Summary
Här presenterar vi en immunophenotypning strategi för karakterisering av megakaryocyte differentiering, och visar hur den strategin tillåter sortering av megakaryocyter i olika stadier med en fluorescensaktiverad cell sortera. Metoden kan tillämpas på mänskliga primära vävnader, men också på megakaryocyter som genereras i kultur in vitro.
Abstract
Megakaryocyt (MK) differentiering omfattar ett antal endomitotiska cykler som resulterar i en mycket polyploid (når även >64N) och extremt stor cell (40-60 μm). I motsats till den snabbt ökande kunskapen i megakaryopoiesis på cellbiologi och molekylär nivå är karakteriseringen av megakaryopoiesis av flödescytometri begränsad till identifiering av mogna MKs med hjälp av härstamningsspecifika ytmarkörer, medan tidigare MK-differentieringsstadier förblir outforskade. Här presenterar vi en immunophenotypning strategi som gör det möjligt att identifiera successiva MK differentiering stadier, med ökande ploidy status, i mänskliga primära källor eller in vitro kulturer med en panel som integrerar MK specifika och icke-specifika ytmarkörer. Trots sin storlek och bräcklighet kan MKs immunofenotypas med hjälp av ovannämnda panel och berikas av fluorescensaktiverad cellsortering under specifika tryckförhållanden och munstyckesdiameter. Detta tillvägagångssätt underlättar multi-Omics studier, med målet att bättre förstå komplexiteten i megakaryopoiesis och trombocytproduktion hos människor. En bättre karakterisering av megakaryopoiesis kan utgöra grundläggande i diagnos eller prognos av härstamning-relaterade patologier och malignitet.
Introduction
Megakaryocyter (MKs) utvecklas från hematopoetiska stamceller (HSCs) efter en komplex process som kallas megakaryopoiesis, som främst orkestreras av hormonet trombopoietin (TPO). Den klassiska synen på megakaryopoiesis beskriver den cellulära resan från HSCs genom en följd av hierarkiska stadier av engagerade stamceller och föregångare celler, vilket i slutändan leder till en mogen MK. Under mognad upplever MKs flera omgångar av endomitosis, utveckla ett invecklat intracellulärt avgränsningssystem (DMS), som ger tillräckligt med membranyta för trombocytproduktion och effektivt producera och packa den mängd faktorer som finns i de olika granulerna som ärvs av mogna trombocyter1,2,3. Som ett resultat är mogna MKs stora celler (40-60 μm) som kännetecknas av en mycket polyploid kärna (når även >64N). Nyligen genomförda studier tyder på alternativa vägar genom vilka HSCs skiljer sig åt i MKs kringgå traditionella härstamning åtagande checkpoints som svar på vissa fysio-patologiska villkor4,5,6,7,8,9,10,11. Dessa resultat belyser att hematopoetisk differentiering mot den mogna MK är en kontinuum och adaptiv process som svarar på biologiska behov.
Med den ökande kunskapen om cellbiologin och de molekylära aspekterna som kännetecknar megakaryopoiesis12, är det mesta av forskningen som ägnas åt studier av processen genom flödescytometri begränsad till identifiering av mogna MKs med hjälp av härstamningsspecifika ytmarkörer (dvs. CD42A / B, CD41 / CD61), medan tidigare MK-differentieringsstadier förblir outforskade. Vi dokumenterade tidigare en strategi för att iscensätta megakaryopoiesis i mus benmärg och benmärg-härledda MK kulturer13,14, som vi har anpassat och tillämpat på människor15. I den nuvarande artikeln visar vi en immunophenotypningsstrategi som gör det möjligt att karakterisera megakaryopoiesis, från HSCs till mogna MKs, i mänskliga primära källor (benmärg -BM- och perifert blod -PB-) eller in vitro-kulturer med hjälp av en panel som integrerar MK-specifika och icke-specifika ytmarkörer (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT och CD71, bland andra). Trots sin stora storlek och bräcklighet kan MKs immunofenotypas med hjälp av ovan nämnda cellytans markörer och berikas av fluorescensaktiverad cellsortering under specifika tryck- och munstyckesdiameter för att minimera cellbrott och / eller skador. Denna teknik underlättar multi-Omics metoder, med målet att bättre förstå komplexiteten i megakaryopoiesis och trombocyt produktion i människors hälsa och sjukdom. Anmärkningsvärt, det kommer att utgöra ett användbart verktyg för att hjälpa diagnos och prognos i ett kliniskt sammanhang av växande efterfrågan.
I detta manuskript dokumenterar vi en strategi för att iscensätta mänsklig megakaryopoiesis med en panel som integrerar MK-specifika och icke-specifika ytmarkörer från primära källor eller genererad in vitro. Dessutom tillhandahåller vi ett protokoll för sortering, med en fluorescensaktiverad cellsortering, de föredragna fraktionerna och mogna MKs (Figur 1). Detta steg är inte populärt, eftersom det är tekniskt svårt på grund av MKs stora storlek och bräcklighet. Det har dock använts både i mus- och mänskliga benmärgsprover tidigare, och på grund av teknisk utveckling, med ett bättre resultat varjegång 16,17,18. Mänskliga primära källor där MKs eller MK prekursorer kan studeras inkluderar benmärg, navelsträngsblod och perifert blod, bland annat. Korrekt provbehandling för att isolera den relevanta cellfraktionen för analys av varje prov är av betydelse. Standardförfaranden införlivas, med vissa överväganden att ta hänsyn till när man siktar på studien av megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Helblods- och benmärgsprover erhölls och behandlades i enlighet med Helsingforsdeklarationen från 1964. Hela blodprover erhölls från friska donatorer efter att ha gett informerat samtycke (ISPA), inom en studie som godkänts av vår institutionella medicinska etiska kommitté (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Benmärgsprover erhölls från benmärgsaspirat kasserat material från patienter som hanterades vid institutionen för hematologi vid sjukhuset Clínico San Carlos (HCSC).
Figur 1: Schematisk representation av det protokoll som dokumenteras i detta manuskript. De primära mänskliga källorna eller primärkulturerna där MK differentiering kan iscensättas med hjälp av immunophenotyping anges. Denna immunophenotypning strategi kan tillämpas på studien av processen i olika härstamning-relaterade patologier eller malignitet i primära källor. Dessutom möjliggör det cellsortering av MKs och prekursorer med en fluorescensaktiverad cellsortering, vilket möjliggör ytterligare analys av berikade fraktioner. Bilder som används är en del av Servier Medical Art (SMART) av Servier och är licensierade enligt CC BY 3.0. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
1. Helblods- och benmärgsbehandling före immunofenotypning
- När du använder helblod (WB) från donationer som primär källa, isolera eventuellt komponenten perifert blod mononukleära celler (PBMC). Detta kan uppnås genom att använda standard differentialcentrifugation i kombination med densitetsgradientcellsseparation, som tidigarebeskrivits 15.
- I korthet centrifugblod vid 193 x g i 15 min (broms 3) vid rumstemperatur. Kassera den övre plasmafraktionen och samla upp den buffy ringen. Späd 1:1 med fosfatbuffertsaltlösning (PBS)/Trisodiumcitrat Dihydratbuffert (38 g/L, pH 7) buffert och pipett försiktigt en volym på 25 ml ovanpå 15 ml av en densitetsgradientlösning (1,076 g/ml) i 50 ml rör.
- Centrifugera i 20 min vid 1114 x g (gaspedalen 3, broms 3, rumstemperatur). Kassera plasmafraktionen och samla upp den buffiga ringen som innehåller PBMCs. Tvätta genom att tillsätta samma volym PBS, centrifug vid 435 x g i 5 minuter och återanvänd i PBS för vidare användning.
- Alternativt kan du använda ett WB-prov (cirka 100 μL) för immunofenotypning efter att ha lysat upp de röda blodkropparna (RBC) och tvättat noggrant.
- Späd kort 1:1 i iskallt RBC lysbuffert (4,15 g NH4Cl, 0,5 g KHCO3 och 18,5 mg EDTA (triplex III) till 500 ml H2O, pH 7,1-7,4). Vänta tills cellfjädringen blir genomskinlig röd (3-5 min).
- Centrifug vid 435 x g i 5 min, vid 4 °C, och återanvänd cellerna i PBS. Upprepa proceduren så många gånger som behövs för att få en vit cellpellet.
- Bearbeta på samma sätt direkt de prover som erhållits från benmärgen (aspiration) med RBC-lysbuffert (se punkt 1.2) och noggrann tvättning, till att börja med en tydlig encellsupphängning (figur 1).
- Undvik användning av virvel för att blanda prover under bearbetningen, eftersom det kan skada de ömtåliga MKs. Blanda genom att snärta eller vända röret.
OBS: Densitetsgradient för att erhålla PBMCs kan resultera i en rikare och renare cellfraktion jämfört med RBC-lysad WB. Vi bör dock komma ihåg att mogna MKs med hög densitet kan gå förlorade i "neutrofil" fraktionen. Detta kommer att diskuteras i de representativa resultaten.
- Undvik användning av virvel för att blanda prover under bearbetningen, eftersom det kan skada de ömtåliga MKs. Blanda genom att snärta eller vända röret.
2. In vitro MK-differentiering från PBMCs
OBS: MKs kan skiljas in vitro från tidigare prekursorer, såsom CD34+ celler, som finns i olika primära källor(dvs. WB / PBMCs, navelsträngsblod, benmärg) och från iPSCs. Det finns olika protokoll som har tillämpats i detta syfte. Här använder vi en kulturmetod utvecklad av oss som tillåter MK-differentiering från PBMCs, utan att behöva berika för CD34+ prekursorer15,19,20,21,22.
- Detta protokoll består av tre kulturfaser,där koncentrationenav trombopoietin (TPO) gradvis ökar på bekostnad av tillväxtfaktorer som gynnar spridningen av tidigare prekursorer ( dvs. SCF, EPO), som gradvis minskar (figur 2)15.
- För basmediet, använd StemSpan SFEM kompletterad med 0,4% kolesterolrik lipidblandning och 1% Penicillin/Streptomycin.
- För fas I-mediet, använd basmediet kompletterat med SCF (100 ng/mL), Erythropoietin (EPO, 0,5 U/mL) och Thrombopoietin (TPO, 30 ng/mL). Fas II-mediet är basmediet kompletterat med SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) och TPO (50 ng/mL). För fas III-mediet, använd basmediet kompletterat med TPO (100 ng/ml).
- Kultur PBMCs i fas I medium. Vid dag 6-8 placerar du PBMCs i fas II-medium och placerar pbmcs dag 9-12 i fas III-medium.
- Byt ut medium mot centrifugeringsceller vid 435 x g i 5 min vid rumstemperatur från fas I till fas II och vid 95 x g i 5 minuter vid rumstemperatur från fas II till fas III och återanvänd dem i färskt medium.
- Odlingsceller i en inkubator vid 37 °C, 5 % CO2. I dessa primära kulturer varar MK-differentiering 10-14 dagar, och prover kan tas vid olika tidpunkter under kulturperioden, för att följa MK-differentiering.
- För basmediet, använd StemSpan SFEM kompletterad med 0,4% kolesterolrik lipidblandning och 1% Penicillin/Streptomycin.
Figur 2: Schematisk representation av den PBMC-härledda MK-odlingsmetoden. PBMCs från friska givare odlades enligt det trefasprotokoll som utvecklats av oss för att generera MK in vitro (system anpassat från Salunkhe et al). 15 Bilder tagna dag 10 och dag 13 av kultur visas. Bilder är tagna med ett 20X-mål. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Provsamling: Tvätta cellerna genom att applicera låghastighetscentrifugering i 5 min (95 x g) och återanvänd dem i PBS eller PBS som innehåller 1 % av bovint serumalbumin (BSA). För immunofenotypning är den ideala densiteten 105-106 celler/100 μL (se punkt 3.1). Beroende på kulturernas status (dvs. närvaro av döda celler, skräp etc.), kan 1 eller 2 tvättar behövas. Samla dina celler vid intressanta tidpunkter under kulturen.
3. Immunophenotypning av MK-differentiering - inkubation med en panel av märkta antikroppar
- Inkubera cellproverna med en panel av märkta antikroppar enligt standardförfaranden, var uppmärksam på centrifugering vid låg hastighet (95 x g) vid bearbetning av megakaryocyter. Vi inkuberar normalt proverna med 1% BSA i PBS i volymer på 100 μL vid 4 °C, 20 min, med ett intervall på 105-106 celler.
- Skala upp vid behov.
- Efter inkubation, tillsätt 5 ml 1% BSA i PBS, centrifugera vid låg hastighet (95 x g), aspirera supernatanten och återanvänd provet i 2% BSA i PBS för att bevara MK-livskraft (2 ml). Tillsätt 1-5 mM EDTA för att störa cellcellsaggregat (som naturligtvis ses i MK-kulturer).
- Överför prover till ett 12 x 75 mm runt bottenrör (FACS-rör) eller platta, håll dem i mörkret tills flödescytometrianalys eller cellsortering.
- Beredning av enstaka antikroppar och antikroppspanelblandningar; ställa in flödescytometern:
- Titrera antikropparna före användning för att bestämma den optimala koncentrationen i antikroppspanelerna. Den optimala koncentrationen av antikroppar är den lägsta koncentrationen som skiljer tydligt positiva från negativa celler (och tillåter distinktion av mellanliggande uttrycksnivåer). Som ett exempel används de flesta antikropparna i en utspädning på 1:200 (lager 100 μg/ml) om inte tillverkaren på annat sätt titrerade eller angav det.
- När antikroppstitrering är bestämd, förbered en 10x utspädning av varje antikropp. Dessa utspädningar används för enfärgskontrollerna och för att förbereda panelblandningarna. Utspädningarna och panelblandningarna är bra att använda även en månad efter beredningen (lagrade vid 4 °C, såvida inte tillverkarens indikationer utesluter dessa lagringsförhållanden). Detta gör det möjligt att färga prover med samma panel under en tidsperiod.
- Använd 10 μL per 100 μL av 10x utspädning både för enfärgskontrollerna och för panelblandningen.
- För enfärgskontrollerna använder du antikroppstillhörighetspärlor, som kan mätas direkt efter att antikroppen har tillstärks. Enfärgskontrollerna bör mätas med varje experiment för att möjliggöra korrekt kompensationsjustering (och finjustering efter mätning med analysprogramvaran).
- Du kan också utföra enfärgskontrollerna med cellprover. Pärlor tillåter dock snabb mätning av ett visst antal händelser, som, beroende på antikropps-/ytmarkören, kanske inte är möjliga att få på komplexa primära eller odlade cellkällor. Vi rekommenderar också att du kör cellprover färgade med "Fluorescens Minus One" (FMO) panelblandningar för att ställa in lämpliga kompensationsinställningar (innan du kör experiment). Detta är relevant för att noggrant identifiera kompensationsproblem, och särskilt i odlade MKs, för att identifiera autofluorescensstörningar (som kommer att finnas om man använder odlingsmedium som innehåller fenolrött).
- Förbered tillräckligt med volym av panelblandningen, beroende på antalet prover, som innehåller antikropparna på den utformade panelen. De flesta av våra paneler innehåller sex antikroppar (6-färgspaneler, se tabellerna 1-2).
- För dessa paneler, använd 488-nm och 633-nm lasrar av flödescytometern, men paneler kan anpassas till andra tekniska scenarier. Dessutom kan kompensationsövervägandena undanröjas vid användning av masspektrometribaserad flödescytometri eller cytometrar med akustisk fokuseringsteknik.
- Färgämnen för att mäta livskraft kan ge falsk information om MKs, särskilt när de mognar. MKs är mycket aktiva upptagande celler, och positivitet med Hoechst, 7-AAD eller PE, kanske inte alltid återspeglar faktisk celldöd. Ett alternativ (om celldödsmätning krävs) kan vara användning av mitokondrier fläckar (CMX Ros) eller aminer reaktiva färgämnen (Zombie eller Ghost färgämnen).
Tabell 1: Anteckningar om cellytans markörer för den megakaryocytiska härstamningen Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Antikroppspaneler Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
4. Ploidy-analys kombinerad med 6-färgspaneler
- För ploidy analys, i kombination med en 6-färgs antikropp panel, fortsätt med fixering och permeabilisering av celler efter inkubation med antikropp panelen. Denna strategi kommer att göra det möjligt att bevara ytmarkörfärgningen, samtidigt som färgning av cellernas DNA tillåts. Vi använder Hoechst 33342 för att färga DNA, eftersom det kan visualiseras med den tillgängliga violetta 405-nm lasern.
- För 105-106 celler, efter inkubation med antikroppspanelen, centrifugceller (95 x g i 5 min), återanvänds 200 μL fixeringsbuffert och inkuberar 10 min vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugceller enligt ovan, återanvänds för andra gången 200 μL fixeringsbuffert och inkuberar ytterligare 10 minuter på RT.
- Förbered permeabiliseringsbuffert, innehållande 0,1% Triton X-100, 200 mg/mL RNase och 20 mg/mL Hoechst 33342 (permeabilisering Hoechst MIX).
- Centrifugera celler som ovan, återanvänd dem i 300 μL av permeabilization Hoechst MIX och inkubera 30 min vid 37 °C. Detta steg är mycket viktigt, eftersom RNA måste försämras för att få en ren ploidymätning.
- Efter inkubationstiden, mät proverna direkt med en flödescytometer. Håll annars proverna vid 4 °C i mörker. Mät dem snabbt. Men eftersom dessa prover är fasta kan mätningen försenas även 24-48 timmar. Se till att provet snärtas noggrant före mätningen, eller passerar genom en cellsil, för att säkerställa en enda cellupphängning.
- Morfometriska parametrar som Framåt och Sidospridning upprätthålls inte efter cellfixering. Framåt-/sidospridningsdiagramt visar en krympning av cellfördelningen efter fixeringen. Ytmarkörfärgningen bevaras dock mestadels, och gatingstrategin ändras knappt, vilket gör det möjligt att analysera ploidystatusen i de olika stadierna av differentiering som definieras av ytmarkörkombinationer.
5. MK differentieringsanalys
OBS: Vi har sett att kombinationen av CD31/CD71 gör det möjligt att ställa in ett antal grindar som motsvarar olika stadier av MK-differentiering. Ytterligare rygg-gating med MK-specifika markörer möjliggör separation av mogna och omogna MKs. I färska prover förfinar dessutom återindelningen för att kontrollera förekomsten av andra markörer som används, eller för att placera populationerna i framåt-/sidospridningsaxlarna, bedömningen av MK-differentieringssteg och gör det möjligt att kassera andra celltyper som kan förekomma på samma populationer.
- Använd en panel av antikroppar som innehåller tidiga prekursormarkörer (KIT, CD34), vanliga prekursormarkörer (CD31, CD71) och härstamningsmarkörer, några av dem specifika (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, etc.) (se tabellerna 1-2). Användningen av härstamning (Lin) cocktail (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 och CD56), gör det också möjligt att "filtrera bort" mogna hematopoetiska celler som kan lägga till brus till analysen (när man väljer Lin- population). Som ett exempel kommer vi att gå igenom analysen av MKs i PBMCs, benmärg och genom PBMC-härledda cellkulturer i de representativa resultaten.
6. MK- och MK-prekursorcellsortering
OBS: De färgade cellerna analyserades och sorterades på en fluorescensaktiverad cellsorterare FACS Aria IIu utrustad med 488 nm och 633 nm standard solid state-lasrar med FACSDiva-programvara; data analyserades och presenterades dessutom med FlowJo programvara och Cytobank (viSNE analys). Renhet av sorterade fraktioner bekräftades av flöde cytometri analys av var och en av de sorterade fraktionerna (renhet över 85%).
- Utför cellsortering så snart som möjligt eller inom 1 timme efter antikroppsinkubation för att undvika cellförsämring.
- Filtrera provet med en 100 μm cellsil för att säkerställa encellsfjädring och integriteten hos stora MK.
- Använd ett keramiskt munstycke på 130 μm, ett manttryck inställt på 11 pund per kvadrattum (PSI) och drop-drive-frekvensen inställd på 12 kHz för att bryta strömmen i droppar.
- Innan du sorterar, sterilisera munstycket, hyxeln och provledningarna genom att utföra ett 30 minuters förvärv med Penicillin/Streptomycin utspädd 1:5 i sterilt vatten, följt av ett 10 minuters förvärv med sterilt vatten för att avlägsna återstående dekontaminant.
- När strömmen har stabiliserats justerar du droppfördröjningen med rekommenderade pärlor för att sortera i finjusterat läge mer än 97,5% av de reflekterade dropparna med en flödeshastighet på 400-1200 händelser per sekund.
- Förbered FACS-rör med 500 μL 2% BSA i PBS. Andelen BSA kan ökas upp till 5-10%.
- Generera experimentmallen med rätt kompensationsmatrisparametrar.
- Ladda FACS-röret i cytometern.
- Utför en mätning av provet för att ställa in önskade grindar och renheten hos målcellspopulationerna. Underhåll posten aktiverad för att visa upp till 200 000 händelser i de valda populationsportarna under cellsortering.
- FACS Aria IIu tillåter separation av upp till 4 olika cellpopulationer samtidigt. Skapa en ny sorteringslayout och välj uppsamlingsenheten (4 rör) och lämpligt precisionsläge (mellanmask av renhet och återhämtning rekommenderas). Lägg slutligen till den eller de populationer som är av intresse i varje sorteringsplatsfält (figur 3).
Figur 3: Schematisk representation av principen om fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Partiklarna går igenom 130 μm-munstycket och tvingas bryta upp i en ström av regelbundna droppar på grund av vibrationer på munstycket. Därefter förhörs dropparna av lasern (analyspunkt) och signalerna bearbetas för att ge "sortera beslutet" genom att tillämpa en laddning på dessa droppar. När en laddningsdroppe passerar genom ett högspänningselektrostatiskt fält (detekteringsplatta) avböjs den och samlas in i motsvarande uppsamlingsrör. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Ladda uppsamlingsrören och börja sortera målpopulationerna.
- Centrifugera uppsamlingsrören i 5 minuter vid 95 x g och återanvänd cellpelleten i lämplig volym på 2 % BSA i PBS.
- Mät igen en bråkdel av varje sorterat prov för att beräkna renheten.
- Lagra celler på lämpligt sätt för vidare användning. Sorterade celler kan användas för cytologiska och molekylära analyser, eller kan omkultureras i syfte att studera differentieringsprocessen för en vald cellpopulation.
7. Provberedning efter sortering
- Förbereda cytospiner för cytologisk analys med cytocentrifuge
- Ta med sorterade celler till en lätthandtagsarbetsvolym på 100-200 μL. Ta hänsyn till att celltätheten beror på den sorterade befolkningsavkastningen i varje enskilt fall.
- Placera en ren glidning på metallhållaren och placera en filtertopp. Kom ihåg att märka bilden och filtret för att undvika blandning av prover.
- Tillsätt 100 μL PBS på filterhålet mot glidningen, så att filtret blir fuktat på hålkanten.
- Placera tratten, stäng metallhållaren och placera den på plats i centrifugen.
- Tillsätt provet (100-200 μL) inuti tratten.
- Centrifugera vid 36 x g i 5 minuter. Cytospinbilderna kan tillåtas lufttorka vid RT (ordentligt täckta för att förhindra damm) och kan förvaras på RT i 1 vecka före immunostaining eller histokemi.
- För immunostaining
- Fixera diabilder i 2% paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS och inkubera under 5min.
- Ett intervall på 0,5-4% PFA i PBS kan användas. I våra händer använder vi 4% för att få korrekt fixering av vävnader eller vissa celltyper, och 0,5% PFA i PBS är tillräckligt för trombocyter. När du ställer in den här tekniken kräver rätt procentandel PFA optimering per celltyp/källa.
- Inkubera 5 min i PBS.
- Inkubera 5 min i 50% etanol (EtOH).
- Inkubera 5 min i 70% EtOH.
- Förvara i 70% EtOH vid -20ºC.
- Vid utförandet av immunostaining, rehydrera och följ standardprocedurer (permeabilisering, tvättning, blockering, primära och sekundära antikroppsinkubationer, konservering etc.).
- Fixera diabilder i 2% paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS och inkubera under 5min.
- För cytokemi:
OBS: Diabilderna kan färgas med Maj-Grünwald Giemsa färgning eller den praktiska färgningen för varje ändamål. - För omedelbar morfologiundersökning
- Tillsätt en droppe monteringsmedium på cytospinens cellinnehållande fläck och placera ett täckglas.
- Håll diabilderna vid 4 °C inte längre än en vecka, om de inte är förseglade, vilket möjliggör långtidslagring även vid RT. Montering av medium fixering möjliggör långtidslagring på RT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benmärg och ploidy
I figur 4visar vi en representativ immunofenotypningsanalys av megakaryopoiesis i BM-prover (aspiration) från patienter. När vi plottar cellfraktionen mot CD71 och CD31 har vi gated sex huvudpopulationer: CD31- CD71- (röd), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71mitten (ljusgrön), CD31+ CD71+ (mörkgrön) och CD31++ CD71mitten (grädde). Dessa populationer är inte alltid närvarande i samma positioner (med tanke på konstanta cytometerinställningar), som det kan ses, och det bör beaktas. Detta kan vara inneboende i patologiska villkoret och benmärg status. Dessa sex populationer överdragna i histogram mot en mognadsmarkör som finns i panelen (CD42A/CD42B) och till framåtspridningen visas till höger. Figuren visar också ett diagram mot CD31/CD71 som visar ett överlägg av CD42B+ celler med den totala cellulära fraktionen för att visualisera fördelningen av de mer mogna MKs. I allmänhet innehåller populationen CD31- CD71- inte MKs eller härstamningsprekursorer, presenterar inte MK mognadsmarkörer och är mindre i storlek. CD31- CD71+ populationen innehåller huvudsakligen celler i erytroida härstamning, även om det också kan innehålla gemensamma härstamning föregångare, som vi antar från våra observationer. Det är fortfarande negativt för MK-mognadsmarkörer, och beroende på andelen tidigare eller senare erytroida celler kan den främre spridningen också fluktuera.
Som ett exempel har myelodysplastic syndrom (MDS) patienten en större andel omogna (dvs.större) erytroida celler, jämfört med andra patienter. MK-förfäder och mogna celler distribueras i CD31+ -cellerna, med viss variation. Men eftersom det kan ses jämföra BM-analysen på varje patologi finns det några konstanta funktioner. Mer mogna MKs finns i CD31++ CD71mellanpopulationen (grädde), och patologier där denna mognad är "blockerad" inkluderar Immun trombocytopeni (ITP) och ett reaktivt BM-prov (med underliggande inflammation). Medan i lymfom patienten verkar det finnas en jämvikt mellan tidiga prekursorer och sena MKs (orange och grädde grindar), ändras denna andel i MDS patienten (med mer "blockerade" prekursorer) och i akut myeloisk leukemi (AML) patient (med mer mogna MKs). Av intresse verkar "blockaden" vara annorlunda jämföra patologier sinsemellan: i patologier som instämmer med underliggande inflammation kan blockaden bero på en kombination av mognadsdefekter, förstörelse (dvs.autoimmunitet) och trombocytproduktion av MK-sprängning.
Figur 4: Immunophenotyìng av megakaryopoiesis i mänskliga benmärgsprover från patienter med olika patologier. Representativa benmärgsprover (BM) från patienter somdiagnostiserats med lymfom( dvs. normal BM), myelodysplastiskt syndrom (MDS), akut myeloisk leukemi (AML), immun trombocytopeni (ITP) och en patient med reaktiv BM på grund av en infektion analyserades. När vi plottarcellfraktionen (dvs.nukleerade celler) mot CD71 och CD31 har vi gated sex huvudpopulationer: CD31- CD71- (röd), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71mitten (ljusgrön), CD31+ CD71+ (mörkgrön) och CD31++ CD71mitten (grädde). Dessa populationer är inte alltid närvarande i samma positioner (med tanke på stabila cytometerinställningar), som det kan ses, och det bör beaktas. Dessa sex populationer överdragna i histogram mot en mognadsmarkör som finns i panelen (CD42A/CD42B) och till framåtspridningen visas till höger. Figuren visar också ett diagram mot CD31/CD71 som visar ett överlägg av CD42B+ -cellerna med den totala cellfraktionen för att visualisera fördelningen av de mer mogna MKs. Tal som matchar portarna i prickdiagrammet och histogramöverläggen avbildas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Vi gav oss sedan ut för att analysera ploidystatusen för ovannämnda populationer på mänskliga BM-prover. Figur 5 visar en ökande ploidystatus inom CD31+ populationerna, som vi förutser kommer att vara olika och karakteristiska för varje patologiskt sammanhang. Observera att på grund av cellfixeringen och permeabiliseringen som används i dessa experiment är punktdiagrammen inte helt jämförbara med dem i obesedda, icke-genomsläppliga prover (figur 4).
Figur 5: Ploidyanalys av de populationer som valts ut baserat på CD31/CD71-uttryck i mänskliga BM-prover. Representativa benmärgsprover (BM) från patienter som diagnostiserats med akut myeloisk leukemi (AML) och immuntrombocytopeni (ITP). När vi plottarcellfraktionen (dvs.nukleerade celler) mot CD71 och CD31 har vi gated sex huvudpopulationer: CD31- CD71- (röd), CD31- CD71+ (blå), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71mitten (ljusgrön), CD31+ CD71+ (mörkgrön) och CD31++ CD71mitten (grädde). Dessa populationer är inte alltid närvarande i samma positioner (med tanke på stabila cytometerinställningar), som det kan ses, och det bör beaktas. Back-gating dessa sex populationer överlagrad i histogram mot Hoechst 33342 visar befolkningens olika ploidy status, och den allmänna tendensen att öka ploidy med mognad (även om MKs kan nå mognad oberoende av polyploidization status). Nummer som matchar grindarna i prickdiagrammet och histogramöverläggen avbildas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
PBMCs och cellkultur
I figur 6visar vi en representativ immunofenotypningsanalys av PBMCs och MK-kulturen som är inställd med dessa PBMCs dag 7 och dag 11. Vi använder en panel som innehåller Lin cocktail, och vi visar cellulära fraktionen av levande celler före och efter Lin- urval. Detta negativa val kan leda till förlust av en bråkdel av MKs som uttrycker till exempel CD14, men det möjliggör också en mer förfinad analys. När vi ritade Lin- fraktion mot CD71 och CD31, gated vi fem huvudpopulationer: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mid och CD31++ CD71mitten. Dessa populationer är inte alltid närvarande i samma positioner (med tanke på konstanta cytometerinställningar), som det kan ses, och det bör beaktas. I detta fall är skillnaderna inte bara inneboende i den individuella hälso- eller patologiska statusen, utan också till MK-differentieringskapaciteten hos prekursorerna i PBMC-fraktionen. Dessa fem populationer som överdragit i histogram mot andra markörer i panelen (KIT och CD42B) och till framåtspridningen visas till höger. MK-prekursorer och MKs i olika stadier av mognad ligger inom CD31+ populationerna.
Figur 6: Immunophenotypning av megakaryopoiesis under MK-cellkulturen, inklusive startmaterialet PBMC. Representativ immunophenotyping analys av PBMCs och MK kulturuppsättningen med de PBMCs på dag 7 och dag 11. Vi använder en panel som innehåller Lin-cocktailen, ochvi visar cellfraktionen (dvs.nukleerade celler) före och efter Lin-valet. Detta negativa val kan leda till förlust av en bråkdel av MKs som uttrycker till exempel CD14, men det möjliggör också en mer förfinad analys. När vi plottade Lin-fraktionen mot CD71 och CD31 gated vi fem huvudpopulationer: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71mitten och CD31++ CD71mitten. Dessa populationer är inte alltid närvarande i samma positioner (med tanke på stabila cytometerinställningar), som det kan ses, och det bör beaktas. Dessa fem populationer som överdragit i histogram mot andra markörer i panelen (KIT och CD42B) och till framåtspridningen visas till höger. MK-prekursorer och MKs i olika stadier av mognad ligger inom CD31+ populationerna. Figuren visar också ett diagram mot CD31/CD71 som visar ett överlägg av CD42B+ -cellerna med den totala cellfraktionen för att visualisera fördelningen av de mer mogna MKs. Tal som matchar portarna i prickdiagrammet och histogramöverläggen avbildas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 3: Befolkningsprocent av flödescytometrianalyser Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
I PBMCs är MKs inom CD31++ CD71mittporten, även om deras storlek inte är så stor som vi har sett med odlade MKs. Detta kan bero på något av följande två alternativ: MKs i PBMCs representerar en bråkdel av omogna MKs som kommer in i cirkulationen, eller en bråkdel av mogna cirkulerande MKs som har förlorat cytoplasmisk komplexitet. Våra sortexperiment tyder på att det senare kan vara orsaken till att förklara den storleksskillnaden. Att stödja detta begrepp, uttrycket av CD42B, finns inte i 100% av cellerna på dessa populationer (som det också kan ses i BM-prover i figur 4), förmodligen på grund av förlust av ytmarkörer vid proplateletbildning och/ eller trombocytutgjutning. Men i odlade prover är MKs i de "mogna" grindarna nästan 100% CD42B+och större i storlek. Dessa hypotetiska cellulära dynamik bör studeras ytterligare och valideras.
På grund av de pleiotropiska effekterna av TPO är dessa kulturer heterogena och asynkrona, vilket i sig gör det svårt att ytterligare analysera diskreta MK-differentieringsstadier. 19,20 Efter expansionen av tidigare föregångare kommer MKs i olika mognadsstadier att visas i kulturen från dag 6-10 (eller tidigare, på grund av donatorvariation) och kommer gradvis att öka i antal när MK-härstamningsbesatta celler mognar mot MK. Vissa MKs kommer att genomgå terminal differentiering och börja bilda proplatelets. Mot slutet av kulturen kommer cellförlusten gradvis att öka på grund av "utökning/utmattning" efter proplateletbildning och trombocytutgjutning eller celldöd (figur 2).
Om TPO-analoger används i stället för rekombinant TPO bör koncentrationerna testas.
Källan till stamceller (vuxen, navelsträngsblod) kommer att konditionerade kulturerna, eftersom MKs från källor till olika utvecklingsstadier har sina egna egenskaper. Dessutom kommer kulturer från berikade CD34+ stamceller, samtidigt som de verkar mer homogena i början av kulturen, att nå ett stadium av heterogenitet och asynkronicitet när MK-engagemang och differentiering börjar19,20.
MK-cellsortering
I figur 7visar vi en representativ gatingstrategi för ett urval av MK in vitro-kultur på dag 10 av differentiering. När vi plottar den nukleära cellfraktionen mot CD31 och CD71, eller Den främre scattern, kan vi skilja två huvudpopulationer som kännetecknas av närvaron eller frånvaron av CD31.
När CD31 +fraktionen ritas mot CD41 och CD71, Vi kan utfärda fyra huvudpopulationer: CD41- CD71- (1), CD41låg CD71+ (2), CD41låg CD71+++ (3) och CD41+++ CD71+ (4), där andra ytmarkörer (KIT och CD49B) uttrycktes differentiellt, vilket gör det möjligt att identifiera MK-facket som CD41 mycket positiva celler (Figur 7A). Renheten hos de sorterade fraktionerna visas, liksom cytologiska färgningar av cytospiner av de sorterade fraktionerna.
För att karakterisera cellpopulationsspektrumet i PBMC-MK-kulturer användes viSNE-analys (figur 7B). ViSNE-kartan separerar celler i rumsligt distinkta delmängder baserat på kombinationen av markörer som de uttrycker. Varje punkt i viSNE-analysen representerar en enskild cell färgad enligt uttrycksnivåerna för CD31, CD42A, CD71 och KIT.
Dubbla negativa celler (CD31- och CD71- )är huvudsakligen resterande lymfocyter (population 5) som kvarstår i hela kulturen under dessa förhållanden. Den här populationen har sorterats i en andra omgång cellsortering med den återstående fraktionen av exemplet.
Gaterna 6 och 7 är CD71mellan- och hög uttrycker celler, som inkluderar erytroida stamceller och, potentiellt, andra föregångare.
Vi måste ta hänsyn till de tekniska svårigheterna på grund av cell heterogena karaktären hos denna kulturmetod och den klibbiga karaktären hos mogna MKs som resulterar i närvaron av mogna MKs i subpopulationer där de inte hör hemma (se anmärkningar avsnitt).
Figur 7:Pre-sort immunophenotypisk analys av 10-dagars in vitro-kultur MKs. A) Representativ gating strategi med CD31, CD41 och CD71, med två sorteringsrundor, vilket resulterar i CD31+ populationer 1-4 och CD31- populationer 5-7. Renheten hos varje sorterad fraktion analyserades efter sortering och avbildas tillsammans med en representativ mikrofotograf av färgade cytospiner från varje sorterad fraktion. B) viSNE karta över dag 10 PBMC-härledda MK odlingsceller mätt med flöde cytometri. Kartan är byggd med uttrycksnivåerna CD31, CD42B, CD71 och KIT, mätt med flödescytometri. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bearbetning efter sortering
De sorterade populationerna kan analyseras med olika metoder, inklusive cytologisk och molekylär analys av immunofluorescens (se avsnitt 7) för att utvärdera MK-funktionerna i ett specifikt fysio-patologiskt sammanhang, eller för att bättre studera processen med megakaryopoiesis. Några exempel presenteras i figur 8.
Bild 8. Eftersortering MK-analys. A) Cytologisk analys av sorterat MK-fack från en 10-dagars in vitro-kultur. May-Grünwald Giemsa färgning gör det möjligt att observation av viktiga funktioner hos mogna MKs, dvs.pseudopod bildas (röd pil), mycket polyploid MK (blå pil). B) Immunofluorescensanalys. Cellerna var färgade med anti-human von Willebrand faktor (visas i röd, sekundär antikropp Alexa Fluor 555 Goat anti-mouse IgG), anti-human CD31 eller tandem CD41/CD61, båda konjugerade med FITC (visas i grönt) och nukleärt DNA var märkt med DAPI (visas i blått). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Anmärkningar:
MKs kan sorteras från oväntade regioner på grund av förmågan att fästa celler i membranet (figur 9). Det här problemet kan vara ett problem för att få cellunderpopulationer med hög renhet. För att minimera cellcellsaggregat kan 1-5 mM EDTA läggas till i panelblandningsbuffertarna.
När vi använde WB som utgångsmaterial föreslog vi dessutom att antingen skaffa PBMCs eller lysande RBCs för att använda cellfraktionen direkt. I figur 10 visar vi flödescytometrianalys av de två metoderna. Å ena sidan, när vi lyser RBCs och analyserar hela cellfacket, har vi fortfarande en stor mängd neutrofiler. Dessa kan filtreras bort med en specifik markör (eller med hjälp av Lin cocktail strategi). Vi kan dock förlora några MKs på grund av deras promiskuösa natur relaterade till ytmarköruttryck. Å andra sidan kommer PBMC-isolering att göra det möjligt för oss att bli av med neutrofiler såväl som RBCs, även om vi kan förlora MKs med högre densitet (dvs.de med mer komplexa cytoplasmafunktioner eller mer omogna). Som visas i figur 10visar MKs från lysed WB ett högre uttryck för mognadsmarkörer, som visas lägre när pbmcs isoleras. Densitetsgradienten kan resultera i förlust av MKs som fortfarande innehåller en komplex cytoplasma, medan de som ingår i PBMC-fraktionen, kan redan vara "utmattade" i cirkulationen efter att trombocyter släppts ut och därmed upprätthålla polyploidkärnan inom en mindre komplex cytoplasma. De bör inte förväxlas med omogna MKs. Varje förfarande har sina fördelar och nackdelar.
Figur 9. MKs klibbiga natur. MKs kan hittas i oväntade grindar på grund av deras förmåga att fästa celler på sitt membran. A-C) MKs sorterade i populationerna 1 (B) och 5 (A och C), enligt gatingstrategin för MK-sortering. Det här problemet kan vara ett problem för att få cellunderpopulationer med hög renhet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 10. Flöde cytometri immunophenotypning av MKs från PBMCs eller WB efter lysing RBCs. A) Gating strategi. B) Storlek (FSC), cellulär komplexitet (SSC) och uttryck för CD42A, CD41, CD71 och KIT i MK som identifierats i PBMCs eller WB. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mesta av forskningen som fokuserar på studier av megakaryopoiesis genom flödescytometri är hittills begränsad till identifiering av MK-undergrupper med endast härstamningsspecifika ytmarkörer (dvs.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), medan tidigare MK-differentieringssteg har undersökts dåligt. I den nuvarande artikeln visar vi en immunophenotyping strategi för att ta itu med ett omfattande flöde cytometri karakterisering av mänskliga megakaryopoiesis. Sammantaget vill vi lyfta fram nyttan av att kombinera MK-specifika och icke-specifika ytmarkörer (tabellerna 1 och 2) i samma flödescytometriantikroppspanel för studier av megakaryopoiesis på ett mer detaljerat sätt. Vårt nya tillvägagångssätt kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att hjälpa diagnos och/eller prognos vid hematologiska störningar. Vi anser att de presenterade panelerna och kombinationerna inte är definitiva. Vi har observerat ett mycket dynamiskt beteende hos ytmarkörer i mänskliga primära källor (främst i BM-prover), som också är beroende av den subjacenta patologin. Fler studier krävs, och förhoppningsvis kommer forskarsamhället att börja tillämpa detta tillvägagångssätt när det gäller feedback med observationer från studier som fokuserar på en enda patologi och hur megakaryopoiesis iscensättning kan hjälpa till vid diagnos eller prognos. Genomförandet av kombinerad HSC- och MK-karakterisering i primärvävnader, med tanke på de olika vägar för MK-engagemang som kommenteras i introduktionsavsnittet, är relevant och värt att vidareutveckla. Det faktum att vi också kan upptäcka MKs i PBMCs är en riktig observation. Vi antar också att analysen av MKs i denna primära källa kommer att bidra till sjukdomsdiagnos och prognos, som ett mycket relevant alternativ till BM aspirerar, eftersom extraktion av ett blodprov inte är lika invasivt. Den aspekten kräver också utveckling.
Trots de tekniska begränsningarna i samband med de biologiska egenskaperna hos MKs (stor storlek, osmotisk bräcklighet, klibbighet) kunde vi sortera olika mognadsstadier i flera mänskliga MK-källor, särskilt i BM, PBMCs och PBMCs-härledda cellkulturer. Framtida studier kommer att genomföras för att analysera särdragen hos megakaryopoiesis i andra mänskliga källor som navelsträngsblod och i olika fysio-patologiska situationer. Dessutom bör differentieringspotentialen för varje gated och sorterad cellfraktion utvärderas i kolonibildande enhet (CFU) analyser av MK-stamceller (CFU-MK) för att objektivt bedöma differentieringspotentialen hos varje population i megakaryopoiesis-resan. Samtidigt som man överträffar de tekniska begränsningar som en gång ansågs hindra den typ av mogna megakaryocyter, kräver en sådan nödvändighet fortfarande mer perfektion. Å ena sidan skulle encelliga Omics tillåta omfattande studier vid applicering av immunofenotypningspanelerna, men om fysisk sortering krävs, trots att renheten hos de sorterade populationerna är över 85% (baserat på ytmarköruttryck), måste andra variabler beaktas, som fortfarande är svåra att lösa. Som nämnts är MK-kulturer inte synkrona och är mycket heterogena. MKs själva är promiskuösa i ytan markör uttryck, dela markörer med andra myeloisk och icke-myeloisk hematopoetiska och icke-hematopoetiska celler. Dessutom är de mycket svåra att gruppera med de morfometriska variablerna (Framåt och Sidospridning) eftersom de distribuerar brett. Ytterligare studier krävs för att förfina denna applikation, men med samarbeten är vi närmare att begränsa megakaryopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Produktionen av audiovisuellt material stöddes av BD Biosciences.
Acknowledgments
Vi tackar Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo och Begoña García Méndez (HUCA) och Paloma Cerezo, Almudena Payero och María de la Poveda-Colomo (HCSC) för teknisk support. Detta arbete stöddes delvis av Medical Grants (Roche SP200221001) till A.B., ett RYC-stipendium (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) och ett I+D 2017-bidrag (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien och Fondos FEDER) till L.G., ett Severo Ochoa-anslag (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanien) till P.M.-B. och ett intramurala postdoktorala bidrag 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Spanien) till A.A.-H. Vi tackar Reinier van der Linden för att han delar med sig av sina kunskaper (och tid), särskilt hans kloka råd om flerfärgs taggad antikroppspanelblandning och enfärgspärlakontrollpreparat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
