Summary
Hier presenteren we een immunofenotyping-strategie voor de karakterisering van megakaryocytdifferentiatie en laten we zien hoe die strategie het sorteren van megakaryocyten in verschillende stadia mogelijk maakt met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder. De methodologie kan worden toegepast op menselijke primaire weefsels, maar ook op megakaryocyten gegenereerd in kweek in vitro.
Abstract
Megakaryocyt (MK) differentiatie omvat een aantal endomitotische cycli die resulteren in een zeer polyploïde (die zelfs >64N) en extreem grote cel (40-60 μm) bereikt. In tegenstelling tot de snel toenemende kennis in megakaryopoiese op celbiologie en moleculair niveau, is de karakterisering van megakaryopoiese door flowcytometrie beperkt tot de identificatie van volwassen MKs met behulp van afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers, terwijl eerdere MK-differentiatiestadia onontgonnen blijven. Hier presenteren we een immunofenotypingstrategie die het mogelijk maakt om opeenvolgende MK-differentiatiestadia, met toenemende ploidy-status, te identificeren in menselijke primaire bronnen of in vitro culturen met een panel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers integreert. Ondanks zijn grootte en kwetsbaarheid kunnen MKs worden geïmmunofeerd met behulp van het bovengenoemde paneel en worden verrijkt door fluorescentie-geactiveerde celsortering onder specifieke omstandigheden van druk en spuitmonddiameter. Deze aanpak vergemakkelijkt multi-Omics studies, met als doel de complexiteit van megakaryopoiese en bloedplaatjesproductie bij mensen beter te begrijpen. Een betere karakterisering van megakaryopoiese kan fundamenteel zijn in de diagnose of prognose van afstammingsgerelateerde pathologieën en maligniteit.
Introduction
Megakaryocyten (MKs) ontwikkelen zich uit hematopoëtische stamcellen (HSC's) na een complex proces genaamd megakaryopoiese, dat voornamelijk wordt georkestreerd door het hormoon trombopoëtine (TPO). De klassieke kijk op megakaryopoiese beschrijft de cellulaire reis van HSC's door een opeenvolging van hiërarchische stadia van geëngageerde voorlopers en precursorcellen, wat uiteindelijk leidt tot een volwassen MK. Tijdens de rijping ervaren MKs meerdere rondes van endmitose, ontwikkelen ze een ingewikkeld intracellulair afbakeningsmembraansysteem (DMS), dat voldoende membraanoppervlak biedt voor de productie van bloedplaatjes, en produceren en verpakken efficiënt de overvloed aan factoren die zich in de verschillende korrels bevinden die worden geërfd door volwassen bloedplaatjes1,2,3. Als gevolg hiervan zijn volwassen MKs grote cellen (40-60 μm) die worden gekenmerkt door een zeer polyploïde kern (die zelfs >64N) bereikt. Recente studies suggereren alternatieve routes waarmee HSC 's zich onderscheiden in MC 's die traditionele lineage commitment checkpoints omzeilen als reactie op bepaalde fysio-pathologische omstandigheden4,5,6,7,8,9,10,11. Deze bevindingen benadrukken dat hematopoëtische differentiatie naar de volwassen MK een continuüm en adaptief proces is dat inspeelt op biologische behoeften.
Met de toenemende kennis over de celbiologie en de moleculaire aspecten die megakaryopoiese12kenmerken, is het grootste deel van het onderzoek gewijd aan de studie van het proces door flowcytometrie beperkt tot de identificatie van volwassen MKs met behulp van afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers(d.w.z. CD42A/B, CD41/CD61), terwijl eerdere MK-differentiatiestadia onontgonnen blijven. We hebben eerder een strategie gedocumenteerd om megakaryopoiese in muisbeenmerg en beenmerg-afgeleide MK-culturen13,14te fasen , die we hebben aangepast en toegepast op mensen15. In dit artikel tonen we een immunofenotypingstrategie die de karakterisering van megakaryopoiese mogelijk maakt, van HSC's tot volwassen MC's, in menselijke primaire bronnen (beenmerg -BM- en perifeer bloed -PB-) of in vitro culturen met behulp van een paneel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers integreert (onder andere CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT en CD71). Ondanks zijn grote omvang en kwetsbaarheid kunnen MKs immunofenotyped worden met behulp van de bovengenoemde celoppervlakmarkers en worden verrijkt door fluorescentiegeactiveerde celsortering onder specifieke druk- en nozzlediameter om celbreuk en/of schade te minimaliseren. Deze techniek vergemakkelijkt multi-Omics benaderingen, met als doel de complexiteit van megakaryopoiese en bloedplaatjesproductie bij menselijke gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Opmerkelijk is dat het een nuttig instrument zal zijn om de diagnose en prognose te helpen in een klinische context van groeiende vraag.
In dit manuscript documenteren we een strategie om menselijke megakaryopoiese in scène te plaatsen met een paneel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers uit primaire bronnen integreert of in vitrowordt gegenereerd . Daarnaast bieden we een protocol om te sorteren, met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder, de voorkeursfracties en volwassen MKs (Figuur 1). Deze stap is niet populair, omdat het technisch moeilijk is vanwege de grote omvang en kwetsbaarheid van MKs. Het is echter eerder gebruikt in zowel muis- als menselijke beenmergmonsters, en als gevolg van technologische vooruitgang, met telkens een beter resultaat16,17,18. Menselijke primaire bronnen waar MKs of MK precursoren kunnen worden bestudeerd omvatten beenmerg, navelstrengbloed en perifeer bloed, onder andere. De juiste monsterverwerking om de relevante celfractie voor analyse op elk monster te isoleren is van belang. Standaardprocedures zijn opgenomen, met enkele overwegingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het bestuderen van megakaryopoiese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Monsters van volbloed en beenmerg werden verkregen en verwerkt overeenkomstig de Verklaring van Helsinki van 1964. Volbloedmonsters werden verkregen van gezonde donoren na het geven van geïnformeerde toestemming (ISPA), binnen een studie goedgekeurd door onze institutionele medisch ethische commissie (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Beenmergmonsters werden verkregen uit beenmerg aspiraat teruggooimateriaal van patiënten beheerd op de afdeling Hematologie van het Ziekenhuis Clínico San Carlos (HCSC).
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol gedocumenteerd in dit manuscript. De primaire menselijke bronnen of primaire culturen waar MK-differentiatie kan worden geënsceneerd met behulp van immunofenotypering zijn geïndiceerd. Deze immunofenotyping-strategie kan worden toegepast op de studie van het proces in verschillende afstammingsgerelateerde pathologieën of maligniteit in primaire bronnen. Bovendien maakt het het sorteren van MKs en precursoren mogelijk met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder, die verdere analyse van verrijkte fracties mogelijk maakt. Gebruikte afbeeldingen maken deel uit van Servier Medical Art (SMART) van Servier en zijn gelicentieerd onder CC BY 3.0. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
1. Verwerking van volbloed en beenmerg voorafgaand aan immunofenotypering
- Bij gebruik van volbloed (WB) uit donaties als primaire bron, eventueel isoleren van de perifere bloedmonnucleaire cel (PBMC) component. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van standaard differentiële centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiëntcelscheiding, zoals eerder beschreven15.
- Kortom, centrifugeer bloed bij 193 x g gedurende 15 minuten (rem 3) bij kamertemperatuur. Gooi de bovenste plasmafractie weg en verzamel de buffy ring. Verdun 1:1 met fosfaatbufferoplossing (PBS)/Trinatriumcitraatdihydraat (38 g/L, pH 7) buffer en pipet voorzichtig een volume van 25 ml bovenop 15 ml van een dichtheidsgradiëntoplossing (1,076 g/ml) in buizen van 50 ml.
- Centrifugeer gedurende 20 min bij 1114 x g (gaspedaal 3, rem 3, kamertemperatuur). Gooi de plasmafractie weg en verzamel de buffy ring die PBMC's bevat. Was door hetzelfde volume PBS toe te voegen, centrifugeer gedurende 5 minuten op 435 x g en resuspend in PBS voor verder gebruik.
- U kunt ook een WB-monster (ongeveer 100 μL) gebruiken voor immunofenotypering na het lyseren van de rode bloedcellen (RBCs) en grondig wassen.
- Kortom, verdun 1:1 in ijskoude RBC-lysingbuffer (4,15 g NH4Cl, 0,5 g KHCO3 en 18,5 mg EDTA (triplex III) tot 500 ml H2O, pH 7,1-7,4). Wacht tot de celsuspensie doorschijnend rood wordt (3-5 min).
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 4 x g en resuspend de cellen in PBS. Herhaal de procedure zo vaak als nodig is om een witte celkorrel te verkrijgen.
- Evenzo moeten de monsters die zijn verkregen uit beenmerg (aspiratie) rechtstreeks worden verwerkt met RBC-lysingbuffer (zie punt 1.2) en grondig worden gewassen, om te beginnen met een duidelijke eencellige suspensie (figuur 1).
- Vermijd het gebruik van vortexing om monsters te mengen tijdens de verwerking, omdat dit de fragiele MKs kan beschadigen. Meng door de buis te flikkeren of om te keren.
OPMERKING: Dichtheidsgradiënt om PBMC's te verkrijgen kan resulteren in een rijkere en schonere celfractie in vergelijking met RBC-lysed WB. We moeten echter in gedachten houden dat volwassen MKs met een hoge dichtheid verloren kunnen gaan in de "neutrofiele" fractie. Dit zal worden besproken in de representatieve resultaten.
- Vermijd het gebruik van vortexing om monsters te mengen tijdens de verwerking, omdat dit de fragiele MKs kan beschadigen. Meng door de buis te flikkeren of om te keren.
2. In vitro MK differentiatie van PBMCs
OPMERKING: MKs kunnen in vitro worden onderscheiden van eerdere precursoren, zoals CD34+ cellen, aanwezig in verschillende primaire bronnen(d.w.z. WB/PBMCs, navelstrengbloed, beenmerg) en van iPSC's. Hiervoor zijn verschillende protocollen toegepast. Hier gebruiken we een door ons ontwikkelde cultuurmethode die MK-differentiatie van PBMC's mogelijk maakt, zonder dat we cd34+ precursoren15 , 19,20,21,22hoeven te verrijken .
- Dit protocol bestaat uit drie kweekfasen, waarbij de concentratie van trombopoëtine (TPO) geleidelijk toeneemt ten koste van groeifactoren die de proliferatie van eerdere precursoren bevorderen (d.w.z.SCF, EPO), die geleidelijk afnemen (Figuur 2)15.
- Gebruik voor het basismedium StemSpan SFEM aangevuld met 0,4% cholesterolrijke lipidenmix en 1% Penicilline/Streptomycine.
- Gebruik voor het fase I-medium het basismedium aangevuld met SCF (100 ng/ml), Erytropoëtine (EPO, 0,5 U/ml) en trombopoëtine (TPO, 30 ng/ml). Het fase II-medium is het basismedium aangevuld met SCF (50 ng/ml), EPO (0,25 U/ml) en TPO (50 ng/ml). Gebruik voor het fase III-medium het basismedium aangevuld met TPO (100 ng/ml).
- Cultuur PBMC's in fase I medium. Plaats de PBMC's op dag 6-8 in fase II-medium en plaats de PBMC's op dag 9-12 in fase III-medium.
- Vervang het medium door centrifugaalcellen op 435 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur van fase I tot fase II en bij 95 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur van fase II tot fase III, en resuspendatie in vers medium.
- Kweekcellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2. In deze primaire culturen duurt MK-differentiatie 10-14 dagen en kunnen gedurende de hele cultuurperiode op verschillende tijdstippen monsters worden genomen om MK-differentiatie te volgen.
- Gebruik voor het basismedium StemSpan SFEM aangevuld met 0,4% cholesterolrijke lipidenmix en 1% Penicilline/Streptomycine.
Figuur 2: Schematische weergave van de PBMC-afgeleide MK-cultuurmethode. PBMC's van gezonde donoren werden gekweekt volgens het driefasige protocol dat door ons werd ontwikkeld om MK in vitro te genereren (schema aangepast van Salunkhe et al). 15 Foto's gemaakt op dag 10 en dag 13 van cultuur worden getoond. Foto's zijn gemaakt met een 20X objectief. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Monsterverzameling: Was cellen door 5 min (95 x g) centrifugeren met lage snelheid aan te brengen en resuspendeer ze in PBS of PBS met 1% runderserumalbumine (BSA). Voor immunofenotypering is de ideale dichtheid 105-106 cellen/100 μL (zie punt 3.1). Afhankelijk van de status van de culturen(d.w.z. aanwezigheid van dode cellen, puin, enz.), kunnen 1 of 2 wasbeurten nodig zijn. Verzamel je cellen op de tijdspunten die van belang zijn tijdens de kweek.
3. Immunofenotypering van MK-differentiatie - incubatie met een panel van gelabelde antilichamen
- Incubeer de celmonsters met een panel van gelabelde antilichamen volgens standaardprocedures, met aandacht voor centrifugeren op lage snelheid (95 x g) bij de verwerking van megakaryocyten. Normaal incuberen we de monsters met 1% BSA in PBS in volumes van 100 μL bij 4 °C, 20 min, met een bereik van 105-106 cellen.
- Schaal op wanneer dat nodig is.
- Voeg na incubatie 5 ml 1% BSA toe in PBS, centrifugeer bij lage snelheid (95 x g), aspireer het supernatant en resuspendeer het monster in 2% BSA in PBS om de levensvatbaarheid van MK (2 ml) te behouden. Voeg 1-5 mM EDTA toe om celcelaggregaten (die van nature in MK-culturen worden gezien) te verstoren.
- Breng monsters over in een ronde bodembuis van 12 x 75 mm (FACS-buis) of -plaat, zodat ze in het donker blijven totdat de cytometrieanalyse of celsortering is voltooid.
- Bereiding van de enkelvoudige antilichamen en antilichaampaneelmengsels; instellen van de flowcytometer:
- Titreer de antilichamen voorafgaand aan het gebruik ervan om de optimale concentratie in de antilichaampanelen te bepalen. De optimale concentratie antilichamen is de laagste concentratie die duidelijk positief van negatieve cellen scheidt (en onderscheid maakt tussen expressieniveaus mogelijk). De meeste antilichamen worden bijvoorbeeld gebruikt in een verdunning van 1:200 (voorraad 100 μg/ml), tenzij anders getitreerd of aangegeven door de fabrikant.
- Zodra de antilichaamtitratie is bepaald, bereidt u een verdunning van 10x van elk antilichaam voor. Deze verdunningen worden gebruikt voor de eenkleurige regelaars en voor het bereiden van de paneelmengsels. De verdunningen en paneelmengsels zijn prima voor gebruik, zelfs een maand na bereiding (bewaard bij 4 °C, tenzij de aanwijzingen van de fabrikant deze opslagomstandigheden uitsluiten). Dit maakt het mogelijk om monsters met hetzelfde paneel gedurende een bepaalde periode te kleuren.
- Gebruik 10 μL per 100 μL van de 10x verdunning, zowel voor de eenkleurige regelaars als voor de paneelmix.
- Gebruik voor de single-color controles antilichaamaffiniteitsparels, die direct kunnen worden gemeten na het toevoegen van het antilichaam. De eenkleurige besturingselementen moeten bij elk experiment worden gemeten om een goede compensatieaanpassing mogelijk te maken (en nameting af te stemmen met de analysesoftware).
- U kunt ook de besturingselementen met één kleur uitvoeren met celmonsters. De kralen maken echter de snelle meting van een bepaald aantal gebeurtenissen mogelijk, die, afhankelijk van het antilichaam / de oppervlaktemarker, mogelijk niet kunnen worden verkregen op complexe primaire of gekweekte celbronnen. We raden ook aan om celmonsters uit te voeren die zijn gekleurd met paneelmixen "Fluorescentie Minus One" (FMO) om de juiste compensatie-instellingen in te stellen (voordat u experimenten uitvoert). Dit is relevant om compensatieproblemen zorgvuldig te identificeren, en vooral bij gekweekte MKs, om autofluorescentie-interferentie te identificeren (die aanwezig zal zijn bij gebruik van kweekmedium dat fenolrood bevat).
- Bereid voldoende volume van de paneelmix voor, afhankelijk van het aantal monsters, dat de antilichamen van het ontworpen paneel bevat. De meeste van onze panelen bevatten zes antilichamen (6-kleuren panelen, zie tabellen 1-2).
- Gebruik voor deze panelen lasers van 488 nm en 633 nm van de flowcytometer, maar panelen kunnen worden aangepast aan andere technische scenario's. Bovendien kunnen de compensatieoverwegingen worden weggenomen bij het gebruik van op massaspectrometrie gebaseerde flowcytometrie of cytometers met akoestische scherpsteltechnologie.
- Kleurstoffen voor het meten van de levensvatbaarheid kunnen valse informatie geven over MKs, vooral wanneer ze rijpen. MKs zijn zeer actieve uptaking cellen, en positiviteit met Hoechst, 7-AAD of PE, kan niet altijd de werkelijke celdood weerspiegelen. Een alternatief (als celdoodmeting vereist is) kan het gebruik van mitochondriënvlekken (CMX Ros) of aminereactieve kleurstoffen (Zombie- of Ghost-kleurstoffen) zijn.
Tabel 1: Opmerkingen over celoppervlakmarkeringen van de megakaryocytische afstamming Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Antilichaampanelen Klik hier om deze tabel te downloaden.
4. Ploidy analyse gecombineerd met 6-kleuren panelen
- Ga voor ploidy-analyse, in combinatie met een 6-kleuren antilichaampaneel, verder met fixatie en permeabilisatie van cellen na incubatie met het antilichaampaneel. Deze strategie maakt het mogelijk om de vlekken van de oppervlaktemarker te behouden, terwijl de kleuring van het DNA van cellen mogelijk wordt. We gebruiken Hoechst 33342 om DNA te beitsen, omdat het kan worden gevisualiseerd met de beschikbare violette 405-nm laser.
- Voor 105-106 cellen, na incubatie met het antilichaampaneel, centrifugeren cellen (95 x g gedurende 5 min), resuspend in 200 μL fixatiebuffer en incuberen 10 min bij kamertemperatuur (RT).
- Centrifugeer cellen zoals hierboven aangegeven, resuspended voor een tweede keer in 200 μL fixatiebuffer, en incubeer nog eens 10 minuten bij RT.
- Bereid permeabilisatiebuffer voor, die 0,1% Triton X-100, 200 mg/ml RNase en 20 mg/ml Hoechst 33342 (permeabilisatie Hoechst MIX) bevat.
- Centrifugeer cellen zoals hierboven, resuspend ze in 300 μL van de permeabilisatie Hoechst MIX en incubeer 30 min bij 37 °C. Deze stap is erg belangrijk, omdat RNA moet worden afgebroken om een schone ploidy-meting te verkrijgen.
- Meet na de incubatietijd monsters rechtstreeks met een flowcytometer. Anders, houd de monsters op 4 °C, in het donker. Meet ze snel op. Omdat deze monsters echter vastliggen, kan de meting zelfs 24-48 uur worden uitgesteld. Zorg ervoor dat het monster grondig wordt geflitseerd voordat het wordt gemetingd of door een celzeef wordt gepasseerd om een enkele celsuspensie te garanderen.
- Morfometrische parameters zoals Forward en Side Scatter worden niet onderhouden na celfixatie. De plot Voorwaarts/zijstrooiing geeft een krimp van de celverdeling weer na fixatie. De kleuring van de oppervlaktemarker blijft echter grotendeels behouden en de gatingstrategie wordt nauwelijks gewijzigd, waardoor de analyse van de ploidy-status in de verschillende stadia van differentiatie die worden gedefinieerd door oppervlaktemarkercombinaties mogelijk is.
5. MK differentiatie analyse
OPMERKING: We hebben gezien dat de combinatie van CD31/CD71 het mogelijk maakt om een aantal poorten in te stellen die overeenkomen met verschillende stadia van MK-differentiatie. Verdere back-gating met MK-specifieke markers maakt de scheiding van volwassen en onrijpe MKs mogelijk. Bovendien verfijnt back-gating in verse monsters de aanwezigheid van andere gebruikte markers of om de populaties in de Forward/Side Scatter-assen te plaatsen, verfijnt de beoordeling van MK-differentiatiestadia en maakt het mogelijk om andere celtypen die op dezelfde populaties aanwezig kunnen zijn, weg te gooien.
- Gebruik een panel van antilichamen dat vroege precursormarkers (KIT, CD34), gemeenschappelijke precursormarkers (CD31, CD71) en afstammingsmarkers bevat, waarvan sommige specifiek zijn (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, enz.) (zie tabellen 1-2). Het gebruik van Lineage (Lin) cocktail (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 en CD56), maakt het ook mogelijk om volwassen hematopoëtische cellen te "filteren" die ruis aan de analyse kunnen toevoegen (bij het selecteren van de Lin- populatie). Als voorbeeld zullen we de analyse van MKs in PBMC's, beenmerg en pbmc-afgeleide celculturen in de representatieve resultaten doornemen.
6. MK en MK precursor celsortering
OPMERKING: De bevlekte cellen werden geanalyseerd en gesorteerd op een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder FACS Aria IIu uitgerust met 488 nm en 633 nm standaard solid-state lasers met behulp van FACSDiva-software; gegevens werden bovendien geanalyseerd en gepresenteerd met behulp van FlowJo-software en Cytobank (viSNE-analyse). De zuiverheid van gesorteerde fracties werd bevestigd door flowcytometrieanalyse van elk van de gesorteerde fracties (zuiverheid boven 85%).
- Voer de celsortering zo snel mogelijk of binnen 1 uur na de incubatie van antilichamen uit om celafbraak te voorkomen.
- Filter het monster met een 100 μm celzeef om eencellige suspensie en de integriteit van grote MK te garanderen.
- Gebruik een keramische nozzle van 130 μm, een manteldruk ingesteld op 11 pond per vierkante inch (PSI) en de drop-drive frequentie ingesteld op 12 kHz om de stroom in druppels te breken.
- Steriliseer voorafgaand aan het sorteren het mondstuk, de huls en de monsterlijnen door een verwerving van 30 minuten uit te voeren met Penicilline/Streptomycine verdund 1:5 in steriel water, gevolgd door een verwerving van 10 minuten met steriel water om het resterende ontsmettingsmiddel te verwijderen.
- Zodra de stroom is gestabiliseerd, past u de druppelvertraging met aanbevolen kralen aan om meer dan 97,5% van de gereflecteerde druppels in de fijnafstellingsmodus te sorteren met een debiet van 400-1200 gebeurtenissen per seconde.
- Bereid verzamel FACS-buizen voor met 500 μL van 2% BSA in PBS. Het percentage BSA kan worden verhoogd tot 5-10%.
- Genereer de experimentsjabloon met de juiste compensatiematrixparameters.
- Plaats de FACS-buis in de cytometer.
- Voer een meting van het monster uit om de gewenste poorten en zuiverheid van de doelcelpopulaties in te stellen. Houd de record geactiveerd om maximaal 200.000 gebeurtenissen in de geselecteerde populatiepoorten weer te geven tijdens het sorteren van cellen.
- FACS Aria IIu maakt de scheiding van maximaal 4 verschillende celpopulaties tegelijkertijd mogelijk. Maak een nieuwe sorteerlay-out en selecteer het verzamelapparaat (4 buizen) en de juiste precisiemodus (tussenmasker van zuiverheid en herstel wordt aanbevolen). Voeg ten slotte de populatie(s) die van belang zijn toe aan elk sorteerlocatieveld (figuur 3).
Figuur 3: Schematische weergave van het principe van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De deeltjes gaan door het 130 μm-mondstuk en worden gedwongen op te breken in een stroom van regelmatige druppels als gevolg van de toepassing van trillingen op het mondstuk. Vervolgens worden de druppels ondervraagd door de laser (punt van analyse) en worden de signalen verwerkt om de ''sorteerbeslissing' te geven door een lading op die druppels toe te passen. Wanneer een ladingsdruppel door een hoogspanningselektrostatisch veld (detectieplaat) gaat, wordt deze afgebogen en verzameld in de overeenkomstige opvangbuis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Laad de opvangbuizen en begin met het sorteren van de doelpopulaties.
- Centrifugeer de opvangbuizen gedurende 5 minuten op 95 x g en resuspend de celkorrel in het juiste volume van 2% BSA in PBS.
- Meet opnieuw een fractie van elk gesorteerd monster om de zuiverheid te berekenen.
- Bewaar cellen op de juiste manier voor verder gebruik. Gesorteerde cellen kunnen worden gebruikt voor cytologische en moleculaire analyses, of kunnen opnieuw worden gekweekt met als doel het differentiatieproces van een geselecteerde celpopulatie te bestuderen.
7. Monstervoorbereiding na sortering
- Cytospins voorbereiden voor cytologische analyse met een cytocentrifuge
- Breng gesorteerde cellen naar een eenvoudig te hanteren werkvolume van 100-200 μL. Houd er rekening mee dat de celdichtheid in elk geval afhangt van de gesorteerde populatieopbrengst.
- Plaats een schone schuif op de metalen houder en plaats een filtertop. Vergeet niet om de dia en het filter te labelen om het mengen van monsters te voorkomen.
- Voeg 100 μL PBS toe aan het filtergat tegen de glijbaan, zodat het filter op de gatrand wordt bevochtigd.
- Plaats de trechter, sluit de metalen houder en plaats deze op zijn plaats in de centrifuge.
- Voeg het monster (100-200 μL) toe aan de trechter.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten op 36 x g. De cytospinglaasjes kunnen aan de lucht worden gedroogd bij RT (goed afgedekt om stof te voorkomen) en kunnen 1 week vóór de immunostaining of histochemie bij RT worden bewaard.
- Voor immunostaining
- Fix slides in 2% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS en incubeer gedurende 5min.
- Er kan een bereik van 0,5-4% PFA in PBS worden gebruikt. In onze handen gebruiken we 4% om een goede fixatie van weefsels of sommige celtypen te verkrijgen, en 0,5% PFA in PBS is voldoende voor bloedplaatjes. Bij het instellen van deze techniek vereist het juiste percentage PFA optimalisatie per celtype/bron.
- Incubeer 5 min in PBS.
- Incubeer 5 min in 50% ethanol (EtOH).
- Incubeer 5 min in 70% EtOH.
- Bewaren in 70% EtOH bij -20ºC.
- Bij het uitvoeren van de immunostaining, rehydrateren en volgen standaardprocedures (permeabilisatie, wassen, blokkeren, primaire en secundaire antilichaam incubaties, conserveren, enz.).
- Fix slides in 2% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS en incubeer gedurende 5min.
- Voor cytochemie:
OPMERKING: De dia's kunnen worden bevlekt met May-Grünwald Giemsa-vlekken of de handige kleuring voor elk doel. - Voor onmiddellijk morfologisch onderzoek
- Voeg een druppel montagemedium toe op de celbevattende plek van de cytospin en plaats een afdeklip.
- Houd dia's op 4 °C niet langer dan een week, tenzij verzegeld, waardoor langdurige opslag mogelijk is, zelfs bij RT. Montage van medium fixatie maakt langdurige opslag bij RT mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beenmerg en Ploidy
In figuur 4tonenwe een representatieve immunofenotypische analyse van megakaryopoiese in BM-monsters (aspiratie) van patiënten. Bij het plotten van de cellulaire fractie tegen CD71 en CD31, hebben we zes hoofdpopulaties gated: CD31- CD71- (rood), CD31- CD71+ (blauw), CD31+ CD71- (oranje), CD31+ CD71midden (lichtgroen), CD31+ CD71+ (donkergroen) en CD31++ CD71midden (crème). Deze populaties zijn niet altijd aanwezig in dezelfde posities (rekening houdend met constante cytometerinstellingen), zoals te zien is, en daar moet rekening mee worden gehouden. Dit kan inherent zijn aan de pathologische toestand en beenmergstatus. Deze zes populaties die in histogrammen zijn bedekt met een rijpingsmarkering in het paneel (CD42A/CD42B) en de Forward Scatter, worden rechts weergegeven. De afbeelding toont ook een plot tegen CD31/CD71 met een overlay van de CD42B+ cellen met de totale cellulaire fractie om de verdeling van de meer volwassen MKs te visualiseren. In het algemeen bevat de populatie CD31- CD71- geen MKs of afstammingsprecursoren, presenteert geen MK-rijpingsmarkers en is kleiner van formaat. De CD31- CD71+ populatie bevat voornamelijk cellen van de erythroid-afstamming, hoewel het ook gemeenschappelijke afstammingsprecursoren kan bevatten, zoals we veronderstellen uit onze waarnemingen. Het blijft negatief voor MK-rijpingsmarkers en afhankelijk van het aandeel eerdere of latere erythroidcellen kan de Forward Scatter ook fluctueren.
Als voorbeeld, de myelodysplastisch syndroom (MDS) patiënt heeft een groter aandeel onrijpe(d.w.z., grotere) erythroid cellen, in vergelijking met andere patiënten. MK-voorlopers en volwassen cellen zullen zich verspreiden in de CD31+ cellen, met enige variatie. Omdat het echter kan worden gezien bij het vergelijken van de BM-analyse op elke pathologie, zijn er enkele constante kenmerken. Meer volwassen MKs zijn aanwezig in de CD31++ CD71middenpopulatie (crème), en pathologieën waar deze rijping wordt "geblokkeerd" omvatten Immune Thrombocytopenia (ITP) en een reactief BM-monster (met onderliggende ontsteking). Terwijl bij de lymfoompatiënt er een evenwicht lijkt te zijn tussen vroege precursoren en late MKs (oranje en crèmekleurige poorten), wordt dit aandeel gewijzigd bij de MDS-patiënt (met meer "geblokkeerde" precursoren) en bij de acute myeloïde leukemie (AML) patiënt (met meer volwassen MKs). Van belang, de "blokkade" lijkt anders te zijn door pathologieën onderling te vergelijken: in pathologieën die overeenkomen met onderliggende ontstekingen kan de blokkade te wijten zijn aan een combinatie van rijpingsdefecten, vernietiging(d.w.z., auto-immuniteit) en bloedplaatjesproductie door MK-breuk.
Figuur 4: Immunofenotyìng van megakaryopoiese in menselijke beenmergmonsters van patiënten met verschillende pathologieën. Representatieve beenmergmonsters (BM) van patiënten met de diagnose lymfoom(d.w.z.normale BM), myelodysplastisch syndroom (MDS), acute myeloïde leukemie (AML), immuuntrombocytopenie (ITP) en een patiënt met een reactieve BM als gevolg van een infectie werden geanalyseerd. Bij het plotten van de cellulaire fractie (d.w.z.nucleated cellen) tegen CD71 en CD31, hebben we zes hoofdpopulaties gated: CD31- CD71- (rood), CD31- CD71+ (blauw), CD31+ CD71- (oranje), CD31+ CD71midden (lichtgroen), CD31+ CD71+ (donkergroen) en CD31++ CD71midden (crème). Deze populaties zijn niet altijd aanwezig in dezelfde posities (rekening houdend met stabiele cytometerinstellingen), zoals te zien is, en daar moet rekening mee worden gehouden. Deze zes populaties die in histogrammen zijn bedekt met een rijpingsmarkering in het paneel (CD42A/CD42B) en de Forward Scatter, worden rechts weergegeven. De afbeelding toont ook een plot tegen CD31/CD71 met een overlay van de CD42B+ cellen met de totale cellulaire fractie om de verdeling van de meer volwassen MKs te visualiseren. Getallen die overeenkomen met de poorten in de puntplot en de histogramoverlays worden afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Vervolgens gingen we op zoek naar een analyse van de ploidy-status van de bovengenoemde populaties op menselijke BM-monsters. Figuur 5 toont een toenemende ploidy status binnen de CD31+ populaties, die we voorzien zal anders en karakteristiek zijn voor elke pathologische context. Merk op dat als gevolg van de celfixatie en permeabilisatie die in deze experimenten worden gebruikt, de puntpercelen niet volledig vergelijkbaar zijn met die van niet-gefixeerde, niet-gepermeabiliseerde monsters (figuur 4).
Figuur 5: Ploidy-analyse van de populaties geselecteerd op basis van CD31/CD71 expressie, in menselijke BM monsters. Representatieve beenmergmonsters (BM) van patiënten met acute myeloïde leukemie (AML) en immuuntrombocytopenie (ITP). Bij het plotten van de cellulaire fractie (d.w.z.nucleated cellen) tegen CD71 en CD31, hebben we zes hoofdpopulaties gated: CD31- CD71- (rood), CD31- CD71+ (blauw), CD31+ CD71- (oranje), CD31+ CD71midden (lichtgroen), CD31+ CD71+ (donkergroen) en CD31++ CD71midden (crème). Deze populaties zijn niet altijd aanwezig in dezelfde posities (rekening houdend met stabiele cytometerinstellingen), zoals te zien is, en daar moet rekening mee worden gehouden. Het terugdraaien van deze zes populaties bedekt in histogrammen tegen Hoechst 33342 toont de verschillende ploidy status van de populaties, en de algemene neiging om de ploidy met rijping te verhogen (hoewel MKs volwassenheid kunnen bereiken onafhankelijk van de polyploidisatiestatus). Getallen die overeenkomen met de poorten in de puntplot en de histogramoverlays worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
PBMC's en celcultuur
In figuur 6tonen we een representatieve immunofenotypinganalyse van PBMCs en de MK-cultuur die op dag 7 en dag 11 met die PBMCs is ingesteld. We gebruiken een paneel met de Lin cocktail, en we tonen de cellulaire fractie van levende cellen voor en na Lin- selectie. Deze negatieve selectie kan leiden tot het verlies van een fractie van MKs die bijvoorbeeld CD14 co-expresseren, maar het maakt ook een meer verfijnde analyse mogelijk. Bij het plotten van de Lin- fractie tegen CD71 en CD31, hebben we vijf hoofdpopulaties omheind: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71midden en CD31++ CD71midden. Deze populaties zijn niet altijd aanwezig in dezelfde posities (rekening houdend met constante cytometerinstellingen), zoals te zien is, en daar moet rekening mee worden gehouden. In dit geval zijn de verschillen niet alleen inherent aan de individuele gezondheid of pathologische status, maar ook aan de MK-differentiatiecapaciteit van de precursoren in de PBMC-fractie. De back-gating van deze vijf populaties die in histogrammen zijn bedekt met andere markers in het paneel (KIT en CD42B) en naar de Forward Scatter, wordt aan de rechterkant weergegeven. MK-precursoren en MKs in verschillende rijpingsfasen bevinden zich binnen de CD31+ populaties.
Figuur 6: Immunofenotypering van megakaryopoiese tijdens MK-celkweek, inclusief het beginnende PBMC-materiaal. Representatieve immunofenotypinganalyse van PBMC's en de MK-cultuur die op dag 7 en dag 11 met die PBMCs is ingesteld. We gebruiken een paneel met de Lin-cocktail en we tonen de cellulaire fractie(d.w.z.nucleated cellen) voor en na Lin-selectie. Deze negatieve selectie kan leiden tot het verlies van een fractie van MKs die bijvoorbeeld CD14 co-expresseren, maar het maakt ook een meer verfijnde analyse mogelijk. Bij het plotten van de Lin-fractie tegen CD71 en CD31, hebben we vijf hoofdpopulaties omheind: CD31- CD71-, CD31- CD71+, CD31+ CD71-, CD31+ CD71midden en CD31++ CD71midden. Deze populaties zijn niet altijd aanwezig in dezelfde posities (rekening houdend met stabiele cytometerinstellingen), zoals te zien is, en daar moet rekening mee worden gehouden. De back-gating van deze vijf populaties die in histogrammen zijn bedekt met andere markers in het paneel (KIT en CD42B) en naar de Forward Scatter, wordt aan de rechterkant weergegeven. MK-precursoren en MKs in verschillende rijpingsfasen bevinden zich binnen de CD31+ populaties. De afbeelding toont ook een plot tegen CD31/CD71 met een overlay van de CD42B+ cellen met de totale cellulaire fractie om de verdeling van de meer volwassen MKs te visualiseren. Getallen die overeenkomen met de poorten in de puntplot en de histogramoverlays worden afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 3: Populatiepercentages van flowcytometrieanalyses Klik hier om deze tabel te downloaden.
In PBMC's bevinden MKs zich binnen de CD31++ CD71mid gate, hoewel hun grootte niet zo groot is als we hebben gezien met gekweekte MKs. Dit kan te wijten zijn aan een van de twee volgende opties: MKs in PBMCs vertegenwoordigen een fractie van onrijpe MKs die in de circulatie komen, of een fractie van volwassen circulerende MKs die cytoplasmatische complexiteit hebben verloren. Onze soort experimenten suggereren dat dit laatste de reden kan zijn om dat grootteverschil te verklaren. Het ondersteunen van dit begrip, de uitdrukking van CD42B, is niet aanwezig in 100% van de cellen op die populaties (zoals ook te zien is in BM-monsters in figuur 4), waarschijnlijk als gevolg van het verlies van oppervlaktemarkers bij proplateletvorming en/ of bloedplaatjesafscheiding. In gekweekte samples zijn de MKs in de "volwassen" poorten echter bijna 100% CD42B+en groter van formaat. Deze veronderstelde cellulaire dynamica moet verder worden bestudeerd en gevalideerd.
Vanwege de pleiotrope effecten van TPO zijn deze culturen heterogeen en asynchroon, wat het op zich moeilijk maakt om discrete MK-differentiatiestadia verder te analyseren. 19,20 Na de uitbreiding van eerdere voorlopers zullen MKs in verschillende rijpingsfasen vanaf dag 6-10 (of eerder, als gevolg van donorvariabiliteit) in de cultuur verschijnen en geleidelijk in aantal toenemen naarmate de mk-afstammingscellen volwassen worden in de richting van MK. Sommige MKs zullen terminal differentiatie ondergaan en proplatelets gaan vormen. Tegen het einde van de cultuur zal er een geleidelijke toename van celverlies zijn als gevolg van "extenuatie/uitputting" na proplateletvorming en bloedplaatjesafscheiding of celdood (figuur 2).
Bij gebruik van TPO-analogen in plaats van recombinante TPO moeten de concentraties worden getest.
De bron van voorlopers (volwassen, navelstrengbloed) zal de culturen conditioneren, omdat MKs uit bronnen van verschillende ontwikkelingsstadia hun eigen kenmerken hebben. Bovendien zullen culturen van verrijkte CD34+ voorlopers, hoewel ze aan het begin van de cultuur homogener lijken, een stadium van heterogeniteit en asynchroniciteit bereiken zodra mk-inzet en differentiatie begint19,20.
MK-celsortering
In figuur 7tonen we een representatieve gatingstrategie van een monster van MK in vitro cultuur op dag 10 van differentiatie. Bij het plotten van de nucleated celfractie tegen CD31 en CD71, of de Forward Scatter, kunnen we twee hoofdpopulaties onderscheiden die worden gekenmerkt door de aan- of afwezigheid van CD31.
Bij het plotten van de CD31+ fractie tegen CD41 en CD71, kunnen we vier hoofdpopulaties gate: CD41- CD71- (1), CD41lage CD71+ (2), CD41lage CD71+++ (3) en CD41+++ CD71+ (4), waarin andere oppervlaktemarkeringen (KIT en CD49B) differentieel werden uitgedrukt, waardoor de identificatie van hetMK-compartimentals CD41 zeer positieve cellen mogelijk werd . De zuiverheid van de gesorteerde fracties wordt getoond, evenals cytologische kleuringen van cytospinen van de gesorteerde fracties.
Om het celpopulatiespectrum in PBMC-MK-culturen te karakteriseren, werd viSNE-analyse gebruikt (figuur 7B). De viSNE-kaart scheidt cellen in ruimtelijk verschillende subsets op basis van de combinatie van markeringen die ze uitdrukken. Elk punt in de viSNE-analyse vertegenwoordigt een individuele cel gekleurd volgens de expressieniveaus van CD31, CD42A, CD71 en KIT.
Dubbele negatieve cellen (CD31- en CD71-) zijn voornamelijk restlymfocyten (populatie 5) die in deze omstandigheden gedurende de hele cultuur blijven bestaan. Deze populatie is gesorteerd in een tweede ronde celsortering met behulp van de resterende fractie van het monster.
Gates 6 en 7 zijn CD71midden- en hoog expresserende cellen, waaronder erythroid-voorlopers en mogelijk andere precursoren.
We moeten rekening houden met de technische moeilijkheden als gevolg van de cel heterogene aard van deze kweekmethode en de kleverige aard van volwassen MKs die resulteert in de aanwezigheid van volwassen MKs in subpopulaties waar ze niet thuishoren (zie opmerkingen sectie).
Figuur 7: Pre-sort immunofenotypische analyse van 10-daagse in vitro kweek MKs. A) Representatieve gatingstrategie met CD31, CD41 en CD71, met twee sorteerrondes, resulterend in CD31+ populaties 1-4 en CD31- populaties 5-7. De zuiverheid van elke gesorteerde fractie werd geanalyseerd na sortering en wordt afgebeeld samen met een representatieve microfoto van gebeitst cytospinen van elke gesorteerde breuk. B) viSNE-kaart van dag 10 PBMC-afgeleide MK-kweekcellen gemeten door flowcytometrie. De kaart is gebouwd met behulp van de expressieniveaus van CD31, CD42B, CD71 en KIT, gemeten door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Nasortering
De gesorteerde populaties kunnen worden geanalyseerd met verschillende methoden, waaronder cytologische en moleculaire analyse door immunofluorescentie (zie rubriek 7) om de MK-kenmerken in een specifieke fysio-pathologische context te evalueren of om het proces van megakaryopoiese beter te bestuderen. Enkele voorbeelden zijn te vinden in figuur 8.
Figuur 8. Mk-analyse na het sorteren. A) Cytologische analyse van gesorteerd MK-compartiment uit een 10-daagse in vitro kweek. May-Grünwald Giemsa-kleuring maakt het mogelijk om belangrijke kenmerken van volwassen MKs te observeren, d.w.z.pseudopode formatie (rode pijl), zeer polyploïde MK (blauwe pijl). B) Immunofluorescentieanalyse. Cellen werden gekleurd met anti-menselijke von Willebrand factor (weergegeven in rood, secundair antilichaam Alexa Fluor 555 Goat anti-muis IgG), anti-menselijke CD31 of tandem CD41/CD61, beide geconjugeerd met FITC (weergegeven in groen) en nucleair DNA was gelabeld met DAPI (blauw weergegeven). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Opmerkingen:
MKs kunnen worden gesorteerd vanuit onverwachte gebieden vanwege de capaciteit om cellen aan hun membraan te bevestigen (figuur 9). Dit probleem kan een probleem zijn om subpopulaties met een hoge zuiverheidscel te krijgen. Om celcelaggregaten te minimaliseren, kan 1-5 mM EDTA worden toegevoegd aan de paneelmixbuffers.
Bovendien stelden we bij het gebruik van WB als uitgangsmateriaal voor om PBMCs te verkrijgen of lysing RBCs om de cellulaire fractie rechtstreeks te gebruiken. In figuur 10 tonen we flow cytometrie analyse van de twee methodieken. Aan de ene kant hebben we bij het lyseren van RBC's en het analyseren van het hele cellulaire compartiment nog steeds een grote hoeveelheid neutrofielen. Deze kunnen worden uitgefilterd met een specifieke marker (of met behulp van de Lin cocktailstrategie). We kunnen echter enkele MKs verliezen vanwege hun promiscue aard met betrekking tot oppervlaktemarkeringsexpressie. Aan de andere kant zal PBMC-isolatie ons in staat stellen om neutrofielen en RBC's kwijt te raken, hoewel we de MC's met een hogere dichtheid kunnen verliezen(d.w.z.degenen met complexere cytoplasmatische kenmerken of onvolwassen). Zoals weergegeven in figuur 10,vertonen MKs van lysed WB een hogere expressie van rijpingsmarkers, die lager lijkt bij het isoleren van PBMC's. De dichtheidsgradiënt kan leiden tot het verlies van de MKs die nog steeds een complex cytoplasma bevatten, terwijl die in de PBMC-fractie al "uitgeput" kunnen zijn in de circulatie na het vrijgeven van bloedplaatjes, en zo de polyploïde kern binnen een minder complex cytoplasma kunnen behouden. Ze moeten niet worden verward met onvolwassen MKs. Elke procedure heeft zijn voordelen en nadelen.
Figuur 9. De kleverige aard van MKs. MKs zijn te vinden in onverwachte poorten vanwege hun vermogen om cellen aan hun membraan te bevestigen. A-C) MKs gesorteerd in populaties 1 (B) en 5 (A en C), volgens de gating strategie voor MK sortering. Dit probleem kan een probleem zijn om subpopulaties met een hoge zuiverheidscel te krijgen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10. Flow cytometrie immunophenotyping van MKs van PBMC's of WB na het lyseren van de RBCs. A) Gating strategie. B) Grootte (FSC), cellulaire complexiteit (SSC) en expressie van CD42A, CD41, CD71 en KIT in MKs zoals geïdentificeerd in PBMC's of WB. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het grootste deel van het onderzoek gericht op de studie van megakaryopoiese door flowcytometrie is tot op heden beperkt tot de identificatie van MK-subsets die alleen afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers gebruiken(d.w.z.CD42A/CD42B, CD41/CD61), terwijl eerdere MK-differentiatiestadia slecht zijn onderzocht. In dit artikel tonen we een immunofenotyping strategie om een uitgebreide flow cytometrie karakterisering van menselijke megakaryopoiese aan te pakken. Over het algemeen willen we het nut benadrukken van het combineren van MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers (tabellen 1 en 2) in hetzelfde cytometrieantilichaampaneel voor de studie van megakaryopoiese op een meer gedetailleerde manier. Onze nieuwe aanpak zou kunnen dienen als een krachtig instrument om de diagnose en/of prognose bij hematologische aandoeningen te helpen. Wij zijn van mening dat de gepresenteerde panelen en combinaties niet definitief zijn. We hebben een zeer dynamisch gedrag van oppervlaktemarkers waargenomen in menselijke primaire bronnen (voornamelijk in BM-monsters), wat ook afhankelijk is van de subjacente pathologie. Er zijn meer studies nodig en hopelijk zal de wetenschappelijke gemeenschap deze benadering gaan toepassen met betrekking tot feedback met observaties van studies die zich richten op één pathologie en hoe megakaryopoiese-enscenering kan helpen bij de diagnose of prognose. De implementatie van gecombineerde HSC- en MK-karakterisering in primaire weefsels, rekening houdend met de verschillende routes voor MK-commitment zoals opgemerkt in het introductiegedeelte, is van belang en de waarde van verdere ontwikkelingen. Het feit dat we ook MKs in PBMCs kunnen detecteren, is een hele constatering. We veronderstellen ook dat de analyse van MKs in deze primaire bron zal helpen bij de diagnose en prognose van ziekten, als een zeer relevant alternatief voor BM-aspiraten, omdat extractie van een bloedmonster niet zo invasief is. Dat aspect vereist ook ontwikkeling.
Ondanks de technische beperkingen die verband houden met de biologische kenmerken van MKs (grote omvang, osmotische kwetsbaarheid, kleverigheid) konden we verschillende rijpingsfasen sorteren in verschillende menselijke MK-bronnen, met name in BM, PBMCs en PBMC's-afgeleide celculturen. Toekomstige studies zullen worden uitgevoerd om de eigenaardigheden van megakaryopoiese in andere menselijke bronnen zoals navelstrengbloed en in verschillende fysio-pathologische situaties te analyseren. Bovendien moet het differentiatiepotentieel van elke gated en gesorteerde celfractie worden geëvalueerd in kolonievormende eenheids-CFU-assays van MK-voorlopers (CFU-MK) om het differentiatiepotentieel van elke populatie in de megakaryopoiese-reis objectief te beoordelen. Hoewel het de technische beperkingen overtreft waarvan ooit werd gedacht dat ze het soort volwassen megakaryocyten zouden belemmeren, vereist een dergelijke noodzaak nog steeds meer perfectie. Aan de ene kant zou eencellige Omics uitgebreide studies mogelijk maken bij het toepassen van de immunofenotyping-panelen, maar als fysieke sortering vereist is, ondanks de zuiverheid van de gesorteerde populaties boven 85% (op basis van oppervlaktemarkerexpressie), moeten andere variabelen in aanmerking worden genomen, die nog steeds moeilijk op te lossen zijn. Zoals gezegd zijn MK-culturen niet synchroon en zeer heterogeen. MKs zelf zijn promiscue in oppervlaktemarkerexpressie en delen markers met andere myeloïde en niet-myeloïde hematopoëtische en niet-hematopoëtische cellen. Bovendien zijn ze erg moeilijk te clusteren met de morfometrische variabelen (Forward en Side Scatter) omdat ze zich wijd verspreiden. Verdere studies zijn nodig om deze toepassing te verfijnen, maar met gezamenlijke inspanningen zijn we dichter bij het beperken van megakaryopoiese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De productie van audiovisueel materiaal werd ondersteund door BD Biosciences.
Acknowledgments
Wij danken Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo en Begoña García Méndez (HUCA) en Paloma Cerezo, Almudena Payero en María de la Poveda-Colomo (HCSC) voor de technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Medical Grants (Roche SP200221001) aan A.B., een RYC fellowship (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje) en een I+D 2017-subsidie (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanje en Fondos FEDER) aan L.G., een Severo Ochoa Grant (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanje) naar P.M.-B. en een intramurale postdoctorale subsidie 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Spanje) aan A.A.-H. Wij danken Reinier van der Linden voor het delen van zijn kennis (en tijd), met name zijn wijze advies over multi-color tagged-antibody panel mix en single-color kraalcontrole voorbereiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding... that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols - unless otherwise specified. |
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), Kaunas. (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
