Summary
该协议提供了执行粘附足迹测定的实验程序，以在快速细胞滚动粘合期间对粘附事件进行成像。
Abstract
由选择素介导的相互作用促进的滚动粘附是将白细胞募集到炎症部位的高度动态，被动的运动。这种现象发生在毛细血管后静脉中，其中血流在内皮细胞上滚动运动推动白细胞。稳定的轧制需要在粘附键形成与其机械驱动的解离之间取得微妙的平衡，使细胞在沿流动方向滚动时保持附着在表面上。与在相对静态环境中发生的其他粘附过程不同，滚动附着力是高度动态的，因为滚动电池以每秒数十微米的速度行进数千微米。因此，由于所需的时间尺度短且灵敏度高，传统的机械生物学方法（如牵引力显微镜）不适合测量单个粘附事件和相关分子力。在这里，我们描述了我们最新的粘附足迹测定方法，以对P-选择素进行成像：PSGL-1在分子水平上滚动粘附中的相互作用。该方法利用不可逆的基于DNA的张力计系绳，以荧光轨迹的形式产生分子粘附事件的永久历史。这些轨迹可以通过两种方式进行成像：（1）将数千张衍射极限图像拼接在一起以产生大视场，从而能够提取长度为数千微米的每个滚动细胞的粘附足迹，（2）执行DNA-PAINT以在小视场内重建荧光轨迹的超分辨率图像。在这项研究中，粘附足迹测定用于研究HL-60细胞在不同剪切应力下滚动。在此过程中，我们能够对P-选择蛋白的空间分布进行成像：PSGL-1相互作用，并通过荧光强度深入了解它们的分子力。因此，该方法为定量研究分子水平上滚动粘附所涉及的各种细胞 - 表面相互作用提供了基础。
Introduction
滚动粘附级联描述了循环细胞如何拴住并沿着血管壁滚动1。被动滚动主要由selectin介导，selectins是一类主要的细胞粘附分子（CAM）1。在血液的剪切流下，表达P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）的白细胞与P-选择素形成高度瞬态键，其可能在发炎的内皮细胞表面表达。这个过程对于白细胞迁移到炎症部位至关重要2。此外，PSGL-1也是一种机械敏感受体，能够在与P-selectin3接触时触发滚动粘附级联的后续牢固粘附阶段。
影响CAM功能的基因突变会严重影响免疫系统，例如在罕见的白细胞粘附缺乏症（LAD）中，介导滚动的粘附分子的故障导致严重免疫功能低下的个体4，5，6。此外，循环肿瘤细胞已被证明在类似的滚动过程之后迁移，导致转移7，8。然而，由于细胞滚动是快速和动态的，传统的实验机械生物学方法不适合研究细胞滚动过程中的分子相互作用。虽然原子力显微镜和光学镊子等单细胞和单分子操作方法能够在单分子水平上研究分子相互作用，例如P-selectin与PSGL-1的力依赖性相互作用9，但它们不适合研究细胞滚动过程中的活粘附事件。此外，体 外 表征的相互作用不能直接回答有关 体内分子粘附的问题。例如，当细胞在其天然环境中起作用时，什么分子张力范围与生物学相关？诸如粘合剂动力学模拟10 或简单稳态模型11 之类的计算方法已经捕获了某些分子细节以及它们如何影响滚动行为，但高度依赖于建模参数和假设的准确性。其他技术，如牵引力显微镜，可以检测细胞迁移过程中的力，但不能提供足够的空间分辨率或分子张力的定量信息。这些技术都不能提供对分子力的时间动力学，空间分布和幅度异质性的直接实验观察，这些与细胞在其天然环境中的功能和行为直接相关。
因此，实施能够准确测量选择介导相互作用的分子力传感器对于提高我们对滚动附着力的理解至关重要。在这里，我们描述了附着足迹测定12 的方案，其中PSGL-1涂层珠子滚动在呈现p-selectin功能化张力计系绳（TGT）13的表面上。这些TGT是基于DNA的不可逆的力传感器，以荧光读数的形式导致永久的破裂事件历史。这是通过TGT（dsDNA）的破裂，然后用荧光标记的互补链随后标记破裂的TGT（ssDNA）来实现的。该系统的一个主要优点是它与衍射极限和超分辨率成像兼容。荧光标记的互补链可以永久结合（>12 bp）用于衍射极限成像，或者瞬态结合（7-9 bp）用于通过DNA PAINT进行超分辨率成像。这是研究TGT在主动轧制过程中破裂时滚动附着力的理想系统，但在轧制后分析荧光读数。这两种成像方法还为用户提供了更大的自由度来研究滚动附着力。通常，衍射极限成像可用于通过荧光强度提取分子断裂力13，而超分辨率成像允许对受体密度进行定量分析。由于能够研究轧制粘附的这些特性，该方法为理解轧制电池在剪切流下分子粘附的力调节机制提供了一个有前途的平台。
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Protocol
1. 寡核苷酸标记和杂交
- 还原蛋白G二硫键
- 将 10 毫克蛋白 G （ProtG） 溶于 1 毫升超纯水中。
注意：这里的蛋白质G在C末端用单个半胱氨酸残基和N-末端聚组氨酸标签修饰。 - 用P6柱将≥20μLProtG（10mg / mL）置换至1x PBS（pH 7.2）中。
- 在缓冲液交换后测量蛋白质浓度。
注意：典型浓度为7-8毫克/毫升。 - 通过将3mg TCEP溶解到90μL1x PBS（pH 7.2）中，然后加入10μL0.5M EDTA中，制备120mM Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）。
注意：TCEP应新鲜制备。 - 加入4μL120mM TCEP（480 nmol）到20μLProtG（4-5 nmol）。
注意：目标是TCEP与蛋白质的摩尔比约为100：1。 - 让反应在室温（RT）下进行30分钟。
- 用P6柱（在1x PBS中交换的缓冲液，pH 7.2）从还原的ProtG中除去多余的TCEP。
- 使用紫外可见分光光度计测量还原的ProtG的浓度并保存光谱。
注：典型浓度为3.5-4.5毫克/毫升。
- 将 10 毫克蛋白 G （ProtG） 溶于 1 毫升超纯水中。
- 胺标记的ssDNA与磺磷脂酸反应
- 将胺标记的ssDNA（胺-ssDNA）溶解在无核酸酶的水中，浓度为1mM。使用紫外可见分光光度计验证链浓度。
- 通过将2mg磺基-SMCC溶解在400μL超纯水和涡旋中来制备11.5mM磺基-SMCC（一种具有磺基-NHS酯和马来酰亚胺的异质双官能交联剂）溶液。
- 加入6μL的1mM胺-ssDNA（6 nmol）到5.2μL的11.5mM磺基-SMCC（60 nmol）和88.8μL的1x PBS（pH 7.2）。涡旋5秒，然后以8600× g 离心3分钟。
- 让反应在室温下进行30分钟。
- 用P6柱（在1x PBS中交换缓冲液，pH 7.2）从SMCC共轭胺-ssDNA（mal-ssDNA）中除去多余的磺基-SMCC。
- 使用紫外可见分光光度计测量mal-ssDNA的浓度并保存光谱。
注：典型浓度为35-45μM。
- ProtG-ssDNA 偶联
- 向不良ssDNA（~4-5 nmol）中加入21μL4.5mg / mL还原ProtG（3 nmol）。
注：此处的体积和浓度是典型值。根据个人实验测量进行调整。始终确保在ProtG上以~1.5：1的比例过量的mal-ssDNA。 - 涡旋5秒，让反应在室温下进行3小时。
- 向不良ssDNA（~4-5 nmol）中加入21μL4.5mg / mL还原ProtG（3 nmol）。
- ProtG-ssDNA纯化和表征
- 用磁性硝基三乙酸镍（Ni-NTA）珠子通过他的标签分离来纯化共轭的ProtG-ssDNA。
- 用P6柱从产物中除去过量的咪唑（Ni-NTA洗脱缓冲液）（缓冲液在1x PBS中交换，pH 7.2）。
注意：该步骤对于量化偶联至关重要，因为咪唑在280nm处具有显着的吸收。 - 使用紫外可见分光光度计记录产品ProtG-ssDNA以及Ni-NTA洗脱缓冲液（1x）的光谱。
注意：260 nm 和 280 nm 处的典型 ProtG-ssDNA 吸光度分别为 0.8 和 0.6。 - 要确定ProtG与ssDNA的偶联效率和比率，请使用定制编写的MATLAB脚本（补充编码文件1）根据先前收集的三个光谱（ProtG，SMCC链，Ni-NTA珠洗脱缓冲液）分解最终产物谱。
注意：简而言之，代码的工作方式如步骤 1.4.5-1.4.8 中所述。典型浓度为4μM的ProtG-ssDNA，ProtG和ssDNA的摩尔比约为1：1（图2A）。 - 将 ProtG、SMCC 链、Ni-NTA 磁珠洗脱缓冲液和 ProtG-ssDNA 紫外可见光谱输入到 MATLAB 脚本中
- 执行多维无约束非线性最小化，从源光谱（ProtG、SMCC 链和 Ni-NTA 磁珠洗脱缓冲液光谱）重建 ProtG-ssDNA 光谱
注：最小化函数输出三个变换因子，每个源光谱一个。 - 通过将光谱乘以相应的因子并组合转换后的源光谱来重建ProtG-ssDNA光谱。
- 将ProtG和SMCC链的初始浓度乘以相应的转化因子，以确定ProtG-ssDNA产物中SMCC链和ProtG的浓度。
- （可选）根据 图 2B 运行本机 PAGE，以帮助确保每个组件和步骤按预期工作。
- TGT杂交
- 在T50M5缓冲液（10 mM Tris，50 mM NaCl，5 mM MgCl2）中以1.2：1的摩尔比将ProtG-ssDNA（上链）与生物素化的底部链杂交，浓度分别为240 nM和200 nM，以杂交完整的TGT构建体。让在室温≥1小时进行杂交。
2. 表面聚碳烯烃
- 表面清洁
- 每8个盖玻片清洁一个锥形瓶和两个染色罐。用1 M KOH溶液填充每个容器，并在室温下超声处理1小时，用超纯水彻底清洗每个容器，并用N2 或烤箱干燥。
注意：将 KOH 填充到顶部以触摸盖子，以便清洁它们。 - 用超纯水彻底冲洗每个盖玻片，然后将其放入其中一个清洁的染色罐中。
注意：确保它们不会相互粘附或粘在染色罐的壁上。 - 在通风橱中，通过在250 mL烧杯中加入30 mL过氧化氢（30%）至90 mL浓缩（95%-98%）硫酸来新鲜制备食人鱼溶液。
注意：浓硫酸具有高度腐蚀性。将过氧化氢非常缓慢地加入硫酸中，并小心地旋转混合。 - 将盖玻片与食人鱼溶液完全浸没在染色罐中。将盖玻片留在食人鱼中30分钟。
注意：在倒入之前，将食人鱼溶液冷却至不超过80°C，以防止染色罐破裂。 - 将食人鱼溶液丢弃到1000 mL烧杯中，并用玻璃清洁的1 M KOH中和。
- （可选）用新鲜的食人鱼溶液重复食人鱼清洁（步骤2.1.3-2.1.5）。
- 用大量的超纯水冲洗盖玻片，以除去所有残留的食人鱼溶液。每次上升时轻轻摇晃染色罐，以方便去除（建议冲洗10次）。
- 用甲醇冲洗盖玻片3次，以除去盖玻片表面的水，并保持盖玻片浸没在甲醇中。
- 每8个盖玻片清洁一个锥形瓶和两个染色罐。用1 M KOH溶液填充每个容器，并在室温下超声处理1小时，用超纯水彻底清洗每个容器，并用N2 或烤箱干燥。
- 表面硅烷化
- 通过在清洁和干燥的锥形瓶中彻底混合94 mL甲醇，1 mL氨基硅烷和5 mL冰醋酸来制备1%氨基硅烷溶液。倒入第二个清洁并干燥的染色罐中14。
- 将浸没在甲醇溶液下的盖玻片转移到含有1%氨基硅烷溶液的染色罐中，并保持罐盖。
注意：在转移到氨基硅烷时，不要让盖玻片干燥，以限制玻璃表面暴露在空气中。 - 将含有盖玻片的染色罐在烤箱中在70°C下在氨基硅烷中孵育1小时15。
- 小心地将氨基硅烷溶液丢弃在单独的废物容器中，并用甲醇冲洗染色罐中的盖玻片5次以除去氨基硅烷溶液。
- 用超纯水冲洗染色罐中的盖玻片5次，然后用N2干燥。
- 将干燥的盖玻片放入110°C的烤箱中的染色罐中烘烤20分钟。让盖玻片冷却至RT，然后将其放在PEGylation机架上。
注意：在烘烤过程中用盖子盖住染色罐，以尽量减少表面上的特定和化学沉积15。
- PEG溶液制备
- 将PEG（聚乙二醇）和PEG-生物素解冻至室温约30分钟。
注意：此步骤可最大限度地减少可能降解PEG上NHS酯的水分冷凝。 - 通过将84mg碳酸氢钠加入10mL超纯水中来制作PEG缓冲液。该制剂应提供pH 8.4的缓冲液。
- 对于8个盖玻片，每个盖玻片都有一个PEGY化的一面，带有20：1 PEG：PEG生物素：测量100mgPEG和5mgPEG生物素，以添加到400μLPEG缓冲液中。涡旋溶液30秒，并以最大速度（≥18000 x g）离心1分钟。
注意：此步骤对时间敏感，因为 SVA NHS-酯水解立即开始，在 pH 8.0 下半衰期为 34 分钟，在 pH 8.4 时半衰期较短。
- 将PEG（聚乙二醇）和PEG-生物素解冻至室温约30分钟。
- PEG 孵育和盖玻片储存
- 设置湿度室并将盖玻片放在里面。
- 将90μLPE溶液加入湿度室中的盖玻片中，并使用盖玻片保持镊子将第二个盖玻片放在PEG溶液的顶部，以均匀地铺展PEG溶液。
- 确保溶液中没有气泡掉落到盖玻片上。在第一个盖玻片上降低第二个盖玻片的一端，然后慢慢放下另一端，这样就不会有气泡夹在盖玻片之间。
注意：气泡会导致某些区域的 PEGylate 不良。 - 重复此步骤，直到所有盖玻片都有PEG（即，8个盖玻片= 4个PEG三明治）。将PEG溶液在室温下在黑暗的湿度室中孵育过夜（约12小时）16。
- 将盖玻片对分开，放入染色罐中。请注意 PEGylated 的侧面。
- 用超纯水彻底冲洗盖玻片，并用N2干燥。
注：用镊子握住盖玻片，将N2 吹过表面朝镊子吹去，以防止污染物干燥到表面上。 - 使用永久记号笔或钻石笔在角落处用圆点标记非 PEGylated 的一面。
- 将2个PEGylated盖玻片放在邮件管中，PEGylated侧面彼此相对，以帮助在使用前识别PEGylate的一面。
- 真空管5分钟，并用N2回填。用钢筋密封管子。
- 将PE包覆盖玻片在-20°C的密封邮件管中储存长达6个月。
注：在组装芯片之前，将存储管加热到RT。密封过程中盖玻片上的冷凝会导致泄漏。
3. 流室制备
- 芯片组装
- 用剃须刀片在双面胶带的两面薄薄地铺上少量环氧树脂。
注：在组装过程中，过多的环氧树脂可能会扩散到通道中。 - 激光切割环氧树脂涂层胶带以创建 4 个通道。通过将环氧胶带夹在4孔滑块和PEG盖玻片之间来创建流动芯片（图1A）。
- 使用移液器吸头，沿通道长度轻轻施加压力，以形成良好的密封性。固化环氧树脂≥1小时。
注意：不要剪切玻璃，以免在环氧树脂上滑动。
- 用剃须刀片在双面胶带的两面薄薄地铺上少量环氧树脂。
- 腔室组装
- 对齐芯片，使每个通道的开口位于适配器的中心（图1A）。将两个透明的丙烯酸垫片放在芯片顶部，在块的中间施加用力，并在每个垫片的末端拧入两个4-40螺钉。
注：请勿用力拧紧螺钉或用力按压垫片，否则芯片可能会破裂。 - 在支架的另一侧，将入口拧入螺纹孔中。通过透明丙烯酸块监控密封状况。
- 当卡套管与切屑开口接触时，通过顺时针方向轻轻扭转卡套管来密封连接。
注：过度拧紧的入口可能会导致流量堵塞，而松动的触点会导致泄漏。
- 对齐芯片，使每个通道的开口位于适配器的中心（图1A）。将两个透明的丙烯酸垫片放在芯片顶部，在块的中间施加用力，并在每个垫片的末端拧入两个4-40螺钉。
4. 表面处理
注：有关整个工作流程，请参阅 图 1B 。
- 阻断剂可防止非特异性结合
- 使用移液器将200μL洗涤缓冲液（10mM Tris，50mM NaCl，5mM MgCl2 和2mM CaCl2，0.05%吐温20）流入腔室以检查泄漏。如果在通道中形成气泡，请积极推动另外200μL以除去气泡。
注意：在此步骤中未去除的大气泡可能会在以后脱落并破坏表面功能化。 - 向流动室中加入40μLBSA（1%w / v）以防止非特异性结合并孵育10分钟。
- 确保在每个孵育期间添加足够的体积，以填充流动室并在入口和出口处形成液滴。相应地调整孵育量，并在湿度室中执行所有孵育。
- 向流动室中加入40μL吐温20（5%v / v）。孵育10分钟，以进一步减少非特异性结合。
- （可选）通过使聚苯乙烯珠流过通道来检查表面是否有足够的钝化。加入40μLProtG包被的聚苯乙烯珠（0.01%w / v），并使用具有10倍物镜的暗场显微镜成像。如果珠子不粘附在表面上，请继续执行下一步。
- 用200μL洗涤缓冲液洗涤通道，以除去所有钝化剂。
- 使用移液器将200μL洗涤缓冲液（10mM Tris，50mM NaCl，5mM MgCl2 和2mM CaCl2，0.05%吐温20）流入腔室以检查泄漏。如果在通道中形成气泡，请积极推动另外200μL以除去气泡。
- 腔室表面功能化
- 向流动室中加入40μL链霉亲和素（100μg/ mL）并孵育20分钟。然后，用200μL洗涤缓冲液洗涤。
- 将40μL杂交的ProtG-TGT（100nM）加入流动室并孵育20分钟。然后，用200μL洗涤缓冲液洗涤。
- 加入40μLProtG-TGT顶链（100nM）20分钟，以完成表面上任何未混合的TGT底链。用200μL洗涤缓冲液洗涤。
- 向流动室中加入40μLP选择素-Fc（10μg/ mL）并孵育60分钟。然后，用200μL洗涤缓冲液洗涤。
注意：孵育持续时间至关重要。
5. 实验和成像
- 流量系统设置
- 用滚动缓冲液填充5 mL玻璃注射器（HBSS与2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM HEPES，0.1%BSA）。确保注射器中没有气泡，方法是轻敲注射器的侧面以移开气泡，并在气泡漂浮向尖端时将其推出。
- 将无菌针头（26 G，5/8英寸长）插入~200 mm聚乙烯管中（内径：0.38 mm;外径：1.09毫米），并将针头连接到玻璃注射器。
注：确保没有空气滞留在针接头的任何位置。 - 将注射器固定在注射器泵上，并倾斜注射器泵，使柱塞侧升高以防止气泡进入通道。将管子的末端插入流室入口。
注意：在进行连接时，通过将液滴沉积到入口处并在注射器管的末端有液滴来确保液与液体接触。在将注射器插入入口之前，允许在注射器管的末端形成一小滴，确保没有气泡进入通道。 - 将另一端200毫米聚乙烯管的一端插入出口，另一端浸没在废烧杯中。
- 设置细胞滚动
- 在IMDM培养基中，在25 cm 2 通风培养瓶中培养HL-60细胞，在37°C下补充20%胎牛血清和1%抗生素，5%CO 2。将细胞密度保持在1 x 105-2×106 个细胞/ mL之间。
- （可选）将HL-60细胞分化在含有1.25%DMSO的完整IMDM培养基中，初始密度为2×105 个细胞/ mL。孵育细胞最活跃5-6天。
- 从细胞悬浮液中取样（1-2mL）并离心（200× g，3分钟）以沉淀细胞。
- 取出培养基并将细胞轻轻重悬于500μL滚动缓冲液中。重复洗涤步骤两次以除去细胞碎片。
- 用血细胞计数器测量细胞密度。用滚动缓冲液重悬细胞沉淀至2×105 个细胞/ mL的密度。
- 小心地断开管道与入口/出口的连接，并将40μL细胞悬浮液移入流动室。如前所述重新连接管道，确保没有气泡引入流道。
- 通过以所需的流速启动注射器泵来开始细胞滚动实验。
注：荧光轨迹的强度取决于剪切应力，较低的细胞速度剪切应力/细胞速度通常会产生较暗的轨迹（图4A）。避免表面上的高细胞密度或过度的滚动持续时间，以确保可分离的单细胞轨道（图4B，C）。 - 使用具有10倍物镜的暗场显微镜来确保观察到细胞滚动。
- 实验完成后，通过以100 mL / h注入滚动缓冲液直到表面无细胞，将细胞从通道中取出。
- 通过"基于DNA的点积累用于纳米级地形成像"（DNA-PAINT）对局部轨迹进行成像
- 将DNA-PAINT缓冲液中的40μLDNA-PAINT成像链（500 pM）（0.05%吐温-20，5mM Tris，75mM MgCl2，1mM EDTA）加入通道。
- 使用100x油浸式TIRF物镜执行全内反射荧光（TIRF）显微镜检查。使用电子倍增电荷耦合器件 （EMCCD） 相机，以 300 的电子倍增 （EM） 增益，以每帧 25 ms 的曝光时间采集 40000+ 帧。
- 使用Picasso软件包17 按照步骤5.3.4-5.3.5本地化和渲染超分辨率图像（图4D）。
- 将DNA-PAINT电影加载到Localize程序中，以确定每个荧光团在每一帧中的定位。
注意：优化箱体边长和最小净梯度参数，直到仅准确跟踪荧光团。最小净梯度参数通常可以高于100000，以实现最佳跟踪。拟合设置：MLE，集成高斯方法产生最佳结果。最后，如果影片太长，请将其拆分为 10000 帧的堆栈，以便在将影片重新组合到最终的 hdf5 文件之前，Localize 中的预览跟踪能够正常工作。 - 然后，将生成的 hdf5 文件加载到渲染程序中以执行漂移校正和渲染。
注：通过 RCC的Undrift 执行多次漂移校正，以改善最终结果。
- 通过永久标记对长轨迹进行成像
- 加入永久成像器链，在T50M5缓冲液中孵育120秒。通过注入200μL洗涤缓冲液来洗涤通道。
- 在关闭激发激光器的情况下录制图像，以获得背景相机噪声。通过TIRF显微镜对网格图案中的大面积进行成像。
注意：对于后续拼接，建议使用≥10%的帧上重叠。 - 对显微镜进行编程，使其扫描 400 x 50 张图像（总共 20000 张图像）的区域。使用斐济程序，将原始数据拆分为单独的tiff文件，每个文件最多包含10000张图像。
- 按照步骤5.4.5-5.4.7使用照明配置文件（图3A-C）展平所有图像。
- 从每一帧中减去背景相机噪音。获取每个背景减去帧的平均堆栈投影（照明配置文件）。
- 按最大值对照度曲线进行规范化。将每个背景减去的帧除以归一化的照明配置文件。
- 将校正后的帧重新缩放到相应位深度的适当范围。
- 使用 MIST18 拼接图像（图 3D，E）。
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Representative Results
上述方案描述了粘附足迹测定的实验程序。一般的实验工作流程如图 1所示，从流动室组件（图1A）到表面功能化（图1B）以及实验和成像步骤（图1C）。
图2 是ProtG-ssDNA生物偶联表征的代表性结果。在最终偶联之前收集了最终产物中三种组分的紫外/可见光谱，即ProtG，mal-ssDNA和咪唑洗脱缓冲液（图2A），每种组分对应于已知浓度。这些光谱构成了拟合生物共轭产物光谱的正交基础，其中三个未知参数是它们的浓度。MATLAB中的自定义函数用于确定浓度。结果显示ProtG与ssDNA的比例接近1：1（图2A）。这是预期的，因为ssDNA只有一个胺修饰，而ProtG在其C端有一个半胱氨酸工程。这种方法比先前报道的方法19 更有利，该方法使用单个硫醇修饰的DNA靶向ProtG上的多种伯胺，其中偶联比不容易维持。
此外，天然PAGE用于确认生物偶联（图2B）。DNA分别由GelGreen染色，蛋白质分别由Coomassie Blue染色。由于GelGreen比ssDNA更强烈地染色dsDNA，因此预计任何ssDNA条带都会比dsDNA条带的相同摩尔浓度（泳道3，4）更暗。由于储备ProtG含有C端半胱氨酸残基，因此一部分蛋白质通过二硫键形成二聚体，如泳道5所示（图2B）。另一方面，减少的ProtG显示单个频段（通道6）。当直接在DNA偶联中使用原液ProtG时，二硫化物二聚化的ProtG不会对DNA发生反应，并且显示为没有任何GelGreen染色的条带（泳道7，8）。使用还原的ProtG（泳道9，10）在共轭产物中消失ProtG二聚体。由于在偶联过程中使用了过量的不良ssDNA到ProtG（1.5：1），因此在最终的共轭产物（通道8，10）中仅可以看到TGT条带。明亮的GelGreen条带与单体ProtG条带一致，表明成功偶联和良好产量。
图3 说明了具有代表性的原始显微镜图像以及为后续图像拼接和分析进行校正的工作流程。从单模光纤引入的 TIRF 照明曲线在视场中间通常更亮，边缘周围较暗（图 3A、B）。为了补偿不均匀的照明并展平图像以进行定量分析，通过平均数千个单独的帧来确定照明曲线（图3B）。通过从原始和照明曲线中减去相机噪声，然后通过照明曲线进行归一化来生成平坦的图像（图3C）。当图像拼接以形成大图像时，图像拼合的效果得到了清晰的说明。在没有任何细胞轨迹的背景区域中，图像强度显示出与未校正图像相对应的清晰周期性图案（图3D）。从拼接的平面图像拼接的相同视野会产生平面背景（图3E）。具有平坦的背景对于解释沿像元轨迹的强度波动至关重要。作为第一个实验，使用类似于 图3F 所示的斜坡流动曲线来确定适合实验的剪切应力范围，以确保稳定的细胞滚动和清晰的荧光细胞轨迹。 图3G显示了该流动剖面下的典型单单元粘附足迹，其中强度随着剪切应力的增加而增加，直到单元无法再承受高剪切应力下的滚动并与表面分离，从而标志着单轨的末端。
图4 显示了从次优到最佳代表性实验结果的潜在结果。 图4A 显示了荧光轨迹具有低信噪比的次优结果。这可能是由完全共轭探头的低表面密度或低流速引起的。 图4B 说明了另一个次优结果，其中荧光轨迹过于密集，无法解析和分离单个轨迹以供后续分析。 图4C 是一个良好结果的示例，其中单个轨道可以在长距离内解析，并且在背景中清晰。 图4D 是衍射极限TIRF图像（左半部分）与DNA-PAINT成像的相同轨迹（右半部分）进行比较的示例。该装置中的DNA-PAINT产生28.8 nm的NeNA（基于最近邻的分析）精度。
图1：附着足迹测定的实验工作流程。（A） 流通池和流通室的组装。 （二） 表面钝化和功能化。每个孵育步骤都以持续时间为标志，然后是洗涤步骤。 （C） 细胞滚动实验和成像。在表面滚动的细胞将解压缩形成粘附相互作用的DNA，在表面留下ssDNA，标记每个粘附事件的位置。用永久成像仪ssDNA标记表面进行大面积成像，在洗掉之前需要2分钟的染色。对于超分辨率DNA-PAINT成像，成像器链保留在缓冲液中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：生物结合表征。（A） 紫外可见分光度，Ni-NTA纯化的生物偶联产物（蓝色）与曲线拟合（红色）的结合比确定。使用ProtG（洋红色），mal-ssDNA（绿色）和咪唑（灰色）的吸收光谱作为组分，以产生与产品光谱（蓝色）的最佳拟合（红色）。拟合的残留物显示为黑色虚线。这使我们能够确定纯化的生物偶联产物中ProtG和ssDNA的浓度及其摩尔比。 （B） 生物偶联过程中组分的天然页面。第一泳道显示低分子量DNA分子量标准品（25，50，75，100，150，200，250，300，350，500，766 bp）。凝胶图像是假色的，DNA染色为绿色的GelGreen和洋红色的考马斯蓝蛋白染色（反转）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：大面积成像的图像处理和代表性结果。（A） 数以千计的原始TIRF图像平铺在广阔的区域内。 （B） 源自原始图像的照明曲线。 （C） 通过展平照明曲线来校正图像。 （D） 从原始图像拼接拼接图像。不均匀的照明曲线可以看作是图像中的周期性图案。蓝色和红色框表示投影平均强度分布的图像部分（蓝色和红色迹线）。平均强度值（任意单位）表示 8 位图像 （0-255） 的强度值。 （E） 与（D）相同的面积，但使用拼合图像。这些投影不显示任何大规模的周期性模式。 （F） 在实验中使用的剪切应力曲线，以确定导致细胞滚动和产生荧光轨迹的剪切应力范围。 （G） 来自（F）所示流动曲线下的单个细胞的样品荧光轨迹。细胞从左向右移动，荧光强度随着剪切应力的增加而增加，直到细胞无法再维持滚动并从表面分离。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：代表性的次优和最佳结果。（A） 对比度不足的荧光轨迹示例。 （B） 荧光轨迹密度过高的一个例子。 （C） 最佳轨道密度和对比度的实例。所有三幅图像都是在相同的条件下拍摄的，扁平化和拼接。每个图像中的红色框表示拍摄强度投影（右）的区域。 （D） 衍射极限（左半部分）和DNA-PAINT（右半部分）成像中显示的荧光轨迹。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 问题 | 可能的原因 | 溶液 | |
| 环氧胶带切割不当 | 环氧树脂层太厚 | 使用激光器刀片尽可能薄环氧树脂层 | |
| 激光雕刻机功率和速度未优化 | 优化激光雕刻机功率和速度 | ||
| 气泡卡在流动室的侧面 | 初始液体引入不当 | 以高流速推动缓冲溶液通过通道以冲洗气泡 | |
| 气泡通过流动室 | 通过入口和出口引入液体不当 | 确保进气管上有液滴，以确保移液器吸头和进气口之间的液对液接触 | |
| 注射器中的气泡进入流线 | 倾斜注射泵以确保气泡被截留在柱塞端 | ||
| 液体无法进入通道 | 进气口拧得太紧 | 调整以优化密封。正确拧入后，进气管应仅接触通道开口。 | |
| 通道泄漏 | 环氧树脂尚未完全固化 | 重新制作通道，确保使用5分钟的快速固化环氧树脂，并让固化至少1小时 | |
| 进水口密封不当 | 调整以优化密封 | ||
| 细胞卡住 | PEGylation 不良导致非特异性结合 | 理想情况下，重制PEG。此外，可以尝试孵育额外的封闭剂（BSA和吐温-20），并添加封闭剂来洗涤缓冲液。 | |
| 通过通道的大气泡破坏表面钝化 | 确保没有气泡通过通道 | ||
| 细胞问题 | 从冷冻中重新开始细胞培养2周后使用HL-60。确认电池在控制表面上滚动，仅使用P选择素。 | ||
| 细胞不与表面发生或具有稀疏的相互作用 | P-选择素密度过低，这是由于表面功能化不良和/或生物结合不良 | 首先，使用ProtG-生物素代替ProtG-TGT作为对照，以确定问题是由于生物结合还是表面生物素密度引起的。在确保生物偶联质量和表面生物素密度后，增加TGT-ProtG和P-selectin-Fc浓度和孵育时间。 | |
| 细胞滚动但不产生荧光轨迹 | 粘合相互作用太弱而无法破裂 TGT | 在滚动实验过程中增加流速以增加相互作用力。我们建议使用初始斜坡上升流量曲线（图3F），以找到产生稳定滚动和荧光轨迹的最佳流速（图3G） | |
| 表面质量差会导致背景荧光过高，对比度不足，无法看到轨迹 | 检查表面钝化 | ||
表 1：故障排除。该表列出了执行此测定时出现问题的可能原因和解决方案
补充编码文件1：定制编写的MATLAB脚本，用于根据先前收集的三个光谱（ProtG，SMCC链，Ni-NTA珠洗脱缓冲液）分解最终产品光谱，以确定ProtG与ssDNA的共轭效率和比率。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
粘附足迹测定可以可视化细胞滚动粘附过程中PSGL-1和P-选择素之间的分子粘附事件。该过程由P-选择素介导的捕获开始，然后在流体剪切应力下滚动。实验过程中的潜在问题通常涉及细胞滚动不良或缺少荧光轨迹，即使细胞滚动良好。这些问题通常是由于在协议中的关键步骤中进行质量控制而引起的，如故障排除表（表1）中所列。
生物分子和缓冲液需要过滤并储存在4°C以防止污染，因为表面处理涉及多个步骤。高质量的表面钝化是实现适当的表面功能化密度和减少生物分子的非特异性结合的要求。生物分子与表面的非特异性结合可以产生高荧光背景，干扰单分子荧光成像和统计数据分析。多种因素会影响表面钝化。氨基硅烷和PEG-NHS的水解产生的PEGY化效率要低得多。充分的KOH清洗和食人鱼清洗通过在玻璃表面产生游离羟基来增强亲水性，增加化学反应性基团的密度。细胞会卡在钝化不良的表面上。通过使用荧光生物分子测量PEGylation之前和之后的背景荧光强度来检查表面钝化的质量。
配体的表面密度是细胞滚动的关键因素，由PEG控制：PEG-生物素比，TGT杂交和P-选择素结合。在该系统中，PEG：PEG-生物素比例为20：1足以用于表面官能化，并且有足够的P-选择素用于细胞滚动。高效的TGT杂交还提高了荧光轨迹的表面密度和信噪比。该协议包括顶链TGT-ProtG的补充步骤，以确保在实验之前补充任何未混合的TGT底链。DNA与ProtG的偶联也会影响表面密度。Sulfo-SMCC连接子在10倍摩尔过量时加入到DNA中，使所有DNA与连接子反应。 在C末端具有单个半胱氨酸残基（ProtG-Cys）的ProtG用于实现1：1的DNA：ProtG偶联比。由于 ProtG - Cys 可以通过二硫键形成二聚体，因此需要在巯基反应联反应之前处理 TCEP 以降低二硫键。蛋白质偶联DNA和TGT杂交可以通过天然PAGE分析进行验证，其中偶联DNA和DNA双链将显示出由于分子量增加而导致的延迟迁移率。组装效率也可以通过凝胶密度测定法估计（图2B）。仔细的PEGylation和生物结合过程对于产生一致的表面至关重要。有时，细胞状态可能会影响细胞滚动和轨迹形成。虽然PSGL-1在细胞密度上的表达尚未报道，但细胞密度是生长阶段细胞周期和蛋白质表达的有效调节因子。
鉴于PSGL-1还具有信号转导受体的功能并调节细胞增殖20，21，因此维持细胞密度等培养条件，以实现PSGL-1的一致表达水平和结合能力。由ProtG介导的P-selectin-Fc附着在表面上对于细胞的粘附和滚动至关重要。P-选择素与ProtG的结合动力学取决于浓度。较低浓度的P-选择素导致达到平衡的时间增加。对于低于100 nM22的浓度，饱和结合至少需要30分钟。使用10nM的P-选择素来减少与表面的非特异性结合并增加与ProtG充分相互作用的孵育时间。孵育1小时足以诱导细胞粘附和滚动。
TGT及其相应的力依赖性寿命是该测定结果的重要因素。 在滚动粘附过程中，系绳上的力通过TGT和P-选择素传递：PSGL-1相互作用。这些单独的组件中的每一个都具有唯一的力相关寿命，并且根据施加的力，破裂概率将有利于一个而不是另一个。例如，已经证明，当使用本文中描述的TGT时，在低于13.6 pN的力下，P-选择素：PSGL-1主要解离，而高于13.6 pN时，TGT主要解离13。在进行此测定时，了解这一点很重要，因为如果剪切应力太低或磁珠滚动太慢，则破裂事件将主要是P-选择素：PSGL-1相互作用，并且来自TGT的可测量荧光信号将最小或没有。TGT的张力阈值也会影响结果。如果TGT在过高的力下破裂，则破裂事件将主要是P-选择素：PSGL-1，并且将有最小的荧光信号。
这里描述的方法允许分析分子断裂力，以及滚动粘附中涉及的分子粘附事件的位置。这种方法不是实时检测粘附，而是允许实验后成像和分析。一旦粘附足迹以ssDNA的形式留在表面上，如果将流道保持在4°C冰箱中的黑暗湿度室中，并且入口和出口都堵塞以防止干燥，则轨迹仍然可以在12小时后成像。该测定的荧光读数的解释取决于所选的成像方法。通过超分辨率成像，该测定实现了高空间分辨率（<50nm），可以定量分析破裂TGT13的密度。受体密度或TGT破裂密度的分析将有助于研究不同条件下的滚动粘附行为。相反，衍射极限成像不能提供高空间分辨率;然而，它允许对大表面积进行成像，以分析数百个视场中多个磁珠的荧光轨迹。这是有利的，因为可以在很远的距离内分析单个磁珠的轨迹的荧光强度，从而提供有关滚动行为随时间变化的信息。这样的例子是剪切应力随时间的变化，并观察荧光强度的相应变化。 最近，已经表明，通过一个简单的模型，轨迹的荧光强度可以用来估计分子力分布13。还有可能应用比率法来实现该测定的力定量23。
由于细胞滚动发生速度快（10μm/s）和较远的距离（1000μm），因此使用传统的实时分子张力传感器研究其分子张力一直具有挑战性。粘附足迹测定打破了这一苛刻的限制，允许进行事后成像。虽然TGT断裂事件没有直接报告破裂前所经历的张力大小，但在荧光轨迹分析方面已经取得了有希望的发展，以便对滚动粘附所涉及的分子力进行定量研究13，23，24。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大创新基金会（CFI 35492），加拿大自然科学和工程研究委员会发现补助金（RGPIN-2017-04407），研究基金新前沿（NFRFE-2018-00969），迈克尔史密斯健康研究基金会（SCH-2020-0559）和不列颠哥伦比亚大学杰出基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
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