Summary
Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.
Abstract
La diferenciación de megacariocitos (MK) abarca una serie de ciclos enddomíticos que dan lugar a una célula altamente poliploide (que alcanza incluso >64N) y extremadamente grande (40-60 μm). En oposición al conocimiento de rápido aumento en megakaryopoiesis en la biología celular y el nivel molecular, la caracterización del megakaryopoiesis por cytometry de flujo se limita a la identificación de MKs maduros usando marcadores superficiales linaje-específicos, mientras que las etapas anteriores de la diferenciación de MK siguen siendo inexploradas. Aquí, presentamos una estrategia de immunophenotyping que permita la identificación de las etapas sucesivas de la diferenciación del MK, con la situación ploidy cada vez mayor, en fuentes primarias humanas o culturas ines vitro con un panel que integra los marcadores superficiales específicos y no específicos del MK. A pesar de su tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser inmunofenotipadas usando el panel antes mencionado y enriquecidas por la clasificación celular activada por fluorescencia bajo condiciones específicas de presión y diámetro de boquilla. Este enfoque facilita los estudios multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en los seres humanos. Una mejor caracterización del megakaryopoiesis puede plantear fundamental en la diagnosis o el pronóstico de patologías y de malignidad linaje-relacionadas.
Introduction
Los megacariocitos (MKs) se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas (HSCs) siguiendo un proceso complejo llamado megacariopoyesis, que es orquestado principalmente por la hormona trombopoyetina (TPO). La visión clásica de la megacariopoyesis describe el viaje celular desde las HSCs a través de una sucesión de etapas jerárquicas de progenitores comprometidos y células precursoras, lo que conduce en última instancia a un MK maduro. Durante la maduración, los MKs experimentan múltiples rondas de endomitosis, desarrollan un intrincado sistema de membrana de demarcación intracelular (DMS), que proporciona suficiente superficie de membrana para la producción de plaquetas, y producen y empaquetan eficientemente la plétora de factores que están contenidos en los diferentes gránulos heredados por las plaquetas maduras1,2,3. Como resultado, los MKs maduros son células grandes (40-60 μm) caracterizadas por un núcleo altamente poliploide (alcanzando incluso >64N). Estudios recientes sugieren rutas alternativas por las cuales las HSCs se diferencian en MKs evitando los puntos de control de compromiso de linaje tradicional en respuesta a ciertas condicionesfisiopatológicas4,5,6,7,8,9,10,11. Estos hallazgos ponen de relieve que la diferenciación hematopoyética hacia el MK maduro es un proceso continuo y adaptativo que responde a las necesidades biológicas.
Con el creciente conocimiento sobre la biología celular y los aspectos moleculares que caracterizan la megacariopoyesis12,la mayor parte de las investigaciones dedicadas al estudio del proceso por citometría de flujo se limitan a la identificación de MKs maduros utilizando marcadores de superficie específicos del linaje(es decir, CD42A/B, CD41/CD61), mientras que las etapas anteriores de diferenciación mk permanecen inexploradas. Hemos documentado previamente una estrategia para escenificar megacariopoyesis en cultivos de MK derivados de la médula ósea de ratón y de la médula ósea13,14,que hemos adaptado y aplicado a los seres humanos15. En el presente artículo mostramos una estrategia de inmunofenotipificación que permite la caracterización de megacariopoyesis, desde HSCs hasta MKs maduros, en fuentes primarias humanas (médula ósea -BM- y sangre periférica -PB-) o cultivos in vitro mediante un panel que integra marcadores de superficie específicos e inespecíficos (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT y CD71, entre otros). A pesar de su gran tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser immunophenotyped usando los marcadores antedichos de la superficie de la célula y enriquecidos por la clasificación fluorescencia-activada de la célula bajo condiciones específicas del diámetro de la presión y de la boquilla para reducir al mínimo la ruptura y/o el daño de la célula. Esta técnica facilita los enfoques multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en la salud humana y la enfermedad. Cabe destacar que se planteará como una herramienta útil para ayudar al diagnóstico y pronóstico en un contexto clínico de creciente demanda.
En este manuscrito documentamos una estrategia para escenificar la megacariopoyesis humana con un panel que integra marcadores de superficie mk-específicos e inespecíficos de fuentes primarias o generadas in vitro. Además, proporcionamos un protocolo para clasificar, con un clasificador de células activado por fluorescencia, las fracciones preferidas y MKs maduros(Figura 1). Este paso no es popular, ya que es técnicamente difícil debido al gran tamaño y la fragilidad de los MKs. Sin embargo, se ha empleado tanto en muestras de ratón como de médula ósea humana con anterioridad, y debido al avance tecnológico, con un mejor resultado cada vez16,17,18. Las fuentes primarias humanas donde se pueden estudiar los precursores de MKs o MK incluyen médula ósea, sangre del cordón umbilical y sangre periférica, entre otras. El procesamiento adecuado de la muestra para aislar la fracción celular relevante para el análisis en cada muestra es de importancia. Se incorporan procedimientos estándar, con algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de apuntar al estudio de la megacariopoyesis.
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Protocol
Las muestras de sangre entera y médula ósea se obtuvieron y procesaron de conformidad con la Declaración de Helsinki de 1964. Se obtuvieron muestras de sangre entera de donantes sanos tras la concesión del consentimiento informado (ISPA), dentro de un estudio aprobado por nuestro comité ético médico institucional (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Se obtuvieron muestras de médula ósea a partir de material de descarte aspirado de médula ósea de pacientes manejados en el Departamento de Hematología del Hospital Clínico San Carlos (HCSC).
Figura 1: Representación esquemática del protocolo documentado en este manuscrito. Las fuentes humanas primarias o las culturas primarias donde la diferenciación del MK se puede organizar usando immunophenotyping se indican. Esta estrategia de inmunofenotipado se puede aplicar al estudio del proceso en diferentes patologías relacionadas con el linaje o malignidad en fuentes primarias. Además, hace posible la clasificación celular de MKs y precursores con un clasificador de células activado por fluorescencia, que permite un análisis adicional de fracciones enriquecidas. Las imágenes utilizadas son parte de Servier Medical Art (SMART) de Servier y están licenciadas bajo CC BY 3.0. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
1. Procesamiento de la sangre entera y la médula ósea antes de la inmunofenotipado
- Cuando se utiliza sangre entera (WB) de donaciones como fuente primaria, opcionalmente aislar el componente de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Esto puede lograrse mediante el uso de la centrifugación diferencial estándar combinada con la separación celular del gradiente de densidad, como se describió anteriormente15.
- En resumen, centrífuga sangre a 193 x g durante 15 min (freno 3) a temperatura ambiente. Deseche la fracción plasmática superior y recoja el anillo buffy. Diluir 1:1 con tampón de fosfato solución salina (PBS)/Citrato trisódico Dihidratado (38 g/L, pH 7) tampón y pipetear cuidadosamente un volumen de 25 mL sobre 15 mL de una solución de gradiente de densidad (1.076 g/mL) en tubos de 50 mL.
- Centrífuga durante 20 min a 1114 x g (acelerador 3, freno 3, temperatura ambiente). Deseche la fracción plasmática y recoja el anillo buffy que contiene PBMCs. Lave agregando el mismo volumen de PBS, centrífuga a 435 x g durante 5 min y resuspend en PBS para su uso posterior.
- Alternativamente, use una muestra de WB (alrededor de 100 μL) para inmunofenotipificación después de lisear los glóbulos rojos (glóbulos rojos) y un lavado exhaustivo.
- En resumen, diluir 1:1 en tampón de lechado de RBC helado (4,15 g de NH4Cl, 0,5 g deKHCO 3 y 18,5 mg de EDTA (triplex III) a 500 mL de H2O, pH 7,1-7,4). Espere hasta que la suspensión celular se vuelva roja translúcida (3-5 min).
- Centrifugar a 435 x g durante 5 min, a 4 °C, y resuspend las células en PBS. Repita el procedimiento tantas veces como sea necesario para obtener un pellet de células blancas.
- Del mismo modo, procesar directamente las muestras obtenidas de médula ósea (aspiración) con tampón de lelising RBC (ver punto 1.2) y lavado a fondo, como para comenzar con una suspensión unicelular clara (Figura 1).
- Evite el uso de vórtice para mezclar muestras durante el procesamiento, ya que puede dañar los MKs frágiles. Mezcle moviendo o invirtiendo el tubo.
NOTA: Gradiente de densidad para obtener PBMCs puede resultar en una fracción de célula más rica y más limpia en comparación con RBC-lysed WB. Sin embargo, debemos tener en cuenta que los MKs maduros de alta densidad podrían perderse en la fracción de "neutrófilos". Esto se discutirá en los resultados representativos.
- Evite el uso de vórtice para mezclar muestras durante el procesamiento, ya que puede dañar los MKs frágiles. Mezcle moviendo o invirtiendo el tubo.
2. Diferenciación in vitro de MK de PBMCs
NOTA: Los MKs se pueden diferenciar in vitro de precursores anteriores, tales como células CD34+, presentes en diversas fuentes primarias(es decir, WB/PBMCs, sangre de cordón umbilical, médula ósea) y de iPSCs. Existen diferentes protocolos que se han aplicado a este fin. Aquí, utilizamos un método de cultivo desarrollado por nosotros que permite la diferenciación MK de PBMCs, sin necesidad de enriquecer para CD34+ precursores15,19,20,21,22.
- Este protocolo consta de tres fases de cultivo, donde la concentración de trombopoyetina (TPO) aumenta gradualmente a expensas de factores de crecimiento que favorecen la proliferación de precursores anteriores(es decir,SCF, EPO), que disminuyen gradualmente(Figura 2)15.
- Para el medio base, utilice StemSpan SFEM complementado con 0.4% de mezcla de lípidos ricos en colesterol y 1% Penicilina / Estreptomicina.
- Para el medio de fase I, utilice el medio base complementado con SCF (100 ng/mL), eritropoyetina (EPO, 0,5 U/mL) y trombopoyetina (TPO, 30 ng/mL). El medio de fase II es el medio base complementado con SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) y TPO (50 ng/mL). Para el medio de fase III, utilice el medio base complementado con TPO (100 ng/mL).
- Cultivo de PBMCs en fase I medio. En el día 6-8, coloque los PBMCs en el medio de la fase II, y en el día 9-12 coloque los PBMCs en el medio de la fase III.
- Reemplace el medio centrifucando las células a 435 x g durante 5 min a temperatura ambiente de la Fase I a la Fase II, y a 95 x g durante 5 min a temperatura ambiente de la Fase II a la Fase III, y reemplándolas en medio fresco.
- Cultivar células en una incubadora a 37 °C, 5% deCO2. En estos cultivos primarios, la diferenciación MK dura 10-14 días, y las muestras se pueden extraer en diferentes puntos de tiempo a lo largo del período de cultivo, como para seguir la diferenciación MK.
- Para el medio base, utilice StemSpan SFEM complementado con 0.4% de mezcla de lípidos ricos en colesterol y 1% Penicilina / Estreptomicina.
Figura 2:Representación esquemática del método de cultivo MK derivado de PBMC. Los PBMCs de donantes sanos fueron cultivados según el protocolo trifásico desarrollado por nosotros para generar MK in vitro (esquema adaptado de Salunkhe et al). Se muestran 15 fotos tomadas en el día 10 y el día 13 de la cultura. Las fotos se toman con un objetivo de 20X. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
- Recolección de muestras: Lave las células aplicando centrifugación a baja velocidad durante 5 min (95 x g) y resuspón en PBS o PBS que contenga 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Para el inmunofenotipado, la densidad ideal es de 105-106 células/100 μL (véase el punto 3.1). Dependiendo del estado de los cultivos(es decir, presencia de células muertas, escombros, etc.), pueden ser necesarios 1 o 2 lavados. Recoger sus células en los puntos de tiempo de interés durante el cultivo.
3. Immunophenotyping de la diferenciación de MK - incubación con un panel de tagged-anticuerpos
- Incubar las muestras de células con un panel de anticuerpos marcados siguiendo los procedimientos estándar, prestando atención a la centrífuga a baja velocidad (95 x g) al procesar megacariocitos. Normalmente incubamos las muestras con BSA al 1% en PBS en volúmenes de 100 μL a 4 °C, 20 min, con un rango de 105-106 células.
- Escale verticalmente cuando sea necesario.
- Después de la incubación, añadir 5 mL de BSA al 1% en PBS, centrífuga a baja velocidad (95 x g), aspirar el sobrenadante y resuspendir la muestra en BSA al 2% en PBS para preservar la viabilidad de MK (2 mL). Agregue 1-5 mM EDTA para interrumpir los agregados célula-célula (que se ven naturalmente en las culturas mk).
- Transfiera las muestras a un tubo inferior redondo de 12 x 75 mm (tubo FACS) o placa, manteniéndolas en la oscuridad hasta el análisis de citometría de flujo o la clasificación celular.
- Preparación de los anticuerpos individuales y mezclas de panel de anticuerpos; configuración del citómetro de flujo:
- Valorar los anticuerpos antes de su uso para determinar la concentración óptima en los paneles de anticuerpos. La concentración óptima de anticuerpos es la concentración más baja que separa las células claramente positivas de las negativas (y permite la distinción de los niveles intermedios de expresión). Por ejemplo, la mayoría de los anticuerpos se utilizan en una dilución 1:200 (stock 100 μg/mL) a menos que el fabricante valore o indique lo contrario.
- Una vez que se determina la titulación de anticuerpos, prepare una dilución de 10x de cada anticuerpo. Estas diluciones se utilizan para los controles de un solo color y para preparar las mezclas de paneles. Las diluciones y las mezclas de paneles están bien para su uso incluso un mes después de la preparación (almacenadas a 4 °C, a menos que las indicaciones del fabricante impidan estas condiciones de almacenamiento). Esto permite la tinción de muestras con el mismo panel a través de un período de tiempo.
- Utilice 10 μL por cada 100 μL de la dilución 10x tanto para los controles de un solo color como para la mezcla de paneles.
- Para los controles de un solo color, utilice perlas de afinidad de anticuerpos, que se pueden medir directamente después de agregar el anticuerpo. Los controles de un solo color deben medirse con cada experimento, para permitir un ajuste de compensación adecuado (y ajustar la medición posterior con el software de análisis).
- Como alternativa, realice los controles de un solo color con muestras de celda. Sin embargo, las perlas permiten la medición rápida de un número dado de eventos, que, dependiendo del marcador de anticuerpos /superficie, podrían no ser posibles de obtener en fuentes celulares primarias o cultivadas complejas. También recomendamos ejecutar muestras de células teñidas con mezclas de panel "Fluorescencia Menos Uno" (FMO) para configurar los ajustes de compensación apropiados (antes de ejecutar experimentos). Esto es relevante para identificar cuidadosamente los problemas de compensación, y especialmente, en los MKs cultivados, para identificar la interferencia de autofluorescencia (que estará presente si se utiliza un medio de cultivo que contiene rojo fenol).
- Prepare suficiente volumen de la mezcla del panel, dependiendo del número de muestras, que contiene los anticuerpos del panel diseñado. La mayoría de nuestros paneles incluyen seis anticuerpos (paneles de 6 colores, ver Tablas 1-2).
- Para estos paneles, utilice láseres de 488 nm y 633 nm del citómetro de flujo, sin embargo, los paneles se pueden adaptar a otros escenarios técnicos. Además, las consideraciones de compensación pueden obviarse cuando se utiliza citometría de flujo basada en espectrometría de masas o citómetros con tecnología de enfoque acústico.
- Los colorantes para medir la viabilidad pueden dar información falsa con respecto a los MKs, especialmente cuando maduran. Los MKs son células de uptaking muy activas, y la positividad con Hoechst, 7-AAD o PE, pudo no reflejar siempre muerte celular real. Una alternativa (si se requiere la medida de la muerte celular) pudo ser el uso de las manchas de la mitocondria (CMX Ros) o de los tintes reactivos de la amina (tintes del zombi o del fantasma).
Tabla 1: Notas sobre los marcadores de superficie celular del linaje megacariocítico Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
Tabla 2: Paneles de anticuerpos Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
4. Análisis ploidy combinado con paneles de 6 colores
- Para el análisis de ploidía, en combinación con un panel de anticuerpos de 6 colores, proceda con la fijación y permeabilización de las células después de la incubación con el panel de anticuerpos. Esta estrategia permitirá la preservación de la tinción del marcador superficial, al tiempo que permitirá la tinción del ADN de las células. Utilizamos Hoechst 33342 para teñir adn, ya que se puede visualizar con el láser violeta de 405 nm disponible.
- Para 105-106 células, después de la incubación con el panel de anticuerpos, centrífuga las células (95 x g durante 5 min), resuspend en 200 μL de tampón de fijación e incubar 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Las células centrífugas como se indicó anteriormente, resuspended por segunda vez en 200 μL de tampón de fijación, e incubar otros 10 min en RT.
- Preparar tampón de permeabilización, que contenga 0,1% de Tritón X-100, 200 mg/mL de ARNasa y 20 mg/mL de Hoechst 33342 (permeabilización De Hoechst MIX).
- Centrífuga de células como las anteriores, resuspend en 300 μL de la permeabilización Hoechst MIX e incubar 30 min a 37 °C. Este paso es muy importante, ya que, para obtener una medición de ploidía limpia, el ARN tiene que ser degradado.
- Después del tiempo de incubación, mida las muestras directamente con un citómetro de flujo. De lo contrario, mantenga las muestras a 4 °C, en la oscuridad. Mídalos con prontitud. Sin embargo, dado que estas muestras son fijas, la medición puede retrasarse incluso 24-48 horas. Asegúrese de que la muestra se deslice bien antes de la medición, o se pase a través de un colador celular, para asegurar una suspensión de una sola célula.
- Los parámetros morfométricos como Forward y Side Scatter no se mantienen después de la fijación de celdas. La gráfica de dispersión hacia adelante/lateral mostrará una contracción de la distribución de celdas después de la fijación. Sin embargo, la tinción del marcador superficial se conserva en su mayor parte, y la estrategia de gating apenas se altera, lo que permite el análisis del estado de ploidía en las diferentes etapas de diferenciación definidas por combinaciones de marcadores de superficie.
5. Análisis de diferenciación MK
NOTA: Hemos visto que la combinación de CD31/CD71 permite establecer un número de puertas que corresponden a diferentes etapas de la diferenciación MK. El back-gating adicional con los marcadores MK-específicos permite la separación de MKs maduros e inmaduros. Además, en muestras frescas, el back-gating para verificar la presencia de otros marcadores utilizados, o para colocar las poblaciones en los ejes Forward/Side Scatter, refina la evaluación de las etapas de diferenciación mk y permite descartar otros tipos de células que podrían estar presentes en las mismas poblaciones.
- Utilizar un panel de anticuerpos que incluya marcadores precursores tempranos (KIT, CD34), marcadores precursores comunes (CD31, CD71) y marcadores de linaje, algunos de ellos específicos (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, etc.) (ver Tablas 1-2). El uso del cóctel Lineage (Lin) (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 y CD56), también permite "filtrar" las células hematopoyéticas maduras que podrían agregar ruido al análisis (al seleccionar lapoblación lin). Como ejemplo, vamos a ir a través del análisis de MKs en PBMCs, médula ósea y a través de cultivos celulares derivados de PBMC en los resultados representativos.
6. Clasificación de células precursoras MK y MK
NOTA: Las células teñidas fueron analizadas y clasificadas en un clasificador de células activado por fluorescencia FACS Aria IIu equipado con láseres de estado sólido estándar de 488 nm y 633 nm utilizando el software FACSDiva; Los datos fueron analizados y presentados adicionalmente usando el software FlowJo y Cytobank (análisis viSNE). La pureza de las fracciones clasificadas se confirmó mediante el análisis citométrico de flujo de cada una de las fracciones clasificadas (pureza superior al 85%).
- Realice la clasificación celular tan pronto como sea posible o dentro de 1 hora después de la incubación de anticuerpos para evitar el deterioro celular.
- Filtre la muestra con un colador de celdas de 100 μm para asegurar la suspensión de una sola célula y la integridad de los MK grandes.
- Utilice una boquilla de cerámica de 130 μm, una presión de vainilla establecida en 11 libras por pulgada cuadrada (PSI) y la frecuencia de accionamiento de caída establecida en 12 kHz para romper la corriente en gotas.
- Antes de clasificar, esterilice la boquilla, la vaina y las líneas de muestra realizando una adquisición de 30 minutos con penicilina/estreptomicina diluida 1:5 en agua estéril, seguida de una adquisición de 10 minutos con agua estéril para eliminar el descontaminante restante.
- Una vez que la secuencia se ha estabilizado, ajuste el drop-delay con los rebordes recomendados para ordenar en modo de ajuste fino más el de 97,5% de las caídas reflejadas a un caudal de 400-1200 eventos por segundo.
- Preparar tubos FACS de recolección con 500 μL de BSA al 2% en PBS. El porcentaje de BSA se puede aumentar hasta 5-10%.
- Genere la plantilla de experimento con los parámetros de matriz de compensación adecuados.
- Cargue el tubo FACS en el citómetro.
- Realice una medición de la muestra para establecer las puertas deseadas y la pureza de las poblaciones de células objetivo. Mantenga el registro activado para mostrar hasta 200.000 eventos en las puertas de población seleccionadas durante la ordenación de celdas.
- FACS Aria IIu permite la separación de hasta 4 poblaciones celulares diferentes al mismo tiempo. Cree un nuevo diseño de ordenación y seleccione el dispositivo de recolección (4 tubos) y el modo de precisión adecuado (se recomienda una máscara intermedia de pureza y recuperación). Finalmente, agregue las poblaciones de interés a cada campo de ubicación de ordenación (Figura 3).
Figura 3:Representación esquemática del principio de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las partículas pasan a través de la boquilla de 130 μm y se ven obligadas a romperse en una corriente de gotitas regulares debido a la aplicación de vibración a la boquilla. A continuación, las gotitas son interrogadas por el láser (punto de análisis) y las señales se procesan para dar la ''decisión de clasificación" mediante la aplicación de una carga a esas gotitas. Cuando una gota de carga pasa a través de un campo electrostático de alto voltaje (placa de detección), se desvía y se recoge en el tubo de recogida correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
- Cargue los tubos de recolección y comience a ordenar las poblaciones objetivo.
- Centrifugar los tubos de recolección durante 5 minutos a 95 x g y resuspend el pellet celular en el volumen apropiado de BSA al 2% en PBS.
- Mida de nuevo una fracción de cada muestra ordenada, para calcular la pureza.
- Almacene las celdas adecuadamente para su uso posterior. Las células clasificadas se pueden utilizar para análisis citológicos y moleculares, o pueden ser re-cultivadas con el objetivo de estudiar el proceso de diferenciación de una población celular seleccionada.
7. Preparación de la muestra posterior a la clasificación
- Preparación de citoespinas para análisis citológicos con citocentrífuga
- Lleve las celdas ordenadas a un volumen de trabajo fácil de manejar de 100-200 μL. Tenga en cuenta que la densidad celular dependerá del rendimiento de la población ordenada en cada caso.
- Coloque una guía limpia en el soporte metálico y coloque una parte superior del filtro. Recuerde etiquetar la diapositiva y el filtro para evitar mezclar muestras.
- Agregue 100 μL de PBS en el orificio del filtro contra la diapositiva, para que el filtro se humidifique en el borde del orificio.
- Coloque el embudo, cierre el soporte metálico y colóquelo en su lugar en la centrífuga.
- Agregue la muestra (100-200 μL) dentro del embudo.
- Centrífuga a 36 x g durante 5 minutos. Los portaobjetos de citoespino se pueden dejar secar al aire en RT (debidamente cubiertos para evitar el polvo) y se pueden mantener en RT durante 1 semana antes de la inmunotensación o histoquímica.
- Para inmunosutensiones
- Fijar diapositivas en paraformadehído al 2% (PFA) diluido en PBS e incubar durante 5min.
- Se puede utilizar un rango de 0.5-4% de PFA en PBS. En nuestras manos, utilizamos el 4% para obtener la fijación apropiada de tejidos o de algunos tipos de la célula, y 0.5% PFA en PBS es suficiente para las plaquetas. Al configurar esta técnica, el porcentaje correcto de PFA requiere optimización por tipo de celda/origen.
- Incubar 5 min en PBS.
- Incubar 5 min en etanol al 50% (EtOH).
- Incubar 5 min en EtOH al 70%.
- Conservar en EtOH al 70% a -20ºC.
- Al realizar la inmunotensación, rehidrate y siga los procedimientos estándar (permeabilización, lavado, bloqueo, incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios, preservación, etc.).
- Fijar diapositivas en paraformadehído al 2% (PFA) diluido en PBS e incubar durante 5min.
- Para citoquímica:
NOTA: Los portaobjetos se pueden teñir con tinción de May-Grünwald Giemsa o la tinción conveniente para cada propósito. - Para el examen inmediato de la morfología
- Agregue una gota de medio de montaje en el punto que contiene la célula del cytospin y coloque un cubrebocas.
- Mantenga las guías a 4 °C no más de una semana, a menos que estén selladas, lo que permite el almacenamiento a largo plazo incluso en RT. El montaje de fijación media permite el almacenamiento a largo plazo en RT.
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Representative Results
Médula ósea y ploidía
En la Figura 4, mostramos un análisis representativo de inmunofenotipado de megacariopoyesis en muestras de BM (aspiración) de pacientes. Al trazar la fracción celular contra CD71 y CD31, hemos bloqueado seis poblaciones principales: CD31- CD71- (rojo), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (naranja), CD31+ CD71medio (verde claro), CD31+ CD71+ (verde oscuro) y CD31+ + CD71medio (crema). Estas poblaciones no siempre están presentes en las mismas posiciones (considerando la configuración constante del citómetro), como se puede ver, y eso debe tenerse en cuenta. Esto pudo ser inherente a la condición patológica y al estado de la médula. A la derecha se muestra el back-gating de estas seis poblaciones superpuestas en histogramas contra un marcador de maduración contenido en el panel (CD42A/CD42B), y hacia la dispersión hacia adelante. La figura también muestra una gráfica contra CD31/CD71 que representa una superposición de las células CD42B+ con la fracción celular total para visualizar la distribución de los MKs más maduros. En términos generales, la población CD31- CD71- no contiene MKs o precursores de linaje, no presenta marcadores de maduración MK, y es de menor tamaño. La población CD31- CD71+ contiene principalmente células del linaje eritroide, aunque también puede contener precursores comunes del linaje, como presumimos a partir de nuestras observaciones. Sigue siendo negativo para los marcadores de maduración MK, y dependiendo de la proporción de células eritroides anteriores o posteriores, la dispersión directa podría fluctuar también.
Como ejemplo, el paciente con síndrome mielodisplásico (SMD) tiene una mayor proporción de células eritroides inmaduras(es decir,más grandes), en comparación con otros pacientes. Los progenitores MK y las células maduras se distribuirán en lascélulas CD31 +, con alguna variación. Sin embargo, como se puede ver comparando el análisis de BM en cada patología, hay algunas características constantes. Los MKs más maduros están presentes en la poblaciónmedia CD31++ CD71 (crema), y las patologías donde se "bloquea" esta maduración incluyen trombocitopenia inmune (ITP) y una muestra reactiva del BM (con la inflamación subyacente). Mientras que en el paciente del linfoma parece haber un equilibrio entre los precursores tempranos y los últimos MKs (puertas de la naranja y de la crema), esta proporción se altera en el paciente de los MDS (con más "bloqueado" precursores) y en el paciente agudo de la leucemia mieloide (AML) (con MKs más maduro). De interés, el "bloqueo" parece ser diferente comparando patologías entre sí: en patologías coincidentes con la inflamación subyacente el bloqueo podría deberse a una combinación de defectos de maduración, destrucción(es decir,autoinmunidad) y producción de plaquetas por ruptura de MK.
Figura 4: Immunophenotyìng de megakaryopoiesis en muestras humanas de médula ósea de pacientes con diferentes patologías. Se analizaron muestras representativas de médula ósea (BM) de pacientes diagnosticados con linfoma(es decir,BM normal), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia mieloide aguda (LMA), trombocitopenia inmune (PTIL) y un paciente con un BM reactivo debido a una infección. Al trazar la fracción celular(es decir,células nucleadas) contra CD71 y CD31, hemos bloqueado seis poblaciones principales: CD31- CD71- (rojo), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (naranja), CD31+ CD71medio (verde claro), CD31+ CD71+ (verde oscuro) y CD31+ + CD71medio (crema). Estas poblaciones no siempre están presentes en las mismas posiciones (considerando ajustes de citómetros estables), como se puede ver, y eso debe tenerse en cuenta. A la derecha se muestra el back-gating de estas seis poblaciones superpuestas en histogramas contra un marcador de maduración contenido en el panel (CD42A/CD42B), y hacia la dispersión hacia adelante. La figura también muestra una gráfica contra CD31/CD71 que representa una superposición de las celdas CD42B+ con la fracción celular total para visualizar la distribución de los MKs más maduros. Se representan números que coinciden con las puertas en la gráfica de puntos y las superposiciones del histograma. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
A continuación, nos propusimos analizar el estado de ploidía de las poblaciones mencionadas anteriormente en muestras de BM humanos. La Figura 5 muestra un estado de ploidía creciente dentro de las poblaciones CD31+, que prevemos que será diferente y característico para cada contexto patológico. Tenga en cuenta que debido a la fijación celular y la permeabilización utilizada en estos experimentos, las gráficas de puntos no son completamente comparables a las de las muestras no fijadas y no permeabilizadas (Figura 4).
Figura 5: Análisis ploidy de las poblaciones seleccionadas en base a la expresión CD31/CD71, en muestras humanas de BM. Muestras representativas de médula ósea (BM) de pacientes diagnosticados con leucemia mieloide aguda (LMA) y trombocitopenia inmune (PMI). Al trazar la fracción celular(es decir,células nucleadas) contra CD71 y CD31, hemos bloqueado seis poblaciones principales: CD31- CD71- (rojo), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (naranja), CD31+ CD71medio (verde claro), CD31+ CD71+ (verde oscuro) y CD31+ + CD71medio (crema). Estas poblaciones no siempre están presentes en las mismas posiciones (considerando ajustes de citómetros estables), como se puede ver, y eso debe tenerse en cuenta. El back-gating estas seis poblaciones superpuestas en histogramas contra Hoechst 33342 muestra el diverso estado ploidy de las poblaciones, y la tendencia general a aumentar ploidy con la maduración (aunque los MKs pueden alcanzar la madurez independientemente del estado del polyploidization). Se representan los números que coinciden con las puertas en el gráfico de puntos y las superposiciones de histograma. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
PBMCs y cultivo celular
En la Figura 6,mostramos un análisis representativo de inmunofenotipado de PBMCs y el conjunto de cultivo MK con esos PBMCs en el día 7 y día 11. Utilizamos un panel que contiene el cóctel lin, y mostramos la fracción celular de las células vivas antes y después de Lin- selección. Esta selección negativa podría resultar en la pérdida de alguna fracción de MKs co-expresando, por ejemplo, CD14, pero también permite un análisis más refinado. Al trazar la lin- fracción contra CD71 y CD31, cerramos cinco poblaciones principales: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71medio y CD31+ + CD71medio. Estas poblaciones no siempre están presentes en las mismas posiciones (considerando la configuración constante del citómetro), como se puede ver, y eso debe tenerse en cuenta. En este caso, las diferencias no sólo son inherentes a la salud individual o estado patológico, sino también a la capacidad de diferenciación MK de los precursores en la fracción PBMC. A la derecha se muestra el back-gating de estas cinco poblaciones superpuestas en histogramas contra otros marcadores contenidos en el panel (KIT y CD42B), y hacia la dispersión hacia adelante. Los precursores de MK y MKs en diferentes etapas de maduración se encuentran dentro de las poblacionesCD31 +.
Figura 6:Inmunofenotipado de megacariopoyesis durante el cultivo celular MK, incluyendo el material PBMC inicial. Análisis immunophenotyping representativo de PBMCs y de la cultura de MK fijada con esos PBMCs en el día 7 y el día 11. Utilizamos un panel que contiene el cóctel Lin, y mostramos la fracción celular(es decir,las células nucleadas) antes y después de la selección de Lin. Esta selección negativa podría resultar en la pérdida de alguna fracción de MKs co-expresando, por ejemplo, CD14, pero también permite un análisis más refinado. Al trazar la fracción de Lin contra CD71 y CD31, cerramos cinco poblaciones principales: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid y CD31++ CD71mid. Estas poblaciones no siempre están presentes en las mismas posiciones (considerando ajustes de citómetros estables), como se puede ver, y eso debe tenerse en cuenta. A la derecha se muestra el back-gating de estas cinco poblaciones superpuestas en histogramas contra otros marcadores contenidos en el panel (KIT y CD42B), y hacia la dispersión hacia adelante. Los precursores de MK y MKs en diferentes etapas de maduración se encuentran dentro de las poblacionesCD31 +. La figura también muestra una gráfica contra CD31/CD71 que representa una superposición de las celdas CD42B+ con la fracción celular total para visualizar la distribución de los MKs más maduros. Se representan números que coinciden con las puertas en la gráfica de puntos y las superposiciones del histograma. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Tabla 3: Porcentajes de población de los análisis de citometría de flujo Haga clic aquí para descargar esta tabla.
En PBMCs, los MKs están dentro de la puertamedia cd31++ CD71, aunque su tamaño no es tan grande como hemos visto con MKs cultivados. Esto pudo ser debido a cualquiera de las dos opciones siguientes: Los MKs en PBMCs representan una fracción de MKs inmaduros que entran en la circulación, o una fracción de MKs circulantes maduros que han perdido complejidad citoplásmica. Nuestros experimentos de ordenación sugieren que este último podría ser la razón que explica esa diferencia de tamaño. Apoyando esta noción, la expresión de CD42B, no está presente en el 100% de las células en esas poblaciones (como también se puede ver en muestras de BM en la Figura 4),probablemente debido a la pérdida de marcadores superficiales tras la formación de proplata y/o el desprendimiento de plaquetas. Sin embargo, en muestras cultivadas, los MKs en las puertas "maduras", son casi 100% CD42B+, y más grandes en tamaño. Esta dinámica celular hipotética se debe estudiar y validar más a fondo.
Debido a los efectos pleiotrópicos de TPO, estos cultivos son heterogéneos y asíncronos, lo que per se hace difícil analizar más a fondo las etapas discretas de diferenciación de MK. 19,20 Después de la expansión de progenitores anteriores, los MKs en diferentes etapas de maduración aparecerán en el cultivo desde el día 6-10 (o antes, debido a la variabilidad del donante) y aumentarán gradualmente en número a medida que las células comprometidas por el linaje MK maduren hacia MK. Algunos MKs se someterán a la diferenciación terminal y comenzarán a formar proplatelets. Hacia el final del cultivo, habrá un incremento gradual de la pérdida celular debido a la "atenuación / agotamiento" después de la formación de proplatelets y el desprendimiento de plaquetas o la muerte celular (Figura 2).
Si se utilizan análogos de TPO en lugar de TPO recombinante, se deben probar las concentraciones.
La fuente de progenitores (adultos, sangre del cordón umbilical) condicionará los cultivos, ya que los MKs de fuentes de diferentes etapas de desarrollo tienen sus propias características. Además, los cultivos a partir de progenitores CD34+ enriquecidos, aunque aparecen más homogéneos al inicio del cultivo, alcanzarán una etapa de heterogeneidad y asincronicidad una vez que comience el compromiso y diferenciación de MK19,20.
Clasificación de celdas MK
En la Figura 7,mostramos una estrategia de gating representativa de una muestra de cultivo mk in vitro en el día 10 de diferenciación. Al trazar la fracción celular nucleada contra CD31 y CD71, o la Dispersión Directa, podemos distinguir dos poblaciones principales caracterizadas por la presencia o ausencia de CD31.
Al trazar la fracciónCD31+ frente a CD41 y CD71, podemos gatear cuatro poblaciones principales: CD41-CD71-(1), CD41 cd71+ bajo+(2), CD41 cd71 bajo+++ (3) y CD41+++ CD71+(4), en las que otros marcadores superficiales (KIT y CD49B) se expresaron de forma diferencial, permitiendo la identificación del compartimento MK como células CD41 altamente positivas(Figura 7A). Se muestra la pureza de las fracciones clasificadas, así como las tinciones citológicas de citoespinos de las fracciones clasificadas.
Para caracterizar el espectro de la población celular en cultivos PBMC-MK, se empleó el análisis viSNE (Figura 7B). El mapa viSNE separa las celdas en subconjuntos espacialmente distintos en función de la combinación de marcadores que expresan. Cada punto en el análisis viSNE representa una célula individual coloreada según los niveles de expresión de CD31, CD42A, CD71 y KIT.
Las células doblemente negativas (CD31- y CD71-) son principalmente linfocitos residuales (población 5) que persisten a lo largo del cultivo en estas condiciones. Esta población se ha ordenado en una segunda ronda de clasificación de celdas utilizando la fracción restante de la muestra.
Las puertas 6 y 7 son células que expresan CD71medias y altas, que incluyen progenitores eritroides y, potencialmente, otros precursores.
Hay que tener en cuenta las dificultades técnicas debidas a la naturaleza heterogénea celular de este método de cultivo y la naturaleza pegajosa de los MKs maduros que se traduce en la presencia de MKs maduros en subpoblaciones a las que no pertenecen (ver sección de observaciones).
Figura 7: Análisis inmunofenotípico pre-clasificado de MKs de cultivo in vitro de 10 días. A) Estrategia representativa de gating utilizando CD31, CD41 y CD71, con dos rondas de clasificación, dando como resultado CD31+ poblaciones 1-4 y CD31- poblaciones 5-7. La pureza de cada fracción clasificada se analizó después de clasificar, y se representa junto con una microfotografía representativa de citospinos teñidos de cada fracción clasificada. B) mapa viSNE de las células de cultivo MK derivadas de PBMC del día 10 medidas por citometría de flujo. El mapa se construye utilizando los niveles de expresión de CD31, CD42B, CD71 y KIT, medidos por citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Procesamiento posterior a la ordenación
Las poblaciones clasificadas pueden ser analizadas por diferentes métodos, incluyendo el análisis citológico y molecular por inmunofluorescencia (ver sección 7) con el fin de evaluar las características de mk en un contexto fisiopatológico específico, o para estudiar mejor el proceso de megacariopoyesis. Algunos ejemplos se presentan en la Figura 8.
Figura 8. Análisis mk posterior a la ordenación. A) Análisis citológico del compartimiento clasificado del MK de una cultura in vitro de 10 días. La tinción de May-Grünwald Giemsa permite la observación de características clave de MKs maduros, es decir,la formación de seudópodos (flecha roja), MK altamente poliploide (flecha azul). B) Análisis de inmunofluorescencia. Las células se tiñeron con factor von Willebrand antihumano (mostrado en rojo, anticuerpo secundario Alexa Fluor 555 Cabra anti-ratón IgG), anti-humano CD31 o en tándem CD41/CD61, ambos conjugados con FITC (se muestra en verde) y adn nuclear fue etiquetado con DAPI (se muestra en azul). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
observaciones:
Los MKs se pueden clasificar desde regiones inesperadas debido a la capacidad de unir las células a su membrana (Figura 9). Este problema puede ser un problema para obtener subpoblaciones celulares de alta pureza. Para minimizar los agregados celda-celda, se puede agregar EDTA de 1-5 mM a los búferes de mezcla de paneles.
Además, cuando se utiliza WB como material de partida, se propuso la obtención de PBMCs o lysing RBCs para utilizar la fracción celular directamente. En la Figura 10 mostramos el análisis de citometría de flujo de las dos metodologías. Por un lado, al analizar los glóbulos rojos y analizar todo el compartimento celular, todavía tenemos una gran cantidad de neutrófilos. Estos se pueden filtrar con un marcador específico (o utilizando la estrategia de cóctel Lin). Sin embargo, podemos perder algunos MKs debido a su naturaleza promiscua relacionada con la expresión de marcadores superficiales. Por otro lado, el aislamiento de PBMC nos permitirá deshacernos de los neutrófilos, así como de los glóbulos rojos, aunque podemos perder los MKs con mayor densidad(es decir,los que tienen características citoplasmáticas más complejas o más inmaduros). Como se muestra en la Figura 10,los MKs de WB lised muestran una mayor expresión de marcadores de maduración, que aparece más baja al aislar PBMCs. El gradiente de densidad podría resultar en la pérdida de los MKs que todavía contienen un citoplasma complejo, mientras que los contenidos en la fracción PBMC, podrían estar ya "agotados" en la circulación después de liberar plaquetas, y por lo tanto mantener el núcleo poliploide dentro de un citoplasma menos complejo. No deben confundirse con MKs inmaduros. Cada procedimiento tiene sus ventajas y sus inconvenientes.
Figura 9. La naturaleza pegajosa de MKs. Los MKs se pueden encontrar en puertas inesperadas debido a su capacidad para unir las células a su membrana. A-C) MKs clasificados en poblaciones 1 (B) y 5 (A y C), de acuerdo con la estrategia de gating para la clasificación MK. Este problema puede ser un problema para obtener subpoblaciones celulares de alta pureza. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 10. Immunophenotyping cytometry de flujo de MKs de PBMCs o de WB después de lysing el RBCs. A) Estrategia de gating. B) Tamaño (FSC), complejidad celular (SSC) y expresión de CD42A, CD41, CD71 y KIT en MKs identificados en PBMCs o WB. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
La mayor parte de la investigación centrada en el estudio de la megacariopoyesis por citometría de flujo se limita hasta la fecha a la identificación de subconjuntos de MK utilizando sólo marcadores de superficie específicos del linaje(es decir,CD42A/CD42B, CD41/CD61), mientras que las etapas anteriores de diferenciación de MK han sido mal examinadas. En el actual artículo mostramos una estrategia immunophenotyping para dirigir una caracterización cytometry de flujo comprensiva del megakaryopoiesis humano. En general, nos gustaría destacar la utilidad de combinar marcadores de superficie mk específicos e inespecíficos (Tablas 1 y 2) en el mismo panel de anticuerpos citometría de flujo para el estudio de la megacariopoyesis de una manera más detallada. Nuestro acercamiento nuevo podía servir como herramienta de gran alcance para ayudar diagnosis y/o al pronóstico en desordenes hematológicos. Consideramos que los grupos especiales y las combinaciones presentados no son definitivos. Hemos observado un comportamiento muy dinámico de los marcadores superficiales en fuentes primarias humanas (principalmente en muestras de BM), que también depende de la patología subjacente. Se requieren más estudios y, con suerte, la comunidad científica comenzará a aplicar este enfoque en cuanto a la retroalimentación con observaciones de estudios que se centran en una sola patología y cómo la estadificación de la megacariopoyesis puede ayudar en el diagnóstico o el pronóstico. La implementación de la caracterización combinada de HSC y MK en tejidos primarios, considerando las diversas rutas para el compromiso de MK como se comenta en la sección de introducción, es de relevancia y vale la pena de desarrollos posteriores. El hecho de que también seamos capaces de detectar MKs en PBMCs es toda una observación. También planteamos la hipótesis de que el análisis de MKs en esta fuente primaria ayudará en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad, ya que una alternativa muy relevante a los BM aspirados, ya que la extracción de una muestra de sangre no es tan invasiva. Este aspecto también requiere desarrollo.
A pesar de las limitaciones técnicas asociadas a las características biológicas de los MKs (gran tamaño, fragilidad osmótica, pegajosidad) pudimos clasificar diferentes etapas de maduración en varias fuentes humanas de MK, específicamente en BM, PBMCs y cultivos celulares derivados de PBMCs. Se realizarán estudios futuros con el fin de analizar las peculiaridades de la megacariopoyesis en otras fuentes humanas como la sangre del cordón umbilical y en diferentes situaciones fisiopatológicas. Además, el potencial de diferenciación de cada fracción celular cerrada y clasificada debe evaluarse en ensayos de unidad formadora de colonias (UFC) de progenitores MK (UFC-MK) para evaluar objetivamente el potencial de diferenciación de cada población en el viaje de megacariopoyesis. Si bien se superan las limitaciones técnicas que una vez se pensó que impedían el tipo de megacariocitos maduros, tal necesidad todavía exige más perfección. Por un lado, el Omics unicelular permitiría realizar estudios exhaustivos a la hora de aplicar los paneles de inmunofenotipado, pero si se requiere una clasificación física, a pesar de que la pureza de las poblaciones clasificadas esté por encima del 85% (en base a la expresión de marcadores superficiales), hay que tener en cuenta otras variables, que todavía son difíciles de resolver. Como se mencionó, las culturas MK no son sincrónicas y son muy heterogéneas. Los MKs ellos mismos son promiscuos en la expresión superficial del marcador, compartiendo marcadores con otras células hematopoyéticas y no hematopoyéticas mieloides y no mieloides. Además, son muy difíciles de agrupar con las variables morfométricas (Forward y Side Scatter) ya que se distribuyen ampliamente. Se requieren más estudios para refinar esta aplicación, pero con los esfuerzos de colaboración, estamos más cerca de reducir la megacariopoyesis.
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Disclosures
La producción de material audiovisual contó con el apoyo de BD Biosciences.
Acknowledgments
Agradecemos a Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo y Begoña García Méndez (HUCA) y Paloma Cerezo, Almudena Payero y María de la Poveda-Colomo (HCSC) por su apoyo técnico. Este trabajo fue parcialmente apoyado por medical grants (Roche SP200221001) a A.B., una beca RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, España) y una beca I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, España y Fondos FEDER) a L.G., beca Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, España) a P.M.-B. y una beca postdoctoral intramuros 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, España) a A.A.-H. Agradecemos a Reinier van der Linden por compartir su conocimiento (y tiempo), especialmente su sabio consejo sobre la mezcla de paneles de anticuerpos etiquetados multicolor y la preparación para el control de perlas de un solo color.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
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