Summary
我们描述了一种高通量比色测定法，用于测量恰加斯病病原体 克氏锥虫三个生命周期阶段的β半乳糖苷酶活性。该测定可用于以简单，快速和可重复的方式鉴定杀锥虫化合物。
Abstract
克氏锥虫 是恰加斯病（ChD）的病原体，恰加斯病（ChD）是拉丁美洲一种具有公共卫生重要性的地方病，由于移民的增加，也影响许多非流行国家。这种疾病影响近800万人，估计每年有5万例新发病例。在20世纪60年代和70年代，引入了两种用于ChD治疗的药物：硝呋替莫和苯并硝唑（BZN）。两者都对新生儿和疾病的急性期有效，但在慢性期无效，并且它们的使用与重要的副作用有关。这些事实突出表明，迫切需要加强对克 氏锥虫新药的寻找。
克氏锥虫 通过鸢尾科和半翅目科的食血昆虫媒介传播。一旦进入哺乳动物宿主，它就会在细胞内繁殖为非鞭毛状的无鞭毛虫形式，并分化成锥虫鞭毛虫，血流非复制性感染形式。在昆虫载体内部，锥虫卵变为上胚芽阶段并通过二元裂变繁殖。
本文描述了一种基于通过使用底物氯酚红β-D-半乳糖苷（CPRG）测量由于寄生虫裂解而释放到培养物中的细胞质β-半乳糖苷酶活性的测定方法。为此，用β半乳糖苷酶过表达的质粒转染了 克氏锥虫 Dm28c菌株，并用于上胚芽肿，色胸苷酸和阿马鞭毛虫阶段的 体外 药理筛选。本文还描述了如何使用对照药物苄硝唑作为示例来测量培养的上胚聚物，用无鞭毛虫感染的Vero细胞和从培养细胞释放的色胸鞭毛中的酶活性。这种比色测定法易于进行，可以缩放到高通量形式并应用于其他 克氏锥虫 菌株。
Introduction
恰加斯病（ChD）或美洲锥虫病是由鞭毛原生动物 克氏锥虫 （克氏锥虫）引起的寄生虫病。ChD始于无症状或无症状的急性期，通常未被诊断，然后是终身慢性期。在慢性病中，约 30% 的患者在感染后数十年表现出各种使人衰弱的疾病，包括心肌病、巨消化系统综合征或两者兼有，死亡率范围为 0.2% 至 20%1，2，3。无症状的慢性患者可能没有临床体征，但终生血清学阳性。
据估计，全世界约有700万人受到感染，其中大部分来自ChD流行的拉丁美洲。在这些国家， 克氏锥虫 主要通过受感染的吸血锥蝽臭虫（媒介传播）传播，较少通过摄入含有寄生虫的锥蝽臭螈粪便污染的食物进行口头传播2.此外，寄生虫可以通过胎盘从伤寒病母亲传播给新生儿，通过输血或在器官移植期间传播。这些独立于媒介的感染和人类迁徙方式助长了该病的全球传播，北美、欧洲以及一些非洲、东地中海和西太平洋国家的病例数量不断增加就证明了这一点 4.ChD被认为是一种被忽视的疾病，因为病媒传播与贫困密切相关，是一个主要的公共卫生问题，特别是在拉丁美洲低收入国家。虽然有可用的治疗方法，但在拉丁美洲，ChD的死亡率是包括疟疾在内的寄生虫病中最高的2。
在1960年代末和1970年代初引入了两种用于ChD治疗的注册药物：硝呋替莫和苯硝唑5。这两种药物在成人、儿童和先天性感染新生儿以及慢性感染儿童的急性期均有效，通常可治愈这些药物。然而，只有少数人被诊断得足够早，可以及时接受治疗。根据最新的临床试验，这两种药物在成人中都有重要的局限性，并且在减轻慢性病患者的症状方面无效;因此，它们在这个阶段的使用是有争议的。其他缺点是需要延长治疗期（60-90天）和观察到频繁，严重的不良反应，这导致感染者比例6，7停止治疗。据估计，只有不到10%的ChD患者被诊断出来，甚至更少的人能够获得治疗，因为许多受影响的人生活在农村地区，无法获得或几乎没有获得医疗保健的机会8。这些事实凸显了迫切需要寻找针对T. cruzi的新药，以实现更有效，安全和适用于现场治疗，特别是对于慢性期。在这方面，开发更有效化合物的另一个挑战是评估体外和体内药物疗效的系统的限制9。
尽管用于鉴定潜在药物靶点的化学生物学和基因组方法已被用于运动弓形寄生虫，但与布鲁氏锥虫或利什曼原虫相比，克氏锥虫中可用的基因组工具有限。因此，筛选具有杀锥虫活性的化合物仍然是寻找针对ChD的新化疗候选药物最常用的方法，通常，在克氏锥虫中发现的药物必须从在体外测定中测试新药对上胚芽阶段的作用开始。几十年来，测量候选化合物对克氏锥虫的抑制作用的唯一方法是手动显微镜计数，这是费力，耗时且依赖于操作员的。此外，这种方法适用于测定少量化合物，但对于大型化合物库的高通量筛选是不可接受的。如今，许多研究都是从分析来自不同来源的大量化合物开始的，这些化合物在体外进行测定，测试它们抑制寄生虫生长的能力。已经开发了比色法和荧光法来提高这些测定的通量，提高筛选的客观性并使整个过程不那么繁琐9。
最广泛使用的比色法之一是基于由Bucknet和合作者10首次描述的转染寄生虫的β半乳糖苷酶活性。由重组寄生虫表达的β-半乳糖苷酶将显色底物氯酚红β-D-半乳糖吡喃糖苷（CPRG）水解为氯酚红，这可以使用微孔板分光光度计轻松测量比色。因此，在多种化合物存在下寄生虫的生长可以在微量滴定板中同时进行评估和定量。该方法已应用于测试上胚层形式（存在于昆虫载体中），锥虫鞭毛虫和细胞内隵突（寄生虫的哺乳动物阶段）的药物。此外，几种用pBS：CL-Neo-01/BC-X-10质粒（pLacZ）10转染以表达大肠杆菌β半乳糖苷酶的重组克氏锥虫菌株已经可用（并且可以构建新的），这允许评估来自不同离散分型单元（DTU）的寄生虫，这些寄生虫可能对相同的化合物表现不一致10，11，12，13.该方法已成功用于评估化合物在低通量和高通量筛选12，13中的对克氏锥虫的活性。类似的方法也用于其他原生动物寄生虫，包括弓形虫和墨西哥利什曼原虫14，15。
本文描述并展示了一种使用表达β半乳糖苷酶的寄生虫对克氏锥虫所有生命周期阶段进行体外药物筛选的详细方法。这里介绍的测定是用表达β半乳糖苷酶的克氏锥虫谱系进行的，该谱系是通过用pLacZ质粒（Dm28c / pLacZ）转染来自DTU I13的克氏锥虫Dm28c菌株而获得的。此外，相同的方案可以很容易地适用于其他菌株，以比较化合物之间以及克氏锥虫菌株或DTU之间的性能。
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Protocol
注： 图1概述了整个实验设计。
图1：使用CPRG作为比色反应底物的克氏锥虫Dm28c / pLacZ系列的体外筛选测定概述。该测定包括接种寄生虫（1），用BZN（2和3）孵育它们，然后加入比色底物（4）。当寄生虫裂解时，β-半乳糖苷酶被释放并将CPRG切割成氯酚红;这种颜色的变化可以通过分光光度法测量（5）。数据可以在统计分析软件中分析，以获得BZN的半抑制浓度（IC50）。缩写：CPRG = 氯酚红β-D-半乳糖苷;BZN = 苄硝唑。请点击此处查看此图的大图。
1. 储备溶液的制备
- 培养基和溶液的制备
- 血红素溶液（附表S1）
- 按照配方中给出的顺序将所有组分加入50 mL离心管中，并通过倒置多次均质。
- 通过0.22μm过滤器过滤灭菌。
- 在1.5 mL微量离心管中制备1 mL等分试样，并将其保持在-80°C直至使用。
- 肝脏输注胰蛋白酶（LIT）培养基（补充表S1）
- 称量所有组分，并在室温下在含有至少700 mL蒸馏水的1 L烧杯中搅拌均匀。
- 将pH值调节至7.2，并在1升量筒中用蒸馏水将体积加满至900毫升;通过过滤或高压灭菌（121°C灭菌20分钟）灭菌。
- 通过加入100mL胎牛血清（FCS），（10%FCS，无菌并在56°C下热灭活45分钟），20mL 40%无菌葡萄糖溶液（通过高压灭菌灭菌，121°C灭菌20分钟）和5mL血红素溶液（终浓度5μM）到900mLLIT培养基中来补充培养基。
- 按照制造商的说明，从粉末中制备杜贝克的改性鹰介质（DMEM）。
- 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（补充表S1）
- 通过在室温下在1 L烧杯中搅拌溶液来溶解所有固体组分。
- 将pH值调节至7.2，在1 L量筒中用蒸馏水水平至1L，并通过过滤或高压灭菌（121°C，20分钟）灭菌。
- 血红素溶液（附表S1）
- 苄硝唑 （BZN） 储备溶液和稀释液
注：这项工作中使用的BZN浓度范围为2.5至80μM。- 通过将13mg药物溶解在50μL二甲基亚砜（DMSO）中来制备1M BZN的储备溶液。在无菌条件下，从该1 M BZN储备溶液中以最终所需浓度（2x溶液）的两倍以足以测定孔数的最终体积制备连续稀释液。
注意：以每孔100μL的过量量计算10-20%。由于药物在培养基中的溶解度低，因此必须在测定中使用前立即制备BZN储备溶液和所有BZN稀释液。 - 制备160，80，40，20，10和5μM的2x BZN稀释液。
- 以100倍稀释（10μL 1M BZN + 990μL培养基）稀释1M BZN储备溶液，以在用于 克氏锥虫每个生命周期阶段的适当培养基中获得10mM溶液。连续混合以使悬浮液均质化。
- 在适当的培养基中稀释10 mM BZN溶液以制备320μM BZN：32μL 10mM BZN + 968μL培养基。连续混合以使悬浮液均质化。
- 将320μM BZN稀释2倍以获得160μM的浓度（500μL320μM BZN + 500μL培养基）。连续混合以使悬浮液均质化。用每个得到的溶液重复这种2倍稀释，以获得80，40，20，10和5μM溶液。
- 在适当的培养基中稀释DMSO 1，000倍，用作未经处理的对照（100%存活对照）。
注意：表观五聚体可耐受高达100倍的DMSO稀释度，而Vero细胞仅耐受高达1000倍稀释的DMSO。如有必要，可将 DMSO 为 50% 的死亡对照列为 0% 生存条件。
- 通过将13mg药物溶解在50μL二甲基亚砜（DMSO）中来制备1M BZN的储备溶液。在无菌条件下，从该1 M BZN储备溶液中以最终所需浓度（2x溶液）的两倍以足以测定孔数的最终体积制备连续稀释液。
- 基板解决方案
- 将浓度为1mM的CPRG溶解在蒸馏水中。对于96孔板，将2.4mg CPRG加入4 mL水中。
注意：CPRG溶液必须在测定前立即制备。
- 将浓度为1mM的CPRG溶解在蒸馏水中。对于96孔板，将2.4mg CPRG加入4 mL水中。
- 裂解液
- 在1x PBS中制备2.5%v / v的非离子，非变性洗涤剂2-[4-（2，4，4-三甲基戊烷-2-基）苯氧基]乙醇（见 材料表）。在测定前立即准备每96孔板1mL溶液。
2. 寄生虫培养准备
- 表皮鞭毛虫制备
注：本报告通篇使用 克氏锥虫 Dm28c/pLacZ 第13 行。- 在生长面积为25cm 2的细胞培养瓶（T-25烧瓶）中以轴ೱ态生长表达β半乳糖苷酶的克氏锥虫上胚芽。通过在补充有10%食品接触物质（补充表S1）和遗传素硫酸盐（G418）的LIT培养基中以200μg/ mL的最终浓度每48-72小时（在5mL中）传代来维持对数期培养物。在传代之前，通过在Neubauer室中进行细胞计数来量化寄生虫生长。牢固地关闭盖子并将培养瓶（不通风）保持在28°C的垂直位置。
注意：G418 确保 pLacZ 质粒的选择和维护。对于 Dm28c/pLacZ 线，对数相培养物的上胚量浓度为 1-5 × 107 个寄生虫/mL。 - 从补充有G418抗生素的LIT中的对数相培养物中制备2×105 个上胚芽肿/ mL的悬浮液。将96孔微孔板的每孔分配100μL上马鞭毛滴液（100μLLIT中为20，000个上胚量），并用培养基将最终体积组成为每孔200μL。
- 在生长面积为25cm 2的细胞培养瓶（T-25烧瓶）中以轴ೱ态生长表达β半乳糖苷酶的克氏锥虫上胚芽。通过在补充有10%食品接触物质（补充表S1）和遗传素硫酸盐（G418）的LIT培养基中以200μg/ mL的最终浓度每48-72小时（在5mL中）传代来维持对数期培养物。在传代之前，通过在Neubauer室中进行细胞计数来量化寄生虫生长。牢固地关闭盖子并将培养瓶（不通风）保持在28°C的垂直位置。
- 阿马鞭草制剂
- 使用从老化的上胚层培养物中获得的自发性超环色斑鞭毛虫（在该方案中为7天）在T-25烧瓶中进行初始感染，其中2×105 Vero细胞先前接种在DMEM中，并补充2%FCS。
- 在Neubauer室中计数超环色氨酸柱头瘤的数量，在5mLDMEM中用2%FCS感染10的多重感染（MOI）感染Vero细胞单层，并在37°C和5%CO2 下孵育16小时。用5 mL无菌移液管从烧瓶中取出培养基，洗涤剩余的锥虫鞭毛虫，然后加入5mL 1x PBS并抽吸。最后，加入5 mL DMEM和2%FCS并在相同条件下孵育。
- 使用从受感染的Vero细胞单层中出现的色胸鞭毛虫来维持T-25烧瓶中的感染，其中2×10个5 Vero细胞在DMEM中具有2%FCS，每周产生一个新的感染瓶。
注意：5-7天后，色斑鞭毛开始出现，并在上清液中可见。不要将G418添加到用于感染细胞或受感染细胞的锥虫中，因为Vero细胞系对G418没有抗性。
- 在DMEM中制备1×105 Vero细胞/ mL的悬浮液，并补充2%FCS，并在96孔组织培养板（每孔10，000个细胞）中每孔接种100μL悬浮液。在37°C和5%CO 2下孵育过夜（12-16 小时），以确保细胞粘附在孔的底部。
- 孵育过夜后，用100μL无菌1x PBS冲洗Vero细胞单层三次。加入 克氏锥虫 Dm28c/pLacZ 锥虫（从先前在 T-25 烧瓶中的感染中获得，步骤 2.2.1）在 100 μL DMEM 中 10，每孔补充 2% FCS（每孔 100，000 个锥虫）。
- 将板在37°C和5%CO2下孵育6小时。在此孵育期之后，用1x PBS洗涤板两次，并加入100μL不含酚红的DMEM，并补充2%FCS。
注意：48小时后（感染后2天），用光学显微镜可见胞浆内隼果。酚红是DMEM和其他细胞培养基中的pH指示剂，可能会干扰CPRG的吸光度测量。如果没有不含酚红的 DMEM，请参阅下面 3.2.1 节中提到的替代方法。
- 使用从老化的上胚层培养物中获得的自发性超环色斑鞭毛虫（在该方案中为7天）在T-25烧瓶中进行初始感染，其中2×105 Vero细胞先前接种在DMEM中，并补充2%FCS。
- 锥虫铮制剂
- 在DMEM中制备1×10个6 Vero细胞/ mL的悬浮液，并补充2%FCS，并在T-25烧瓶中的5mL培养基中接种800，000个细胞。在37°C和5%CO 2下孵育过夜（12-16 小时）以确保细胞粘附。
注意：对于T-75烧瓶，接种2×106 个细胞，最终体积为15 mL。 - 孵育后，用3 mL无菌1x PBS冲洗两次。在 5 mL DMEM 中加入 克氏锥虫 Dm28c/pLacZ 锥虫，加入 2% FCS（8 × 106 个色氨酸，用于 T-25 烧瓶）。
注意：对于T-75烧瓶，在15mL DMEM的最终体积中加入20×10 6 个色氨酸，2%FCS。 - 在37°C和5%CO 2下孵育过夜（12-16小时）。用 3 mL 1x PBS 洗涤烧瓶两次，并加入 5 mL 补充 2% FCS 的新鲜 DMEM。在37°C和5%CO2 下孵育四天。
- 在光学显微镜下检查上清液中的锥虫。通过在诺伊鲍尔腔室中计数来量化锥虫鞭毛虫。将上清液收集在15mL管中，并在室温下以7，000× g 离心10分钟。
- 弃去上清液并重悬沉淀，在DMEM中获得浓度为1×10 6 个色氨酸靛铁/mL，不含酚红，并补充2%FCS。在96孔板中接种100μL锥虫鼓组悬浮液（每孔100，000个色氨酸）
注：如果没有不含酚红的 DMEM，请参阅下面第 3.2.1 节中的替代方法。
- 在DMEM中制备1×10个6 Vero细胞/ mL的悬浮液，并补充2%FCS，并在T-25烧瓶中的5mL培养基中接种800，000个细胞。在37°C和5%CO 2下孵育过夜（12-16 小时）以确保细胞粘附。
3. β-半乳糖苷酶测定
注意：β半乳糖苷酶活性的定量被用作确定寄生虫数量的间接方法。预计在杀锥虫化合物存在下生长将受到抑制，导致与未经处理的对照相比，寄生虫数量较少，这将反映在较低的β半乳糖苷酶活性中，因此吸光度较低。
- 将寄生虫与BZN孵育。
- 每孔加入100μL相应的2x BZN溶液，以达到80，40，20，10，5和2.5μM至100μL表靛混悬液（从步骤2.1开始），具有马氏体（感染后2天）的Vero细胞（步骤2.2）或锥虫鞭毛（步骤2.3）在96孔板中。
- 将表阑在28°C下孵育72小时，并将锥虫卵或感染的Vero细胞与金刚砂苷在37°C和5%CO 2下孵育24小时。
注意：每种药物浓度应至少一式三份进行评估，包括上胚聚物、锥虫和DMSO感染的Vero细胞的对照培养（参见步骤1.2.2.4）。
- 比色反应
- 在治疗潜伏期后，如果感染的Vero细胞或锥虫在DMEM中用酚红，用100μL1x PBS替换培养基以避免干扰。对仅含有 100 μL 相应培养基（或 1x PBS，视情况而定）的空白孔进行一式三份的空孔。
注意：在LIT培养基或DMEM没有酚红的情况下，没有必要去除上锗的培养基。含有酚红的DMEM仍然可以使用;单独使用DMEM准备一个空白孔以测量碱基吸光度，然后在数据分析期间减去该值（步骤3.3.）。施耐德的昆虫培养基是无色的，是上胚层的替代品。 - 向每个孔中加入40μL CPRG底物溶液和10μL洗涤剂溶液，在每个孔中以250μL的最终体积获得200μM CPRG和0.1%洗涤剂的最终浓度。
注意：CPRG溶液和洗涤剂可以以每孔50μL的最终体积相加。 - 在37°C下孵育2小时，并在微孔板分光光度计中测量595nm处的吸光度。
注意：在β半乳糖苷酶酶解理时，预期的颜色变化为黄色至红棕色（图2A）。孵育时间可以延长至4小时，并且可以使用类似的曲线拟合在570至595nm之间读取氯酚红的吸光度光谱（补充图S1A，B）。在CPRG底物存在下孵育长达24小时显示出类似的曲线拟合（补充图S1C）。- 在带有单色器选择器的微孔板分光光度计中，在设备软件中创建新的实验方案（补充图S2）。
- 点击 吸光度 作为 检测方法|终结点作为读取类型 |好的（补充图S2A）。添加 读取步骤，键入所选波长，然后单击 确定（补充图S2B）。
- 在 “板布局” 部分中，标记要读取的孔，然后单击 “确定” （补充图S2C）。要读取印版，请将其插入托盘中，然后单击“ 读取印版”。等待值出现在屏幕上（补充图S2D），然后将其导出到电子表格中以分析结果。
- 在治疗潜伏期后，如果感染的Vero细胞或锥虫在DMEM中用酚红，用100μL1x PBS替换培养基以避免干扰。对仅含有 100 μL 相应培养基（或 1x PBS，视情况而定）的空白孔进行一式三份的空孔。
- 数据分析和培养基抑制剂浓度 （IC50） 计算
- 减去空白测量值，仅对应于LIT介质，1x PBS或DMEM，含或不含酚红加上CPRG洗涤剂溶液。在测试有色化合物的杀锥活性时，使用LIT或DMEM测量其他空白对照对照的吸光度，每种药物浓度，然后从每种浓度下寄生虫获得的吸光度值中减去这些值。
注意： 补充表S2 显示了使用不含寄生虫的这些培养基加CPRG洗涤剂溶液在该测定中获得的典型值。添加CPRG之前和之后的差异是显着的，但不干扰寄生虫的测定（补充表S2）。 - 在统计分析软件中，在xy表中绘制BZN（以μM为单位）的浓度与595nm处的吸光度。将BZN浓度转换为对数值，方法是单击“ 分析 ”按钮，选择“ 转换 ”选项 |“使用x=log（x）选项转换x值 ，然后单击” 确定 “按钮。
- 从统计分析软件获取 IC50 值。
注意：IC50 定义为与未经处理的对照相比，将寄生虫生长减少50%的药物浓度，并计算为拟合曲线的乙状函数的拐点。- 在统计分析软件中，单击分析按钮，在 xy 分析列表中选择非线性回归（曲线拟合），然后单击确定。
- 在“参数”窗口的模型选项卡中，在内置方程的剂量-响应-抑制组中，选择选项剂量-响应方法：log（抑制剂）与响应-可变斜率（四个参数）。将所有其他选项卡保留为默认值;单击“确定”。
- 单击统计分析软件 的结果 部分，查找 IC50 值、 SD 和 拟合优度。
- 单击图形部分以查找药物对数浓度与吸光度值的xy图。寻找曲线拟合也以不同的颜色绘制。
注意：免费的在线 IC50 计算工具可在 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator 找到。
- 减去空白测量值，仅对应于LIT介质，1x PBS或DMEM，含或不含酚红加上CPRG洗涤剂溶液。在测试有色化合物的杀锥活性时，使用LIT或DMEM测量其他空白对照对照的吸光度，每种药物浓度，然后从每种浓度下寄生虫获得的吸光度值中减去这些值。
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Representative Results
按照上述方案，将表达β半乳糖苷酶的Dm28c表观五磷酸盐与6浓度的BZN（2.5，5，10，20，40，80μM）（或感兴趣的化合物）一起孵育72小时。在此之后，CPRG试剂与洗涤剂一起加入，洗涤剂裂解细胞并释放β半乳糖苷酶。CPRG被β-半乳糖苷酶切割以产生氯酚红，导致颜色从黄色变为红色（图2A）。通过在酶标仪中读取2小时后595nm处的吸光度来测量氯酚红。用BZN的对数浓度与595nm处的吸光度绘制了XY表。该图使用非线性回归拟合（图 2B）。在该特定实验中，获得的用于表靛的IC 50为20.59±1.075μM，类似于从文献中获得的IC 50（表I）16，17。使用这种方法对色胺瘤和阿马鞭毛虫的代表性结果已在前面描述13。
图2：计算用于表观靛组形式的苄硝唑的IC50 值Dm28c。 （A）在加入CPRG（1）之前，在初始加入CPRG和洗涤剂（2）之后，以及与CPRG和洗涤剂一起孵育后，用不同浓度的BZN浓度（2.5，5，10，20，40和80μM）处理的表观阯蓝的96孔板（3）。（B）Dm28c/pLacZ表观五磷酸特在595 nm处BZN对数浓度与吸光度（OD）的XY图。使用非线性回归拟合该图来估计 IC50 值。每个值表示 6 个独立生物重复的平均值和标准偏差（误差线）。连续的蓝线表示曲线拟合。缩写：CPRG = 氯酚红β-D-半乳糖苷;BZN = 苄硝唑;OD = 光密度;C = 控制。 请点击此处查看此图的大图。
| 使用表达β半乳糖苷酶的 Dm28c 计算的 BZN IC50 （μM） | 文献中报道的比特币 IC50 （μM） | |
| 表观 | 17.08 至 20.59 | 11 到 18.72 |
| 阿马鞭毛虫 | 2，31 到 3，92 | 1，66 到 4，39 |
| 锥虫 | 27.07 至 44.74 | 24.68 至 50.72 |
表1：使用该方案获得的上锗五聚糖、色胸钽和靛靛的IC50值范围与文献17，18中报道的IC 50值进行比较。
补充图S1：用于读取吸光度的酶标仪软件的设置。请按此下载此档案。
补充图S2：在不同时间点与CPRG孵育后，使用来自克氏锥虫的Dm28c / pLacZ系的表观锄进行β半乳糖苷酶活性测量（570至595nm处的光密度）。值表示为三个独立重复的平均值和标准差。彩色连续线表示曲线拟合。（A）用200μM CPRG孵育2小时（B）与200μM CPRG孵育4小时（C）表示不同时间点（2，4和24小时）的β半乳糖苷酶活性（570nm处的光密度）。缩写：CPRG =氯酚红β-D-半乳糖苷。请按此下载此档案。
补充表S1：LIT培养基、血红素和PBS的组成和制备。 缩写： LIT = 肝脏输注胰蛋白酶;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请按此下载此表格。
补充表S2：没有寄生虫的LIT和DMEM培养基的吸光度读数。 值表示为每种介质的一式三份; 介质 行包含三个重复的平均值;， 则 SD 行包含仿行的标准偏差值。缩写： SD = 标准偏差;LIT = 肝脏输注胰蛋白酶;DMEM = 杜尔贝科的改良鹰中。 请按此下载此表格。
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Discussion
本文描述了一种基于测定由于 克氏锥虫 上锗、色斑锄或感染细胞的膜裂解而释放的细胞质β半乳糖苷酶活性的测定方法。我们使用 克氏锥虫 Dm28c/pLacZ 寄生虫，这是一种稳定的寄生虫菌株，由 Buckner 和合著者10 构建的含β半乳糖苷酶质粒转染后获得。该测定已被用于寻找抗失色化合物12，19，20，21。使用 克氏锥虫 Dm28c/pLacZ 菌株优化筛选方案。如图 1所示，该协议有四个主要点;第一种是在96孔板中寄生寄生虫。表观五聚体和锥虫卵胎从悬浮液中计数和播种。在靛虫的情况下，首先接种Vero细胞以形成贴壁单层，然后感染锥虫鞭毛虫。48小时后，细胞内存在靛虫。其次，准备要以所需浓度测试的药物的稀释液并与寄生虫一起孵育。最后，第三步涉及添加CPRG和洗涤剂来裂解细胞。CPRG在β-半乳糖苷酶从寄生虫细胞质释放时被切割，并产生氯酚红并以分光光度法测量。第四个关键步骤涉及数据分析，构建x-y图，以及拟合获得的曲线以计算目标药物的IC50 值。
对克氏锥虫所有生命周期阶段的体外测定是研究潜在新药效果的第一步。在这些测定中，通过显微镜计数来评估效果，这是一种耗时且主观的过程，难以自动化。用比色测定代替这种技术可以提高筛选的客观性，也使其不那么耗时。比色板读数只需几分钟，而劳动密集型手动显微镜计数所需的时间则不同，并且有助于筛选具有潜在治疗价值的大型新化合物库。关于表达β半乳糖苷酶的寄生虫（Dm28c/pLacZ）与野生型Dm28c菌株的总体相似性，我们确定寄生虫在形态上是正常的，具有相似的生长速率，并且在生命周期形式中分化程度相同。此外，比较野生型Dm28c和通过显微镜计数定量的Dm28c/pLacZ品系获得的药物检测结果显示差异不显著13.
该协议的一个局限性是有色培养基可能会干扰测量的吸光度。建议使用不含酚红的 DMEM（或 RPMI）来克服此限制。在该协议中，成功将带有DMEM的空白孔用作基础吸光度值。另一个限制是使用有色药物时的假定干扰，可以使用化合物作为空白的介质或通过选择570至595nm之间的吸光度波长来克服这一点，从而获得最低的干扰。CPRG不会因给定药物的存在（有色或无色）而改变，使该测定非常可靠。当使用含有酚红或有色药物的培养基时，对每种情况进行空白对照，然后减去从寄生虫测量中获得的吸光度值以避免任何干扰，这一点至关重要。
报告的 克氏锥虫 和刚 地弓形虫 的CPRG溶液浓度为100μM10，15。然而，报告的表观五聚物的最佳浓度为200μM11。在该Dm28c/ pLacZ系列中，使用200μM CPRG溶液进行上胚芽肿，色斑铯和靛靛，结果可靠。关于CPRG孵育时间，当外消旋体与底物溶液一起孵育2小时（R2 = 0.9995）时，实现了最佳的曲线拟合。然而，R2 非常相似（R2 = 0.9994），并且在4 h时β-半乳糖苷酶活性在每孔6，250-200，000个表体（即62，500-2，000，000个表靛/mL）的范围内呈线性（补充图S2）。据报道，每孔3，150-100，000个色氨酸（即31，500-1，000，000个色斑/mL）的色斑靛13的线性范围。为了避免观察到较大的标准偏差，重要的是在每个孔中播种正确数量的寄生虫。由于体积小，在播种前计数寄生虫时保持一致非常重要。此外，如有必要，可以针对每个实验条件测量三个以上的重复。
与其他比色法筛选测定22不同，此处不需要后续操作步骤，从而提高了测定的可重复性和可靠性以及数据收集的速度。这是一种简单，快速和可靠的测定，适用于ChD治疗候选化合物的高通量药物筛选，并且可以应用于其他 克氏锥虫 菌株。pLacZ质粒可根据Bucker实验室的要求获得，可用于转染抗性菌株，例如敲除线，以评估该品系对不同遗传背景中不同药物的敏感性。要记住的唯一关键点是敲除质粒应具有与pLacZ不同的抗生素耐药性标志物。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢巴克纳博士慷慨地提供了pLacZ质粒。这项工作得到了阿根廷国家科学与技术促进署（PICT2016-0439、PICT2019-0526、PICT2019-4212）和英国研究理事会[MR/P027989/1]的支持。施维雅医学艺术被用来制作 图1 （https://smart.servier.com）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
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