini belgeledik13,14, uyarladık ve insanlara uyguladık15. Bu yazıda megakaryopoezlerin karakterizasyonuna izin veren bir immünofenomipi stratejisi gösteriyoruz, HSC'lerden olgun MK'lere, insan birincil kaynaklarında (kemik iliği -BM- ve periferik kan -PB-) veya in vitro kültürlerde MK'ye özgü ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT ve CD71) entegre eden bir panel kullanarak. Büyük boyutuna ve kırılganlığına rağmen, MK'ler yukarıda belirtilen hücre yüzeyi belirteçleri kullanılarak immünofipotip edilebilir ve hücre yırtılmasını ve/veya hasarını en aza indirmek için belirli basınç ve nozül çapı koşullarında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile zenginleştirilebilir. Bu teknik, megakaryopoez ve trombosit üretiminin insan sağlığı ve hastalığındaki karmaşıklığını daha iyi anlamak amacıyla çoklu Omics yaklaşımlarını kolaylaştırır. Dikkat çekici, artan talebin klinik bağlamında tanı ve prognoza yardımcı olmak için yararlı bir araç olarak ortaya çıkacaktır.
Bu yazıda, birincil kaynaklardan MK'ya özgü ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini entegre eden veya in vitrooluşturulan bir panel ile insan megakaryopoezini sahneleme stratejisini belgeleyeceğiz. Ayrıca, floresanla etkinleştirilmiş bir hücre sıralayıcısı, tercih edilen kesirler ve olgun MK'ler ile sıralamak için bir protokol sağlıyoruz (Şekil 1). Bu adım popüler değildir, çünkü MK'lerin büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle teknik olarak zordur. Bununla birlikte, daha önce hem fare hem de insan kemik iliği örneklerinde ve teknolojik ilerleme nedeniyle, her seferinde daha iyi bir sonuçla16,17,18. MK'lerin veya MK öncüllerinin çalışılabildiği insan birincil kaynakları arasında kemik iliği, kordon kanı ve periferik kan bulunur. Her numune üzerinde analiz için ilgili hücre fraksiyonunu izole etmek için uygun numune işleme önemlidir. Standart prosedürler, megakaryopoez çalışmasını hedeflerken dikkate alınması gereken bazı hususlarla dahil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1964 Helsinki Bildirgesi uyarınca tam kan ve kemik iliği örnekleri alınarak işlendi. Kurumsal tıbbi etik komitemiz (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-) tarafından onaylanan bir çalışma dahilinde, bilinçli onay (ISPA) verildikten sonra sağlıklı donörlerden tam kan örnekleri alındı. Clínico San Carlos Hastanesi Hematoloji Bölümü'nde (HCSC) yönetilen hastaların kemik iliği aspirat atma materyalinden kemik iliği örnekleri alındı.
Şekil 1: Bu yazıda belgelenen protokolün şematik gösterimi. İmmünafotipleme kullanılarak MK farklılaşması yapılabilen birincil insan kaynakları veya birincil kültürler belirtilir. Bu immünofenoniping stratejisi, sürecin farklı soyla ilgili patolojilerde veya birincil kaynaklarda malignitede incelenmesine uygulanabilir. Ek olarak, zenginleştirilmiş fraksiyonların daha fazla analizini sağlayan floresan ile etkinleştirilmiş bir hücre sıralayıcısı ile MK'lerin ve öncüllerin hücre sıralamasını mümkün kılar. Kullanılan görüntüler Servier tarafından Servier Medical Art'ın (SMART) bir parçasıdır ve CC BY 3.0 altında lisanslanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. İmmünofenosipsiyondan önce tam kan ve kemik iliği işleme
- Bağışlardan elde edilen tam kanı (WB) birincil kaynak olarak kullanırken, isteğe bağlı olarak periferik kan mononükleer hücre (PBMC) bileşenini izole edin. Bu, daha önce açıklandığı gibi yoğunluk gradyan hücre ayrımı ile birlikte standart diferansiyel santrifüjleme kullanılarak elde edilebilir15.
- Kısacası, oda sıcaklığında 15 dakika (fren 3) için 193 x g'da santrifüj kanı. Üst plazma fraksiyonunu atın ve buffy halkasını toplayın. 1:1'i fosfat tampon salin (PBS)/Trisodium Sitrat Dihidrat (38 g/L, pH 7) tampon ve pipet ile 50 mL'lik tüplerde 15 mL yoğunluk gradyan çözeltisinin (1.076 g/mL) üzerine 25 mL'lik bir hacimle dikkatlice seyreltin.
- 1114 x g'da 20 dakika santrifüj (hızlandırıcı 3, fren 3, oda sıcaklığı). Plazma fraksiyonunu atın ve PBMC'leri içeren buffy halkayı toplayın.
- Alternatif olarak, kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) ve iyice yıkadıktan sonra immünofenotiping için bir WB örneği (yaklaşık 100 μL) kullanın.
- Kısacası, buz gibi RBC liz tamponunda 1:1 seyreltin (4.15 g NH4Cl, 0.5 g KHCO3 ve 18.5 mg EDTA (tripleks III) ila 500 mL H2O, pH 7.1-7.4). Hücre süspansiyonu yarı saydam kırmızı olana kadar bekleyin (3-5 dk).
- 5 dakika boyunca 435 x g'da, 4 °C'de santrifüj ve PBS'deki hücreleri yeniden biriktirin. Beyaz bir hücre peleli elde etmek için prosedürü gerektiği kadar tekrarlayın.
- Benzer şekilde, kemik iliğinden (aspirasyon) elde edilen örnekleri doğrudan RBC lising tamponu (bkz. nokta 1.2) ve net bir tek hücreli süspansiyonla başlamak üzere iyice yıkama ile işleyin (Şekil 1).
- Hassas MK'lere zarar verebileceğinden, işleme sırasında numuneleri karıştırmak için girdap kullanımından kaçının.
NOT: PBMC'leri elde etmek için yoğunluk gradyanı, RBC-lysed WB ile karşılaştırıldığında daha zengin ve daha temiz bir hücre fraksiyonu ile sonuçlanabilir. Bununla birlikte, yüksek yoğunluklu, olgun MK'lerin "nötrofil" fraksiyonunda kaybolabileceğini unutmamalıyız. Bu, temsili sonuçlarda tartışılacaktır.
- Hassas MK'lere zarar verebileceğinden, işleme sırasında numuneleri karıştırmak için girdap kullanımından kaçının.
2. PBMC'lerden in vitro MK farklılaşması
NOT: MK'ler in vitro olarak farklı birincil kaynaklarda (örneğin, WB/PBMC'ler, kordonkanı, kemik iliği) bulunan CD34+ hücreleri gibi önceki öncüllerden ve iPSC'lerden ayırt edilebilir. Bu amaçla uygulanan farklı protokoller vardır. Burada, CD34+ öncüller 15 , 19,20,21,22için zenginleştirmeye gerek kalmadan MK'lerin PBMC'lerden farklılaşmasına izin veren bizim geliştirdiğimiz bir kültür yöntemi kullanıyoruz.
- Bu protokol, trombopoietin (TPO) konsantrasyonunun, daha önceki öncüllerin(yaniSCF, EPO) çoğalmasını destekleyen büyüme faktörleri pahasına kademeli olarak arttığı üç kültür aşamasından oluşur ve bu aşama giderek azalır (Şekil 2)15.
- Temel ortam için, kolesterol zengin lipid karışımının% 0.4'ü ve% 1 Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiş StemSpan SFEM kullanın.
- Faz I ortamı için SCF (100 ng/mL), Eritropoietin (EPO, 0,5 U/mL) ve Trombopoietin (TPO, 30 ng/mL) ile desteklenmiş temel ortamı kullanın. Faz II ortamı SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) ve TPO (50 ng/mL) ile desteklenmiş temel ortamdır. Faz III ortamı için, TPO (100 ng/mL) ile desteklenmiş temel ortamı kullanın.
- Aşama I ortamında Kültür PBMC'leri. 6-8. günde PBMC'leri Faz II ortamına, 9-12.
- Aşama I'den Faz II'ye kadar oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 435 x g'da ve Faz II'den Faz III'e oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 95 x g'da hücreleri santrifüj ederek ve taze ortamda yeniden depolayarak ortamı değiştirin.
- 37 °C'de bir inkübatörde kültür hücreleri, % 5 CO2. Bu birincil kültürlerde, MK farklılaşması 10-14 gün sürer ve MK farklılaşmasını takip etmek için kültür dönemi boyunca farklı zaman noktalarında örnekler çizilebilir.
- Temel ortam için, kolesterol zengin lipid karışımının% 0.4'ü ve% 1 Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiş StemSpan SFEM kullanın.
Şekil 2: PBMC türevi MK kültür yönteminin şematik gösterimi. Sağlıklı donörlerden pbmc'ler, MK in vitro (Salunkhe ve ark.'dan uyarlanan şema) oluşturmak için geliştirdiğimiz üç fazlı protokole göre kültürlendi. Kültürün 10. ve 13. gününde çekilen 15 fotoğraf gösterilmiştir. Fotoğraflar 20X hedefiyle çekilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Örnek toplama: Hücreleri 5 dakika (95 x g) düşük hızlı santrifüj uygulayarak yıkayın ve sığır serum albüminin (BSA) % 1'ini içeren PBS veya PBS'de yeniden uygulayın. İmmünafotipleme için ideal yoğunluk 105 -106 hücre/100 μL'dir (bkz. nokta 3.1). Kültürlerin durumuna bağlı olarak(yani ölü hücrelerin varlığı, döküntüler vb.), 1 veya 2 yıkama gerekebilir. Kültür sırasında ilgi çekici zaman noktalarında hücrelerinizi toplayın.
3. MK farklılaşması immünofenotiping - etiketli antikorlar paneli ile inkübasyon
- Hücre örneklerini standart prosedürleri takip eden bir etiketli antikor paneli ile kuluçkaya yatırarak, megakaryositleri işlerken düşük hızda (95 x g) santrifüje dikkat edin. Normalde PBS'de %1 BSA olan numuneleri 100 μL hacimlerde 4 °C, 20 dk, 105 -106 hücre aralığında kuluçkaya yatırıyoruz.
- Gerektiğinde ölçeği büyüt.
- İnkübasyondan sonra, PBS'de % 1 BSA'nın 5 mL'sini ekleyin, düşük hızda santrifüj (95 x g), süpernatantı aspire edin ve MK canlılığını (2 mL) korumak için örneği PBS'de% 2 BSA'da yeniden dirildi. Hücre-hücre agregalarını bozmak için 1-5 mM EDTA ekleyin (MK kültürlerinde doğal olarak görülür).
- Numuneleri 12 x 75 mm yuvarlak alt tüpe (FACS tüpü) veya plakaya aktarın, akış sitometri analizine veya hücre sıralamaya kadar karanlıkta tutun.
- Tek antikor ve antikor paneli karışımlarının hazırlanması; akış sitometresini ayarlama:
- Antikor panellerindeki en uygun konsantrasyonu belirlemek için kullanmadan önce antikorları titrat. Antikorların optimal konsantrasyonu, negatif hücrelerden açıkça pozitif ayıran (ve orta düzeyde ifadenin ayırt olmasına izin veren) en düşük konsantrasyondur. Örnek olarak, antikorların çoğu, üretici tarafından aksi belirtilmedikçe veya belirtilmedikçe 1:200 seyreltmede (stok 100 μg/ mL) kullanılır.
- Antikor titrasyonu belirlendikten sonra, her antikorun 10x seyreltilmesini hazırlayın. Bu seyreltmeler tek renkli kontroller ve panel karışımlarının hazırlanması için kullanılır. Seyreltmeler ve panel karışımları, hazırlık işleminden bir ay sonra bile kullanım için iyidir (üreticinin endikasyonları bu depolama koşullarını engellemediği sürece 4 °C'de saklanır). Bu, bir zaman dilimi boyunca aynı panele sahip örneklerin boyanmalarına izin verir.
- Hem tek renkli kontroller hem de panel karışımı için 10x seyreltmenin 100 μL'si başına 10 μL kullanın.
- Tek renkli kontroller için, antikor ekledikten sonra doğrudan ölçülebilen antikor benzeşim boncukları kullanın. Tek renkli kontroller, uygun kompanzasyon ayarına (ve analiz yazılımı ile ölçüm sonrası ince ayar yapılmasına) izin vermek için her denemede ölçülmelidir.
- Alternatif olarak, hücre örnekleriyle tek renkli denetimleri gerçekleştirin. Bununla birlikte, boncuklar, antikor/ yüzey işaretçisine bağlı olarak karmaşık birincil veya kültürlü hücre kaynaklarında elde edilmesi mümkün olmayabilecek belirli sayıda olayın hızlı bir şekilde ölçülmesine izin verir. Ayrıca, uygun telafi ayarlarını ayarlamak için (denemeleri çalıştırmadan önce) "Floresan Eksi Bir" (FMO) panel karışımları ile boyanmış hücre örneklerini çalıştırmanızı tavsiye ederiz. Bu, tazminat sorunlarını dikkatlice tanımlamak ve özellikle kültürlü MK'lerde otoflüoresans parazitlerini tanımlamak için geçerlidir (fenol kırmızısı içeren kültür ortamı kullanılsaydı mevcut olacaktır).
- Tasarlanan panelin antikorlarını içeren numune sayısına bağlı olarak panel karışımının yeterli hacmini hazırlayın. Panellerimizin çoğu altı antikor içerir (6 renkli paneller, bkz. Tablolar 1-2).
- Bu paneller için akış sitometresinin 488-nm ve 633-nm lazerlerini kullanın, ancak paneller diğer teknik senaryolara uyarlanabilir. Ayrıca, kütle spektrometresi bazlı akış sitometrisi veya akustik odaklama teknolojisine sahip sitometreler kullanılırken kompanzasyon hususları ortadan bırakılabilir.
- Uygulanabilirliği ölçmek için boyalar, özellikle olgunlaştıklarında MK'ler hakkında yanlış bilgi verebilir. MK'ler çok aktif alma hücreleridir ve Hoechst, 7-AAD veya PE ile pozitiflik her zaman gerçek hücre ölümünü yansıtmayabilir. Bir alternatif (hücre ölümü ölçümü gerekiyorsa) mitokondri lekelerinin (CMX Ros) veya amin reaktif boyalarının (Zombi veya Hayalet boyaları) kullanılması olabilir.
Tablo 1: Megakaryositik soyun hücre yüzeyi işaretleyicileri ile ilgili notlar Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Antikor panelleri Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
4. Ploidy analizi 6 renkli panellerle birleştirildi
- Ploidy analizi için, 6 renkli bir antikor paneli ile birlikte, antikor paneli ile inkübasyondan sonra hücrelerin sabitlenmesi ve permeabilizasyonu ile devam edin. Bu strateji, yüzey işaretleyici lekelerinin korunmasına izin verirken, hücrelerin DNA'sının lekelenebilmesini sağlayacaktır. Mevcut menekşe 405-nm lazer ile görselleştirilebildiği için DNA'yı lekelemek için Hoechst 33342 kullanıyoruz.
- 105 -106 hücre için, antikor paneli ile inkübasyondan sonra, santrifüj hücreleri (5 dakika için 95 x g), 200 μL fiksasyon tamponunda yeniden depolayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika kuluçkalayın.
- Yukarıda belirtildiği gibi santrifüj hücreleri, 200 μL sabitleme tamponunda ikinci kez yeniden biriktirilir ve RT'de 10 dakika daha kuluçkaya yatırılabilir.
- %0,1 Triton X-100, 200 mg/mL RNaz ve 20 mg/mL Hoechst 33342 (permeabilizasyon Hoechst MIX) içeren permeabilizasyon tamponunu hazırlayın.
- Yukarıdaki gibi santrifüj hücreleri, permeabilizasyon Hoechst MIX'in 300 μL'sinde yeniden biriktirin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bu adım çok önemlidir, çünkü temiz bir ploidy ölçümü elde etmek için RNA'nın bozulması gerekir.
- Kuluçka süresinden sonra, numuneleri doğrudan bir akış sitometresi ile ölçün. Aksi takdirde, numuneleri 4 °C'de, karanlıkta tutun. Bunları derhal ölçün. Ancak bu numuneler sabit olduğundan ölçüm 24-48 saat bile geciktirilebilir. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için numunenin ölçümden önce iyice hareket ettirildiklerine veya bir hücre süzgecinden geçirildiklerine emin olun.
- hücre fiksasyonundan sonra İleri ve Yan Dağılım gibi morfometrik parametreler korunmaz. İleri/Yan Dağılım grafiği, sabitlemeden sonra hücre dağılımının büzüldüğünü gösterir. Bununla birlikte, yüzey işaretleyici lekeleme çoğunlukla korunur ve gating stratejisi zar zor değiştirilir ve yüzey işaretleyici kombinasyonları tarafından tanımlanan farklılaşma aşamalarında ploidy durumunun analizine izin verir.
5. MK farklılaşma analizi
NOT: CD31/CD71 kombinasyonunun MK farklılaşmanın farklı aşamalarına karşılık gelen bir dizi kapı ayarlamaya izin verdiğini gördük. MK'ya özgü işaretleyicilerle daha fazla geri geçiş, olgun ve olgunlaşmamış MK'lerin ayrılmasını sağlar. Ayrıca, taze örneklerde, kullanılan diğer belirteçlerin varlığını doğrulamak veya popülasyonları İleri/Yan Saçılma eksenlerine yerleştirmek için arka kapı, MK farklılaşma aşamalarının değerlendirilmesini iyileştirir ve aynı popülasyonlarda bulunabilecek diğer hücre türlerinin atılmasını sağlar.
- Erken öncü işaretleyiciler (KIT, CD34), ortak öncü işaretleyiciler (CD31, CD71) ve bazıları spesifik (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, vb.) içeren bir antikor paneli kullanın (bkz. Tablolar 1-2). Lineage (Lin) kokteylinin (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 ve CD56) kullanımı, analize gürültü ekleyebilecek olgun hematopoetik hücreleri "filtrelemeye" de izin verir (Lin- popülasyonu seçerken). Örnek olarak, PBMC'lerde, kemik iliğinde ve PBMC türevi hücre kültürlerinde MK'lerin analizini temsili sonuçlarda yapacağız.
6. MK ve MK öncü hücre sıralama
NOT: Lekeli hücreler, FACSDiva yazılımı kullanılarak 488-nm ve 633-nm standart katı hal lazerleri ile donatılmış floresanla etkinleştirilmiş bir hücre sıralayıcı facs Aria IIu üzerinde analiz edildi ve sıralandı; veriler ayrıca FlowJo yazılımı ve Cytobank (viSNE analizi) kullanılarak analiz edildi ve sunuldu. Sıralanmış fraksiyonların saflığı, sıralanmış fraksiyonların her birinin akış sitometri analizi ile doğrulandı (saflık% 85'in üzerinde).
- Hücre bozulmasını önlemek için hücre sıralamasını mümkün olan en kısa sürede veya antikor inkübasyonundan sonraki 1 saat içinde gerçekleştirin.
- Tek hücre süspansiyonunu ve büyük MK'nın bütünlüğünü sağlamak için numuneyi 100 μm hücre süzgeçle filtreleyin.
- 130-μm seramik nozulu, inç kare başına 11 pound (PSI) olarak ayarlanmış bir kılıfa basınca ve akışı damlalara bölmek için 12 kHz'e ayarlanmış damla sürücü frekansı kullanın.
- Sıralamadan önce, steril suda 1:5 seyreltilmiş Penisilin/ Streptomisin ile 30 dakikalık bir alım gerçekleştirerek nozül, kılıfta ve numune çizgilerini sterilize edin, ardından kalan dekontaminantları gidermek için steril su ile 10 dakikalık bir alım.
- Akış sabitlendikten sonra, saniyede 400-1200 olay akış hızında yansıyan düşüşlerin% 97,5'inden fazlasını ince ayar modunda sıralamak için damla gecikmesini önerilen boncuklarla ayarlayın.
- PBS'de %2 BSA'nın 500 μL'si ile toplama FACS tüpleri hazırlayın. BSA yüzdesi% 5-10'a kadar artırılabilir.
- Deneme şablonlarını uygun ücret matrisi parametreleriyle oluşturun.
- FACS tüpünü sitometreye yükleyin.
- Hedef hücre popülasyonlarının istenen kapılarını ve saflığını ayarlamak için numunenin ölçümünü gerçekleştirin. Hücre sıralama sırasında seçilen nüfus kapılarında 200.000'e kadar olayı göstermek için etkinleştirilen kaydı koruyun.
- FACS Aria IIu, aynı anda 4 farklı hücre popülasyonunun ayrılmasına izin verir. Yeni bir sıralama düzeni oluşturun ve toplama cihazını (4 tüp) ve uygun hassas modu seçin (ara saflık ve kurtarma maskesi önerilir). Son olarak, her sıralama konumu alanına ilgi alanlarını ekleyin (Şekil 3).
Şekil 3: Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) ilkesinin şematik gösterimi. Parçacıklar 130 μm-nozülden geçer ve nozüle titreşim uygulanması nedeniyle düzenli damlacık akışına ayrılmaya zorlanır. Daha sonra, damlacıklar lazer (analiz noktası) tarafından sorgulanır ve sinyaller bu damlacıklara bir yük uygulanarak ''sıralama kararı' vermek için işlenir. Bir yük damlası yüksek voltajlı bir elektrostatik alandan (algılama plakası) geçtiğinde, saptırılır ve ilgili toplama tüpüne toplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Toplama tüplerini yükleyin ve hedef popülasyonları sıralamaya başlayın.
- Toplama tüplerini 95 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve hücre peletini PBS'de% 2 BSA'nın uygun hacminde yeniden dürtün.
- Saflığı hesaplamak için sıralanmış her örneğin bir kısmını yeniden ölçün.
- Hücreleri daha fazla kullanım için uygun şekilde depolayın. Sıralanmış hücreler sitolojik ve moleküler analizler için kullanılabilir veya seçilen bir hücre popülasyonunun farklılaşma sürecini incelemek amacıyla yeniden kültürlenebilir.
7. Sıra sonrası numune hazırlama
- Sitospinlerin sitosantrifüj ile sitolojik analize hazırlanması
- Sıralanmış hücreleri 100-200 μL'lik kullanımı kolay bir çalışma hacmine getirin. Hücre yoğunluğunun her durumda sıralanmış popülasyon verimine bağlı olacağını göz önünde bulundurun.
- Metal tutucuya temiz bir slayt yerleştirin ve bir filtre üst yerleştirin. Örneklerin karıştırılmasını önlemek için slaydı ve filtreyi etiketlemeyi unutmayın.
- Filtre deliğine slayda karşı 100 μL PBS ekleyin, böylece filtre delik kenarında nemlendirilir.
- Huniyi yerleştirin, metal tutucuyu kapatın ve santrifüjdeki yerine yerleştirin.
- Huninin içine numuneyi (100-200 μL) ekleyin.
- 5 dakika boyunca 36 x g'da santrifüjleyin. Sitospin slaytlarının RT'de havayla kurumasına izin verilebilir (tozu önlemek için uygun şekilde kaplanır) ve immünostainleme veya histokimyadan önce 1 hafta RT'de tutulabilir.
- İmmünasyon için
- Slaytları PBS'de seyreltilmiş %2 paraformaldehitte (PFA) sabitleyin ve 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- PBS'de %0,5-4 PFA aralığı kullanılabilir. Elimizde, dokuların veya bazı hücre tiplerinin uygun şekilde sabitlenmesi için% 4 kullanıyoruz ve PBS'deki% 0.5 PFA trombositler için yeterlidir. Bu tekniği ayarlarken, DOĞRU PFA yüzdesi hücre türü/kaynağı başına iyileştirme gerektirir.
- PBS'de 5 dk kuluçkaya yaslanın.
- %50 etanolde (EtOH) 5 dk kuluçkaya yaslanın.
- %70 EtOH'da 5 dk kuluçkaya yaslanın.
- %70 EtOH'da -20ºC'de saklayın.
- İmmünasyon yaparken, yeniden sulandırma ve standart prosedürleri (permeabilizasyon, yıkama, blokaj, birincil ve ikincil antikor inkübasyonları, koruma vb.) uygulayın.
- Slaytları PBS'de seyreltilmiş %2 paraformaldehitte (PFA) sabitleyin ve 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Sitokimetri için:
NOT: Slaytlar May-Grünwald Giemsa boyama veya her amaç için uygun boyama ile boyanabilir. - Acil morfoloji incelemesi için
- Sitospin hücre içeren noktasına bir damla montaj ortamı ekleyin ve bir kapak parçası yerleştirin.
- Rt'de bile uzun süreli depolamaya izin veren sızdırmazlık olmadığı sürece slaytları bir haftadan uzun olmayan 4 °C'de tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik İliği ve Ploidy
Şekil 4'tehastalardan alınan BM örneklerinde (aspirasyon) megakaryopoezin temsili immünofenotiping analizini gösteriyoruz. Hücresel fraksiyonu CD71 ve CD31'e göre çizerken, altı ana popülasyonu eledik: CD31- CD71- (kırmızı), CD31- CD71+ (mavi), CD31+ CD71- (turuncu), CD31+ CD71orta (açık yeşil), CD31+ CD71+ (koyu yeşil) ve CD31++ CD71orta (krem). Bu popülasyonlar her zaman aynı konumlarda (sabit sitometre ayarları göz önüne alındığında) mevcut değildir ve bu dikkate alınmalıdır. Bu patolojik durumun ve kemik iliğinin doğasında olabilir. Histogramlarda panelde bulunan bir olgunlaşma işaretçisine (CD42A/CD42B) ve İleri Saçılım'a karşı kaplanmış bu altı popülasyonun arkadan gatingi sağda gösterilir. Şekil ayrıca CD31/CD71'e karşı, daha olgun MK'lerin dağılımını görselleştirmek için cd42B+ hücrelerin toplam hücresel fraksiyonu ile bir kaplamasını gösteren bir çizim göstermektedir. Genel anlamda, CD31- CD71- popülasyonu MK veya soy öncülleri içermez, MK olgunlaşma belirteçleri sunmaz ve boyutu daha küçüktür. CD31- CD71+ popülasyonu esas olarak eritiroid soyunun hücrelerini içerir, ancak gözlemlerimizden hipotez ettiğimiz gibi ortak soy öncülleri de içerebilir. MK olgunlaşma belirteçleri için negatif kalır ve daha önceki veya daha sonraki eritroid hücrelerin oranına bağlı olarak, İleri Saçılım da dalgalanabilir.
Örnek olarak, miyelodisplastik sendrom (MDS) hastası, diğer hastalara kıyasla daha büyük oranda olgunlaşmamış(yanidaha büyük) eritroid hücrelere sahiptir. MK progenitörleri ve olgun hücreler CD31+ hücrelerinde bazı varyasyonlarla dağıtılacaktır. Bununla birlikte, her patoloji üzerindeki BM analizini karşılaştırdığı görülebileceği gibi, bazı sabit özellikler vardır. CD31++ CD71orta popülasyonunda (krem) daha olgun MK'ler bulunur ve bu olgunlaşmanın "engellendiği" patolojiler arasında İmmün Trombositopeni (ITP) ve reaktif bir BM örneği (altta bulunan iltihaplı) bulunur. Lenfoma hastasında erken öncüller ile geç MK'lar (turuncu ve krem kapılar) arasında bir denge olduğu düşünülürken, bu oran MDS hastasında (daha "tıkalı" öncüllerle) ve akut miyeloid lösemi (AML) hastasında (daha olgun MK'lerle) değiştirilir. İlgi çekici olan, "abluka" kendi aralarında patolojileri karşılaştıran farklı görünüyor: altta yatan iltihapla aynı fikirde olan patolojilerde, tıkanıklık olgunlaşma kusurları, yıkım(yaniotoimmünite) ve MK rüptürü ile trombosit üretiminin bir kombinasyonundan kaynaklanıyor olabilir.
Şekil 4: Farklı patolojileri olan hastalardan alınan insan kemik iliği örneklerinde megakaryopoez immünofenotyìng. Lenfoma(yaninormal BM), miyelodisplastik sendrom (MDS), akut miyeloid lösemi (AML), immün trombositopeni (İtP) tanısı alan hastalardan ve enfeksiyona bağlı reaktif BM'li bir hastadan alınan temsili kemik iliği (BM) örnekleri analiz edildi. Hücresel fraksiyonu(yaniçekirdekli hücreler) CD71 ve CD31'e karşı çizerken, altı ana popülasyonu eledik: CD31- CD71- (kırmızı), CD31- CD71+ (mavi), CD31+ CD71- (turuncu), CD31+ CD71orta (açık yeşil), CD31+ CD71+ (koyu yeşil) ve CD31++ CD71orta (krem). Bu popülasyonlar her zaman aynı pozisyonlarda (sabit sitometre ayarları göz önüne alındığında) mevcut değildir ve bu dikkate alınmalıdır. Histogramlarda panelde bulunan bir olgunlaşma işaretçisine (CD42A/CD42B) ve İleri Saçılım'a karşı kaplanmış bu altı popülasyonun arkadan gatingi sağda gösterilir. Şekil ayrıca CD31/CD71'e karşı, cd42B+ hücrelerinin toplam hücresel fraksiyonu ile birlikte daha olgun MK'lerin dağılımını görselleştirmek için bir çizim göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Daha sonra insan BM örneklerinde yukarıda belirtilen popülasyonların ploidy durumunu analiz etmek için yola çıktık. Şekil 5, CD31+ popülasyonları içinde, her patolojik bağlam için farklı ve karakteristik olacağını öngördüğümuz artan bir ploidy durumunu göstermektedir. Bu deneylerde kullanılan hücre fiksasyonu ve permeabilizasyon nedeniyle, nokta çizimlerinin düzeltilmemiş, dengelenmemiş örneklerinkiyle tamamen karşılaştırılamaz olduğunu unutmayın (Şekil 4).
Şekil 5: İnsan BM örneklerinde CD31/CD71 ekspresyona göre seçilen popülasyonların ploidy analizi. Akut miyeloid lösemi (AML) ve immün trombositopeni (ITP) tanısı alan hastalardan temsili kemik iliği (BM) örnekleri. Hücresel fraksiyonu(yaniçekirdekli hücreler) CD71 ve CD31'e karşı çizerken, altı ana popülasyonu eledik: CD31- CD71- (kırmızı), CD31- CD71+ (mavi), CD31+ CD71- (turuncu), CD31+ CD71orta (açık yeşil), CD31+ CD71+ (koyu yeşil) ve CD31++ CD71orta (krem). Bu popülasyonlar her zaman aynı pozisyonlarda (sabit sitometre ayarları göz önüne alındığında) mevcut değildir ve bu dikkate alınmalıdır. Histogramlarda Hoechst 33342'ye karşı üst üste binen bu altı popülasyonun geriye doğru örtülmesi, popülasyonların farklı ploidy durumunu ve olgunlaşma ile ploidy'yi artırma eğilimini gösterir (MK'ler poliploidizasyon durumundan bağımsız olarak olgunluğa ulaşabilse de). Nokta çizimi ve histogram kaplamalarındaki kapılarla eşleşen sayılar tasvir edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PBMC'ler ve Hücre Kültürü
Şekil 6'da, PBMC'lerin ve MK kültürünün 7. Lin kokteylini içeren bir panel kullanıyoruz ve Lin- seçiminden önce ve sonra canlı hücrelerin hücresel fraksiyonunu gösteriyoruz. Bu olumsuz seçim, örneğin CD14 gibi MK'lerin bazı kesirlerinin birlikte ifade edilmesine neden olabilir, ancak daha rafine bir analize de izin verir. Lin- fraksiyonu CD71 ve CD31'e karşı çizerken, beş ana popülasyonu kapladık: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71orta ve CD31++ CD71orta. Bu popülasyonlar her zaman aynı konumlarda (sabit sitometre ayarları göz önüne alındığında) mevcut değildir ve bu dikkate alınmalıdır. Bu durumda, farklılıklar sadece bireysel sağlık veya patolojik durumun doğasında değil, aynı zamanda PBMC fraksiyonundaki öncüllerin MK farklılaşma kapasitesine de özgüdür. Histogramlarda panelde bulunan diğer işaretleyicilere (KIT ve CD42B) ve İleri Saçılım'a karşı kaplanmış bu beş popülasyonun arkadan gatingi sağda gösterilir. Olgunlaşmanın farklı aşamalarında MK öncülleri ve MK'ler CD31+ popülasyonları içindedir.
Şekil 6: Başlangıç PBMC materyali de dahil olmak üzere MK hücre kültürü sırasında megakaryopoez immünofenotipsi. PBMC'lerin ve MK kültürünün temsili immünofenotiping analizi, 7. Lin kokteylini içeren bir panel kullanıyoruz ve Lin seçiminden önce ve sonra hücresel fraksiyonu(yaniçekirdekli hücreleri) gösteriyoruz. Bu olumsuz seçim, örneğin CD14 gibi MK'lerin bazı kesirlerinin birlikte ifade edilmesine neden olabilir, ancak daha rafine bir analize de izin verir. Lin fraksiyonunu CD71 ve CD31'e karşı çizerken, beş ana popülasyonu kapladık: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71orta ve CD31++ CD71orta. Bu popülasyonlar her zaman aynı pozisyonlarda (sabit sitometre ayarları göz önüne alındığında) mevcut değildir ve bu dikkate alınmalıdır. Histogramlarda panelde bulunan diğer işaretleyicilere (KIT ve CD42B) ve İleri Saçılım'a karşı kaplanmış bu beş popülasyonun arkadan gatingi sağda gösterilir. Olgunlaşmanın farklı aşamalarında MK öncülleri ve MK'ler CD31+ popülasyonları içindedir. Şekil ayrıca CD31/CD71'e karşı, cd42B+ hücrelerinin toplam hücresel fraksiyonu ile birlikte daha olgun MK'lerin dağılımını görselleştirmek için bir çizim göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Akış sitometrisi analizlerinin popülasyon yüzdeleri Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
PBMC'lerde, MK'ler CD31++ CD71orta kapı içindedir, ancak boyutları kültürlü MK'lerde gördüğümüz kadar büyük değildir. Bunun nedeni aşağıdaki iki seçeneklerden biri olabilir: PBMC'lerdeki MK'ler dolaşıma giren olgunlaşmamış MK'lerin bir kısmını veya sitoplazmik karmaşıklığı kaybetmiş olgun dolaşımdaki MK'lerin bir kısmını temsil eder. Tür deneylerimiz, bu boyut farkını açıklamanın nedeninin ikincisi olabileceğini gösteriyor. Bu kavramı destekleyen CD42B ifadesi, bu popülasyonlardaki hücrelerin% 100'lerinde (Şekil 4'tekiBM örneklerinde de görülebileceği gibi), muhtemelen proplatlet oluşumu ve / veya trombosit dökülmesi üzerine yüzey belirteçlerinin kaybı nedeniyle mevcut değildir. Bununla birlikte, kültürlü örneklerde, "olgun" kapılardaki MK'ler neredeyse% 100 CD42B+ve daha büyüktür. Bu hipotezlenmiş hücresel dinamikler daha fazla incelenmeli ve doğrulanmalıdır.
TPO'nun pleiotropik etkileri nedeniyle, bu kültürler heterojen ve asenkrondur, bu da ayrık MK farklılaşma aşamalarını daha fazla analiz etmeyi zorlaştırır. 19,20 Önceki ataların genişlemesini takiben, farklı olgunlaşma aşamalarındaki MK'lar 6-10. günden itibaren kültürde görünecektir (veya donör değişkenliği nedeniyle daha erken) ve MK soyuna bağlı hücreler MK'ya doğru olgunlaştıkça sayıca giderek artacaktır. Bazı MK'ler terminal farklılaşmasına uğrayacak ve proplatelet oluşturmaya başlayacaktır. Kültürün sonlarına doğru, proplatlet oluşumu ve trombosit dökülmesi veya hücre ölümü sonrasında "zayıflama/ tükenme" nedeniyle hücre kaybında kademeli bir artış olacaktır (Şekil 2).
Rekombinant TPO yerine TPO analogları kullanıyorsanız, konsantrasyonlar test edilmelidir.
Farklı gelişim evrelerinin kaynaklarından gelen MK'ler kendi özelliklerine sahip olduğu için, ataların kaynağı (yetişkin, kordon kanı) kültürleri şarta bağlayacaktır. Ayrıca, zenginleştirilmiş CD34+ atalarından gelen kültürler, kültürün başlangıcında daha homojen görünürken, MK taahhüdü ve farklılaşması başladığında heterojenlik ve asenteniklik aşamasına ulaşacaktır19,20.
MK Hücre Sıralama
Şekil 7'de,farklılaşmanın 10. Çekirdekli hücre fraksiyonunu CD31 ve CD71'e veya İleri Saçılım'a karşı çizerken, CD31'in varlığı veya yokluğu ile karakterize edilen iki ana popülasyonu ayırt edebiliriz.
CD31+ fraksiyonunu CD41 ve CD71'e göre çizerken, dört ana popülasyonu kaplayabiliriz: CD41- CD71- (1), CD41düşük CD71+ (2), CD41düşük CD71+++ (3) ve CD41+++ CD71+ (4), diğer yüzey işaretleyicilerinin (KIT ve CD49B) farklı şekilde ifade edildiği, MK bölmesinin CD41 son derece pozitif hücreler olarak tanımlanmasını sağlayan (Şekil 7A). Sıralanmış fraksiyonların saflığı ve sıralanmış fraksiyonların sitospinlerinin sitolojik lekeleri gösterilmiştir.
PBMC-MK kültürlerinde hücre popülasyon spektrumunu karakterize etmek için viSNE analizi kullanıldı (Şekil 7B). ViSNE haritası, hücreleri ifade ettikleri işaretleyicilerin birleşimine göre mekansal olarak farklı alt kümelere ayırır. viSNE çözümlemesinde yer alan her nokta, CD31, CD42A, CD71 ve KIT ifade düzeylerine göre renklenmiş tek bir hücreyi temsil eder.
Çift negatif hücreler (CD31- ve CD71-) esas olarak bu koşullarda kültür boyunca devam eden kalıntı lenfositlerdir (popülasyon 5). Bu popülasyon, örneğin kalan kesirleri kullanılarak ikinci bir hücre sıralama turunda sıralanmıştır.
Kapı 6 ve 7, eritroid progenitörleri ve potansiyel olarak diğer öncülleri içeren CD71orta ve yüksek ekspresyatör hücreleridir.
Bu kültür yönteminin hücre heterojen doğası ve olgun MK'lerin ait olmadıkları yerlerdeki alt nüfuslarda olgun MK'lerin varlığıyla sonuçlanan yapışkan doğası nedeniyle teknik zorlukları dikkate almalıyız (açıklamalar bölümüne bakınız).
Şekil 7: 10 günlük in vitro kültür MK'larının immünofenotipik analizi önceden sıralanır. A) CD31, CD41 ve CD71 kullanarak temsili gating stratejisi, iki sıralama turu ile, CD31+ 1-4 ve CD31 popülasyonları- popülasyonlar 5-7 ile sonuçlanır. Sıralanmış her fraksiyonun saflığı sıralamadan sonra analiz edildi ve her sıralanmış fraksiyondan lekeli sitospinlerin temsili bir mikrofotoğrafçısı ile birlikte tasvir edildi. B) akış sitometrisi ile ölçülen 10 PBMC türevi MK kültür hücrelerinin viSNE haritası. Harita, akış sitometrisi ile ölçülen CD31, CD42B, CD71 ve KIT ifade düzeyleri kullanılarak oluşturulmuştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Sıralama sonrası işleme
Sıralanmış popülasyonlar, MK özelliklerini belirli bir fizyo-patolojik bağlamda değerlendirmek veya megakaryopoezis sürecini daha iyi incelemek için immünofluoresans (bkz. bölüm 7) ile sitolojik ve moleküler analiz de dahil olmak üzere farklı yöntemlerle analiz edilebilir. Bazı örnekler Şekil 8'de sunulmuştur.
Şekil 8. Sıralama sonrası MK analizi. A) 10 günlük in vitro kültürden sıralanmış MK bölmesinin sitolojik analizi. May-Grünwald Giemsa boyama, olgun MK'lerin, yanipsödopod oluşumunun (kırmızı ok), yüksek poliploid MK'nin (mavi ok) temel özelliklerinin gözlemlenmesine izin verir. B) İmmünoresans analizi. Hücreler anti-insan von Willebrand faktörü (kırmızı, ikincil antikor Alexa Fluor 555 Goat fare karşıtı IgG ile gösterilmiştir), anti-insan CD31 veya tandem CD41/CD61 ile boyanmış, hem FITC ile eşleştirilmiş (yeşil renkte gösterilmiştir) hem de nükleer DNA DAPI (mavi ile gösterilmiştir) ile etiketlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Açıklamalar:
MK'ler, hücreleri membranlarına bağlama kapasitesi nedeniyle beklenmeyen bölgelerden sıralanabilir (Şekil 9). Bu sorun, yüksek saflık hücre alt nüfus almak için bir sorun olabilir. Hücre-hücre toplamlarını en aza indirmek için panel karışım tamponlarına 1-5 mM EDTA eklenebilir.
Ayrıca, WB'yi başlangıç malzemesi olarak kullanırken, hücresel fraksiyonu doğrudan kullanmak için PBMC'ler elde etmeyi veya RBC'leri katlamayı önerdik. Şekil 10'da iki metodolojinin akış sitometrisi analizini gösteriyoruz. Bir yandan, RBC'leri yutarken ve tüm hücresel bölmeyi analiz ederken, hala çok miktarda nötrofilimiz var. Bunlar belirli bir işaretleyici ile filtrelenebilir (veya Lin kokteyl stratejisi kullanılarak). Bununla birlikte, yüzey işaretleyici ekspresyözü ile ilgili karışık doğası nedeniyle bazı MK'leri kaybedebiliriz. Öte yandan, PBMC izolasyonu nötrofillerin yanı sıra RBC'lerden de kurtulmamızı sağlayacaktır, ancak daha yüksek yoğunluklu MK'leri kaybedebiliriz(yani,daha karmaşık sitoplazmik özelliklere veya daha olgunlaşmamış olanlara). Şekil 10'dagösterildiği gibi, lislenmiş WB'den gelen MK'ler, PBMC'leri yalıtırken daha düşük görünen olgunlaşma işaretçilerinin daha yüksek bir ifadesini gösterir. Yoğunluk gradyanı, pbmc fraksiyonunda bulunanlar trombositleri serbest bıraktıktan sonra dolaşımda zaten "tükenmiş" olabilirken, hala karmaşık bir sitoplazma içeren MK'lerin kaybına neden olabilir ve böylece poliploid çekirdeği daha az karmaşık bir sitoplazma içinde koruyabilir. Olgunlaşmamış MK'lerle karıştırılmamalıdır. Her prosedürün avantajları ve dezavantajları vardır.
Şekil 9. MK'lerin yapışkan doğası. MK'ler, membranlarına hücre takma kapasiteleri nedeniyle beklenmedik kapılarda bulunabilir. A-C) MK sıralama için gating stratejisine göre, 1 (B) ve 5 (A ve C) popülasyonlarında sıralanmış MK'ler. Bu sorun, yüksek saflık hücre alt nüfus almak için bir sorun olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10. RBC'leri yutturduktan sonra PBMC'lerden veya WB'den MK'lerin akış sitometrisi immünofenotiping. A) Gating stratejisi. B) PBMC veya WB'de tanımlı olarak MK'lerde CD42A, CD41, CD71 ve KIT'in boyutu (FSC), hücresel karmaşıklık (SSC) ve ekspresyasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Megakaryopoezisin akış sitometrisi ile incelenmesine odaklanan araştırmaların çoğu, bugüne kadar MK alt kümelerinin sadece soyunaözgü yüzey belirteçleri (cd42A/CD42B, CD41/CD61) kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıyken, daha önceki MK farklılaşma aşamaları kötü incelenmiştir. Bu makalede, insan megakaryopoezisinin kapsamlı bir akış sitometrisi nitelemesi ele almak için bir immünofenotipleme stratejisi gösteriyoruz. Genel olarak, megakaryopoezisin daha ayrıntılı bir şekilde incelenmesi için MK spesifik ve spesifik olmayan yüzey işaretleyicilerini (Tablo 1 ve 2) aynı akış sitomemetri antikor panelinde birleştirmenin yararını vurgulamak istiyoruz. Yeni yaklaşımımız hematolojik bozukluklarda tanı ve/veya prognoza yardımcı olmak için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir. Sunulan panellerin ve kombinasyonların kesin olmadığını düşünüyoruz. Alt merkez patolojiye de bağlı olan insan birincil kaynaklarında (özellikle BM örneklerinde) yüzey belirteçlerinin çok dinamik bir davranışını gözlemledik. Daha fazla çalışma gereklidir ve umarım, bilim topluluğu bu yaklaşımı tek bir patolojiye odaklanan çalışmalardan elde edilen gözlemlerle geri bildirimlere ve megakaryopoezis evrelemenin tanı veya prognoza nasıl yardımcı olabileceğine dair geri bildirimlerle uygulamaya başlayacaktır. Giriş bölümünde belirtildiği gibi MK taahhüdü için çeşitli yollar göz önüne alındığında, birincil dokularda kombine HSC ve MK karakterizasyonunun uygulanması, daha fazla gelişmeyle ilgilidir. PBMC'lerdeki MK'leri de tespit edebilmemiz oldukça gözlemsel. Ayrıca, bu birincil kaynaktaki MK'lerin analizinin, BM aspiratlarına çok uygun bir alternatif olarak hastalık tanısı ve prognozunda yardımcı olacağını vardır, çünkü bir kan örneğinin çıkarılması o kadar invaziv değildir. Bu yönü de gelişmeyi gerektirir.
MK'lerin biyolojik özellikleriyle ilişkili teknik sınırlamalara rağmen (büyük boyut, ozmotik kırılganlık, yapışkanlık) farklı olgunlaşma aşamalarını, özellikle BM, PBMC'ler ve PBMC'lerden türetilmiş hücre kültürlerinde olmak üzere birkaç insan MK kaynağında sıralayabildik. Gelecekte, kordon kanı gibi diğer insan kaynaklarında ve farklı fizyo-patolojik durumlarda megakaryopoezis özelliklerini analiz etmek için çalışmalar yapılacaktır. Ek olarak, her kapılı ve sıralanmış hücre fraksiyonunun farklılaşma potansiyeli, megakaryopoez yolculuğundaki her popülasyonun farklılaşma potansiyelini objektif olarak değerlendirmek için MK atalarının (CFU-MK) koloni oluşturan birim (CFU) tahlillerinde değerlendirilmelidir. Bir zamanlar olgun megakaryositleri engellemek için düşünülen teknik sınırlamaları aşmakla birlikte, böyle bir gereklilik hala daha fazla mükemmellik gerektirir. Bir yandan, tek hücreli Omics, immünofenotiping panellerini uygularken kapsamlı çalışmalara izin verecektir, ancak fiziksel sıralama gerekiyorsa, sıralanmış popülasyonların saflığı% 85'in üzerinde olmasına rağmen (yüzey işaretleyici ifadesine dayanarak), çözülmesi hala zor olan diğer değişkenlerin dikkate alınması gerekir. Belirtildiği gibi, MK kültürleri senkron değildir ve çok heterojendir. MK'lerin kendileri yüzey belirteci ifadesinde karışıktır, belirteçleri diğer miyeloid ve miyeloid olmayan hematopoetik ve hematopoetik olmayan hücrelerle paylaşırlar. Ayrıca, geniş bir şekilde dağıttıkları için morfometrik değişkenlerle (İleri ve Yan Dağılım) kümelenmeleri çok zordur. Bu uygulamayı iyileştirmek için daha fazla çalışma yapılması gerekiyor, ancak işbirlikçi çabalarla megakaryopoezleri daraltmaya daha yakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Görsel-işitsel malzeme üretimi BD Biosciences tarafından desteklenmiştir.
Acknowledgments
Teknik destek için Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo ve Begoña García Méndez (HUCA) ve Paloma Cerezo, Almudena Payero ve María de la Poveda-Colomo'ya (HCSC) teşekkür ederiz. Bu çalışma, RYC bursu olan A.B.'ye Tıbbi Hibeler (Roche SP200221001) tarafından kısmen desteklendi (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve I+D 2017 hibesi (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, İspanya ve Fondos FEDER) L.G.'ye, severo Ochoa Grant 'e (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, İspanya) p.M.-B. ve A.A.-H'ye intramural doktora sonrası hibe 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, İspanya). Reinier van der Linden'e bilgilerini (ve zamanını) paylaştığı için teşekkür ederiz, özellikle çok renkli etiketli antikor paneli karışımı ve tek renkli boncuk kontrolü hazırlığı hakkındaki bilge tavsiyeleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
