Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

في المختبر فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبيات الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

نحن نصف مقايسة لونية عالية الإنتاجية تقيس نشاط β-galactosidase في ثلاث مراحل دورة حياة من Trypanosoma cruzi ، العامل المسبب لمرض شاغاس. يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد مركبات المثقبيات بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار.

Abstract

المثقبيات كروزي هي العامل المسبب لمرض شاغاس (ChD) ، وهو مرض متوطن له أهمية في مجال الصحة العامة في أمريكا اللاتينية ويؤثر أيضا على العديد من البلدان غير الموبوءة بسبب الزيادة في الهجرة. يصيب هذا المرض ما يقرب من 8 ملايين شخص ، مع حالات جديدة تقدر ب 50،000 حالة سنويا. في 1960s و 70s ، تم إدخال اثنين من الأدوية لعلاج ChD: nifurtimox و benznidazole (BZN). كلاهما فعال في الأطفال حديثي الولادة وخلال المرحلة الحادة من المرض ولكن ليس في المرحلة المزمنة ، ويرتبط استخدامهما بآثار جانبية مهمة. وتؤكد هذه الحقائق الحاجة الملحة إلى تكثيف البحث عن عقاقير جديدة ضد ت. كروزي.

ينتقل T. cruzi من خلال ناقلات الحشرات الدموية من عائلتي Reduviidae و Hemiptera. بمجرد وصوله إلى مضيف الثدييات ، فإنه يتكاثر داخل الخلايا كشكل amastigote غير السوط ويتمايز في trypomastigote ، وهو الشكل المعدي غير التكراري في مجرى الدم. داخل ناقل الحشرات ، تتحول المثقبيات إلى مرحلة epimastigote وتتكاثر من خلال الانشطار الثنائي.

تصف هذه الورقة مقايسة تعتمد على قياس نشاط السيتوبلازم β-galactosidase المنبعث في الثقافة بسبب تحلل الطفيليات باستخدام الركيزة ، الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG). لهذا ، تم نقل سلالة T. cruzi Dm28c مع بلازميد مفرط التعبير عن β-galactosidase واستخدامه في الفحص الدوائي في المختبر في مراحل epimastigote و trypomastigote و amastigote. تصف هذه الورقة أيضا كيفية قياس النشاط الأنزيمي في الظواهر المستزرعة ، وخلايا فيرو المصابة بالأماسيغوت ، والتريبومستيجوت المنبعثة من الخلايا المستزرعة باستخدام الدواء المرجعي ، البنزنيدازول ، كمثال. يتم إجراء هذا الفحص اللوني بسهولة ويمكن تحجيمه إلى تنسيق عالي الإنتاجية وتطبيقه على سلالات T. cruzi الأخرى.

Introduction

مرض شاغاس (ChD) ، أو داء المثقبيات الأمريكي ، هو مرض طفيلي تسببه البروتوزوان السوطية ، Trypanosoma cruzi (T. cruzi). يبدأ ChD بمرحلة حادة بدون أعراض أو قليلة الأعراض لا يتم تشخيصها عادة ، تليها مرحلة مزمنة مدى الحياة. في المزمنة ، ~ 30 ٪ من المرضى يظهرون بعد عقود من العدوى - مجموعة متنوعة من الحالات الموهنة ، بما في ذلك اعتلال عضلة القلب ، ومتلازمات الجهاز الهضمي الضخمة ، أو كليهما ، مع معدل وفيات يتراوح بين 0.2 ٪ إلى 20 ٪ 1،2،3. قد لا يكون لدى المرضى المزمنين الذين لا تظهر عليهم أعراض أي علامات سريرية ولكنهم يظلون إيجابيين مصليا طوال حياتهم.

تشير التقديرات إلى أن حوالي 7 ملايين شخص مصابون في جميع أنحاء العالم ، معظمهم من أمريكا اللاتينية ، حيث يتوطن ChD. وفي هذه البلدان، ينتقل T. cruzi أساسا عن طريق حشرات الترياتومين المصابة بالدم (الانتقال عن طريق النواقل) وأقل تواترا عن طريق الانتقال عن طريق الفم عن طريق تناول الأغذية الملوثة ببراز الترياتومين المحتوي على الطفيليات2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ينتقل الطفيلي عبر المشيمة من الأمهات الشاغاسيات إلى الأطفال حديثي الولادة ، أو من خلال عمليات نقل الدم ، أو أثناء زراعة الأعضاء. وقد ساهمت هذه الطرق المستقلة عن النواقل للحصول على العدوى والهجرة البشرية في انتشار المرض في جميع أنحاء العالم، ويتضح ذلك من خلال عدد متزايد من الحالات في أمريكا الشمالية وأوروبا وبعض البلدان الأفريقية وشرق البحر الأبيض المتوسط وغرب المحيط الهادئ4. ويعتبر مرض الأمراض المزمنة مرضا مهملا لأن انتقال العدوى المنقولة بالنواقل يرتبط ارتباطا وثيقا بالفقر وهو قضية صحية عمومية رئيسية، ولا سيما في بلدان أمريكا اللاتينية المنخفضة الدخل. وعلى الرغم من توافر العلاجات، فإن معدل الوفيات الناجمة عن أمراض الكلى المزمنة في أمريكا اللاتينية هو الأعلى بين الأمراض الطفيلية، بما في ذلك الملاريا2.

هناك نوعان من الأدوية المسجلة لعلاج ChD أدخلت في أواخر 1960s وأوائل 1970s: nifurtimox و benznidazole5. كلا العقارين فعالان في المرحلة الحادة من المرض لدى البالغين والأطفال وحديثي الولادة المصابين خلقيا ، وكذلك في الأطفال المصابين بعدوى مزمنة ، حيث يتم تحقيق الشفاء عادة. ومع ذلك ، يتم تشخيص عدد قليل فقط من الأشخاص في وقت مبكر بما يكفي ليتم علاجهم في الوقت المناسب. وفقا لأحدث التجارب السريرية ، فإن كلا العقارين لهما قيود مهمة لدى البالغين ولم يكونا فعالين في تقليل الأعراض لدى الأشخاص الذين يعانون من أمراض مزمنة. وبالتالي ، فإن استخدامها في هذه المرحلة مثير للجدل. العيوب الأخرى هي فترات العلاج المطولة المطلوبة (60-90 يوما) والآثار الضارة المتكررة والشديدة التي لوحظت ، والتي تؤدي إلى التوقف عن العلاج في نسبة من المصابين 6,7. وتشير التقديرات إلى أن أقل من 10٪ من الأشخاص المصابين بأمراض القلب المزمنة قد تم تشخيصهم، بل إن عددا أقل منهم يمكنهم الحصول على العلاج، حيث يعيش العديد من الأفراد المتضررين في المناطق الريفية دون الحصولعلى الرعاية الصحية أو ندرة الوصول إليها8. تسلط هذه الحقائق الضوء على الحاجة الملحة لإيجاد أدوية جديدة ضد T. cruzi للسماح بعلاجات أكثر كفاءة وأمانا وقابلة للتطبيق في الميدان ، خاصة بالنسبة للمرحلة المزمنة. وفي هذا الصدد، هناك تحد آخر يواجه تطوير مركبات أكثر فعالية يتمثل في الحد من نظم تقييم فعالية الأدوية في المختبر وفي الجسم الحي9.

على الرغم من أن البيولوجيا الكيميائية والنهج الجينومية لتحديد أهداف الأدوية المحتملة قد استخدمت في طفيليات kinetoplastid ، فإن الأدوات الجينومية المتاحة في T. cruzi محدودة على النقيض من T. brucei أو Leishmania. وبالتالي ، فإن فحص المركبات ذات النشاط المبيد للمثقبيات لا يزال هو النهج الأكثر استخداما في البحث عن مرشحات جديدة للعلاج الكيميائي ضد ChD. عادة ، يجب أن يبدأ اكتشاف الدواء في T. cruzi باختبار آثار دواء جديد في فحص في المختبر ضد مرحلة epimastigote. لعقود من الزمان ، كانت الطريقة الوحيدة لقياس التأثيرات المثبطة للمركبات المرشحة على T. cruzi هي العد المجهري اليدوي ، وهو أمر شاق ومستهلك للوقت ويعتمد على المشغل. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج مناسب لفحص عدد صغير من المركبات ولكنه غير مقبول بالنسبة للفحص عالي الإنتاجية للمكتبات المركبة الكبيرة. في الوقت الحاضر ، تبدأ العديد من التحقيقات بتحليل عدد كبير من المركبات من أصول مختلفة يتم فحصها في المختبر ، واختبار قدرتها على تثبيط نمو الطفيليات. تم تطوير كل من طرق قياس الألوان والفلورومترات لزيادة الإنتاجية في هذه الفحوصات ، وتحسين موضوعية الفحص وجعل العملية برمتها أقل مملة9.

تعتمد إحدى طرق قياس الألوان الأكثر استخداما على نشاط β-galactosidase للطفيليات المنقولة التي وصفها Bucknet والمتعاونون معها لأول مرة10. يقوم إنزيم β-galactosidase الذي تعبر عنه الطفيليات المؤتلفة بتحلل الركيزة اللونية ، الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG) ، إلى الكلوروفينول الأحمر ، والذي يمكن قياسه بسهولة بالألوان باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة. وبالتالي ، يمكن تقييم نمو الطفيليات في وجود مجموعة متنوعة من المركبات في وقت واحد وتحديدها كميا في لوحات microtiter. تم تطبيق هذه الطريقة لاختبار الأدوية في أشكال epimastigote (الموجودة في ناقل الحشرات) ، trypomastigotes ، و amastigotes داخل الخلايا ، المراحل الثديية للطفيلي. علاوة على ذلك ، تتوفر بالفعل العديد من سلالات T. cruzi المؤتلفة المنقولة باستخدام بلازميد pBS:CL-Neo-01 / BC-X-10 (pLacZ)10 للتعبير عن إنزيم الإشريكية القولونية β-galactosidase (ويمكن بناء أخرى جديدة) ، مما يسمح بتقييم الطفيليات من وحدات الكتابة المنفصلة المختلفة (DTUs) التي قد لا تتصرف بالتساوي تجاه نفس المركبات10,11,12,13 . وقد استخدمت هذه الطريقة بالفعل بنجاح لتقييم المركبات للنشاط ضد T. cruzi في فحص الإنتاجية المنخفضة والعالية12,13. كما تم استخدام نهج مماثلة في طفيليات أولية أخرى ، بما في ذلك التوكسوبلازما غوندي والليشمانيا المكسيكية14،15.

تصف هذه الورقة وتبين طريقة مفصلة لفحص المخدرات في المختبر ضد جميع مراحل دورة حياة T. cruzi باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase. تم إجراء الفحوصات المعروضة هنا باستخدام خط T. cruzi المعبر عن β-galactosidase الذي تم الحصول عليه عن طريق نقل سلالة T. cruzi Dm28c من DTU I13 مع بلازميد pLacZ (Dm28c / pLacZ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف نفس البروتوكول بسهولة مع السلالات الأخرى لمقارنة الأداء بين المركبات وبين سلالات T. cruzi أو DTUs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يبين الشكل 1 نظرة عامة على التصميم التجريبي بأكمله.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على فحص الفحص في المختبر لخط Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ باستخدام CPRG كركيزة للتفاعل اللوني. يتكون الفحص من بذر الطفيليات (1) ، واحتضانها ب BZN (2 و 3) ، ثم إضافة الركيزة اللونية (4). عندما يتم تحليل الطفيليات ، يتم إطلاق β-galactosidase ويشق CPRG إلى الكلوروفينول الأحمر ؛ يمكن قياس هذا التغير في اللون الطيفية (5). يمكن تحليل البيانات في برنامج التحليل الإحصائي للحصول على التركيز نصف المثبط (IC50) من BZN. الاختصارات: CPRG = الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside; BZN = بنزنيدازول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. إعداد حلول المخزون

  1. إعداد وسائل الإعلام والحلول
    1. محلول الهيمين (الجدول التكميلي S1)
      1. أضف جميع المكونات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل بالترتيب الوارد في الوصفة وقم بتجانس الانعكاس عدة مرات.
      2. تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      3. تحضير 1 مل من الأليكوت في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل والحفاظ عليها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. تريب الكبد تريبتوز (LIT) متوسط (الجدول التكميلي S1)
      1. وزن جميع المكونات وحرك للتجانس في درجة حرارة الغرفة في كوب سعة 1 لتر يحتوي على 700 مل على الأقل من الماء المقطر.
      2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 وارفع الحجم إلى 900 مل في أسطوانة متدرجة سعة 1 لتر بالماء المقطر ؛ تعقيم عن طريق الترشيح أو التعقيم (121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
      3. استكمل الوسط بإضافة 100 مل من مصل العجل الجنيني (FCS) ، (10٪ FCS ، معقم ومعطل حراريا عند 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة) ، 20 مل من محلول الجلوكوز المعقم بنسبة 40٪ (معقم عن طريق الأوتوكلاف ، 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) ، و 5 مل من محلول الهيمين (التركيز النهائي 5 ميكرومتر) إلى 900 مل من وسط LIT.
    3. قم بتحضير وسيط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو من المسحوق باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    4. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (الجدول التكميلي S1)
      1. قم بإذابة جميع المكونات الصلبة عن طريق تحريك المحلول في درجة حرارة الغرفة في كوب سعة 1 لتر.
      2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 ، ومستوى يصل إلى 1 لتر في أسطوانة متدرجة سعة 1 لتر بالماء المقطر ، وتعقيمها عن طريق الترشيح أو التعقيم (121 درجة مئوية ، 20 دقيقة).
  2. بنزنيدازول (BZN) حلول الأسهم والتخفيفات
    ملاحظة: كان نطاق تركيز BZN المستخدم في هذا العمل يتراوح بين 2.5 و80 ميكرومتر.
    1. تحضير محلول مخزون من 1 M BZN عن طريق إذابة 13 ملغ من الدواء في 50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). في ظل الظروف المعقمة، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية من محلول مخزون 1 M BZN هذا بضعف التركيز النهائي المطلوب (2x المحاليل) في حجم نهائي مناسب لعدد الآبار المراد فحصها.
      ملاحظة: حساب 100 ميكرولتر لكل بئر مع زيادة 10-20 ٪. يجب تحضير محلول مخزون BZN وجميع تخفيفات BZN مباشرة قبل الاستخدام في الفحص بسبب انخفاض قابلية ذوبان الدواء في الوسط.
    2. قم بإعداد مخففات BZN 2x من 160 و 80 و 40 و 20 و 10 و 5 ميكرومتر.
      1. قم بتخفيف محلول مخزون 1 M BZN عند تخفيف 100 ضعف (10 ميكرولتر من 1 M BZN + 990 ميكرولتر من الوسط) للحصول على محلول 10 mM في الوسط المناسب المستخدم لكل مرحلة من مراحل دورة حياة T. cruzi. اخلطي باستمرار لتجانس نظام التعليق.
      2. قم بتخفيف محلول BZN 10 mM لإعداد 320 μM BZN في الوسط المناسب: 32 ميكرولتر من 10 mM BZN + 968 μL من المتوسط. اخلطي باستمرار لتجانس نظام التعليق.
      3. تمييع 320 ميكرومتر BZN 2 أضعاف للحصول على تركيز 160 ميكرومتر (500 ميكرولتر من 320 ميكرومتر BZN + 500 ميكرولتر من المتوسط). اخلطي باستمرار لتجانس نظام التعليق. كرر هذا التخفيف 2 أضعاف مع كل محلول ناتج للحصول على حلول 80 و 40 و 20 و 10 و 5 ميكرومتر.
      4. قم بتخفيف DMSO 1000 ضعف في الوسط المناسب للاستخدام كعنصر تحكم غير معالج (100٪ للتحكم في البقاء على قيد الحياة).
        ملاحظة: تتحمل Epimastigotes تخفيفا يصل إلى 100 ضعف من DMSO ، في حين أن خلايا Vero تتحمل فقط ما يصل إلى 1000 ضعف تخفيف DMSO. إذا لزم الأمر ، يمكن تضمين التحكم في الموت بنسبة 50٪ DMSO كحالة بقاء 0٪.
  3. حل الركيزة
    1. قم بإذابة CPRG بتركيز 1 ملليمتر في الماء المقطر. للحصول على طبق من 96 بئرا ، أضف 2.4 ملغ من CPRG إلى 4 مل من الماء.
      ملاحظة: يجب إعداد حل CPRG مباشرة قبل الفحص.
  4. حل التحلل
    1. تحضير محلول v/v بنسبة 2.5٪ من المنظفات غير الأيونية غير المؤمنة 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy] الإيثانول (انظر جدول المواد) في 1x PBS. تحضير 1 مل من المحلول لكل لوحة 96 بئر مباشرة قبل الفحص.

2. إعداد ثقافة الطفيليات

  1. إعداد epimastigote
    ملاحظة: يستخدم السطر13 من T. cruzi Dm28c/pLacZ في جميع أجزاء هذا التقرير.
    1. تنمو β-galactosidase المعبرة عن T . cruzi epimastigotes محوريا عند 28 درجة مئوية في قوارير زراعة الخلايا مع مساحة نمو 25 سم2 (قوارير T-25). الحفاظ على الثقافات في مرحلة السجل عن طريق الزراعة الفرعية كل 48-72 ساعة (في 5 مل) في وسط LIT مع استكمال 10٪ FCS (الجدول التكميلي S1) وكبريتات geneticin (G418) بتركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام / مل. حدد نمو الطفيليات عن طريق عد الخلايا في غرفة نيوباور قبل الزراعة الفرعية. أغلق الغطاء بإحكام واحتفظ بقارورة الثقافة (غير المهواة) عند 28 درجة مئوية في وضع رأسي.
      ملاحظة: يضمن G418 اختيار بلازميد pLacZ وصيانته. تحتوي مزارع مرحلة السجل على تركيز فوق سطح البحر من 1-5 × 107 طفيليات / مل لخط Dm28c / pLacZ.
    2. قم بإعداد تعليق 2 × 105 epimastigotes / mL من ثقافة مرحلة السجل في LIT المكملة بالمضادات الحيوية G418. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من التعليق فوق الظاهري لكل بئر (20000 epimastigotes في 100 ميكرولتر من LIT) من صفيحة صغيرة من 96 بئرا وشكل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر لكل بئر مع الوسط.
  2. إعداد أمستيغوت
    1. استخدم المثقبيات الحلقية العفوية التي تم الحصول عليها من ثقافة epimastigote القديمة (لمدة 7 أيام في هذا البروتوكول) لإجراء عدوى أولية في قارورة T-25 مع 2 × 105 خلايا Vero التي تم زرعها سابقا في DMEM مع 2٪ FCS.
      1. عد عدد المثقبيات الحلقية في غرفة نيوباور ، وأصاب الطبقة الأحادية لخلية فيرو بتعدد العدوى (MOI) من 10 في 5 مل من DMEM مع 2 ٪ FCS ، وحضانة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 لمدة 16 ساعة. اغسل المثقبيات المتبقية عن طريق إزالة الوسط من القارورة باستخدام ماصة معقمة سعة 5 مل ، ثم أضف 5 مل من 1x PBS والشفط. أخيرا ، أضف 5 مل من DMEM مع 2٪ FCS واحتضنها في ظل نفس الظروف.
      2. استخدم المثقبيات الخارجة من الطبقة الأحادية لخلية فيرو المصابة للحفاظ على العدوى في قوارير T-25 مع 2 × 105 خلايا فيرو في DMEM مع 2٪ FCS ، وتوليد زجاجة مصابة جديدة كل أسبوع.
        ملاحظة: بعد 5-7 أيام ، تبدأ المثقبيات في الظهور وتكون مرئية في supernatant. لا تقم بإضافة G418 إلى المثقبيات المستخدمة لإصابة الخلايا أو الخلايا المصابة ، لأن خط خلايا Vero لا يقاوم G418.
    2. قم بإعداد تعليق 1 × 105 خلايا Vero / mL في DMEM مكملة ب 2٪ FCS وبذور 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في لوحات زراعة الأنسجة 96 بئرا (10000 خلية لكل بئر). احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لضمان التصاق الخلايا بقاع الآبار.
    3. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، شطف الطبقة الأحادية الخلية Vero ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر من 1x PBS المعقمة. أضف T. cruzi Dm28c / pLacZ trypomastigotes (تم الحصول عليها من عدوى سابقة في قارورة T-25 ، الخطوة 2.2.1) في MOI من 10 في 100 ميكرولتر من DMEM مكملة بنسبة 2٪ FCS لكل بئر (100000 trypomastigotes لكل بئر).
    4. احتضن الألواح لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد فترة الحضانة هذه ، اغسل الألواح مرتين باستخدام 1x PBS ، وأضف 100 ميكرولتر من DMEM بدون أحمر الفينول مع 2٪ FCS.
      ملاحظة: بعد 48 ساعة (2 أيام بعد الإصابة) ، تكون amastigotes داخل السيتوبلازم مرئية باستخدام المجهر البصري. الفينول الأحمر ، وهو مؤشر الأس الهيدروجيني في DMEM وغيرها من وسائط زراعة الخلايا ، يمكن أن تتداخل مع قياس امتصاص CPRG. إذا لم يكن DMEM بدون أحمر الفينول متاحا ، فراجع البدائل المذكورة أدناه في القسم 3.2.1.
  3. إعداد تريبومستيجوت
    1. قم بإعداد تعليق 1 × 106 خلايا Vero / mL في DMEM مكملة بنسبة 2٪ FCS وخلايا البذور 800,000 في 5 مل من الوسط في قوارير T-25. احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لضمان الالتصاق الخلايا.
      ملاحظة: بالنسبة لقارورة T-75 ، × البذور 2 106 خلايا في حجم نهائي يبلغ 15 مل.
    2. بعد الحضانة ، شطف مرتين مع 3 مل من 1x PBS معقمة. أضف T . cruzi Dm28c / pLacZ trypomastigotes في MOI من 10 في 5 مل من DMEM مع 2٪ FCS (8 × 106 trypomastigotes لقارورة T-25).
      ملاحظة: بالنسبة لقارورة T-75 ، أضف 20 × 106 trypomastigotes في حجم نهائي من 15 مل من DMEM مع 2٪ FCS.
    3. احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. اغسل القارورة مرتين مع 3 مل من 1x PBS ، وأضف 5 مل من DMEM الطازج مع 2٪ FCS. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة أربعة أيام.
    4. تحقق من supernatant بحثا عن المثقبيات تحت المجهر البصري. حدد كميا المريبوماستيغوتات عن طريق عدها في غرفة نيوباور. اجمع المادة الفائقة في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 7000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات للحصول على تركيز 1 × 106 trypomastigotes / mL في DMEM دون الفينول الأحمر المكمل ب 2٪ FCS. البذور 100 ميكرولتر من تعليق المثقبيات (100000 تريبوماستيجوت لكل بئر) في صفيحة من 96 بئرا.
      ملاحظة: إذا لم يكن DMEM بدون أحمر الفينول متوفرا ، فراجع البدائل أدناه في القسم 3.2.1.

3. β-غالاكتوزيداز

ملاحظة: يستخدم القياس الكمي لنشاط β-galactosidase كوسيلة غير مباشرة لتحديد عدد الطفيليات. من المتوقع أن يتم تثبيط النمو في وجود مركب مبيد للمثقبيات ، مما يؤدي إلى انخفاض عدد الطفيليات مقارنة بالتحكم غير المعالج ، والذي سينعكس في انخفاض نشاط β-galactosidase وبالتالي انخفاض الامتصاص.

  1. احتضان الطفيليات مع BZN.
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول BZN 2x المقابل لكل بئر للوصول إلى تركيز نهائي من BZN من 80 و 40 و 20 و 10 و 5 و 2.5 ميكرومتر إلى 100 ميكرولتر من تعليق epimastigote (من الخطوة 2.1) أو خلايا Vero ذات amastigotes (يومان بعد الإصابة) (الخطوة 2.2) أو trypomastigotes (الخطوة 2.3) في صفيحة 96 بئرا.
    2. احتضان epimastigotes عند 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، و trypomastigotes أو خلايا Vero المصابة مع amastigotes لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2.
      ملاحظة: ينبغي تقييم كل تركيز من العقاقير على الأقل في ثلاثة أضعاف وأن يشمل ثقافات مراقبة للظهارة والمثقبيات وخلايا فيرو المصابة ب DMSO (انظر الخطوة 1-2-2-4).
  2. التفاعل اللوني
    1. بعد فترة حضانة العلاج ، إذا كانت خلايا Vero المصابة أو trypomastigotes موجودة في DMEM مع الفينول الأحمر ، فاستبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من 1x PBS لتجنب التدخل. قم بإجراء آبار فارغة ثلاثية الأبعاد تحتوي على 100 ميكرولتر فقط من الوسط المقابل (أو 1x PBS حسب الاقتضاء).
      ملاحظة: ليس من الضروري إزالة الوسط الاستزراعي للظهارة في حالة وسط LIT أو DMEM بدون أحمر الفينول. DMEM مع الفينول الأحمر لا يزال من الممكن استخدامها. قم بإعداد بئر فارغ باستخدام DMEM وحده لقياس امتصاص القاعدة ثم طرح هذه القيمة أثناء تحليل البيانات (الخطوة 3.3). يعد وسط الحشرات في شنايدر ، عديم اللون ، بديلا للظهارة.
    2. أضف 40 ميكرولتر من محلول الركيزة CPRG و 10 ميكرولتر من محلول المنظفات إلى كل بئر ، والحصول على تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر CPRG و 0.1٪ منظف في حجم نهائي قدره 250 ميكرولتر في كل بئر.
      ملاحظة: يمكن إضافة محلول CPRG والمنظفات معا في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وقياس الامتصاص عند 595 نانومتر في مطياف ميكروبليت.
      ملاحظة: التغيير المتوقع في اللون هو الأصفر إلى البني المحمر عند الانقسام الأنزيمي β-galactosidase (الشكل 2A). يمكن تمديد وقت الحضانة حتى 4 ساعات ، ويمكن قراءة أطياف امتصاص الكلوروفينول الأحمر بين 570 و 595 نانومتر مع تركيبات منحنية مماثلة (الشكل التكميلي S1A ، B). أظهرت الحضانة لمدة تصل إلى 24 ساعة في وجود ركيزة CPRG تركيبات منحنية مماثلة (الشكل التكميلي S1C).
      1. في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة مع محدد أحادي اللون ، قم بإنشاء بروتوكول جديد في برنامج المعدات (الشكل التكميلي S2).
      2. انقر فوق الامتصاص كطريقة للكشف | نقطة النهاية كنوع قراءة | موافق (الشكل التكميلي S2A). أضف خطوة قراءة، واكتب الطول الموجي المحدد، وانقر فوق موافق (الشكل التكميلي S2B).
      3. في قسم تخطيط اللوحة، ضع علامة على الآبار المراد قراءتها وانقر فوق موافق (الشكل التكميلي S2C). لقراءة اللوحة، أدخلها في الدرج وانقر على قراءة اللوحة. انتظر حتى تظهر القيم على الشاشة (الشكل التكميلي S2D) وقم بتصديرها إلى جدول بيانات لتحليل النتائج.
  3. تحليل البيانات وحساب تركيز مثبطات الوسائط (IC50)
    1. اطرح القيمة المقاسة الفارغة ، المقابلة لوسيط LIT فقط ، أو 1x PBS ، أو DMEM مع أو بدون أحمر الفينول بالإضافة إلى محلول منظف CPRG. عند اختبار نشاط المبيد للمثقبيات للمركبات الملونة ، قم بقياس امتصاص عناصر التحكم الفارغة الإضافية باستخدام LIT أو DMEM مع كل تركيز من المخدرات المستخدمة ثم اطرح تلك القيم من قيم الامتصاص التي تم الحصول عليها مع الطفيليات في كل تركيز.
      ملاحظة: يوضح الجدول التكميلي S2 القيم النموذجية التي تم الحصول عليها في هذا الفحص باستخدام هذه الوسائط بدون طفيليات بالإضافة إلى محلول منظف CPRG. الاختلافات قبل وبعد إضافة CPRG كبيرة ولكنها لا تتداخل مع الفحص مع الطفيليات (الجدول التكميلي S2).
    2. في برنامج التحليل الإحصائي ، ارسم تركيز BZN (بالميكرومتر) مقابل الامتصاص عند 595 نانومتر في جدول xy. قم بتحويل تركيزات BZN إلى قيم لوغاريتمية بالنقر فوق الزر تحليل، وتحديد خيار التحويل | تحويل قيم x باستخدام خيار x=log(x)، والنقر فوق الزر موافق.
    3. احصل على قيم IC50 من برنامج التحليل الإحصائي.
      ملاحظة: يعرف IC 50 بأنه تركيز الدواء الذي يقلل من نمو الطفيليات بنسبة50 ٪ مقارنة بالتحكم غير المعالج ويتم حسابه كنقطة انعطاف للدالة السينية التي تناسب المنحنى.
      1. في برنامج التحليل الإحصائي ، انقر فوق الزر تحليل ، وحدد الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) في قائمة تحليل xy ، وانقر فوق موافق.
      2. في علامة تبويب النموذج في نافذة المعلمات ، في مجموعة الجرعة - الاستجابة - التثبيط من المعادلات المضمنة ، حدد الخيار طريقة الاستجابة للجرعة: log (المثبط) مقابل الاستجابة - المنحدر المتغير (أربعة معلمات). اترك جميع علامات التبويب الأخرى عند القيم الافتراضية ؛ انقر فوق موافق.
      3. انقر على قسم النتائج في برنامج التحليل الإحصائي للعثور على قيمة IC50 و SD وجودة الملائمة.
      4. انقر على قسم الرسم البياني للعثور على الرسم البياني xy للتركيز اللوغاريتمي للدواء مقابل قيم الامتصاص. ابحث عن ملاءمة المنحنى أيضا بلون مختلف.
        ملاحظة: يمكن العثور على أداة حساب IC50 مجانية عبر الإنترنت في https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وعملا بالبروتوكول الموصوف أعلاه، تم احتضان الظواهر المعبرة Dm28c المعبرة عن β-galactosidase ب 6 تركيزات من BZN (2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 ميكرومتر) (أو مركبات ذات أهمية) لمدة 72 ساعة. بعد هذه الفترة ، تمت إضافة كاشف CPRG جنبا إلى جنب مع المنظفات ، التي تحلل الخلايا وتطلق β-galactosidase. يتم شق CPRG بواسطة β-galactosidase لإنتاج الكلوروفينول الأحمر ، مما يؤدي إلى تغيير في اللون من الأصفر إلى المحمر (الشكل 2A). تم قياس الكلوروفينول الأحمر عن طريق قراءة الامتصاص عند 595 نانومتر في قارئ الصفائح الدقيقة بعد 2 ساعة. تم رسم جدول XY مع التركيزات اللوغاريتمية ل BZN مقابل الامتصاص عند 595 نانومتر. تم تركيب المؤامرة باستخدام الانحدار غير الخطي (الشكل 2B). في هذه التجربة بالذات ، كان IC 50 الذي تم الحصول عليه لل epimastigotes20.59 ± 1.075 ميكرومتر ، على غرار ذلك الذي تم الحصول عليه من الأدبيات (الجدول الأول) 16,17. تم وصف النتائج التمثيلية باستخدام هذه الطريقة للمريبوماستيغوت والأمستيجوتات سابقا13.

Figure 2
الشكل 2: حساب قيمة IC50 للبنزنيدازول لشكل epimastigote Dm28c. (أ) صفيحة من 96 بئرا مع epimastigotes تعامل بتركيزات BZN مختلفة (2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 ميكرومتر) قبل إضافة CPRG (1) ، وبعد الإضافة الأولية ل CPRG والمنظفات (2) ، وبعد الحضانة باستخدام CPRG والمنظفات التي تظهر تغير اللون (3). (ب) مخطط XY للتركيزات اللوغاريتمية ل BZN مقابل الامتصاص (OD) عند 595 نانومتر للظواهر Dm28c/pLacZ. تم تركيب قطعة الأرض باستخدام الانحدار غير الخطي لتقدير قيمة IC50 . تمثل كل قيمة المتوسط والانحراف المعياري (أشرطة الخطأ) ل 6 نسخ بيولوجية مستقلة. يمثل الخط الأزرق المستمر ملاءمة المنحنى. الاختصارات: CPRG = الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside; BZN = بنزنيدازول; OD = الكثافة البصرية; C = التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

BZN IC50 (μM) محسوبة باستخدام Dm28c معبرا عن β-galactosidase BZN IC50 (μM) المبلغ عنها في الأدبيات
Epimastigotes 17.08 إلى 20.59 11 إلى 18.72
أماستيغوتيس 2.31 إلى 3.92 1.66 إلى 4.39
Trypomastigotes 27.07 إلى 44.74 24.68 إلى 50.72

الجدول 1: نطاق قيم IC 50 التي تم الحصول عليها للظواهر و trypomastigotes و amastigotes باستخدام هذا البروتوكول مقارنة ب IC50 المبلغ عنها في الأدبيات17,18.

الشكل التكميلي S1: إعداد برنامج قارئ الصفائح الدقيقة لامتصاص القراءة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: قياسات نشاط β-galactosidase (الكثافة البصرية عند 570 إلى 595 نانومتر) باستخدام epimastigotes من خط Dm28c/pLacZ من Trypanosoma cruzi بعد الحضانة مع CPRG في نقاط زمنية مختلفة. يتم التعبير عن القيم كمتوسط وانحراف معياري لثلاث نسخ متماثلة مستقلة. تمثل الخطوط المستمرة الملونة ملاءمة المنحنى. (أ) الحضانة مع 200 ميكرومتر CPRG لمدة 2 ساعة (B) الحضانة مع 200 ميكرومتر CPRG لمدة 4 ساعات (C) تمثيل نشاط β-galactosidase (الكثافة البصرية عند 570 نانومتر) في نقاط زمنية مختلفة (2 و 4 و 24 ساعة). اختصار: CPRG = الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: تكوين وإعداد LIT المتوسطة ، الهيمين ، و PBS. الاختصارات: LIT = تريب الكبد تريبتوز; PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S2: قراءات الامتصاص لوسائط LIT و DMEM بدون طفيليات. يتم التعبير عن القيم على أنها ثلاثة أضعاف كل وسيط. يحتوي صف الوسائط على القيمة المتوسطة للنسخ المتماثلة الثلاثة؛ ويحتوي صف SD على قيم الانحراف المعياري للنسخ المتماثلة. الاختصارات: SD = الانحراف المعياري; LIT = تريببوز تسريب الكبد. DMEM = وسط النسر المعدل من دولبيكو. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الورقة فحصا يعتمد على تحديد نشاط β-galactosidase السيتوبلازمي الذي تم إطلاقه بسبب التحلل الغشائي ل T. cruzi epimastigotes أو trypomastigotes أو الخلايا المصابة ب amastigotes في وجود CPRG الركيزة. استخدمنا طفيليات T. cruzi Dm28c / pLacZ ، وهي سلالة طفيليات مستقرة تم الحصول عليها بعد النقل باستخدام بلازميد حامل β غالاكتوزيداز تم بناؤه بواسطة Buckner والمؤلفين المشاركين10. تم استخدام هذا الفحص للبحث عن المركبات المضادة للمثقبيات 12،19،20،21. تم استخدام سلالة T. cruzi Dm28c / pLacZ لتحسين بروتوكول الفحص. وكما هو موجز في الشكل 1، يتضمن هذا البروتوكول أربع نقاط رئيسية؛ الأول هو البذر الطفيلي في لوحات 96 بئر. يتم حساب Epimastigotes و trypomastigotes والبذور من التعليق. في حالة amastigotes ، أولا خلايا فيرو البذور لتشكيل طبقة أحادية الالتصاق ثم تصيب مع trypomastigotes. توجد الأماسيغوت داخل الخلايا بعد 48 ساعة. ثانيا ، قم بإعداد تخفيفات الدواء ليتم اختباره بالتركيزات المطلوبة واحتضانه مع الطفيليات. وأخيرا ، تتضمن الخطوة الثالثة إضافة CPRG والمنظفات لتحليل الخلايا. يتم شق CPRG عند إطلاق β-galactosidase من السيتوبلازم الطفيلي ، ويتم توليد الكلوروفينول الأحمر وقياسه طيفا. تتضمن الخطوة الحرجة الرابعة تحليل البيانات ، وبناء الرسوم البيانية x-y ، وتركيب المنحنى الذي تم الحصول عليه لحساب قيم IC50 للأدوية ذات الاهتمام.

الفحص في المختبر لجميع مراحل دورة حياة T. cruzi هو الخطوة الأولية في دراسة آثار دواء جديد محتمل. في هذه الفحوصات، يتم تقييم الآثار عن طريق العد المجهري، وهو إجراء ذاتي مكلف زمنيا يصعب أتمتته. يمكن أن يؤدي استبدال هذه التقنية بفحص قياس الألوان إلى تحسين موضوعية الفحص ، مما يجعله أقل استهلاكا للوقت. تستغرق قراءة الصفائح اللونية بضع دقائق فقط ، على عكس الساعات اللازمة للعد المجهري اليدوي المكثف العمالة ، وتسهل فحص المكتبات الكبيرة للمركبات الجديدة ذات القيمة العلاجية المحتملة. فيما يتعلق بالتشابه العام للطفيليات المعبرة عن β-galactosidase (Dm28c / pLacZ) مقارنة بسلالة Dm28c من النوع البري ، قررنا أن الطفيليات كانت طبيعية من الناحية المورفولوجية ، مع معدلات نمو مماثلة ومتمايزة بالتساوي داخل أشكال دورة الحياة. وعلاوة على ذلك، فإن نتائج اختبار المخدرات التي تم الحصول عليها مقارنة بين النوع البري Dm28c وخط Dm28c/pLacZ الذي تم تحديده كميا بالعد المجهري لم تظهر أي اختلافات كبيرة13.

أحد قيود هذا البروتوكول هو أن وسائط الثقافة الملونة يمكن أن تتداخل مع الامتصاص المقاس. يوصى باستخدام DMEM (أو RPMI) بدون أحمر الفينول للتغلب على هذا القيد. تم استخدام بئر فارغ مع DMEM بنجاح كقيمة امتصاص قاعدية في هذا البروتوكول. هناك قيد آخر هو التداخل المفترض عند استخدام الأدوية الملونة ، والذي يمكن التغلب عليه باستخدام الوسائط مع المركب كفارغ أو عن طريق اختيار الطول الموجي للامتصاص بين 570 و 595 نانومتر لإعطاء أدنى تداخل. لا يتم تغيير CPRG من خلال وجود دواء معين (ملون أم لا) ، مما يجعل هذا الفحص قويا للغاية. عند استخدام الوسائط ذات الأدوية الحمراء أو الملونة بالفينول ، من الأهمية بمكان إجراء ضوابط فارغة لكل حالة ثم طرح قيمة الامتصاص التي تم الحصول عليها من القياسات مع الطفيليات لتجنب أي تدخل.

تركيز محلول CPRG المبلغ عنه ل T. cruzi trypomastigotes و Toxoplasma gondii هو 100 ميكرومتر10,15. ومع ذلك ، فإن التركيز الأمثل المبلغ عنه للظهارة هو 200 ميكرومتر11. في خط Dm28c / pLacZ هذا ، تم استخدام محلول CPRG 200 μM ل epimastigotes و trypomastigotes و amastigotes مع نتائج موثوقة. فيما يتعلق بأوقات حضانة CPRG ، تم تحقيق أفضل تركيب منحنى عندما تم احتضان epimastigotes بمحلول الركيزة لمدة 2 ساعة (R2 = 0.9995). ومع ذلك ، كان R 2 مشابها جدا (R 2 = 0.9994) ، وكان نشاط β-galactosidase خطيا في نطاق 6,250-200,000 epimastigotes لكل بئر (أي 62,500-2,000,000 epimastigotes / mL) في 4 h (الشكل التكميلي S2). تم الإبلاغ عن نطاق خطي يتراوح بين 3,150-100,000 تريبوماستيجوت لكل بئر (أي 31,500-1,000,000 تريبومستيجوت/مل) للمريبوماستيغوتس13. لتجنب ملاحظة الانحرافات المعيارية الكبيرة ، من المهم زرع الكمية الصحيحة من الطفيليات في كل بئر. نظرا لأن الأحجام صغيرة ، من المهم أن تكون متسقا عند حساب الطفيليات قبل البذر. علاوة على ذلك ، يمكن قياس أكثر من ثلاثة نسخ متماثلة لكل حالة تجريبية إذا لزم الأمر.

على عكس فحوصات الفحص اللوني الأخرى22 ، فإن خطوات المعالجة اللاحقة ليست ضرورية هنا ، مما يزيد من قابلية التكرار وموثوقية الفحص بالإضافة إلى سرعة جمع البيانات. هذا فحص سهل وسريع وموثوق به مناسب لفحص الأدوية عالية الإنتاجية للمركبات المرشحة لعلاج ChD ويمكن تطبيقه على سلالات T. cruzi الأخرى. يتوفر بلازميد pLacZ عند الطلب من مختبر Bucker ويمكن استخدامه لنقل سلالات مقاومة ، على سبيل المثال ، خطوط خروج المغلوب لتقييم حساسية الخط للأدوية المختلفة في خلفيات وراثية مختلفة. النقطة الحرجة الوحيدة التي يجب وضعها في الاعتبار هي أن البلازميدات القاضية يجب أن يكون لها علامة مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية عن pLacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح للإفصاح عنهما.

Acknowledgments

نشكر الدكتور باكنر على التكرم بتوفير بلازميد pLacZ. وقد تم دعم هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية للترويج العلمي والتكنولوجي ووزارة العلوم والابتكار من الأرجنتين (PICT2016-0439، PICT2019-0526، PICT2019-4212)، ومجلس البحوث في المملكة المتحدة [MR/P027989/1]. تم استخدام فن سيرفييه الطبي لإنتاج الشكل 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 177 ،
<em>في المختبر</em> فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة <em>المثقبيات الكروزية</em> باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter