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Biochemistry

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Descriviamo un saggio colorimetrico ad alto rendimento che misura l'attività β-galattosidasi in tre fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi, l'agente eziologico della malattia di Chagas. Questo test può essere utilizzato per identificare i composti tripanocidi in modo facile, veloce e riproducibile.

Abstract

Trypanosoma cruzi è l'agente eziologico della malattia di Chagas (ChD), una malattia endemica di importanza per la salute pubblica in America Latina che colpisce anche molti paesi non endemici a causa dell'aumento della migrazione. Questa malattia colpisce quasi 8 milioni di persone, con nuovi casi stimati in 50.000 all'anno. Negli anni 1960 e '70, sono stati introdotti due farmaci per il trattamento della ChD: nifurtimox e benznidazolo (BZN). Entrambi sono efficaci nei neonati e durante la fase acuta della malattia ma non nella fase cronica, e il loro uso è associato a importanti effetti collaterali. Questi fatti sottolineano l'urgente necessità di intensificare la ricerca di nuovi farmaci contro T. cruzi.

T. cruzi è trasmesso attraverso insetti vettori ematofagi delle famiglie Reduviidae ed Hemiptera. Una volta nell'ospite mammifero, si moltiplica intracellulare come forma amastigote non flagellata e si differenzia nella tripomastigote, la forma infettiva non replicativa del flusso sanguigno. All'interno dell'insetto vettore, i tripomastigoti si trasformano nello stadio epimastigote e si moltiplicano attraverso la fissione binaria.

Questo articolo descrive un test basato sulla misurazione dell'attività della β-galattosidasi citoplasmatica rilasciata nella coltura a causa della lisi dei parassiti utilizzando il substrato, clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG). Per questo, il ceppo T. cruzi Dm28c è stato trasfettato con un plasmide sovraespressivo β-galattosidasi e utilizzato per lo screening farmacologico in vitro negli stadi epimastigote, tripomastigote e amastigote. Questo articolo descrive anche come misurare l'attività enzimatica in epimastigoti in coltura, cellule Vero infette con amastigoti e tripomastigoti rilasciati dalle cellule coltivate utilizzando il farmaco di riferimento, il benznidazolo, come esempio. Questo test colorimetrico è facilmente eseguibile e può essere scalato in un formato ad alta produttività e applicato ad altri ceppi di T. cruzi .

Introduction

La malattia di Chagas (ChD), o tripanosomiasi americana, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD inizia con una fase acuta asintomatica o oligosintomatica che di solito non viene diagnosticata, seguita da una fase cronica permanente. Nella cronicità, ~ 30% dei pazienti manifesta - decenni dopo l'infezione - una varietà di condizioni debilitanti, tra cui miocardiopatia, sindromi mega-digestive, o entrambe, con un tasso di mortalità che va dallo 0,2% al 20% 1,2,3. I pazienti cronici asintomatici possono non avere segni clinici, ma rimangono sieropositivi per tutta la vita.

Le stime suggeriscono che circa 7 milioni di persone sono infette in tutto il mondo, per lo più dall'America Latina, dove la ChD è endemica. In questi paesi, T. cruzi viene trasmesso principalmente attraverso insetti triatomine infetti succhiatori di sangue (trasmissione trasmessa da vettori) e meno frequentemente per trasmissione orale attraverso l'ingestione di alimenti contaminati da feci di triatomina contenenti i parassiti2. Inoltre, il parassita può essere trasmesso attraverso la placenta dalle madri chagasic ai neonati, attraverso trasfusioni di sangue o durante il trapianto di organi. Questi modi indipendenti dal vettore di acquisire l'infezione e la migrazione umana hanno contribuito alla diffusione mondiale della malattia, evidenziata da un numero crescente di casi in Nord America, Europa e alcuni paesi africani, del Mediterraneo orientale e del Pacifico occidentale4. La ChD è considerata una malattia trascurata in quanto la trasmissione trasmessa da vettori è strettamente associata alla povertà ed è un importante problema di salute pubblica, specialmente nei paesi a basso reddito dell'America Latina. Sebbene ci siano trattamenti disponibili, la mortalità dovuta a ChD in America Latina è la più alta tra le malattie parassitarie, tra cui la malaria2.

Ci sono due farmaci registrati per il trattamento ChD introdotti alla fine del 1960 e all'inizio del 1970: nifurtimox e benznidazolo5. Entrambi i farmaci sono efficaci nella fase acuta della malattia negli adulti, nei bambini e nei neonati congenitamente infetti, così come nei bambini con infezione cronica, dove di solito si ottiene la cura. Tuttavia, solo poche persone vengono diagnosticate abbastanza presto da essere trattate in tempo. Secondo gli ultimi studi clinici, entrambi i farmaci hanno importanti limitazioni negli adulti e sono stati inefficaci nel ridurre i sintomi nelle persone con malattie croniche; quindi, il loro uso in questa fase è controverso. Altri inconvenienti sono i periodi di trattamento prolungati richiesti (60-90 giorni) e gli effetti avversi frequenti e gravi osservati, che portano all'interruzione della terapia in una percentuale di persone infette 6,7. Si stima che meno del 10% delle persone con ChD siano state diagnosticate e ancora meno abbiano accesso alle cure, poiché molti individui affetti vivono in aree rurali con accesso assente o scarso all'assistenza sanitaria8. Questi fatti evidenziano l'urgente necessità di trovare nuovi farmaci contro T. cruzi per consentire trattamenti più efficienti, sicuri e applicabili al campo, specialmente per la fase cronica. A questo proposito, un'altra sfida nello sviluppo di composti più efficaci è la limitazione dei sistemi per valutare l'efficacia dei farmaci in vitro e in vivo9.

Sebbene la biologia chimica e gli approcci genomici per l'identificazione di potenziali bersagli farmacologici siano stati utilizzati nei parassiti kinetoplastidi, gli strumenti genomici disponibili in T. cruzi sono limitati in contrasto con T. brucei o Leishmania. Pertanto, lo screening di composti con attività tripanocida è ancora l'approccio più utilizzato nella ricerca di nuovi candidati farmaci chemioterapici contro ChD. Di solito, la scoperta di farmaci in T. cruzi deve iniziare con il test degli effetti di un nuovo farmaco in un test in vitro contro lo stadio epimastigote. Per decenni, l'unico modo per misurare gli effetti inibitori dei composti candidati su T. cruzi era il conteggio microscopico manuale, che è laborioso, dispendioso in termini di tempo e dipendente dall'operatore. Inoltre, questo approccio è adatto per l'analisi di un piccolo numero di composti, ma è inaccettabile per lo screening ad alto rendimento di grandi librerie di composti. Al giorno d'oggi, molte indagini iniziano con l'analisi di un vasto numero di composti di origini diverse che vengono analizzati in vitro, testando la loro capacità di inibire la crescita dei parassiti. Sono stati sviluppati sia metodi colorimetrici che fluorometrici per aumentare la produttività in questi saggi, migliorando l'obiettività dello screening e rendendo l'intero processo meno noioso9.

Uno dei metodi colorimetrici più utilizzati si basa sull'attività β-galattosidasi dei parassiti trasfettati descritti per la prima volta da Bucknet e dai collaboratori10. L'enzima β-galattosidasi espresso dai parassiti ricombinanti idrolizza il substrato cromogenico, il clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG), al rosso clorofenolo, che può essere facilmente misurato colorimetricamente utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre. Pertanto, la crescita del parassita in presenza di una varietà di composti può essere simultaneamente valutata e quantificata in piastre di microtitolazione. Questo metodo è stato applicato per testare farmaci in forme epimastigote (presenti nell'insetto vettore), tripomastigoti e amastigoti intracellulari, gli stadi mammiferi del parassita. Inoltre, sono già disponibili diversi ceppi di T. cruzi ricombinanti trasfettati con il plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 per esprimere l'enzima Escherichia coli β-galattosidasi (e ne possono essere costruiti di nuovi), che consente la valutazione di parassiti provenienti da diverse unità di tipizzazione discreta (DTU) che potrebbero non comportarsi allo stesso modo verso gli stessi composti 10,11,12,13 . Questo metodo è già stato utilizzato con successo per valutare i composti per l'attività contro T. cruzi nello screening a bassa e alta produttività12,13. Approcci simili sono stati utilizzati anche in altri parassiti protozoari, tra cui Toxoplasma gondii e Leishmania mexicana14,15.

Questo documento descrive e mostra un metodo dettagliato per uno screening farmacologico in vitro contro tutte le fasi del ciclo di vita di T. cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi. I saggi qui presentati sono stati eseguiti con una linea di T. cruzi che esprime β galattosidasi ottenuta per trasfezione del ceppo T. cruzi Dm28c da DTU I13 con plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). Inoltre, lo stesso protocollo potrebbe essere facilmente adattato ad altri ceppi per confrontare le prestazioni tra composti e tra ceppi di T. cruzi o DTU.

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Protocol

NOTA: una panoramica dell'intero progetto sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Panoramica del test di screening in vitro della linea Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilizzando CPRG come substrato per la reazione colorimetrica. Il test consiste nel seminare i parassiti (1), incubarli con BZN (2 e 3) e quindi aggiungere il substrato colorimetrico (4). Quando i parassiti vengono lisati, viene rilasciata β-galattosidasi e scinde CPRG in rosso clorofenolo; questo cambiamento di colore può essere misurato spettrofotometricamente (5). I dati possono essere analizzati in un software di analisi statistica per ottenere la concentrazione semi-inibitoria (IC50) di BZN. Abbreviazioni: CPRG = clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside; BZN = benznidazolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione di soluzioni stock

  1. Preparazione di media e soluzioni
    1. Soluzione di hemin (Tabella supplementare S1)
      1. Aggiungere tutti i componenti a un tubo centrifuga da 50 ml nell'ordine indicato nella ricetta e omogeneizzare per inversione più volte.
      2. Sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm.
      3. Preparare aliquote da 1 mL in tubi microcentrifuga da 1,5 mL e mantenerli a -80 °C fino all'uso.
    2. Iniezione epatica triptosio (LIT) Media (Tabella supplementare S1)
      1. Pesare tutti i componenti e mescolare per omogeneizzare a temperatura ambiente in un becher da 1 L contenente almeno 700 ml di acqua distillata.
      2. Regolare il pH a 7,2 e rabboccare il volume a 900 ml in un cilindro graduato da 1 L con acqua distillata; sterilizzare per filtrazione o autoclave (121 °C per 20 min).
      3. Integrare il mezzo aggiungendo 100 mL di siero fetale di vitello (FCS), (10% FCS, sterile e inattivato termicamente a 56 °C per 45 min), 20 ml di soluzione di glucosio sterile al 40% (sterilizzata mediante autoclave, 121 °C per 20 min) e 5 ml di soluzione di emina (concentrazione finale 5 μM) a 900 mL di mezzo LIT.
    3. Preparare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco dalla polvere seguendo le istruzioni del produttore.
    4. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Tabella supplementare S1)
      1. Sciogliere tutti i componenti solidi mescolando la soluzione a temperatura ambiente in un becher da 1 L.
      2. Regolare il pH a 7,2, livellare fino a 1 L in un cilindro graduato da 1 L con acqua distillata e sterilizzare mediante filtrazione o autoclave (121 °C, 20 min).
  2. Soluzioni e diluizioni stock di benznidazolo (BZN)
    NOTA: L'intervallo di concentrazione di BZN utilizzato in questo lavoro era compreso tra 2,5 e 80 μM.
    1. Preparare una soluzione madre di 1 M BZN sciogliendo 13 mg del farmaco in 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO). In condizioni asettiche, preparare diluizioni seriali da questa soluzione madre BZN da 1 M al doppio della concentrazione finale desiderata (soluzioni 2x) in un volume finale adeguato al numero di pozzetti da analizzare.
      NOTA: Calcolare per 100 μL per pozzetto con un eccesso di 10-20%. La soluzione madre BZN e tutte le diluizioni BZN devono essere preparate immediatamente prima dell'uso nel test a causa della bassa solubilità del farmaco nel mezzo.
    2. Preparare 2 diluizioni BZN di 160, 80, 40, 20, 10 e 5 μM.
      1. Diluire la soluzione madre 1 M BZN a una diluizione di 100 volte (10 μL di 1 M BZN + 990 μL di mezzo) per ottenere una soluzione di 10 mM nel mezzo appropriato utilizzato per ogni fase del ciclo di vita di T. cruzi. Mescolare continuamente per omogeneizzare la sospensione.
      2. Diluire la soluzione di BZN da 10 mM per preparare 320 μM di BZN nel mezzo appropriato: 32 μL di 10 mM BZN + 968 μL di mezzo. Mescolare continuamente per omogeneizzare la sospensione.
      3. Diluire 320 μM BZN 2 volte per ottenere una concentrazione di 160 μM (500 μL di 320 μM BZN + 500 μL di mezzo). Mescolare continuamente per omogeneizzare la sospensione. Ripetere questa diluizione 2 volte con ogni soluzione risultante per ottenere soluzioni da 80, 40, 20, 10 e 5 μM.
      4. DMSO diluito 1.000 volte nel mezzo appropriato per l'uso come controllo non trattato (controllo della sopravvivenza al 100%).
        NOTA: gli epimastigoti tollerano fino a una diluizione di DMSO di 100 volte, mentre le cellule Vero tollerano solo una diluizione di DMSO fino a 1.000 volte. Se necessario, un controllo della morte con il 50% di DMSO può essere incluso come condizione di sopravvivenza allo 0%.
  3. Soluzione di substrato
    1. Sciogliere CPRG a 1 mM di concentrazione in acqua distillata. Per una piastra da 96 pozzetti, aggiungere 2,4 mg di CPRG a 4 ml di acqua.
      NOTA: la soluzione cprg deve essere preparata immediatamente prima del test.
  4. Soluzione di lisi
    1. Preparare una soluzione al 2,5% v/v di detergente non ionico e non denaturante 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-il)fenossi]etanolo (vedere la tabella dei materiali) in 1x PBS. Preparare 1 mL di soluzione per piastra da 96 pozzetti immediatamente prima del test.

2. Preparazione della coltura del parassita

  1. Preparazione epimastigote
    NOTA: T. cruzi Dm28c/pLacZ linea13 è utilizzato in tutto questo rapporto.
    1. Coltivare axenicamente a 28 °C i bubottinite che esprimono β galattosidasi a 28 °C in palloni di coltura cellulare con un'area di crescita di 25 cm2 (palloni T-25). Mantenere le colture in fase logaritmica subculturando ogni 48-72 h (in 5 mL) in mezzo LIT integrato con 10% FCS (Tabella Supplementare S1) e geneticina solfato (G418) ad una concentrazione finale di 200 μg/mL. Quantificare la crescita dei parassiti contando le cellule in una camera neubauer prima di subculturare. Chiudere saldamente il tappo e mantenere il matraccio di coltura (non ventilato) a 28 °C in posizione verticale.
      NOTA: G418 garantisce la selezione e la manutenzione del plasmide pLacZ. Le colture in fase logaritrica hanno una concentrazione di epimastigote di 1-5 × 107 parassiti/mL per la linea Dm28c/pLacZ.
    2. Preparare una sospensione di 2 × 105 epimastigoti/mL da una coltura in fase logaritmica in LIT integrata con antibiotico G418. Erogare 100 μL della sospensione di epimastigote per pozzetto (20.000 epimastigoti in 100 μL di LIT) di una micropiastra a 96 pozzetti e portare il volume finale a 200 μL per pozzetto con il mezzo.
  2. Preparazione amastigote
    1. Utilizzare tripomastitigoti metaciclici spontanei ottenuti da una coltura di epimastigote invecchiata (per 7 giorni in questo protocollo) per eseguire un'infezione iniziale in un pallone T-25 con 2 × 105 cellule Vero seminate in precedenza in DMEM integrate con FCS al 2%.
      1. Contare il numero di tripomastitigoti metaciclici in una camera neubauer, infettare il monostrato cellulare Vero con una molteplicità di infezione (MOI) di 10 in 5 ml di DMEM con 2% FCS e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 16 ore. Lavare i tripomastigoti rimanenti rimuovendo il mezzo dal matraccio con una pipetta sterile da 5 ml, quindi aggiungere 5 mL di 1x PBS e aspirare. Infine, aggiungere 5 ml di DMEM con il 2% di FCS e incubare nelle stesse condizioni.
      2. Utilizzare i tripomastigoti che emergono dal monostrato cellulare Vero infetto per mantenere l'infezione in palloni T-25 con 2 × 105 cellule Vero in DMEM con FCS al 2%, generando una nuova bottiglia infetta ogni settimana.
        NOTA: Dopo 5-7 giorni, i tripomastiti iniziano ad emergere e sono visibili nel surnatante. Non aggiungere G418 ai tripomastigoti usati per infettare le cellule o le cellule infette, poiché la linea cellulare Vero non è resistente a G418.
    2. Preparare una sospensione di 1 × 105 cellule Vero/mL in DMEM integrata con 2% fcs e seme 100 μL della sospensione per pozzetto in piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti (10.000 cellule per pozzetto). Incubare durante la notte (12-16 h) a 37 °C e 5% di CO2 per garantire l'aderenza cellulare al fondo dei pozzetti.
    3. Dopo l'incubazione notturna, sciacquare il monostrato cellulare Vero tre volte con 100 μL di PBS sterile 1x. Aggiungere T. cruzi Dm28c/pLacZ tripomastigotes (ottenuto da una precedente infezione in un pallone T-25, fase 2.2.1) ad un MOI di 10 su 100 μL di DMEM integrato con il 2% di FCS per pozzetto (100.000 tripomatigoti per pozzetto).
    4. Incubare le piastre per 6 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo questo periodo di incubazione, lavare le piastre due volte con 1x PBS e aggiungere 100 μL di DMEM senza rosso fenolo integrato con il 2% di FCS.
      NOTA: Dopo 48 ore (2 giorni dopo l'infezione), gli amastigoti intracitoplasmatici sono visibili con un microscopio ottico. Il rosso fenolo, un indicatore di pH nel DMEM e in altri terreni di coltura cellulare, potrebbe interferire con la misurazione dell'assorbanza del CPRG. Se DMEM senza rosso fenolo non è disponibile, vedere le alternative menzionate di seguito al paragrafo 3.2.1.
  3. Preparazione di tripomastigote
    1. Preparare una sospensione di 1 × 106 cellule Vero/mL in DMEM integrata con 2% fcs e semina 800.000 cellule in 5 mL del mezzo in palloni T-25. Incubare durante la notte (12-16 h) a 37 °C e 5% di CO2 per garantire l'aderenza cellulare.
      NOTA: per un pallone T-75, il seme 2 × 106 celle in un volume finale di 15 ml.
    2. Dopo l'incubazione, risciacquare due volte con 3 ml di PBS sterile 1x. Aggiungere T. cruzi Dm28c/pLacZ tripomastigotes ad un MOI di 10 in 5 ml di DMEM con 2% DI FCS (8 × 106 tripomastiti per un pallone T-25).
      NOTA: Per un pallone T-75, aggiungere 20 × 106 tripomastiti in un volume finale di 15 ml di DMEM con il 2% di FCS.
    3. Incubare durante la notte (12-16 h) a 37 °C e 5% DI CO2. Lavare il matraccio due volte con 3 mL di 1x PBS e aggiungere 5 mL di DMEM fresco integrato con il 2% di FCS. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per quattro giorni.
    4. Controllare il surnatante per i tripomastimiti al microscopio ottico. Quantificare i tripomastimiti contandoli in una camera neubauer. Raccogliere il surnatante in un tubo da 15 ml e centrifugare a 7.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet per ottenere una concentrazione di 1 × 106 tripomastigoti/mL in DMEM senza rosso fenolo integrato con 2% FCS. Semina 100 μL della sospensione di tripomastigote (100.000 tripomastiti per pozzetto) in una piastra da 96 pozzetti.
      NOTA: se DMEM senza rosso fenolo non è disponibile, vedere le alternative riportate di seguito al paragrafo 3.2.1.

3. saggio β-galattosidasi

NOTA: La quantificazione dell'attività della β-galattosidasi viene utilizzata come modo indiretto per determinare il numero di parassiti. Si prevede che la crescita sarà inibita in presenza di un composto tripanocida, portando ad un minor numero di parassiti rispetto al controllo non trattato, che si rifletterà in una minore attività β-galattosidasi e quindi in una minore assorbanza.

  1. Incubare i parassiti con BZN.
    1. Aggiungere 100 μL di corrispondente 2x soluzione di BZN per pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di BZN di 80, 40, 20, 10, 5 e 2,5 μM a 100 μL di sospensione di epimastigote (dal passo 2.1), cellule Vero con amastigoti (2 giorni dopo l'infezione) (passo 2.2) o tripomatigoti (passo 2.3) in una piastra a 96 pozzetti.
    2. Incubare gli epimastigoti a 28 °C per 72 ore e i tripomastigoti o cellule Vero infette con amastigoti per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Ogni concentrazione di farmaco deve essere valutata almeno in triplice copia e includere colture di controllo di epimastigoti, tripomastigoti e cellule Vero infette con DMSO (vedere fase 1.2.2.4).
  2. Reazione colorimetrica
    1. Dopo il periodo di incubazione del trattamento, se le cellule Vero infette o tripomastimiti sono in DMEM con rosso fenolo, sostituire il mezzo con 100 μL di 1x PBS per evitare interferenze. Eseguire pozzetti vuoti triplicati contenenti solo 100 μL di mezzo corrispondente (o 1x PBS a seconda dei casi).
      NOTA: Non è necessario rimuovere il terreno di coltura per epimastigoti in caso di mezzo LIT o DMEM senza rosso fenolo. DMEM con rosso fenolo può ancora essere utilizzato; preparare un pozzetto vuoto con DMEM da solo per misurare l'assorbanza di base e quindi sottrarre questo valore durante l'analisi dei dati (passaggio 3.3.). Il mezzo insetto di Schneider, che è incolore, è un'alternativa per gli epimastigoti.
    2. Aggiungere 40 μL di soluzione di substrato CPRG e 10 μL di soluzione detergente a ciascun pozzetto, ottenendo una concentrazione finale di 200 μM CPRG e 0,1% detergente in un volume finale di 250 μL in ciascun pozzetto.
      NOTA: La soluzione CPRG e il detergente possono essere sommati in un volume finale di 50 μL per pozzetto.
    3. Incubare a 37 °C per 2 ore e misurare l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro a micropiastre.
      NOTA: il cambiamento di colore previsto è da giallo a bruno-rossastro al momento della scissione enzimatica β-galattosidasi (Figura 2A). Il tempo di incubazione può essere esteso fino a 4 ore e gli spettri di assorbanza del clorofenolo rosso possono essere letti tra 570 e 595 nm con raccordi di curva simili (Figura supplementare S1A,B). L'incubazione fino a 24 ore in presenza di substrato CPRG ha mostrato raccordi di curva simili (Figura supplementare S1C).
      1. In uno spettrofotometro a micropiastre con un selettore monocromatore, creare un nuovo protocollo nel software dell'apparecchiatura (Figura supplementare S2).
      2. Fare clic su Assorbanza come metodo di rilevamento | Endpoint come tipo di lettura | Ok (Figura supplementare S2A). Aggiungere un passaggio di lettura, digitare la lunghezza d'onda selezionata e fare clic su OK (Figura supplementare S2B).
      3. Nella sezione Layout piastra, contrassegnare i pozzetti da leggere e fare clic su Ok (Figura supplementare S2C). Per leggere la piastra, inseriscila nel vassoio e clicca su Leggi piastra. Attendere che i valori vengano visualizzati sullo schermo (Figura supplementare S2D) ed esportarli in un foglio di calcolo per analizzare i risultati.
  3. Analisi dei dati e calcolo della concentrazione di inibitori dei media (IC50)
    1. Sottrarre il valore misurato in bianco, corrispondente solo al mezzo LIT, 1x PBS o DMEM con o senza rosso fenolo più la soluzione detergente CPRG. Quando si testa l'attività tripanocida di composti colorati, misurare l'assorbanza di ulteriori controlli in bianco con LIT o DMEM con ogni concentrazione di farmaco utilizzato e quindi sottrarre tali valori dai valori di assorbanza ottenuti con i parassiti ad ogni concentrazione.
      NOTA: La tabella supplementare S2 mostra i valori tipici ottenuti in questo test con questi mezzi senza parassiti più soluzione detergente CPRG. Le differenze prima e dopo l'aggiunta di CPRG sono significative ma non interferiscono con il test con i parassiti (Tabella supplementare S2).
    2. Nel software di analisi statistica, tracciare la concentrazione di BZN (in μM) rispetto all'assorbanza a 595 nm in una tabella xy. Trasformare le concentrazioni di BZN in valori logaritmici facendo clic sul pulsante Analizza, selezionando l'opzione Trasforma | trasformare i valori x utilizzando l'opzione x= log(x) e facendo clic sul pulsante Ok.
    3. Ottenere i valori IC50 dal software di analisi statistica.
      NOTA: L'IC50 è definito come la concentrazione del farmaco che riduce la crescita del parassita del 50% rispetto al controllo non trattato ed è calcolato come il punto di inflessione della funzione sigmoidale che si adatta alla curva.
      1. Nel software di analisi statistica, fare clic sul pulsante Analizza , selezionare Regressione non lineare (adattamento curva) nell'elenco di analisi xy e fare clic su OK.
      2. Nella scheda modello della finestra Parametri , nel gruppo dose-risposta - inibizione delle equazioni incorporate, selezionare l'opzione metodo dose-risposta: log(inibitore) vs. risposta - Pendenza variabile (quattro parametri). Lasciare tutte le altre schede ai valori predefiniti; fare clic su OK.
      3. Clicca sulla sezione dei risultati del software di analisi statistica per trovare il valore IC50, la SD e la bontà della vestibilità.
      4. Fare clic sulla sezione del grafico per trovare il grafico xy della concentrazione logaritmica del farmaco rispetto ai valori di assorbanza . Cerca l'adattamento della curva è anche rappresentato graficamente in un colore diverso.
        NOTA: uno strumento di calcolo IC50 online gratuito è disponibile all'indirizzo https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

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Representative Results

Seguendo il protocollo sopra descritto, gli epimastigoti Dm28c che esprimono β galattosidasi sono stati incubati con 6 concentrazioni di BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (o composti di interesse) per 72 ore. Dopo questo periodo, il reagente CPRG è stato aggiunto insieme al detergente, che lisa le cellule e rilascia β-galattosidasi. CpRG è scisso dalla β-galattosidasi per produrre clorofenolo rosso, portando ad un cambiamento di colore da giallo a rossastro (Figura 2A). Il rosso clorofenolo è stato misurato leggendo l'assorbanza a 595 nm in un lettore di micropiastre dopo 2 ore. Una tabella XY è stata tracciata con le concentrazioni logaritmiche di BZN rispetto all'assorbanza a 595 nm. Il grafico è stato adattato utilizzando la regressione non lineare (Figura 2B). In questo particolare esperimento, l'IC50 ottenuto per gli epimastigoti è stato di 20,59 ± 1,075 μM, simile a quello ottenuto dalla letteratura (Tabella I)16,17. Risultati rappresentativi che utilizzano questo metodo per tripomastitigoti e amastigoti sono stati descritti in precedenza13.

Figure 2
Figura 2: Calcolo del valore IC50 del benznidazolo per epimastigote in forma Dm28c. (A) Una piastra a 96 pozzetti con epimastigoti trattati con diverse concentrazioni di BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 e 80 μM) prima di aggiungere CPRG (1), dopo l'aggiunta iniziale di CPRG e detergente (2) e dopo l'incubazione con CPRG e detergente che mostra il cambiamento di colore (3). (B) XY-plot delle concentrazioni logaritmiche di BZN rispetto all'assorbanza (OD) a 595 nm per gli epimastigoti dm28c/pLacZ. Il grafico è stato montato utilizzando la regressione non lineare per stimare il valore IC50 . Ogni valore rappresenta la media e la deviazione standard (barre di errore) di 6 repliche biologiche indipendenti. La linea blu continua rappresenta l'adattamento della curva. Abbreviazioni: CPRG = clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside; BZN = benznidazolo; OD = densità ottica; C = controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

BZN IC50 (μM) calcolato utilizzando Dm28c che esprime β-galattosidasi BZN IC50 (μM) riportato in letteratura
Epimastigoti dal 17.08 al 20.59 Dalle 11 alle 18.72
Amastigotes Da 2,31 a 3,92 Da 1,66 a 4,39
Tripomastiti Dal 27.07 al 44.74 Da 24,68 a 50,72

Tabella 1: Intervallo di valori IC50 ottenuti per epimastigoti, tripomastiti e amastigoti utilizzando questo protocollo rispetto a IC50 riportati in letteratura17,18.

Figura supplementare S1: Configurazione del software del lettore di micropiastre per l'assorbimento della lettura. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Misure dell'attività della β-galattosidasi (densità ottica a 570-595 nm) utilizzando epimastigoti della linea Dm28c/pLacZ di Trypanosoma cruzi dopo incubazione con CPRG in diversi punti temporali. I valori sono espressi come deviazione media e standard di tre repliche indipendenti. Le linee continue colorate rappresentano l'adattamento della curva. (A) Incubazione con CPRG da 200 μM per 2 h. (B) Incubazione con CPRG da 200 μM per 4 h. (C) Rappresentazione dell'attività della β-galattosidasi (densità ottica a 570 nm) in diversi punti temporali (2, 4 e 24 h). Abbreviazione: CPRG = clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Composizione e preparazione del mezzo LIT, dell'emina e del PBS. Abbreviazioni: LIT = Liver Infusion Tryptose; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S2: Letture di assorbanza per fluidi LIT e DMEM senza parassiti. I valori sono espressi come triplicati di ciascun mezzo; la riga multimediale contiene il valore medio delle tre repliche; e la riga SD contiene i valori di deviazione standard delle repliche. Abbreviazioni: SD = Deviazione standard; LIT = Iniezione epatica triptosio; DMEM = Dulbecco's Modified Eagle Medium. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Questo articolo descrive un test basato sulla determinazione dell'attività citoplasmatica β-galattosidasi rilasciata a causa della lisi di membrana di T. cruzi epimastigotes, tripomastigotes o cellule infette con amastigoti in presenza del substrato CPRG. Abbiamo usato i parassiti T. cruzi Dm28c/pLacZ, un ceppo parassitario stabile ottenuto dopo la trasfezione con un plasmide portatore di β-galattosidasi costruito da Buckner e co-autori10. Questo test è stato utilizzato per la ricerca di composti antitripanocidi 12,19,20,21. Il ceppo T. cruzi Dm28c/pLacZ è stato utilizzato per ottimizzare il protocollo di screening. Come riassunto nella Figura 1, questo protocollo ha quattro punti principali; il primo è la semina parassitaria in piastre a 96 pozzetti. Epimastigotes e tripomastigoti vengono contati e seminati da una sospensione. Nel caso degli amastigoti, prima seminare cellule Vero per formare un monostrato aderente e poi infettare con tripomastitigoti. Gli amastigoti sono presenti all'interno delle cellule dopo 48 ore. In secondo luogo, preparare le diluizioni del farmaco da testare nelle concentrazioni desiderate e incubare con i parassiti. Infine, il terzo passo prevede l'aggiunta di CPRG e detergente per lisare le cellule. Il CPRG viene scisso al momento del rilascio di β-galattosidasi dal citoplasma parassita e il clorofenolo rosso viene generato e misurato spettrofotometricamente. Il quarto passo critico prevede l'analisi dei dati, la costruzione di grafici x-y e l'adattamento della curva ottenuta per calcolare i valori IC50 dei farmaci di interesse.

Un test in vitro per tutte le fasi del ciclo di vita di T. cruzi è il primo passo nello studio degli effetti di un potenziale nuovo farmaco. In questi test, gli effetti sono valutati mediante il conteggio microscopico, una procedura lunga e soggettiva che è difficile da automatizzare. La sostituzione di questa tecnica con un test colorimetrico può migliorare l'obiettività dello screening, rendendolo anche meno dispendioso in termini di tempo. La lettura colorimetrica delle lastre richiede solo pochi minuti, al contrario delle ore richieste per il conteggio microscopico manuale ad alta intensità di lavoro, e facilita lo screening di grandi librerie di nuovi composti con potenziale valore terapeutico. Per quanto riguarda la somiglianza complessiva dei parassiti che esprimono β galattosidasi (Dm28c / pLacZ) rispetto al ceppo Dm28c wild-type, abbiamo determinato che i parassiti erano morfologicamente normali, con tassi di crescita simili e differenziati equamente all'interno delle forme del ciclo di vita. Inoltre, i risultati dei test antidroga ottenuti confrontando il wild-type Dm28c e la linea Dm28c/pLacZ quantificata dal conteggio microscopico non hanno mostrato differenze significative13.

Una limitazione di questo protocollo è che i terreni di coltura colorati potrebbero interferire con l'assorbanza misurata. DMEM (o RPMI) senza rosso fenolo è raccomandato per superare questa limitazione. Un pozzo vuoto con DMEM è stato utilizzato con successo come valore di assorbanza basale in questo protocollo. Un'altra limitazione è la presunta interferenza quando si usano farmaci colorati, che potrebbero essere superati usando mezzi con il composto come un bianco o selezionando la lunghezza d'onda di assorbanza tra 570 e 595 nm per dare l'interferenza più bassa. CpRG non è alterato dalla presenza di un determinato farmaco (colorato o meno), rendendo questo test abbastanza robusto. Quando si utilizzano mezzi con farmaci rosso fenolo o colorati, è fondamentale eseguire controlli in bianco per ogni condizione e quindi sottrarre il valore di assorbanza ottenuto dalle misurazioni con i parassiti per evitare qualsiasi interferenza.

La concentrazione di soluzione cprg riportata per T. cruzi tripomastigotes e Toxoplasma gondii è di 100 μM10,15. Tuttavia, la concentrazione ottimale riportata per gli epimastigoti è di 200 μM11. In questa linea Dm28c/pLacZ, è stata utilizzata una soluzione CPRG da 200 μM per epimastigoti, tripomastiti e amastigoti con risultati affidabili. Per quanto riguarda i tempi di incubazione CPRG, il miglior adattamento della curva è stato ottenuto quando le epimastigoti sono state incubate con la soluzione di substrato per 2 ore (R2 = 0,9995). Tuttavia, l'R2 era molto simile (R2 = 0,9994) e l'attività della β-galattosidasi era lineare nell'intervallo di 6.250-200.000 epimastigoti per pozzetto (cioè 62.500-2.000.000 di epimastigoti / mL) a 4 h (Figura supplementare S2). Un intervallo lineare di 3.150-100.000 tripomastigoti per pozzetto (cioè 31.500-1.000.000 di tripomatigoti / mL) è stato riportato per tripomastiti13. Per evitare di osservare grandi deviazioni standard, è importante seminare la giusta quantità di parassiti in ogni pozzo. Poiché i volumi sono piccoli, è importante essere coerenti quando si contano i parassiti prima della semina. Inoltre, più di tre repliche potrebbero essere misurate per ogni condizione sperimentale, se necessario.

A differenza di altri saggi di screening colorimetrico22, qui non sono necessarie successive fasi di manipolazione, aumentando la riproducibilità e l'affidabilità del test e la velocità di raccolta dei dati. Questo è un test facile, rapido e affidabile adatto per lo screening farmacologico ad alto rendimento di composti candidati per il trattamento con ChD e può essere applicato ad altri ceppi di T. cruzi . Il plasmide pLacZ è disponibile su richiesta presso il laboratorio Bucker e potrebbe essere utilizzato per trasfettare ceppi resistenti, ad esempio, di linee knockout per valutare la sensibilità della linea a diversi farmaci in diversi background genetici. L'unico punto critico da tenere a mente è che i plasmidi knockout dovrebbero avere un marcatore di resistenza agli antibiotici diverso da pLacZ.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Buckner per aver gentilmente fornito il plasmide pLacZ. Questo lavoro è stato sostenuto da Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva dall'Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) e Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art è stato utilizzato per produrre la Figura 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

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References

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Biochimica Numero 177
<em>In vitro</em> Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di <em>Trypanosoma cruzi</em> utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi
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Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

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