Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Narkotika screening mot alle livssyklus stadier av Trypanosoma cruzi Bruke parasitter Uttrykke β-galactosidase

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Vi beskriver en kolorimetrisk analyse med høy gjennomstrømning som måler β-galaktosidaseaktivitet i tre livssyklusstadier av Trypanosoma cruzi, det forårsakende middelet til Chagas sykdom. Denne analysen kan brukes til å identifisere trypanocidalforbindelser på en enkel, rask og reproduserbar måte.

Abstract

Trypanosoma cruzi er årsaksmidlet til Chagas sykdom (ChD), en endemisk sykdom av folkehelse betydning i Latin-Amerika som også påvirker mange ikke-endemiske land på grunn av økningen i migrasjon. Denne sykdommen rammer nesten 8 millioner mennesker, med nye tilfeller anslått til 50 000 per år. På 1960- og 70-tallet ble to legemidler for ChD-behandling introdusert: nifurtimox og benznidazol (BZN). Begge er effektive hos nyfødte og i den akutte fasen av sykdommen, men ikke i kronisk fase, og deres bruk er forbundet med viktige bivirkninger. Disse fakta understreker det presserende behovet for å intensivere søket etter nye stoffer mot T. cruzi.

T. cruzi overføres gjennom hematofagøse insektvektorer av familiene Reduviidae og Hemiptera. En gang i pattedyrverten multipliserer den intracellulært som den ikke-flagellerte amastigotformen og skiller seg ut i trypomastigoten, blodets ikke-replikative infeksjonsform. Inne i insektvektoren forvandles trypomastigoter til epimaskigotstadiet og formerer seg gjennom binær fisjon.

Dette papiret beskriver en analyse basert på måling av aktiviteten til cytoplasmatisk β-galaktosidase som slippes ut i kulturen på grunn av parasitter lysis ved bruk av substratet, klorfenolrødt β-D-galactopyranoside (CPRG). For dette ble T. cruzi Dm28c-stammen transfisert med en β-galaktosidase-overuttrykkende plasmid og brukt til in vitro farmakologisk screening i epimaskigot-, trypomastigot- og amastigotstadier. Dette papiret beskriver også hvordan man måler den enzymatiske aktiviteten i dyrkede epimastigoter, infiserte Vero-celler med amastigoter og trypomastigoter frigjort fra de dyrkede cellene ved hjelp av referansemedikamentet benznidazol, som et eksempel. Denne kolorimetriske analysen utføres enkelt og kan skaleres til et høyt gjennomstrømningsformat og påføres andre T. cruzi-stammer .

Introduction

Chagas sykdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, er en parasittisk sykdom forårsaket av flagellert protozo, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begynner med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akutt fase som vanligvis er udiagnostisert, etterfulgt av en livslang kronisk fase. I kronisiteten manifesterer ~ 30% av pasientene - tiår etter infeksjonen - en rekke svekkende forhold, inkludert myokardiopati, mega-fordøyelsessyndromer, eller begge deler, med en dødelighet fra 0,2% til 20% 1,2,3. Asymptomatiske kroniske pasienter kan ikke ha noen kliniske tegn, men forblir seropositive gjennom hele livet.

Estimater tyder på at ~ 7 millioner mennesker er smittet over hele verden, hovedsakelig fra Latin-Amerika, hvor ChD er endemisk. I disse landene overføres T. cruzi hovedsakelig gjennom infiserte blodsugende triatominbugs (vektorbåren overføring) og sjeldnere ved oral overføring ved inntak av mat forurenset med triatomin avføring som inneholder parasittene2. I tillegg kan parasitten overføres via morkaken fra chagasiske mødre til nyfødte, gjennom blodtransfusjoner eller under organtransplantasjon. Disse vektoruavhengige måtene å skaffe seg infeksjonen og menneskelig migrasjon har bidratt til den verdensomspennende spredningen av sykdommen, dokumentert av et økende antall tilfeller i Nord-Amerika, Europa og noen afrikanske, østlige Middelhavet og vestlige Stillehavsland4. ChD regnes som en forsømt sykdom, da vektorbåren overføring er nært forbundet med fattigdom og er et ledende folkehelseproblem, spesielt i latinamerikanske lavinntektsland. Selv om det finnes tilgjengelige behandlinger, er dødeligheten på grunn av ChD i Latin-Amerika den høyeste blant parasittiske sykdommer, inkludert malaria2.

Det er to registrerte legemidler for ChD-behandling introdusert på slutten av 1960-tallet og begynnelsen av 1970-tallet: nifurtimox og benznidazol5. Begge legemidlene er effektive i den akutte fasen av sykdommen hos voksne, barn og medfødt infiserte nyfødte, så vel som hos barn med kronisk infeksjon, hvor kur vanligvis oppnås. Imidlertid blir bare noen få personer diagnostisert tidlig nok til å bli behandlet i tide. Ifølge de siste kliniske forsøkene har begge legemidlene viktige begrensninger hos voksne og var ineffektive for å redusere symptomer hos personer med kronisk sykdom; derfor er deres bruk i dette stadiet kontroversielt. Andre ulemper er de forlengede behandlingsperiodene som kreves (60-90 dager) og de hyppige, alvorlige bivirkningene som observeres, noe som fører til seponering av behandlingen hos en andel av smittede 6,7. Det anslås at færre enn 10% av personer med ChD har blitt diagnostisert, og enda færre har tilgang til behandling, da mange berørte individer bor i landlige områder med ingen eller knapp tilgang til helsetjenester8. Disse fakta fremhever det presserende behovet for å finne nye stoffer mot T. cruzi for å muliggjøre mer effektive, trygge og anvendelige behandlinger, spesielt for kronisk fase. I denne forbindelse er en annen utfordring i utviklingen av mer effektive forbindelser begrensningen av systemer for å vurdere legemiddeleffektivitet in vitro og in vivo9.

Selv om kjemisk biologi og genomiske tilnærminger for identifisering av potensielle legemiddelmål har blitt brukt i kinetoplastidparasitter, er de tilgjengelige genomiske verktøyene i T. cruzi begrenset i motsetning til T. brucei eller Leishmania. Dermed er screening av forbindelser med trypanocidal aktivitet fortsatt den mest brukte tilnærmingen i søket etter nye kjemoterapeutiske legemiddelkandidater mot ChD. Vanligvis må narkotikaoppdagelse i T. cruzi begynne med å teste effekten av et nytt stoff i en in vitro-analyse mot epimaskotstadiet. I flere tiår var den eneste måten å måle de hemmende effektene av kandidatforbindelser på T. cruzi manuell mikroskopisk telling, som er arbeidskrevende, tidkrevende og operatøravhengig. Videre er denne tilnærmingen egnet for å analysere et lite antall forbindelser, men er uakseptabelt for høy gjennomstrømningsscreening av store sammensatte biblioteker. I dag begynner mange undersøkelser med analysen av et stort antall forbindelser fra forskjellige opprinnelser som analyseres in vitro, og tester deres evne til å hemme parasittvekst. Både kolorimetriske og fluorometriske metoder er utviklet for å øke gjennomstrømningen i disse analysene, forbedre objektiviteten til screeningen og gjøre hele prosessen mindre kjedelig9.

En av de mest brukte kolorimetriske metodene er basert på den β-galaktosidaseaktiviteten til transfiserte parasitter først beskrevet av Bucknet og samarbeidspartnere10. Det β-galaktosidase-enzymet uttrykt av de rekombinante parasittene hydrolyserer det kromogene substratet, klorfenolrødt β-D-galactopyranoside (CPRG), til klorfenolrødt, som lett kan måles kolorimetrisk ved hjelp av et mikroplate-spektrofotometer. Dermed kan parasittvekst i nærvær av en rekke forbindelser samtidig evalueres og kvantifiseres i mikrotiterplater. Denne metoden har blitt brukt til å teste legemidler i epimaskigoteformer (tilstede i insektvektoren), trypomastigoter og intracellulære amastigoter, pattedyrstadiene av parasitten. Videre er flere rekombinante T. cruzi-stammer transfisert med pBS: CL-Neo-01 / BC-X-10 plasmid (pLacZ) 10 for å uttrykke Escherichia coli-β-galaktosidase-enzymet allerede tilgjengelige (og nye kan konstrueres), noe som gjør det mulig å evaluere parasitter fra forskjellige diskrete skriveenheter (DTU) som kanskje ikke oppfører seg likt mot de samme forbindelsene 10,11,12,13 . Denne metoden har allerede blitt brukt til å evaluere forbindelser for aktivitet mot T. cruzi i lav- og høy gjennomstrømningsscreening12,13. Lignende tilnærminger har også blitt brukt i andre protozoa parasitter, inkludert Toxoplasma gondii og Leishmania mexicana14,15.

Denne artikkelen beskriver og viser en detaljert metode for en in vitro medikamentell screening mot alle livssyklusstadier av T. cruzi ved bruk av parasitter som uttrykker β-galaktosidase. Analysene som presenteres her er utført med en β-galaktosidase-uttrykkende T. cruzi-linje oppnådd ved transfeksjon av T. cruzi Dm28c-stamme fra DTU I13 med pLacZ-plasmid (Dm28c/pLacZ). I tillegg kan den samme protokollen lett tilpasses andre stammer for å sammenligne ytelsen mellom forbindelser og mellom T. cruzi-stammer eller DTU-er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: En oversikt over hele det eksperimentelle designet er avbildet i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over in vitro screeningsanalysen av Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ linje med CPRG som substrat for den kolorimetriske reaksjonen. Analysen består i å så parasittene (1), inkubere dem med BZN (2 og 3), og deretter tilsette det kolorimetriske substratet (4). Når parasitter lyser, frigjøres β-galaktosidase og klipper HLRG til klorfenolrød; denne fargeendringen kan måles spektrofotometrisk (5). Data kan analyseres i statistisk analyseprogramvare for å oppnå den halvhemmende konsentrasjonen (IC50) av BZN. Forkortelser: CPRG = klorfenolrød β-D-galactopyranosid; BZN = benznidazol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Klargjøring av stamløsninger

  1. Fremstilling av medier og løsninger
    1. Hemin oppløsning (tilleggstabell S1)
      1. Tilsett alle komponentene i et 50 ml sentrifugerør i den rekkefølgen som er gitt i oppskriften og homogeniser ved inversjon flere ganger.
      2. Steriliser ved filtrering gjennom et 0,22 μm filter.
      3. Klargjør 1 ml aliquot i 1,5 ml mikrosentrifuger og oppbevar dem ved -80 °C til bruk.
    2. Leverinfusjons-tryptose (LIT) medium (tilleggstabell S1)
      1. Vei alle komponentene og rør for å homogenisere ved romtemperatur i et 1 L beger som inneholder minst 700 ml destillert vann.
      2. Juster pH til 7,2 og fyll opp volumet til 900 ml i en 1 L gradert sylinder med destillert vann; sterilisere ved filtrering eller autoklavering (121 °C i 20 min).
      3. Suppler mediet ved å tilsette 100 ml føtalt kalveserum (FCS), (10 % FCS, steril og varmeinaktivert ved 56 °C i 45 minutter), 20 ml 40 % steril glukoseoppløsning (sterilisert ved autoklavering, 121 °C i 20 minutter) og 5 ml heminoppløsning (endelig konsentrasjon 5 μM) til 900 ml LIT-medium.
    3. Forbered Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) fra pulveret etter produsentens instruksjoner.
    4. Fosfatbufret saltvann (PBS) (tilleggstabell S1)
      1. Løs opp alle faste komponenter ved å røre løsningen ved romtemperatur i et 1 L beger.
      2. Juster pH til 7,2, nivå opp til 1 L i en 1 L gradert sylinder med destillert vann, og steriliser ved filtrering eller autoklavering (121 ° C, 20 min).
  2. Benznidazol (BZN) lagerløsninger og fortynninger
    MERK: Utvalget av BZN-konsentrasjon som ble brukt i dette arbeidet var 2,5 til 80 μM.
    1. Forbered en stamoppløsning på 1 M BZN ved å oppløse 13 mg av legemidlet i 50 μL dimetylsulfoksid (DMSO). Under aseptiske forhold tilberedes seriefortynninger fra denne 1 M BZN stamløsningen med to ganger den endelige ønskede konsentrasjonen (2x oppløsninger) i et endelig volum som er tilstrekkelig for antall brønner som skal analyseres.
      MERK: Beregn for 100 μL per brønn med et overskudd på 10-20%. BZN stamløsningen og alle BZN-fortynninger må tilberedes umiddelbart før bruk i analysen på grunn av den lave løseligheten av legemidlet i mediet.
    2. Forbered 2x BZN-fortynninger på 160, 80, 40, 20, 10 og 5 μM.
      1. Fortynn 1 M BZN stamløsning ved en 100 ganger fortynning (10 μL av 1 M BZN + 990 μL medium) for å oppnå en 10 mM løsning i passende medium som brukes for hvert livssyklusstadium av T. cruzi. Bland kontinuerlig for å homogenisere suspensjonen.
      2. Fortynn 10 mM BZN-oppløsning for å fremstille 320 μM BZN i passende medium: 32 μL av 10 mM BZN + 968 μL medium. Bland kontinuerlig for å homogenisere suspensjonen.
      3. Fortynn 320 μM BZN 2 ganger for å oppnå en konsentrasjon på 160 μM (500 μL på 320 μM BZN + 500 μL medium). Bland kontinuerlig for å homogenisere suspensjonen. Gjenta denne 2 ganger fortynningen med hver resulterende løsning for å oppnå 80, 40, 20, 10 og 5 μM løsninger.
      4. Fortynn DMSO 1000 ganger i egnet medium for bruk som ubehandlet kontroll (100% overlevelseskontroll).
        MERK: Epimastigoter tolererer opptil 100 ganger fortynning av DMSO, mens Vero-celler bare tåler opptil 1000 ganger fortynning av DMSO. Om nødvendig kan en dødskontroll med 50% DMSO inkluderes som 0% overlevelsestilstand.
  3. Substrat løsning
    1. Løs opp CPRG ved 1 mM konsentrasjon i destillert vann. For en 96-brønns plate, tilsett 2,4 mg CPRG til 4 ml vann.
      MERK: Oppløsningen med CPRG må tilberedes umiddelbart før analysen.
  4. Lysis løsning
    1. Klargjør en 2,5% v / v-løsning av ikke-ionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoksy]etanol (se materialtabellen) i 1x PBS. Forbered 1 ml av løsningen per 96-brønns plate umiddelbart før analysen.

2. Forberedelse av parasittkultur

  1. Epimastigote forberedelse
    MERK: T. cruzi Dm28c/pLacZ linje13 brukes gjennom hele denne rapporten.
    1. Dyrk β-galaktosidase-uttrykkende T. cruzi epimastigoter aksentisk ved 28 °C i cellekulturflasker med et vekstareal på 25 cm2 (T-25 kolber). Opprettholde kulturene i loggfasen ved å subkulturere hver 48-72 time (i 5 ml) i LIT-medium supplert med 10% FCS (supplerende tabell S1) og genetisk sulfat (G418) ved en endelig konsentrasjon på 200 μg / ml. Kvantifiser parasittvekst ved celletelling i et Neubauer-kammer før subkulturering. Lukk hetten forsvarlig og oppbevar kulturkolben (ikke ventilert) ved 28 °C i vertikal stilling.
      MERK: G418 sikrer pLacZ plasmidvalg og vedlikehold. Logfasekulturer har en epimaskigotkonsentrasjon på 1-5 × 107 parasitter/ml for Dm28c/pLacZ-linjen.
    2. Klargjør en suspensjon på 2 × 105 epimastigoter/ml fra en logfasekultur i LIT supplert med G418 antibiotika. Dispenser 100 μL av epimaskitiospensjonen per brønn (20 000 epimastigoter i 100 μL LIT) av en 96-brønns mikroplate og utgjør det endelige volumet til 200 μL per brønn med mediet.
  2. Amastigote forberedelse
    1. Bruk spontane metasykliske trypomastigoter oppnådd fra en eldre epimaskigotkultur (i 7 dager i denne protokollen) for å utføre en innledende infeksjon i en T-25 kolbe med 2 × 105 Vero-celler sådd tidligere i DMEM supplert med 2% FCS.
      1. Tell antall metasykliske trypomastigoter i et Neubauer-kammer, infiser Vero-cellemonolaget med et mangfold av infeksjon (MOI) på 10 i 5 ml DMEM med 2 % FCS, og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 16 timer. Vask de resterende trypomastigotene ved å fjerne mediet fra kolben med en 5 ml steril pipette, tilsett deretter 5 ml 1x PBS og aspirer. Til slutt legger du til 5 ml DMEM med 2 % FCS og inkuberer under de samme forholdene.
      2. Bruk trypomastigotene som kommer fra det infiserte Vero-cellemonolaget for å opprettholde infeksjonen i T-25 kolber med 2 × 105 Vero-celler i DMEM med 2% FCS, og genererer en ny infisert flaske hver uke.
        MERK: Etter 5-7 dager begynner trypomastigoter å dukke opp og er synlige i supernatanten. Ikke legg G418 til trypomastigotene som brukes til å infisere cellene eller de infiserte cellene, da Vero-cellelinjen ikke er motstandsdyktig mot G418.
    2. Forbered en suspensjon på 1 × 105 Vero-celler / ml i DMEM supplert med 2% FCS og frø 100 μL av suspensjonen per brønn i 96-brønns vevskulturplater (10.000 celler per brønn). Rug over natten (12-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2 for å sikre celletilslutning til bunnen av brønnene.
    3. Etter inkubering over natten, skyll Vero-cellemonolaget tre ganger med 100 μL steril 1x PBS. Tilsett T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigotes (oppnådd fra en tidligere infeksjon i en T-25 kolbe, trinn 2.2.1) ved en MOI på 10 i 100 μL DMEM supplert med 2% FCS per brønn (100.000 trypomastigoter per brønn).
    4. Inkuber platene i 6 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter denne inkubasjonsperioden vasker du platene to ganger med 1x PBS, og tilsett 100 μL DMEM uten fenolrødt supplert med 2% FCS.
      MERK: Etter 48 timer (2 dager etter infeksjon) er intracytoplasmatiske amastigoter synlige med et optisk mikroskop. Fenolrød, en pH-indikator i DMEM og andre cellekulturmedier, kan forstyrre absorbansmålingen av HLRG. Hvis DMEM uten rødt fenol ikke er tilgjengelig, se alternativene nevnt nedenfor i pkt. 3.2.1.
  3. Trypomastigote forberedelse
    1. Forbered en suspensjon på 1 × 106 Vero-celler / ml i DMEM supplert med 2% FCS og frø 800 000 celler i 5 ml av mediet i T-25 kolber. Inkuber over natten (12-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2 for å sikre celletilslutning.
      MERK: For en T-75 kolbe, frø 2 × 106 celler i et endelig volum på 15 ml.
    2. Etter inkubering, skyll to ganger med 3 ml steril 1x PBS. Tilsett T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigotes ved en MOI på 10 i 5 ml DMEM med 2% FCS (8 × 106 trypomastigoter for en T-25 kolbe).
      MERK: For en T-75 kolbe, tilsett 20 × 106 trypomastigoter i et siste volum på 15 ml DMEM med 2% FCS.
    3. Rug over natten (12-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2. Vask kolben to ganger med 3 ml 1x PBS, og tilsett 5 ml fersk DMEM supplert med 2% FCS. Ruge ved 37 °C og 5 % CO2 i fire dager.
    4. Sjekk supernatanten for trypomastigoter under et optisk mikroskop. Kvantifiser trypomastigotene ved å telle dem i et Neubauer-kammer. Samle supernatanten i et 15 ml rør og sentrifuge ved 7000 × g i 10 minutter ved romtemperatur.
    5. Kast supernatanten og sett pelleten tilbake for å oppnå en konsentrasjon på 1 × 106 trypomastigoter/ml i DMEM uten fenolrødt supplert med 2 % FCS. Frø 100 μL av trypomastigote suspensjonen (100.000 trypomastigoter per brønn) i en 96-brønns plate.
      MERK: Hvis DMEM uten rødt fenol ikke er tilgjengelig, se alternativene nedenfor i pkt. 3.2.1.

3. β-galaktosidase-analyse

MERK: Kvantifisering av β-galaktosidaseaktivitet brukes som en indirekte måte å bestemme antall parasitter på. Det forventes at veksten vil bli hemmet i nærvær av en trypanocidal forbindelse, noe som fører til et lavere antall parasitter sammenlignet med ubehandlet kontroll, noe som vil gjenspeiles i en lavere β-galaktosidaseaktivitet og dermed lavere absorbans.

  1. Inkuber parasittene med BZN.
    1. Tilsett 100 μL tilsvarende 2x BZN-oppløsning per brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon av BZN på 80, 40, 20, 10, 5 og 2,5 μM til 100 μL epimasketosuspensjon (fra trinn 2.1), Vero-celler med amastigoter (2 dager etter infeksjon) (trinn 2.2) eller trypomastigoter (trinn 2.3) i en plate med 96 brønner.
    2. Inkuber epimastigotene ved 28 °C i 72 timer, og trypomastigotene eller infiserte Vero-cellene med amastigoter i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
      MERK: Hver legemiddelkonsentrasjon bør evalueres minst i tre eksemplarer og inkludere kontrollkulturer av epimastigoter, trypomastigoter og infiserte Vero-celler med DMSO (se trinn 1.2.2.4).
  2. Kolorimetrisk reaksjon
    1. Etter behandlingsinkubasjonsperioden, hvis infiserte Vero-celler eller trypomastigoter er i DMEM med fenolrød, erstatt mediet med 100 μL 1x PBS for å unngå interferens. Utfør tredoble blanke brønner som inneholder bare 100 μL tilsvarende medium (eller 1x PBS etter behov).
      MERK: Det er ikke nødvendig å fjerne kulturmediet for epimastigoter i tilfelle LIT medium eller DMEM uten fenolrødt. DMEM med fenolrød kan fortsatt brukes; klargjør en tom brønn med DMEM alene for å måle baseabsorbansen og deretter trekke fra denne verdien under dataanalyse (trinn 3.3.). Schneiders insektmedium, som er fargeløst, er et alternativ for epimastigoter.
    2. Tilsett 40 μL CPRG-substratløsning og 10 μL vaskemiddeloppløsning til hver brønn, oppnå en endelig konsentrasjon på 200 μM CPRG og 0,1% vaskemiddel i et sluttvolum på 250 μL i hver brønn.
      MERK: CPRG-oppløsningen og vaskemiddelet kan tilsettes sammen i et endelig volum på 50 μL per brønn.
    3. Inkuber ved 37 °C i 2 timer og mål absorbansen ved 595 nm i et mikroplate-spektrofotometer.
      MERK: Den forventede fargeendringen er gul til rødbrun ved β-galaktosidase enzymatisk spaltning (figur 2A). Inkubasjonstiden kan forlenges opp til 4 timer, og absorbansspektrene til klorfenolrødt kan leses mellom 570 og 595 nm med lignende kurvetilpasninger (Supplerende figur S1A, B). Inkubasjon i opptil 24 timer i nærvær av CPRG-substrat har vist lignende kurvetilpasninger (supplerende figur S1C).
      1. I et mikroplate-spektrofotometer med en monokromatvelger oppretter du en ny protokoll i utstyrsprogramvaren (tilleggsfigur S2).
      2. Klikk Absorbans som deteksjonsmetode | Endepunkt som lesetype | Ok (supplerende figur S2A). Legg til et lesetrinn, skriv inn den valgte bølgelengden, og klikk OK (supplerende figur S2B).
      3. Merk brønnene som skal leses i delen Plateoppsett , og klikk på OK (supplerende figur S2C). For å lese platen, sett den inn i skuffen og klikk på Les plate. Vent til verdiene vises på skjermen (Supplerende figur S2D), og eksporter dem til et regneark for å analysere resultatene.
  3. Dataanalyse og beregning av konsentrasjon av mediehemmere (IC50)
    1. Trekk fra den tomme målte verdien, tilsvarende bare LIT medium, 1x PBS eller DMEM med eller uten fenolrød pluss CPRG-vaskemiddelløsningen. Når du tester den trypanocide aktiviteten til fargede forbindelser, måler du absorbansen av ytterligere blanke kontroller med LIT eller DMEM med hver konsentrasjon av legemiddel som brukes, og trekker deretter disse verdiene fra absorbansverdiene oppnådd med parasittene ved hver konsentrasjon.
      MERK: Tilleggstabell S2 viser typiske verdier oppnådd i denne analysen med disse mediene uten parasitter pluss CPRG-vaskemiddelløsning. Forskjellene før og etter tilsetning av CPRG er signifikante, men forstyrrer ikke analysen med parasitter (tilleggstabell S2).
    2. I statistisk analyseprogramvare plotter du konsentrasjonen av BZN (i μM) versus absorbansen ved 595 nm i et xy-bord. Transformer BZN-konsentrasjonene til logaritmiske verdier ved å klikke på Analyser-knappen, velge Transform-alternativet | transformere x-verdiene ved hjelp av x = log (x) og klikke på Ok-knappen.
    3. Skaff IC50-verdiene fra programvaren for statistisk analyse.
      MERK: IC50 er definert som legemiddelkonsentrasjonen som reduserer parasittveksten med 50% sammenlignet med ubehandlet kontroll og beregnes som bøyningspunktet for den sigmoidale funksjonen som passer til kurven.
      1. I programvaren for statistisk analyse klikker du på Analyser-knappen , velger Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) i xy-analyselisten og klikker OK.
      2. I modellfanen i parametervinduet , i dose-respons-inhiberingsgruppen av innebygde ligninger, velg alternativet dose-respons metode: log (inhibitor) vs. respons - Variabel skråning (fire parametere). La alle de andre fanene ha standardverdier; klikk på Ok.
      3. Klikk på resultatdelen av den statistiske analyseprogramvaren for å finne IC50-verdien, SD og passformens godhet.
      4. Klikk på grafseksjonen for å finne xy-grafen for den logaritmiske konsentrasjonen av stoffet versus absorbansverdiene . Se etter kurvetilpasningen er også grafisk i en annen farge.
        MERK: Et gratis online IC50 beregningsverktøy finner du på https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor ble β-galaktosidase-uttrykkende Dm28c epimastigoter inkubert med 6 konsentrasjoner av BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (eller forbindelser av interesse) i 72 timer. Etter denne perioden ble CPRG-reagens tilsatt sammen med vaskemiddel, som lyser cellene og frigjør β-galaktosidase. HLRG spaltes av β-galaktosidase for å produsere klorfenolrødt, noe som fører til endring i farge fra gul til rødlig (figur 2A). Klorfenolrødt ble målt ved å lese absorbansen ved 595 nm i en mikroplateleser etter 2 timer. Et XY-bord ble plottet med logaritmiske konsentrasjoner av BZN versus absorbansen ved 595 nm. Plottet ble montert med ikke-lineær regresjon (figur 2B). I dette spesielle eksperimentet var IC50 oppnådd for epimastigoter 20,59 ± 1,075 μM, tilsvarende det som er oppnådd fra litteraturen (tabell I)16,17. Representative resultater ved bruk av denne metoden for trypomastigoter og amastigoter er beskrevet tidligere13.

Figure 2
Figur 2: Beregning av IC50-verdi av benznidazol for epimaskigotform Dm28c. (A) En 96-brønns plate med epimastigoter behandlet med forskjellige BZN-konsentrasjoner (2,5, 5, 10, 20, 40 og 80 μM) før tilsetning av CPRG (1), etter første tilsetning av CPRG og vaskemiddel (2), og etter inkubering med HLRG og vaskemiddel som viser fargeendring (3). (B) XY-plott av de logaritmiske konsentrasjonene av BZN versus absorbans (OD) ved 595 nm for Dm28c/pLacZ epimastigoter. Plottet ble montert ved hjelp av ikke-lineær regresjon for å estimere IC50-verdien . Hver verdi representerer gjennomsnittet og standardavviket (feilfeltene) til 6 uavhengige biologiske replikasjoner. Den kontinuerlige blå linjen representerer kurvetilpasningen. Forkortelser: CPRG = klorfenolrød β-D-galactopyranosid; BZN = benznidazol; OD = optisk tetthet; C = kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

BZN IC50 (μM) beregnet ved hjelp av Dm28c som uttrykker β-galaktosidase BZN IC50 (μM) rapportert i litteraturen
Epimastigoter 17.08 til 20.59 11 til 18,72
Amastigoter 2,31 til 3,92 1,66 til 4,39
Trypomastigoter 27.07 til 44.74 24,68 til 50,72

Tabell 1: Område for IC50-verdier oppnådd for epimastigoter, trypomastigoter og amastigoter ved bruk av denne protokollen sammenlignet med IC50 rapportert i litteratur17,18.

Supplerende figur S1: Oppsett av mikroplateleserprogramvaren for leseabsorbans. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: β-galaktosidaseaktivitetsmålinger (optisk tetthet ved 570 til 595 nm) ved bruk av epimastigoter fra Dm28c/pLacZ-linjen til Trypanosoma cruzi etter inkubasjon med CPRG på forskjellige tidspunkter. Verdier uttrykkes som gjennomsnitt og standardavvik for tre uavhengige replikasjoner. Fargede kontinuerlige linjer representerer kurvetilpasningen. (A) Inkubasjon med 200 μM CPRG for 2 h. (B) Inkubasjon med 200 μM CPRG i 4 timer. (C) Representasjon av β-galaktosidaseaktivitet (optisk tetthet ved 570 nm) ved forskjellige tidspunkter (2, 4 og 24 timer). Forkortelse: CPRG = chlorophenol red β-D-galactopyranoside. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Sammensetning og fremstilling av LIT medium, hemin og PBS. Forkortelser: LIT = Leverinfusjon tryptose; PBS = fosfatbufret saltvann. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S2: Absorbansavlesninger for LIT- og DMEM-medier uten parasitter. Verdier uttrykkes som tredobler av hvert medium; medieraden inneholder middelverdien til de tre replikasjonene; og SD-raden inneholder standardavviksverdiene for replikasjonene. Forkortelser: SD = Standardavvik; LIT = Leverinfusjon tryptose; DMEM = Dulbeccos modifiserte ørnemedium. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papiret beskriver en analyse basert på å bestemme cytoplasmatiske β-galaktosidaseaktivitet utgitt på grunn av membranlyse av T. cruzi epimastigoter, trypomastigoter eller infiserte celler med amastigoter i nærvær av substratet CPRG. Vi brukte T. cruzi Dm28c/pLacZ parasitter, en stabil parasittstamme oppnådd etter transfeksjon med et β-galaktosidase-bærende plasmid konstruert av Buckner og medforfattere10. Denne analysen har blitt brukt til å søke etter antitrypanocidal forbindelser 12,19,20,21. T. cruzi Dm28c/pLacZ-stammen ble brukt til å optimalisere screeningprotokollen. Som oppsummert i figur 1 har denne protokollen fire hovedpunkter; den første er parasittsåing i 96-brønns plater. Epimastigoter og trypomastigoter telles og sås fra en suspensjon. Når det gjelder amastigoter, frø først Vero-celler for å danne et tilhenger monolag og deretter infisere med trypomastigoter. Amastigoter er tilstede inne i cellene etter 48 timer. For det andre, forberede fortynninger av stoffet som skal testes i de ønskede konsentrasjoner og inkubere med parasittene. Til slutt innebærer det tredje trinnet å tilsette HLRG og vaskemiddel til cellene. HLRG spaltes ved β-galaktosidasefrigjøring fra parasitten cytoplasma, og klorfenolrødt genereres og måles spektrofotometrisk. Det fjerde kritiske trinnet innebærer dataanalyse, konstruksjon av x-y-grafer og montering av kurven som er oppnådd for å beregne IC50-verdiene av stoffene av interesse.

En in vitro-analyse for alle livssyklusstadiene til T. cruzi er det første trinnet i å studere effekten av et potensielt nytt legemiddel. I disse analysene evalueres effektene ved mikroskopisk telling, en tidkrevende og subjektiv prosedyre som er vanskelig å automatisere. Substitusjonen av denne teknikken med en kolorimetrisk analyse kan forbedre objektiviteten til screeningen, noe som også gjør den mindre tidkrevende. Den kolorimetriske plateavlesningen tar bare noen få minutter, i motsetning til timene som kreves for arbeidsintensiv manuell mikroskopisk telling, og letter screeningen av store biblioteker av nye forbindelser med potensiell terapeutisk verdi. Når det gjelder den generelle likheten mellom de β-galaktosidase-uttrykkende parasittene (Dm28c/pLacZ) sammenlignet med villtype Dm28c-stammen, bestemte vi at parasittene var morfologisk normale, med lignende vekstrater og differensiert likt innenfor livssyklusformene. Videre viste de oppnådde legemiddeltestresultatene som sammenlignet villtypen Dm28c og Dm28c / pLacZ-linjen kvantifisert ved mikroskopisk telling ingen signifikante forskjeller13.

En begrensning ved denne protokollen er at fargede kulturmedier kan forstyrre den målte absorbansen. DMEM (eller RPMI) uten fenolrød anbefales for å overvinne denne begrensningen. En blank brønn med DMEM ble vellykket brukt som basal absorbansverdi i denne protokollen. En annen begrensning er den antatte forstyrrelsen ved bruk av fargede stoffer, som kan overvinnes ved bruk av medier med forbindelsen som et tomt eller ved å velge absorbansbølgelengden mellom 570 og 595 nm for å gi den laveste forstyrrelsen. HLRG endres ikke av tilstedeværelsen av et gitt legemiddel (farget eller ikke), noe som gjør denne analysen ganske robust. Når du bruker media med fenolrøde eller fargede stoffer, er det viktig å utføre tomme kontroller for hver tilstand og deretter trekke absorbansverdien oppnådd fra målingene med parasitter for å unngå forstyrrelser.

Konsentrasjonen av CPRG-oppløsning rapportert for T. cruzi trypomastigotes og Toxoplasma gondii er 100 μM10,15. Den optimale konsentrasjonen rapportert for epimastigoter er imidlertid 200 μM11. I denne Dm28c /pLacZ-linjen ble en 200 μM CPRG-løsning brukt til epimastigoter, trypomastigoter og amastigoter med pålitelige resultater. Når det gjelder HLRG-inkubasjonstider, ble den beste kurvetilpasningen oppnådd når epimastigoter ble inkubert med substratløsningen i 2 timer (R2 = 0,9995). Imidlertid var R2 svært lik (R2 = 0,9994), og β-galaktosidaseaktiviteten var lineær i området 6 250-200 000 epimastigoter per brønn (dvs. 62 500-2 000 000 epimastigoter / ml) ved 4 timer (supplerende figur S2). Et lineært område på 3 150-100 000 trypomastigoter per brønn (dvs. 31 500-1 000 000 trypomastigoter/ml) ble rapportert for trypomastigoter13. For å unngå å observere store standardavvik, er det viktig å frø riktig mengde parasitter i hver brønn. Siden volumene er små, er det viktig å være konsekvent når du teller parasittene før såing. Videre kan mer enn tre replikasjoner måles for hver eksperimentell tilstand om nødvendig.

I motsetning til andre kolorimetriske screeninganalyser22, er det ikke nødvendig med påfølgende manipulasjonstrinn her, noe som øker reproduserbarheten og påliteligheten til analysen samt hastigheten på datainnsamlingen. Dette er en enkel, rask og pålitelig analyse som er egnet for høy gjennomstrømnings narkotikascreening av kandidatforbindelser for ChD-behandling og kan brukes på andre T. cruzi-stammer . pLacZ-plasmidet er tilgjengelig på forespørsel fra Bucker-laboratoriet og kan brukes til å transfektere resistente stammer av for eksempel knockout-linjer for å evaluere følsomheten til linjen for forskjellige stoffer i forskjellige genetiske bakgrunner. Det eneste kritiske punktet som må huskes er at knockout-plasmidene skal ha en annen antibiotikaresistensmarkør enn pLacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å oppgi.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Buckner for vennlig å gi pLacZ plasmid. Dette arbeidet ble støttet av Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva fra Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) og Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art ble brukt til å produsere figur 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

Biokjemi utgave 177
<em>In vitro</em> Narkotika screening mot alle livssyklus stadier av <em>Trypanosoma cruzi</em> Bruke parasitter Uttrykke β-galactosidase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter