A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBEM) för studie av dendritiska ryggrader
Chapters
Summary October 2nd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Seriell Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) tillämpas på bild och analysera dendritiska ryggrader i murine hippocampus.
Transcript
Varje neuron i hjärnan är kopplad till andra neuronala celler med cirka 7 000 synapser. Förutom att synapserna i däggdjurshjärnan främst ligger på de små utskjutningarna av membranet som kallas dendritiska ryggrader. Plasticitet hos synapserna och dendritiska ryggraden och liknande, så viktiga hjärnfunktioner som lärande och minnesprocesser.
Det är viktigt att notera att endast elektronmikroskopi ger en fullständig insikt om huruvida en dendritisk ryggrad har en postsynaptisk ingång. Olika tekniker på dendritiska ryggradsavbildning finns tillgängliga. Seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi ger dock unik möjlighet att avbilda stora volymer vävnad med hög upplösning.
Seriell blockbaserad scanningelektronmikroskopiteknik kräver ett speciellt protokoll för provberedning som innebär stark kontrastering mot tungmetaller. Min primära fixering under perfusion tillät oss att använda samma hjärnor för lättad elektronmikroskopi. Möss offrades och perfused med en mild primära fixativ.
Hjärnan skars i halvor och en halvklot var post fixerad med immunofluorescens dedikerade fixativ, cryoprotectant, skivas med en cryostat och bearbetas för immunofluorescens studier. Där den andra halvklotet var post fixerad med elektronmikroskopi fixativ, skivas med vibratome och beredd för elektronmikroskopi studier. Hjärnskivor för seriell blockbaserad scanning elektronmikroskopi studier kontrasterades, platt inbäddad i harts, sedan en CA1 region av hippocampus monterades på stiftet och avbildas med seriell block-baserade scanning elektronmikroskop.
Den del av protokollet som markerats i en gul ruta presenterades i videon. Ta vävnaden, som har fixerats och skurits i 100 mikrobiotiska skivor och tvätta den med kall fosfatbuffert fem gånger i tre minuter vardera. Förbered en 1-till-1-blandning av 4%osmium tetroxid och 3%kalium ferrocyanid.
Slutprodukten blir brun. Fördjupa proverna i denna blandning. Lägg sedan proverna på is.
Och från och med nu är det viktigt att skydda dem från ljus. Inkubera dem med mjuka skakningar i en timme. Under tiden, förbered TCH-lösningen.
Blanda 10 milliliter dubbeldestillerat vatten och 0,1 gram TCH. Placera den i en ugn på 60 Celsius i en timme. Det är viktigt att då och då swill lösningen.
När du är klar, kyl den till rumstemperaturen. Tvätta nu proverna med dubbelt destillerat vatten fem gånger i tre minuter vardera och sänk sedan ned dem i filtrerad TCH-lösning. Skivorna blir svarta.
Inkubera dem i 20 minuter vid rumstemperatur. Tvätta proverna med dubbelt destillerat vatten fem gånger i tre minuter vardera och inkubera dem med 2%osmium tetroxid i 30 minuter, denna gång vid rumstemperatur. Återigen, tvätta proverna med dubbelt destillerat vatten fem gånger i tre minuter vardera och placera dem i filtrerat 1%eller amylacetat.
Inkubera dem vid fyra grader Celsius över natten. Nästa dag börjar du med D-aspartate förberedelse. Blanda blynitrat med asparaginsyralösning förvärmd till 60 grader Celsius.
Placera blandningen i ett vattenbad på 60 grader Celsius och justera pH till 5,5 med en molar natriumhydroxid. Stäng injektionsflaskan med bly aspartate och lämna den i 60 grader Celsius i 30 minuter. Lösningen bör vara tydlig.
Om det blir grumligt måste det kasseras och en ny måste förberedas. Under tiden tvätta proverna med gasen dubbelt destillerat vatten fem gånger i tre minuter vardera och håll dem i ugnen på 60 grader Celsius i 30 minuter. Doppa proverna i den nyberedda bly aspartatelösningen och inkubera dem i ugnen som är inställd på 60 grader Celsius i 20 minuter.
Förbered epoxiharts. Väg ingredienserna och blanda hartsbrunnen i minst 30 minuter innan du tillsätter gaspedalen DMP 30. Förbered virus med graderad utspädning av etanol.
Ta sedan proverna ur ugnen och tvätta dem igen med dubbelt destillerat vatten fem gånger i tre minuter vardera. Under tiden blanda hartset med 100% etanol i en-till-en-proportion för att få 50% harts. Blanda det bra.
Torka därefter ut proverna i varje utspädning av etanol i fem minuter. Kom ihåg att proverna aldrig får torka helt. Infiltrera proverna först i 50% harts i 30 minuter, nästa i 100% harts i en timme och sedan igen i en färsk 100% harts över natten.
Nästa dag placerar du proverna i färskt 100% harts i en timme och bäddar sedan in dem mellan fluoropolymerinbäddningsark. Förbered bitar av inbäddningsplåt som har avfettats med etanol och lägg åt sidan glasrutschbanorna som ska användas som stöd. Placera en bit inbäddningsark på en glasbild, sätt en droppe harts på den och överför sedan provet försiktigt med hjälp av träpinne.
Täck den med den andra biten. Försök att undvika luftbubblor. Var försiktig eftersom vävnaden är mycket bräcklig.
Placera försiktigt en annan glasrutschbana ovanpå inbäddningsplåten och härda provet i ugnen vid 70 grader Celsius i minst 48 timmar. Separera lagren och skär en bit av det inbäddade provet med ett rakblad. Överför den till paraffin.
Detta minimerar risken för att förlora provet på grund av elektrostatik. Ta en aluminiumstift som har avsmords med etanol. Blanda en ledande epoxibrunn och använd lite av den för att montera provet på stiftet.
Bota ledande epoxi vid 70 grader Celsius i 10 minuter. Trimma varje sida av provblocket med diamantkniven och polera sedan blockets ansikte tills vävnaden exponeras. Jorda provet till stiftet med ledande färg och härda det.
För att minimera laddningen bör proverna också ses belagda med ett tunt lager guld eller guldpaladium. Placera stiftet med provet i kammaren i det seriella blockbaserade scanningelektronmikroskopet. Rikta provet mot kniven och stäng sedan kammaren och ställ in parametrarna.
Samla en hög med bilder. Med hjälp av den beskrivna metoden erhölls bilder av mus hjärnvävnad. Den stora bilden av hippocampus en region togs och avbildningen sattes i mitten av stratum radiatum.
En hög med bilder förvärvades och objekt av intresse, såsom dendritiska ryggrader och synapser, segmenterades. God kvalitet vävnad morfologi erhölls med tydligt synliga membran och synaptiska vesiklar och välbevarade mitokondrier. Immunofluorescerande studier av PSD 95 antikroppar bekräftade att mild primär fixering och traditionell fixering med 4%PFA ger jämförbara resultat.
Presenterat protokoll möjliggör förvärv av hjärnvävnad bilder med användning av seriell block-baserade scanning elektronmikroskopi, högkvalitativa vävnad morfologi och 12 synliga membran underlättar 10 rätt segmentering och återuppbyggnad. Min primära fixering gjorde det möjligt att använda samma hjärnor för analys av PSD 95 immunofluorescens och elektronmikroskopi imaging dendritiska ryggrader. Här använder vi PSE 9, 500 spirande.
Men den andra kan också användas.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
