Summary
Seriell Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) tillämpas på bild och analysera dendritiska ryggrader i murine hippocampus.
Abstract
Tredimensionell elektronmikroskopi (3D EM) ger möjlighet att analysera morfologiska parametrar för dendritiska ryggrader med nanoskalaupplösning. Dessutom kan vissa funktioner i dendritiska ryggraden, såsom ryggradens volym och postsynaptisk densitet (PSD) (som representerar postsynaptisk del av synapsen), närvaro av presynaptisk terminal och slät endoplasmisk retikulum eller atypisk form av PSD (t.ex. multi-innervated spines), observeras endast med 3D EM. Genom att använda seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBEM) är det möjligt att få 3D EM-data enklare och på ett mer reproducerbart sätt än vid utförandet av traditionell seriell sektionering. Här visar vi hur man förbereder mus hippocampal prover för SBEM analys och hur detta protokoll kan kombineras med immunofluorescens studie av dendritiska ryggraden. Mild fixering perfusion gör det möjligt för oss att utföra immunofluorescens studier med lätt mikroskopi på ena halvan av hjärnan, medan den andra hälften var beredd på SBEM. Detta tillvägagångssätt minskar antalet djur som ska användas för studien.
Introduction
De flesta excitatoriska synapserna i centrala nervsystemet ligger på dendritiska ryggrader - små utskjutningar av ett neuronalt membran. Dessa utskjutningar bildar begränsade biokemiska fack som styr intracellulär signaltransduktion. Strukturell plasticitet av dendritiska ryggrader och synapser är nära besläktad med de funktionella förändringarna i synaptisk effekt som ligger till grund för sådana viktiga processer somlärande och minne 1,2. Det är viktigt att notera att elektronmikroskopi (EM) är den enda tekniken som gör det möjligt att avgöra om en dendritisk ryggrad har en presynaptisk ingång. EM-upplösning behövs också för att studera strukturella detaljer såsom form av en postsynaptisk densitet (PSD), som representerar en postsynaptisk del av en synaps eller dimensioner av en dendritisk ryggrad, liksom storleken och formen på en axonal bouton. Dessutom är det möjligt att visualisera synapser och deras omgivning med EM.
Tack vare framsteg inom bild- och datateknik är det möjligt att rekonstruera hela neurala kretsar. Volymelektronmikroskopitekniker, såsom seriell sektionsöverföringselektronmikroskopi (ssTEM), seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBEM) och fokuserad jonstråleskanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) används ofta för neuronala kretsrekonstruktioner3.
I våra studier används SBEM-metoden framgångsrikt för att undersöka den strukturella plasticiteten hos dendritiska ryggrader och PSDs i prover av musen hippocampus och organotypiska hjärnskivor 4,5. SBEM är baserad på installationen av en miniatyr ultramicrotome inuti scanning elektronmikroskopkammaren6,7,8,9. Toppen av provblocket avbildas, och sedan skärs provet på ett angivet djup av ultramicrotome, vilket avslöjar en ny block-face, som återigen avbildas och sedan upprepasprocessen 8. Som ett resultat är det bara bilden av ett block-ansikte kvar medan skivan som har skurits går förlorad som skräp. Det är därför SBEM kallas en destruktiv teknik, vilket innebär att det inte är möjligt att avbilda samma plats igen. Fördelen med de destruktiva blockeringsmetoderna är dock att de inte lider av warpingproblem och sektionsförlust som avsevärt kan påverka datakvaliteten och dataanalysen3. Dessutom ger SBEM möjlighet att avbilda ett relativt stort synfält (> 0,5 mm × 0,5 mm) vid hög upplösning3.
För att använda SBEM måste prover förberedas enligt ett dedikerat, mycket kontrasterande protokoll på grund av den backscattered elektrondetektorn som används för att förvärva bilder. Vi visar här hur man utför provberedning enligt protokollet baserat på ett förfarande utvecklat av Deerinck10 (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) metod), med hjälp av reducerade osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) fläckar som utvecklats på 1980-talet8,11. Dessutom introducerar vi en tvåstegs fixeringsmetod, med mild fixering perfusion som gör det möjligt att använda samma hjärna både för immunofluorescensstudier med lätt mikroskopi och SBEM.
I protokollet är en mushjärna främst fixerad med ett milt fixativ och skärs sedan i halvor, och en halvklot postfixeras och förbereds för immunofluorescens (IF), medan den andra för EM-studier (Figur 1).
Figur 1. Schematisk representation av arbetsflödet för dendritiska ryggraden förberedelse för analysen med SBEM. Möss offrades och perfused med en mild primära fixativ. Hjärnan var skuren i halvor, och en halvklot postfixerades med immunofluorescens (IF)-dedikerade fixativ, cryoprotected, skivas med en cryostat och bearbetades för IF studier, medan den andra halvklotet var postfixed med EM fixativ, skivas med vibratome och beredd för EM studier. Hjärnskivor för SBEM-studier kontrasterades, platt inbäddad i harts, sedan monterades en CA1-region i hippocampus på stiftet och avbildades med SBEM (Figur 1). Den del av protokollet som markerats i en gul ruta presenterades i videon. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen utfördes i enlighet med Nencki-institutets riktlinjer och tillstånd från den lokala etiska kommittén. Studierna genomfördes i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG), Polens djurskyddslag och godkändes av den första lokala etikkommittén i Warszawa. Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som användes och deras lidande.
VARNING: Alla procedurer som beskrivs nedan måste utföras i en laboratorierökhuv. På grund av den farliga karaktären hos de reagenser som används. Personliga säkerhetsåtgärder som handskar, labbrock, skyddsglasögon och ansiktsmask krävs.
1. Beredning av fixeringsmedel för perfusion (2% wt/vol paraformaldehyd (PFA) och 0,5% vol/vol glutaraldehyd (GA) i 0,1 M fosfatbuffert (PB), pH 7,4)
OBS: Förbered fixeringslösningen samma dag som den kommer att användas och förvara den inte längre än i 3 timmar. Vid tidsbrist, förbered 2% PFA i 0,1 M PB dagen innan, lagra den vid 4 °C och tillsätt färsk GA strax före perfusionen.
- Ta 400 ml sterilt dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och värm det till 60 °C med en omrörande kokplatta. Tillsätt sedan 20 g PFA. Tillsätt droppar på 1 M NaOH tills PFA är helt upplöst och låt blandningen svalna.
- Tillsätt 500 ml 0,2 M PB (pH 7,4).
- Filtrera lösningen för att ta bort eventuell deposition och kyl den till 4 °C.
- Strax före perfusion, tillsätt 20 ml 25% GA till lösningen och fylla sedan på volymen med ddH2O till 1 L.
2. Beredning av postperfusion fixativ för SBEM (2% wt/vol PFA och 2,5% vol/vol GA i 0,1 M PB, pH 7,4)
- Ta 50 ml av fixativet för perfusion (2% PFA och 0,5% GA i 0,1 M PB).
- Tillsätt 5 ml 25% GA.
3. Beredning av postperfusion fixativ för IF färgning (4% PFA i fosfat buffrad saltlösning (PBS))
- Lös upp en tablett på 1x PBS (pH 7.4) i renat och avjoniserat vatten (H2O) enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd en omrörande värmeplatta för att värma lösningen till 60 °C och tillsätt 40 g PFA.
- Tillsätt droppar på 1 M NaOH tills PFA är helt upplöst och låt blandningen svalna.
- Justera lösningens pH-fel till 7,5 med 1 M HCl och fylla sedan på volymen med H2O till 1 L.
- Filtrera lösningen för att ta bort eventuella avlagringar.
4. Transkardiell perfusion av djur
OBS: Allt PFA- och GA-avfall måste samlas in och lagras för bortskaffande enligt lokala föreskrifter. Anestesi och perfusion bör följa de lokala reglerna. I det beskrivna protokollet vuxna 3-månader gamla och 20±1 månader gamla kvinnliga Thy1-GFP (M) möss (Thy1-GFP +/-)12 uttrycker grön fluorescens protein (GFP) i en glest distribuerad population av glutamatergic nervceller användes men någon annan kan också användas. Djur uppföddes som heterozygoter med C57BL/6J-bakgrund i Djurhuset vid Nencki Institute of Experimental Biology.
- Före perfusion bedöva en mus genom administrering av en ketamin/xylazinblandning (upp till 90 mg/kg kroppsvikt ketamin och 10 mg/kg kroppsvikt xylazin) via intraperitoneal injektion (27-gauge nål).
- Bedöma om anestesidjupet är tillräckligt genom att kontrollera reflexen till smärtstimuli (nypning) och hornhinnans reflex (kisande).
- Efter 20 minuter utför en intraperitoneal injektion (27-gauge nål) av natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvikt).
- Granska en mus enligt ett perfusionskirurgiprotokoll som beskrivs av Gage et al.13 (se punkt 4; Figur 5-6). Använd en perfusionspump som börjar med en 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,4 (30 ml) i 3 minuter och fortsätt med 2% PFA och 0,5% GA i 0,1 M PB, pH 7,4 i 6 minuter (80 ml).
- Dissekera försiktigt hjärnan från skallen och dela den i hälften (se figur 9-10 i Gage et al., 201213). Placera en bit i en flaska som innehåller fixeringsmedel för SBEM och den andra i injektionsflaskan med 4% PFA/PBS för IF-färgning.
- Håll halvkloten i fixativet vid 4 °C över natten.
5. Hjärnskivor förberedelse för elektronmikroskopi
- Välj vibratomeinställningar (bladens körhastighet: 0,075 mm/s, skärfrekvens: 80 Hz).
- Placera skärkammaren i hållaren, fäst den på vibratome och omge den med is. Placera sedan ett rakblad i vibratomebladhållaren.
- Använd en sked, eller liknande föremål och placera den kylda hjärnan (dorsal yta upp) på en tuff skäryta (t.ex. ett petriskållock i glas). För att förbereda en koronell skiva av hippocampus göra en vinkelrät skärning mellan hjärnhalvan och lillhjärnan med ett rakblad eller skalpell, vilket tar bort lillhjärnan. Luktlampan kan också tas bort.
- Applicera cyanoakrylatlim på vibratomens torra plattform.
- Plocka upp hjärnan med tång och torka försiktigt den på filterpapper.
- Limma halvklotet till plattformen nära skärbladet med rostralspetsen uppåt. Fäst plattformen på hållaren och fyll den omedelbart med iskallt 0,1 M PB, pH 7.4. Om det vinkelräta snittet är korrekt gjort, kommer halvklotet att stå rakt upp och ge 90 ° vinkel som krävs för att göra ett symmetriskt koronarslipning som innehåller hippocampus. Försäkra dig om att hjärnan är täckt med PB.
- Placera vibratomebladet framför halvklotet och sänk det till koronarsidan av halvklotet. Sänk bladet till 400 μm längre i kaudal riktning och börja skära. Fortsätt skivningen tills de två första skivorna är helt separerade från vävnadsblocket.
- Dra tillbaka bladet och sänk ytterligare 100 μm och skiva sedan igen.
- När hippocampus blir synlig (använd mushjärnatlasen Paxinos och Franklin, 200414) samla skivorna med den lilla penseln eller breddad plast Pasteur pipett.
- Överför skivorna till en 12-brunnsplatta fylld med kall 0,1 M PB, pH 7,4.
- Dissekera hippocampus i en petriskål fylld med 0,1 M PB, pH 7.4 med rakblad eller skalpell och lägg den i glasflaskor med samma fosfatbuffert.
OBS: För långtidslagring av skivorna tillägg 0,1 M PB med 0,05% natriumazid (NaN3).
6. Förberedelse av hjärnprov för immunstainning
- Efter fixering över natten i 4% PFA/PBS-lösning i en rökhuva, sätt hjärnvävnaden i kryopreservationslösningen (30% sackaros i PBS med 0,05% NaN3) och håll den vid 4 °C i 2 dagar (tills den sjunkit).
- Förbered en frostskyddslösning (15% sackaros/30% etylenglykol/0,05% NaN3/PBS).
- Ställ in kryostatens skåptemperatur på -19 °C och se till att temperaturen uppnås innan du fortsätter vidare. Under sektionering, se till att skåpets temperatur förblir mellan -18 °C och -20 °C.
- Använd en sked, eller liknande föremål och placera den kylda hjärnan (dorsal yta upp) på en tuff skäryta (t.ex. ett petriskållock i glas). För att förbereda en koronell skiva av hippocampus göra en vinkelrät skärning mellan hjärnhalvan och lillhjärnan med ett rakblad eller skalpell, vilket tar bort lillhjärnan.
- Välj en förkyld provskiva, täck den med ett medium för frysning på en friande hylla och använd tång fixera halvklotet på skivan med en rostral spets uppåt och vänta tills provet är helt fruset. Sätt in provskivan i ett provhuvud.
- Montera ett blad i en bladhållare inuti kryokammaren och skär 40 μm tjocka skivor.
- Överför skivor med en liten pensel till 96-brunnsplattan fylld med kall frostskyddslösning och rulla försiktigt ut sektionerna (samla en skiva efter varje skiva för att förhindra att de går vilse i skärkammaren).
OBS: Hjärnor eller sektioner kan lagras i en frostskyddslösning vid -20 °C under lång tid.
7. Immunostaining av hjärnskivor
OBS: Alla färgningssteg utfördes i en 24-brunnsplatta på en plattformsskakapparat.
- Tvätta skivorna med PBS tre gånger, varje gång i 6 minuter.
- Inkubera skivor i 300 μL blockeringslösning (5% normalt åsneserum (NDS)/0,3% Triton X-100) i 1 timme med skonsam skakning på en rotator.
- Inkubera skivorna med den primära antikroppen mot PSD-95 utspädd 1:500 i 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 μL per brunn) över natten vid 4 °C. Den slutliga koncentrationen av den primära antikroppen är 2 μg/ml.
- Tvätta skivorna med 0,3% Triton X-100/PBS vid rumstemperatur (RT) tre gånger, varje gång i 6 minuter.
- Inkubera skivor med den sekundära antikroppen utspädd 1:500 i 300 μL på 0,3% Triton X-100/PBS i 90 minuter. Den slutliga koncentrationen av den sekundära antikroppen är 4 μg /ml.
- Tvätta skivorna med PBS tre gånger, varje gång i 6 minuter.
- Montera skivorna på diabilderna med ett monteringsmedium och stäng dem sedan med en täckbild.
- Undersök proverna med hjälp av ett konfokalt mikroskop (63 × oljemål, NA 1.4, pixelstorlek 0,13 μm × 0,13 μm).
OBS: För långtidslagring: förvara proverna vid 4 °C, skydda dem mot ljus.
8. Beredning av SBEM-prov
VARNING: På grund av reagensernas farliga karaktär måste alla procedurer som beskrivs nedan utföras i en laboratorierökhuv. Innan du använder dessa kemikalier, läs noggrant i de datablad för materialsäkerhet som tillhandahålls av tillverkarna och fråga säkerhetsansvarige om de lokala reglerna för att säkerställa säker hantering och avfallshantering.
- Exempelkontrast
OBS: Skivor tvätt och rumstemperaturinkubation bör utföras med mild skakning (t.ex. på en plattformskakapparat). Autoklavavgasat vatten användes.- Tvätta skivorna med kallt 0,1 M PB, pH 7,4 fem gånger, varje gång i 3 minuter.
- Förbered en 1:1 blandning av 4% vattenhaltigt osmium tetroxid och 3% kalium ferrocyanid (1:1 med vol). Slutprodukten blir brun. Fördjupa proverna i denna blandning, placera dem på is, och från detta stadium och framåt är det viktigt att skydda dem från ljus. Inkubera dem med mild skakning i 1 timme.
- Förbered under tiden en TCH-lösning (thiocarbohydrazide). Blanda 10 ml dubbeldestillerat H2O (ddH2O) och 0,1 g TCH och placera det i en ugn inställd på 60 °C i 1 timme. Det är viktigt att virvla lösningen då och då (t.ex. var 10: e minut). När du är klar, kyl den till rumstemperatur.
- Tvätta skivorna med ddH2O fem gånger, varje gång i 3 minuter.
- Filtrera TCH-lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter och sänk ned provet i filtrerad lösning. Skivorna blir svarta. Inkubera dem i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta proverna med ddH2O fem gånger, varje gång i 3 minuter.
- Inkubera proverna med en 2% vattenlösning av OsO4 i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta proverna med ddH2O fem gånger, varje gång i 3 minuter.
- Placera proverna i filtrerat 1% vattenhaltigt uranylacetat och inkubera dem vid 4 °C över natten. Använd 0,22 μm sprutfilter för filtrering.
- Förbered L-aspartic syralösning genom att blanda 0,4 g L-aspartikelsyra och 80 ml ddH2O, justera pH-talet till 3,8 för enklare upplösning och sedan fylla på med vatten till 100 ml.
- Nästa dag börjar med Waltons bly aspartate15 förberedelser. Blanda 0,066 g blynitrat med 10 ml L-aspartikelsyralösning (punkt 8.1.10) förvärmd till 60 °C och justera pH till 5,5 (uppmätt vid 60 °C) med 1 M NaOH. Stäng injektionsflaskan med bly aspartate och lämna den vid 60 °C i 30 minuter i ett vattenbad. Lösningen bör vara tydlig. Om det blir grumligt måste det kasseras och en ny måste förberedas.
- Under tiden tvätta proverna med avgasat ddH2O fem gånger, varje gång i 3 minuter. Håll dem sedan i ugnen inställd på 60 °C i 30 minuter.
- Doppa proverna i den nyberedda blyaspartatlösningen och inkubera dem i ugnen som är inställd på 60 °C i 20 minuter.
- Tvätta proverna med avgasat ddH2O fem gånger, varje gång i 3 minuter.
- Uttorkning och hartsinbäddning
- Förbered epoxiharts. Väg ingredienserna (33,3 g komponent A/M, 33,3 g komponent B och 1 g komponent D) och blanda hartsbrunnen (t.ex. skaka den på en roterande skakapparat i ett 15 ml-rör) i minst 30 minuter innan du tillsätter 16 droppar gaspedalen DMP 30. Rör om i ytterligare 10 minuter.
OBS: Väg ingredienserna under rökhuven. Denna mängd komponenter ger cirka 60 ml harts vad som räcker för 15 injektionsflaska med prover. Du kan förbereda mindre eller lagra resten av hartset i en spruta vid 4 °C och använda det nästa dag. Kom ihåg att försegla sprutans spets. - Förbered injektionsflaska med graderad utspädning av etanol (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% etanol i vatten och 100% torkad på en molekylär sikt).
- Blanda hartset med 100% etanol i 1:1-proportion för att erhålla 50% harts. Blanda det bra.
- Dehydrera proverna i 5 minuter i varje utspädning av etanol från 30% och slutar med 100% vattenfri etanol torkad på molekylär sikt. Kom ihåg att proverna aldrig får torka helt.
- Infiltrera proverna först i 50% harts i 30 minuter, nästa i 100% harts i en timme och sedan igen i 100% harts över natten. Utför alla infiltrationssteg med konstant långsam skakning.
- Nästa dag placerar du proverna i färskt 100% harts i en timme och bäddar sedan in dem mellan fluoropolymerinbäddningsark. Avfetta bitar av inbäddningsplåt med etanol och bädda in proverna mellan två lager av det, med två glasbilder som stöd. Försök att undvika luftbubblor i harts på eller nära provet.
- Härda proverna i ugnen vid 70 °C i minst 48 timmar.
- Förbered epoxiharts. Väg ingredienserna (33,3 g komponent A/M, 33,3 g komponent B och 1 g komponent D) och blanda hartsbrunnen (t.ex. skaka den på en roterande skakapparat i ett 15 ml-rör) i minst 30 minuter innan du tillsätter 16 droppar gaspedalen DMP 30. Rör om i ytterligare 10 minuter.
- Trimning och montering
- Separera inbäddningsplåtar och skär en bit av det inbäddade provet (ca 1 mm x 1 mm) med ett rakblad. Överför den till en parafilm. Detta minimerar risken för att förlora provet på grund av elektrostatik.
- Ta en aluminiumstift som har avfettats med etanol. Blanda en ledande epoxibrunn och använd lite av den för att montera provet på stiftet. Härda ledande epoxi vid 70 °C i 10 minuter.
- Trimma varje sida av provblocket med diamantkniven och polera sedan blockets ansikte tills vävnaden exponeras.
OBS: Bekräfta i detta steg förekomsten av en region av intresse genom att samla in vissa sektioner och utföra toluidinblå färgning16 eller kontrollera under elektronmikroskopet. - Minska provet så mycket som möjligt. Jorda sedan provet till stiftet med ledande färg och härda det (i 24 timmar vid rumstemperatur eller i ugnen vid 65 °C i 40 minuter).
- För att minimera laddningsartefakter, sputter belägga proverna med ett tunt lager av guld eller guld / palladium.
9. SBEM-avbildning
- Placera stiftet med ett prov i kammaren i det seriella block-face scanning elektronmikroskopet. Rikta provet mot kniven. Stäng kammaren och ställ in parametrarna.
- Samla en bunt bilder vid önskad förstoring, pixelstorlek, skiva tjocklek, accelererad spänning (EHT), bländare, tryck, etc.
Parametrarna beror på provet och experimentmålet. Föredömliga inledande bildinställningar ingår i materialförteckningen.
10.3D rekonstruktioner
OBS: För stegen som nämns nedan använder vi öppen programvara, t.ex. FijiJ17 (ImageJ version 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)18 och Reconstruct19 men olika andra program kan användas.
- Konvertera digitala mikrograffiler (dm) till TIFF-format. Importera först bildsekvensen (i FijiJ: File > Import > Image sequence > Choose 8 Bit Format) och spara sedan som TIFF (i FijiJ: File > Save As > Image Sequence > Choose Tiff).
- Justera ljusstyrkan och kontrasten på bildstacken (i FijiJ: Bild > Justera > Ljusstyrka/Kontrast)och, om nödvändigt, denoise den (använd DenoisEM plugin för FijJ20 : Plugins > DenoiseEM > Denoise).
- Justera stacken (i FijiJ: Plugins > StagReg eller MIB: Dataset > Alignment Tools).
- Segment dendritiska ryggrader och synapser (I MIB eller Rekonstruera programvara finns omfattande handledningar tillgängliga (Se tabell över material för detaljer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av metoden som beskrivs ovan högkontrast kan bra upplösningsbilder av mushjärnvävnad erhållas. Ett stort synfält som tillhandahålls av SBEM-tekniken underlättar ett exakt urval av den intresseregion som är av intresse. Den stora bilden av CA1-regionen i hippocampus togs för att mäta längden på stratum radiatum (SR) (Figur 2A) och för att ställa in avbildningen exakt i mitten (Figur 2B). Därefter förvärvades högen med bilder och objekt av intresse, såsom dendriter, dendritiska ryggrader, postsynaptiska densiteter i synapserna segmenterades (Figur 2C,D).
Användningen av SBEM-tekniken ger möjlighet att analysera en relativt stor volym vävnad och att känna igen sällsynta händelser som en multi-innervated dendritisk ryggrad (Figur 2E) - en viss typ av synapser som kännetecknas av flera presynaptiska terminaler som kontaktar samma postsynaptiska ryggrad21.
Figur 2. Dendritiska ryggraden i mus hippocampus CA1 regionen. Representativ bild av mus hippocampal CA1 region. Stratum radiatum (SR) visas med en vit pil (A). Regionen mitt i SR valdes för bildbehandling (B). Rekonstruktion av en bit dendrit med dendritiska ryggrader (C). Rekonstruktion av dendritiska ryggrader i en volym vävnad (D). Rekonstruktion av en multi-innervated dendritic ryggrad (E). Två presynaptiska terminaler som kontaktar samma postsynaptiska ryggrad visas (i magenta och grönt). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Det presenterade protokollet för SBEM provberedning gjorde det möjligt för oss att få högkvalitativa bilder av hjärnvävnaden med kraftigt kontrasterade membran, vilket möjliggör enklare segmentering och återuppbyggnad av membran omgivna strukturer. Standardfixeringen med den högre koncentrationen av PFA (figur 3B) och tvåstegsfixeringsmetoden resulterade i liknande vävnadsmorfologi (figur 3A).
Bild 3. Morfologiska detaljer. Med hjälp av protokollet presenteras här god kvalitet bilder som visar morfologi av synaptiska vesiklar, PSD och mitokondrier erhölls. Hjärnvävnad fixerad med tvåstegsmetod(A)eller med ett standardfixativt (B). Skala 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Resultaten är reproducerbara, vilket innebär att varje prov som framställs med detta protokoll, inte bara hjärnvävnad utan också monoskiktet av odlade celler, var väl kontrasterat.
Användningen av mild primär fixering erbjuder möjlighet att använda vävnaden även för immunofluorescensstudier som involverar ett ljusmikroskop. När det gäller PSD-95-antikroppen observerade vi inte skillnaden i immunostainingresultat mellan de prover som fixerades med tvåstegsfixering (mild primär och sedan sekundär med ett traditionellt fixativ) och det som erhållits med traditionell fixering med endast 4% PFA (figur 4A respektive 4B).
Figur 4. Jämförelse av PSD-95 immunofluorescens i prover som är fixerade med olika protokoll. Representativa mikrofoton av PSD-95 immunostaining i stratum radiatum skiktet i CA1 området i dorsala hippocampus. (A) Konfokal bild efter mild primär fixering följt av postfixering med en standard fixativ. (B) Konfokal bild efter standard, starkare fixering. Skalstänger: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns många variationer av den primära NCMIR-metoden som beskrivs av Deerinck 201010. De grundläggande principerna förblir desamma, men beroende på vilken typ av material som studeras genomförs små förändringar. Det beskrevs tidigare att olika hartser kan användas för att bädda in exemplar för SBEM och till exempel när det gäller växter är Spurrs det resin som valdes på grund av dess låga viskositet som möjliggör bättre infiltration genom cellväggarna22,23. Dessutom kan olika buffertar tillämpas för fixering (t.ex. kakodylatbuffert, HEPES- eller fosfatbuffert samt en annan koncentration av glutaraldehyd (2-3%) och paraformaldehyd (2-4%)23,24,25,26,27,28). Användningen av garvsyra för att förbättra färgningen av prover rik på extracellulärmatris 29 eller rutheniumrött för att förbättra färgningen av växtmaterial23,30 är ett annat ändringsförslag som kan användas. När det gäller uttorkning rekommenderas vanligtvis etanol och/eller aceton för epoxiharts24,28.
Samma protokoll som beskrivs här, eller mycket liknande, har framgångsrikt använts tidigare av vårt team och andra grupper4,5,24. Prover som bearbetas enligt denna metod är kompatibla med TEM imaging31. I jämförelse med det ursprungliga NCMIR-protokollet som publicerades2010 10 introducerar vi några mindre förändringar som ersättning av giftig kakodylatbuffert under fixering och osmium efter fixeringssteg med en fosfatbuffert. Som nämnts ovan kan olika buffertar användas under EM-beredning, och enligt vår erfarenhet ger giftfri PB tillfredsställande resultat.
En annan förändring är en ersättning av aceton med mindre användarskadlig etanol under det sista steget av uttorkning. Etanol användes också som hartslösningsmedel under inbäddningsprocessen. Dessutom användes DMP-30 istället för epoxihartskomponent C, som publicerats före32,33.
På grund av behovet av att använda samma hjärnor för immunofluorescensstudier infördes tvåstegs fixeringsmetoden. För det första, djuren perfunderades med en buffert som innehöll en lägre koncentration av glutaraldehyd (mild primär fixering genom perfusion med en buffert som innehöll 2% PFA och 0, 5% GA) och därefter var endast hälften av hjärnan tillägnad EM ytterligare postfixerad med en högre koncentration av glutaraldehyd (2% PFA och 2, 5% GA), medan den andra halvan av hjärnan var postfixerad med ett standardfixativt för immunstaining (4% PFA). Användningen av EM fixativ med en lägre koncentration av PFA publicerades tidigare av andra och vår grupp4,5,31,34. Den tvåstegsfixering som presenteras här är lika tillräcklig som en traditionell strategi i ett steg (figur 3 och figur 4). Men eftersom vi föreslår att varje halva av hjärnan kan bearbetas separat, tillåter vårt protokoll att minska antalet djur som används. Mild primär fixering upprätthåller framgångsrikt vävnad antigenicitet, möjliggör ytterligare immunofluorescens som visats för antikroppar mot PSD-95 protein. Det måste dock betonas att nyttan av vårt tillvägagångssätt måste valideras för andra antikroppar.
Den presenterade metoden resulterar i högkontrastbilder av hjärnvävnaden med tydligt synliga membran. Det är dock värt att nämna att det finns samma steg som är benägna att misslyckas, som när det gäller någon annan metod för beredning av SBEM-prov, och särskild uppmärksamhet måste ägnas dem. Kvaliteten på vävnadsmorfologin i sig beror främst på perfusionen. Det är ett kritiskt steg, eftersom endast framgångsrikt fasta exemplar ger tillfredsställande resultat. Tyvärr påverkas fixering perfusion av individuell variation bland djur, så kvaliteten på bilderna kan variera från ett djur till ett annat. Dessutom måste man vara försiktig så att man inte torkar provet under uttorkning; Annars infiltreras provet inte ordentligt med hartset. En annan viktig aspekt är provmontering på stiftet. Epoxihartserna är icke-konduktiva, och därför ackumulerar de elektroner under avbildning av vad som orsakar laddning av artefakter. För att minska laddningseffekten i SBEM är det nödvändigt att försiktigt ta bort överskott av harts på varje sida av provet och noggrant jorda provet med silverfärg och sputterbeläggning.
Det nuvarande protokollet fokuserar på hjärnvävnad; Det kan dock anpassas för cellmonalayer, organotypiska skivor eller andra vävnader. Liksom det ursprungliga NCMIR-protokollet resulterar det som presenteras här i mycket kontrasterade prover som är lämpliga inte bara för SBEM, men också för FIB-SEM- och ATUM-SEM-experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
SBEM imaging, ljusmikroskopi imaging och elektronmikroskopi provberedning utfördes med hjälp av utrustningen från Laboratory of Imaging Tissue and Function som fungerar som en bildkärna anläggning vid Nencki Institute of Experimental Biology.
För förberedelse av figur 1 användes bilden av en mus (Souris_02) och en flaska https://smart.servier.com/ beredningen.
Detta arbete stöddes av National Science Centre (Polen) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) som tilldelades KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
| Fixatives: | |||
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
| Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade,  98%, pellets (anhydrous) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
| Perfusion: | |||
| Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
| Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
| Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
| Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
| Brain slices preparation for EM: | |||
| 12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
| Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
| Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
| Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain slices preparation for IF: | |||
| 96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
| Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
| Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
| Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
| Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| 24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
| Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
| Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
| Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
| Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
| Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
| Electron microsocpy sample preparation | |||
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
| Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
| DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
| Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
| Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
| Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
| Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
| Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
| Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
| pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
| Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
| Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
| Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
| Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
| Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
| Specimen mounting for SBEM | |||
| 96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
| AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
| Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
| Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
| Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
| Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
| Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
| Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
| trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
| Software | webpage | tutorials | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animals | |||
| Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
References
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
- Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
- Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
- Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
- Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Acad. Press. San Diego, Calif. (2004).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
- Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
- Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
- Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
- Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
- Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
- Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
- Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
- Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
- Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
- Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
- Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
- Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. Princeton. (2014).
- Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).
