Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

We beschrijven een high-throughput colorimetrische test die β-galactosidase-activiteit meet in drie levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas. Deze test kan worden gebruikt om trypanocidale verbindingen op een eenvoudige, snelle en reproduceerbare manier te identificeren.

Abstract

Trypanosoma cruzi is de veroorzaker van de ziekte van Chagas (ChD), een endemische ziekte van volksgezondheidsbelang in Latijns-Amerika die ook veel niet-endemische landen treft vanwege de toename van migratie. Deze ziekte treft bijna 8 miljoen mensen, met nieuwe gevallen geschat op 50.000 per jaar. In de jaren 1960 en 70 werden twee geneesmiddelen voor ChD-behandeling geïntroduceerd: nifurtimox en benznidazol (BZN). Beide zijn effectief bij pasgeborenen en tijdens de acute fase van de ziekte, maar niet in de chronische fase, en het gebruik ervan wordt geassocieerd met belangrijke bijwerkingen. Deze feiten onderstrepen de dringende noodzaak om de zoektocht naar nieuwe medicijnen tegen T. cruzi te intensiveren.

T. cruzi wordt overgedragen door hematofagote insectenvectoren van de Reduviidae- en Hemiptera-families. Eenmaal in de gastheer van het zoogdier vermenigvuldigt het zich intracellulair als de niet-flagellaat amastigote vorm en differentieert het in de trypomastigote, de niet-replicatieve infectieuze vorm van de bloedbaan. In de insectenvector transformeren trypomastigoten in het epimastigotenstadium en vermenigvuldigen zich door binaire splijting.

Dit artikel beschrijft een test gebaseerd op het meten van de activiteit van de cytoplasmatische β-galactosidase die in de cultuur wordt vrijgegeven als gevolg van parasyse met behulp van het substraat, chlorofenol rood β-D-galactopyranoside (CPRG). Hiervoor werd de T. cruzi Dm28c-stam getransfecteerd met een β-galactosidase-overexpressie plasmide en gebruikt voor in vitro farmacologische screening in epimastigoten, trypomastigote en amastigote stadia. Dit artikel beschrijft ook hoe de enzymatische activiteit in gekweekte epimastigoten, geïnfecteerde Vero-cellen met amastigoten en trypomastigoten die vrijkomen uit de gekweekte cellen kunnen worden gemeten met behulp van het referentiegeneesmiddel benznidazol als voorbeeld. Deze colorimetrische test is eenvoudig uit te voeren en kan worden geschaald naar een high-throughput formaat en worden toegepast op andere T. cruzi stammen.

Introduction

De ziekte van Chagas (ChD), of Amerikaanse trypanosomiasis, is een parasitaire ziekte veroorzaakt door de flagellated protozoa, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begint met een asymptomatische of oligosymptomatische acute fase die meestal niet gediagnosticeerd is, gevolgd door een levenslange chronische fase. In de chroniciteit manifesteert ~ 30% van de patiënten zich - decennia na de infectie - een verscheidenheid aan slopende aandoeningen, waaronder myocardiopathie, mega-spijsverteringssyndromen of beide, met een sterftecijfer variërend van 0,2% tot 20% 1,2,3. Asymptomatische chronische patiënten kunnen geen klinische symptomen hebben, maar blijven hun hele leven seropositief.

Schattingen suggereren dat ~ 7 miljoen mensen wereldwijd besmet zijn, meestal uit Latijns-Amerika, waar ChD endemisch is. In deze landen wordt T. cruzi voornamelijk overgedragen door geïnfecteerde bloedzuigende triatomine-insecten (vectoroverdracht) en minder vaak door orale overdracht door de inname van voedsel dat besmet is met triatomine-uitwerpselen die de parasieten bevatten2. Bovendien kan de parasiet via de placenta worden overgedragen van chagasische moeders op pasgeborenen, via bloedtransfusies of tijdens orgaantransplantatie. Deze vectoronafhankelijke manieren om de infectie en menselijke migratie te verwerven, hebben bijgedragen aan de wereldwijde verspreiding van de ziekte, wat blijkt uit een toenemend aantal gevallen in Noord-Amerika, Europa en sommige Afrikaanse, oostelijke mediterrane en westelijke Pacifische landen4. ChD wordt beschouwd als een verwaarloosde ziekte omdat vectoroverdracht nauw verbonden is met armoede en een toonaangevend volksgezondheidsprobleem is, vooral in Latijns-Amerikaanse lage-inkomenslanden. Hoewel er beschikbare behandelingen zijn, is de mortaliteit als gevolg van ChD in Latijns-Amerika de hoogste onder parasitaire ziekten, waaronder malaria2.

Er zijn twee geregistreerde geneesmiddelen voor ChD-behandeling geïntroduceerd in de late jaren 1960 en vroege jaren 1970: nifurtimox en benznidazol5. Beide geneesmiddelen zijn effectief in de acute fase van de ziekte bij volwassenen, kinderen en aangeboren geïnfecteerde pasgeborenen, evenals bij kinderen met een chronische infectie, waar genezing meestal wordt bereikt. Slechts een paar mensen worden echter vroeg genoeg gediagnosticeerd om op tijd te worden behandeld. Volgens de laatste klinische onderzoeken hebben beide geneesmiddelen belangrijke beperkingen bij volwassenen en waren ze niet effectief in het verminderen van symptomen bij mensen met een chronische ziekte; vandaar dat het gebruik ervan in deze fase controversieel is. Andere nadelen zijn de verlengde behandelingsperioden die nodig zijn (60-90 dagen) en de frequente, ernstige bijwerkingen die worden waargenomen, die leiden tot stopzetting van de behandeling bij een deel van de geïnfecteerde mensen 6,7. Geschat wordt dat minder dan 10% van de mensen met ChD is gediagnosticeerd en nog minder hebben toegang tot behandeling, omdat veel getroffen personen op het platteland wonen met geen of nauwelijks toegang tot gezondheidszorg8. Deze feiten benadrukken de dringende noodzaak om nieuwe geneesmiddelen tegen T. cruzi te vinden om efficiëntere, veiligere en op het veld toepasbare behandelingen mogelijk te maken, vooral voor de chronische fase. In dit verband is een andere uitdaging bij de ontwikkeling van effectievere verbindingen de beperking van systemen voor het beoordelen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in vitro en in vivo9.

Hoewel chemische biologie en genomische benaderingen voor de identificatie van potentiële geneesmiddeldoelen zijn gebruikt bij kinetoplastide parasieten, zijn de beschikbare genomische hulpmiddelen in T. cruzi beperkt in tegenstelling tot T. brucei of Leishmania. De screening van verbindingen met trypanocidale activiteit is dus nog steeds de meest gebruikte benadering in de zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische kandidaat-geneesmiddelen tegen ChD. Gewoonlijk moet de ontdekking van geneesmiddelen in T. cruzi beginnen met het testen van de effecten van een nieuw geneesmiddel in een in vitro test tegen het epimastigotenstadium. Decennialang was de enige manier om de remmende effecten van kandidaat-verbindingen op T. cruzi te meten handmatig microscopisch tellen, wat arbeidsintensief, tijdrovend en operatorafhankelijk is. Bovendien is deze aanpak geschikt voor het testen van een klein aantal verbindingen, maar is onaanvaardbaar voor high-throughput screening van grote samengestelde bibliotheken. Tegenwoordig beginnen veel onderzoeken met de analyse van een groot aantal verbindingen van verschillende oorsprong die in vitro worden getest, waarbij hun vermogen om de groei van parasieten te remmen wordt getest. Zowel colorimetrische als fluorometrische methoden zijn ontwikkeld om de doorvoer in deze testen te verhogen, de objectiviteit van de screening te verbeteren en het hele proces minder vervelend te maken9.

Een van de meest gebruikte colorimetrische methoden is gebaseerd op de β-galactosidase-activiteit van getransfecteerde parasieten die voor het eerst werden beschreven door Bucknet en medewerkers10. Het β-galactosidase-enzym dat tot expressie wordt gebracht door de recombinante parasieten hydrolyseert het chromogene substraat, chloorfenolrood β-D-galactopyranoside (CPRG), tot chloorfenolrood, dat gemakkelijk colorimetrisch kan worden gemeten met behulp van een microplaatspectrofotometer. Zo kan parasietgroei in aanwezigheid van een verscheidenheid aan verbindingen tegelijkertijd worden geëvalueerd en gekwantificeerd in microtiterplaten. Deze methode is toegepast om geneesmiddelen te testen in epimastigote vormen (aanwezig in de insectenvector), trypomastigoten en intracellulaire amastigoten, de zoogdierstadia van de parasiet. Verder zijn verschillende recombinante T. cruzi-stammen getransfecteerd met het pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plasmide (pLacZ)10 om de Escherichia coli-β-galactosidase-enzym tot expressie te brengen al beschikbaar (en er kunnen nieuwe worden geconstrueerd), wat de evaluatie mogelijk maakt van parasieten van verschillende discrete typeringseenheden (DTU's) die zich mogelijk niet gelijk gedragen ten opzichte van dezelfde verbindingen 10,11,12,13 . Deze methode is al met succes gebruikt om verbindingen te evalueren op activiteit tegen T. cruzi in lage en hoge doorvoer screening12,13. Soortgelijke benaderingen zijn ook gebruikt bij andere protozoaire parasieten, waaronder Toxoplasma gondii en Leishmania mexicana14,15.

Dit artikel beschrijft en toont een gedetailleerde methode voor een in vitro medicijnscreening tegen alle levenscyclusstadia van T. cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen. De hier gepresenteerde testen zijn uitgevoerd met een β-galactosidase-expresserende T. cruzi-lijn verkregen door transfectie van T. cruzi Dm28c stam van DTU I13 met pLacZ plasmide (Dm28c/pLacZ). Bovendien kan hetzelfde protocol eenvoudig worden aangepast aan andere stammen om de prestaties tussen verbindingen en tussen T. cruzi-stammen of DTU's te vergelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Een overzicht van het gehele experimentele ontwerp is weergegeven in figuur 1.

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van de in vitro screening assay van Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ lijn met CPRG als substraat voor de colorimetrische reactie. De test bestaat uit het zaaien van de parasieten (1), ze incuberen met BZN (2 en 3) en vervolgens het colorimetrische substraat toevoegen (4). Wanneer parasieten worden gelyseerd, wordt β-galactosidase vrijgegeven en splijt CPRG tot chloorfenolrood; deze verandering in kleur kan spectrofotometrisch worden gemeten (5). Gegevens kunnen worden geanalyseerd in statistische analysesoftware om de half remmende concentratie (IC50) van BZN te verkrijgen. Afkortingen: CPRG = chlorofenol rood β-D-galactopyranoside; BZN = benznidazol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding van voorraadoplossingen

  1. Voorbereiding van media en oplossingen
    1. Hemine-oplossing (aanvullende tabel S1)
      1. Voeg alle componenten toe aan een centrifugebuis van 50 ml in de volgorde die in het recept is aangegeven en homogeniseer meerdere keren door inversie.
      2. Steriliseren door filtratie door een filter van 0,22 μm.
      3. Bereid 1 ml aliquots in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en houd ze tot gebruik op -80 °C.
    2. Leverinfusie Tryptose (LIT) Medium (Aanvullende Tabel S1)
      1. Weeg alle componenten af en roer om bij kamertemperatuur te homogeniseren in een bekerglas van 1 l met ten minste 700 ml gedestilleerd water.
      2. Stel de pH in op 7,2 en vul het volume aan tot 900 ml in een maatcilinder van 1 L met gedestilleerd water; steriliseren door filtratie of autoclaveren (121 °C gedurende 20 minuten).
      3. Vul het medium aan door toevoeging van 100 ml foetaal kalfsserum (FCS), (10% FCS, steriel en warmte-geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 45 minuten), 20 ml steriele glucoseoplossing (gesteriliseerd door autoclaveren, 121 °C gedurende 20 minuten) en 5 ml hemineoplossing (eindconcentratie 5 μM) tot 900 ml LIT-medium.
    3. Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uit het poeder volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (aanvullende tabel S1)
      1. Los alle vaste componenten op door de oplossing bij kamertemperatuur in een bekerglas van 1 L te roeren.
      2. Stel de pH in op 7,2, breng tot 1 L in een maatcilinder van 1 L met gedestilleerd water en steriliseer door filtratie of autoclaveren (121 °C, 20 min).
  2. Benznidazol (BZN) stamoplossingen en verdunningen
    OPMERKING: Het bereik van de BZN-concentratie dat in dit werk werd gebruikt, was 2,5 tot 80 μM.
    1. Bereid een stamoplossing van 1 M BZN door 13 mg van het geneesmiddel op te lossen in 50 μL dimethylsulfoxide (DMSO). Bereid onder aseptische omstandigheden seriële verdunningen uit deze 1 M BZN-stamoplossing met tweemaal de uiteindelijke gewenste concentratie (2x oplossingen) in een eindvolume dat voldoende is voor het aantal te testen putten.
      OPMERKING: Bereken voor 100 μL per put met een overmaat van 10-20%. De BZN-stamoplossing en alle BZN-verdunningen moeten onmiddellijk voor gebruik in de test worden bereid vanwege de lage oplosbaarheid van het geneesmiddel in het medium.
    2. Bereid 2x BZN verdunningen van 160, 80, 40, 20, 10 en 5 μM.
      1. Verdun 1 M BZN stamoplossing bij een 100-voudige verdunning (10 μL van 1 M BZN + 990 μL medium) om een 10 mM-oplossing te verkrijgen in het geschikte medium dat wordt gebruikt voor elke levenscyclusfase van T. cruzi. Meng continu om de suspensie te homogeniseren.
      2. Verdun 10 mM BZN-oplossing om 320 μM BZN in het juiste medium te bereiden: 32 μL van 10 mM BZN + 968 μL medium. Meng continu om de suspensie te homogeniseren.
      3. Verdun 320 μM BZN 2-voudig tot een concentratie van 160 μM (500 μL van 320 μM BZN + 500 μL medium). Meng continu om de suspensie te homogeniseren. Herhaal deze 2-voudige verdunning met elke resulterende oplossing om 80, 40, 20, 10 en 5 μM oplossingen te verkrijgen.
      4. Verdun DMSO 1.000 keer in het juiste medium voor gebruik als onbehandelde controle (100% overlevingscontrole).
        OPMERKING: Epimastigoten verdragen tot een 100-voudige verdunning van DMSO, terwijl Vero-cellen slechts tot een 1.000-voudige verdunning van DMSO verdragen. Indien nodig kan een death control met 50% DMSO worden opgenomen als de 0% overlevingsconditie.
  3. Substraat oplossing
    1. Los CPRG op in een concentratie van 1 mM in gedestilleerd water. Voeg voor een 96-well plaat 2,4 mg CPRG toe aan 4 ml water.
      OPMERKING: DE CPRG-oplossing moet onmiddellijk vóór de test worden bereid.
  4. Lysis oplossing
    1. Bereid een 2,5% v/v oplossing van niet-ionisch, niet-denaturerend detergend deterrageend detertainer 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)fenoxy]ethanol (zie de materiaaltabel) in 1x PBS. Bereid 1 ml van de oplossing per 96-well plaat onmiddellijk vóór de test.

2. Parasiet cultuur voorbereiding

  1. Epimastigotenpreparaat
    OPMERKING: T. cruzi Dm28c/pLacZ lijn13 wordt in dit hele rapport gebruikt.
    1. Kweek de β-galactosidase-expresserende T. cruzi epimastigoten axenisch bij 28 °C in celkweekkolven met een groeigebied van 25 cm2 (T-25 kolven). Houd de culturen in logfase door elke 48-72 h (in 5 ml) te subcultureren in LIT-medium aangevuld met 10% FCS (aanvullende tabel S1) en geneticïnesulfaat (G418) bij een eindconcentratie van 200 μg / ml. Kwantificeer de groei van parasieten door celtelling in een Neubauer-kamer voordat u subcultureert. Sluit de dop goed en houd de kweekkolf (niet geventileerd) op 28 °C in verticale positie.
      OPMERKING: G418 zorgt voor pLacZ plasmide selectie en onderhoud. Logfaseculturen hebben een epimastigotenconcentratie van 1-5 × 107 parasieten/ml voor de Dm28c/pLacZ-lijn.
    2. Bereid een suspensie van 2 × 105 epimastigoten/ml uit een logfasecultuur in LIT aangevuld met G418-antibioticum. Doseer 100 μL van de epimastigotenuspensie per put (20.000 epimastigoten in 100 μL LIT) van een 96-well microplaat en vul het uiteindelijke volume aan tot 200 μL per put met het medium.
  2. Amastigote voorbereiding
    1. Gebruik spontane metacyclische trypomastigoten verkregen uit een verouderde epimastigotenkweek (gedurende 7 dagen in dit protocol) om een eerste infectie uit te voeren in een T-25 kolf met 2 × 105 Vero-cellen die eerder in DMEM zijn gezaaid, aangevuld met 2% FCS.
      1. Tel het aantal metacyclische trypomastigoten in een Neubauer-kamer, infecteer de Vero-celmonolaag met een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 in 5 ml DMEM met 2% FCS en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 16 uur. Was de resterende trypomastigoten door het medium uit de kolf te verwijderen met een steriele pipet van 5 ml, voeg vervolgens 5 ml 1x PBS toe en aspirate. Voeg ten slotte 5 ml DMEM toe met 2% FCS en incubeer onder dezelfde omstandigheden.
      2. Gebruik de trypomastigoten die uit de geïnfecteerde Vero-celmonolaag komen om de infectie in T-25-kolven met 2 × 105 Vero-cellen in DMEM met 2% FCS te behouden, waardoor elke week een nieuwe geïnfecteerde fles wordt gegenereerd.
        OPMERKING: Na 5-7 dagen beginnen trypomastigoten te verschijnen en zijn zichtbaar in het supernatant. Voeg G418 niet toe aan de trypomastigoten die worden gebruikt om de cellen of de geïnfecteerde cellen te infecteren, omdat de Vero-cellijn niet resistent is tegen G418.
    2. Bereid een suspensie van 1 × 105 Vero-cellen/ml in DMEM aangevuld met 2% FCS en zaad 100 μL van de suspensie per put in 96-well weefselkweekplaten (10.000 cellen per put). Incubeer 's nachts (12-16 uur) bij 37 °C en 5% CO2 om ervoor te zorgen dat de cel zich aan de bodem van de putten hecht.
    3. Spoel na de nachtelijke incubatie de Vero-celmonolaag drie keer met 100 μL steriele 1x PBS. Voeg T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigoten (verkregen uit een eerdere infectie in een T-25 kolf, stap 2.2.1) toe bij een MOI van 10 op 100 μL DMEM aangevuld met 2% FCS per putje (100.000 trypomastigoten per put).
    4. Incubeer de platen gedurende 6 uur bij 37 °C en 5% CO2. Was na deze incubatietijd de platen twee keer met 1x PBS en voeg 100 μL DMEM toe zonder fenolrood aangevuld met 2% FCS.
      OPMERKING: Na 48 uur (2 dagen na infectie) zijn intracytoplasmatische amastigoten zichtbaar met een optische microscoop. Fenolrood, een pH-indicator in DMEM en andere celkweekmedia, kan de absorptiemeting van CPRG verstoren. Als DMEM zonder fenolrood niet beschikbaar is, zie de alternatieven die hieronder in rubriek 3.2.1 worden vermeld.
  3. Trypomastigote bereiding
    1. Bereid een suspensie van 1 × 106 Vero-cellen/ml in DMEM aangevuld met 2% FCS en zaai 800.000 cellen in 5 ml van het medium in T-25 kolven. Incubeer 's nachts (12-16 uur) bij 37 °C en 5% CO2 om de celaanhang te garanderen.
      OPMERKING: Voor een T-75 kolf, zaad 2 × 106 cellen in een eindvolume van 15 ml.
    2. Spoel na incubatie twee keer met 3 ml steriele 1x PBS. Voeg T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigoten toe bij een MOI van 10 in 5 ml DMEM met 2% FCS (8 × 106 trypomastigoten voor een T-25 kolf).
      OPMERKING: Voeg voor een T-75 kolf 20 × 106 trypomastigoten toe in een laatste volume van 15 ml DMEM met 2% FCS.
    3. Incubeer 's nachts (12-16 uur) bij 37 °C en 5% CO2. Was de kolf twee keer met 3 ml 1x PBS en voeg 5 ml verse DMEM toe, aangevuld met 2% FCS. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vier dagen.
    4. Controleer het supernatant op trypomastigoten onder een optische microscoop. Kwantificeer de trypomastigoten door ze te tellen in een Neubauer-kamer. Verzamel het supernatant in een buis van 15 ml en centrifugeer op 7.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet om een concentratie van 1 × 106 trypomastigoten/ml in DMEM te verkrijgen zonder fenolrood aangevuld met 2% FCS. Zaai 100 μL van de trypomastigote suspensie (100.000 trypomastigoten per put) in een 96-well plaat.
      OPMERKING: Als DMEM zonder fenolrood niet beschikbaar is, zie alternatieven hieronder in rubriek 3.2.1.

3. β-galactosidase-test

OPMERKING: Kwantificering van β-galactosidase-activiteit wordt gebruikt als een indirecte manier om het aantal parasieten te bepalen. Verwacht wordt dat de groei zal worden geremd in de aanwezigheid van een trypanocidale verbinding, wat leidt tot een lager aantal parasieten in vergelijking met de onbehandelde controle, wat zal worden weerspiegeld in een lagere β-galactosidase activiteit en dus een lagere absorptie.

  1. Incubeer de parasieten met BZN.
    1. Voeg 100 μL overeenkomstige 2x BZN-oplossing per put toe om een uiteindelijke concentratie BZN van 80, 40, 20, 10, 5 en 2,5 μM tot 100 μL epimastigotenuspensie (vanaf stap 2.1), Vero-cellen met amastigoten (2 dagen na infectie) (stap 2.2) of trypomastigoten (stap 2.3) in een 96-well plaat toe te voegen.
    2. Incubeer de epimastigoten bij 28 °C gedurende 72 uur en de tryptomalipigoten of geïnfecteerde Vero-cellen met amastigoten gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Elke geneesmiddelconcentratie moet ten minste in drievoud worden geëvalueerd en controleculturen van epimastigoten, trypomastigoten en geïnfecteerde Vero-cellen met DMSO omvatten (zie stap 1.2.2.4).
  2. Colorimetrische reactie
    1. Na de incubatietijd van de behandeling, als geïnfecteerde Vero-cellen of tryptomaigoten zich in DMEM bevinden met fenolrood, vervangt u het medium door 100 μL 1x PBS om interferentie te voorkomen. Voer drievoudige blanco putten uit die slechts 100 μL overeenkomstig medium bevatten (of 1x PBS, naargelang het geval).
      OPMERKING: Het is niet nodig om het kweekmedium voor epimastigoten te verwijderen in het geval van LIT-medium of DMEM zonder fenolrood. DMEM met fenolrood kan nog steeds worden gebruikt; bereid een lege put voor met DMEM alleen om de basisabsorptie te meten en trek deze waarde vervolgens af tijdens de gegevensanalyse (stap 3.3.). Schneider's insectenmedium, dat kleurloos is, is een alternatief voor epimastigoten.
    2. Voeg 40 μL CPRG-substraatoplossing en 10 μL van de reinigingsoplossing toe aan elke put, waarbij een eindconcentratie van 200 μM CPRG en 0,1% detergent in een eindvolume van 250 μL in elke put ontstaat.
      OPMERKING: De CPRG-oplossing en het reinigingsmiddel kunnen samen worden toegevoegd in een eindvolume van 50 μL per putje.
    3. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur en meet de absorptie bij 595 nm in een microplaatspectrofotometer.
      OPMERKING: De verwachte kleurverandering is geel tot roodbruin op β-galactosidase enzymatische splitsing (figuur 2A). De incubatietijd kan worden verlengd tot 4 uur en de absorptiespectra van chloorfenolrood kunnen worden afgelezen tussen 570 en 595 nm met vergelijkbare curvefittingen (aanvullende figuur S1A, B). Incubatie gedurende maximaal 24 uur in aanwezigheid van CPRG-substraat heeft vergelijkbare curvefittingen laten zien (aanvullende figuur S1C).
      1. Maak in een microplaatspectrofotometer met een monochromatorkiezer een nieuw protocol in de apparatuursoftware (Supplemental Figure S2).
      2. Klik op Absorptie als detectiemethode | Eindpunt als gelezen type | Ok (aanvullende figuur S2A). Voeg een leesstap toe, typ de geselecteerde golflengte en klik op OK (aanvullende afbeelding S2B).
      3. Markeer in het gedeelte Plaatindeling de putjes die moeten worden gelezen en klik op OK (aanvullende afbeelding S2C). Om de plaat te lezen, plaatst u deze in de lade en klikt u op Leesplaat. Wacht tot de waarden op het scherm verschijnen (Supplemental Figure S2D) en exporteer ze naar een spreadsheet om de resultaten te analyseren.
  3. Data-analyse en media inhibitor concentratie (IC50) berekening
    1. Trek de blanco gemeten waarde af, die alleen overeenkomt met LIT-medium, 1x PBS of DMEM met of zonder fenolrood plus de CPRG-detergentoplossing. Meet bij het testen van de trypanocide activiteit van gekleurde verbindingen de absorptie van extra blanco controles met LIT of DMEM met elke gebruikte concentratie van het gebruikte geneesmiddel en trek die waarden vervolgens af van de absorptiewaarden die bij elke concentratie met de parasieten zijn verkregen.
      OPMERKING: Aanvullende tabel S2 toont typische waarden die in deze test zijn verkregen met deze media zonder parasieten plus CPRG-reinigingsmiddeloplossing. De verschillen voor en na het toevoegen van CPRG zijn significant, maar interfereren niet met de test met parasieten (aanvullende tabel S2).
    2. In statistische analysesoftware plot je de concentratie van BZN (in μM) versus de absorptie bij 595 nm in een xy-tabel. Transformeer de BZN-concentraties naar logaritmische waarden door op de knop Analyseren te klikken, de optie Transformeren te selecteren | de x-waarden te transformeren met de optie x=log(x) en op de knop Ok te klikken.
    3. Verkrijg de IC50-waarden uit de statistische analysesoftware.
      OPMERKING: De IC50 wordt gedefinieerd als de geneesmiddelconcentratie die de groei van parasieten met 50% vermindert in vergelijking met de onbehandelde controle en wordt berekend als het buigpunt van de sigmoïdale functie die past bij de curve.
      1. Klik in de statistische analysesoftware op de knop Analyseren , selecteer Niet-lineaire regressie (curve fit) in de xy-analyselijst en klik op OK.
      2. Selecteer op het tabblad Model van het venster Parameters in de dosis-respons - remmingsgroep van ingebouwde vergelijkingen de optie dosis-responsmethode: log(inhibitor) vs. response - Variable Slope (vier parameters). Laat alle andere tabbladen op standaardwaarden staan; klik op OK.
      3. Klik op het resultatengedeelte van de statistische analysesoftware om de IC50-waarde, de SD en de goedheid van de pasvorm te vinden.
      4. Klik op de grafieksectie om de xy-grafiek te vinden van de logaritmische concentratie van het geneesmiddel versus de absorptiewaarden . Zoek naar de curve fit is ook in een andere kleur weergegeven.
        OPMERKING: Een gratis online IC50-berekeningstool is te vinden op https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol werden β-galactosidase-expresserende Dm28c-epimastigoten geïncubeerd met 6 concentraties BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (of verbindingen van belang) gedurende 72 uur. Na deze periode werd CPRG-reagens toegevoegd samen met wasmiddel, dat de cellen lyseert en β-galactosidase vrijgeeft. CPRG wordt gesplitst door de β-galactosidase om chloorfenolrood te produceren, wat leidt tot een verandering in kleur van geel naar roodachtig (figuur 2A). Chloorfenolrood werd gemeten door de absorptie bij 595 nm in een microplaatlezer na 2 uur af te lezen. Een XY-tabel werd uitgezet met de logaritmische concentraties van BZN versus de absorptie bij 595 nm. De plot werd aangebracht met behulp van niet-lineaire regressie (figuur 2B). In dit specifieke experiment was de IC50 verkregen voor epimastigoten 20,59 ± 1,075 μM, vergelijkbaar met die verkregen uit de literatuur (tabel I)16,17. Representatieve resultaten met behulp van deze methode voor trypomastigoten en amastigoten zijn eerder beschreven13.

Figure 2
Figuur 2: Berekening van ic50-waarde van benznidazol voor epimastigotenvorm Dm28c. (A) Een 96-well plaat met epimastigoten behandeld met verschillende BZN-concentraties (2,5, 5, 10, 20, 40 en 80 μM) voordat CPRG (1) wordt toegevoegd, na initiële toevoeging van CPRG en detergent (2) en na incubatie met CPRG en wasmiddel dat de verandering van kleur laat zien (3). (B) XY-plot van de logaritmische concentraties van BZN versus absorptie (OD) bij 595 nm voor Dm28c/pLacZ epimastigoten. Het perceel werd aangebracht met behulp van niet-lineaire regressie om de IC50-waarde te schatten. Elke waarde vertegenwoordigt het gemiddelde en de standaarddeviatie (foutbalken) van 6 onafhankelijke biologische replicaties. De doorlopende blauwe lijn geeft de curve fit weer. Afkortingen: CPRG = chlorofenol rood β-D-galactopyranoside; BZN = benznidazol; OD = optische dichtheid; C = controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BZN IC50 (μM) berekend met dm28c die β-galactosidase uitdrukt BZN IC50 (μM) gerapporteerd in de literatuur
Epimastigoten 17.08 tot 20.59 uur 11 tot 18,72
Amastigoten 2,31 tot 3,92 1,66 tot 4,39
Trypomastigoten 27,07 tot 44,74 24,68 tot 50,72

Tabel 1: Bereik van IC50-waarden verkregen voor epimastigoten, trypomastigoten en amastigoten met behulp van dit protocol in vergelijking met IC50 gerapporteerd in literatuur17,18.

Aanvullende figuur S1: Installatie van de microplaatlezersoftware voor leesabsorptie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: β-galactosidase activiteitsmetingen (optische dichtheid bij 570 tot 595 nm) met behulp van epimastigoten uit de Dm28c/pLacZ-lijn van Trypanosoma cruzi na incubatie met CPRG op verschillende tijdstippen. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde en standaarddeviatie van drie onafhankelijke replicaties. Gekleurde doorlopende lijnen vertegenwoordigen de curve fit. (A) Incubatie met 200 μM CPRG gedurende 2 h. (B) Incubatie met 200 μM CPRG gedurende 4 h. (C) Representatie van β-galactosidase activiteit (optische dichtheid bij 570 nm) op verschillende tijdstippen (2, 4 en 24 uur). Afkorting: CPRG = chlorofenol rood β-D-galactopyranoside. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Samenstelling en bereiding van LIT-medium, hemine en PBS. Afkortingen: LIT = Liver Infusion Tryptose; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Absorptiemetingen voor LIT- en DMEM-media zonder parasieten. Waarden worden uitgedrukt als driedelingen van elk medium; de mediarij bevat de gemiddelde waarde van de drie replicaties; en de SD-rij bevat de standaardafwijkingswaarden van de replicaties. Afkortingen: SD = Standaarddeviatie; LIT = Tryptose voor leverinfusie; DMEM = Dulbecco's Gemodificeerde Eagle Medium. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel beschrijft een test op basis van het bepalen van de cytoplasmatische β-galactosidase-activiteit die vrijkomt als gevolg van membraanlysis van T. cruzi-epimastigoten, trypomastigoten of geïnfecteerde cellen met amastigoten in aanwezigheid van het substraat CPRG. We gebruikten T. cruzi Dm28c/pLacZ parasieten, een stabiele parasiestam verkregen na transfectie met een β-galactosidase-dragend plasmide geconstrueerd door Buckner en co-auteurs10. Deze test is gebruikt om te zoeken naar antitrypanocidale verbindingen 12,19,20,21. De T. cruzi Dm28c/pLacZ stam werd gebruikt om het screeningsprotocol te optimaliseren. Zoals samengevat in figuur 1 heeft dit protocol vier belangrijke punten; de eerste is parasietzaaien in 96-well platen. Epimastigoten en trypomastigoten worden geteld en gezaaid uit een suspensie. In het geval van amastigoten, eerst zaad Vero-cellen om een aanhangende monolaag te vormen en vervolgens te infecteren met trypomastigoten. Amastigoten zijn na 48 uur aanwezig in de cellen. Ten tweede, bereid verdunningen van het te testen medicijn voor in de gewenste concentraties en incubeer met de parasieten. Ten slotte omvat de derde stap het toevoegen van CPRG en wasmiddel om de cellen te lyseren. CPRG wordt gesplitst na afgifte van β-galactosidase uit het cytoplasma van de parasiet en chloorfenolrood wordt gegenereerd en spectrofotometrisch gemeten. De vierde kritieke stap omvat data-analyse, constructie van x-y-grafieken en het aanpassen van de curve die is verkregen om de IC50-waarden van de geneesmiddelen van belang te berekenen.

Een in vitro assay voor alle levenscyclusstadia van T. cruzi is de eerste stap in het bestuderen van de effecten van een potentieel nieuw medicijn. In deze testen worden de effecten geëvalueerd door microscopisch tellen, een tijdrovende en subjectieve procedure die moeilijk te automatiseren is. De vervanging van deze techniek door een colorimetrische test kan de objectiviteit van de screening verbeteren, waardoor deze ook minder tijdrovend wordt. De colorimetrische plaatlezing duurt slechts een paar minuten, in tegenstelling tot de uren die nodig zijn voor arbeidsintensief handmatig microscopisch tellen, en vergemakkelijkt de screening van grote bibliotheken van nieuwe verbindingen met potentiële therapeutische waarde. Met betrekking tot de algemene gelijkenis van de β-galactosidase-tot expressie brengende parasieten (Dm28c / pLacZ) in vergelijking met de wild-type Dm28c-stam, stelden we vast dat de parasieten morfologisch normaal waren, met vergelijkbare groeisnelheden en gelijk gedifferentieerd binnen de levenscyclusvormen. Bovendien toonden de resultaten van de drugstest die werden verkregen door vergelijking van het wildtype Dm28c en de Dm28c / pLacZ-lijn gekwantificeerd door microscopisch kleine tellingen geen significante verschillen13.

Een beperking van dit protocol is dat gekleurde cultuurmedia de gemeten absorptie kunnen verstoren. DMEM (of RPMI) zonder fenolrood wordt aanbevolen om deze beperking te overwinnen. Een blanco put met DMEM werd met succes gebruikt als een basale absorptiewaarde in dit protocol. Een andere beperking is de vermeende interferentie bij het gebruik van gekleurde geneesmiddelen, die kan worden overwonnen met behulp van media met de verbinding als een blanco of door de absorptiegolflengte tussen 570 en 595 nm te selecteren om de laagste interferentie te geven. CPRG wordt niet veranderd door de aanwezigheid van een bepaald medicijn (gekleurd of niet), waardoor deze test vrij robuust is. Bij het gebruik van media met fenolrode of gekleurde geneesmiddelen is het van cruciaal belang om blanco controles uit te voeren voor elke aandoening en vervolgens de absorptiewaarde af te trekken die is verkregen uit de metingen met parasieten om interferentie te voorkomen.

De gerapporteerde concentratie van CPRG-oplossing voor T. cruzi trypomastigoten en Toxoplasma gondii is 100 μM10,15. De optimale concentratie gerapporteerd voor epimastigoten is echter 200 μM11. In deze Dm28c/pLacZ-lijn werd een CPRG-oplossing van 200 μM gebruikt voor epimastigoten, trypomastigoten en amastigoten met betrouwbare resultaten. Wat de CPRG-incubatietijden betreft, werd de beste curve-aanpassing bereikt wanneer epimastigoten gedurende 2 uur werden geïncubeerd met de substraatoplossing (R2 = 0,9995). De R2 was echter zeer vergelijkbaar (R2 = 0,9994) en β-galactosidase-activiteit was lineair in het bereik van 6.250-200.000 epimastigoten per put (d.w.z. 62.500-2.000.000 epimastigoten / ml) bij 4 uur (aanvullende figuur S2). Een lineair bereik van 3.150-100.000 trypomastigoten per put (d.w.z. 31.500-1.000.000 trypomastigoten / ml) werd gemeld voor trypomastigoten13. Om te voorkomen dat grote standaardafwijkingen worden waargenomen, is het belangrijk om de juiste hoeveelheid parasieten in elke put te zaaien. Omdat de volumes klein zijn, is het belangrijk om consistent te zijn bij het tellen van de parasieten voordat ze worden gezaaid. Verder kunnen indien nodig meer dan drie replicaties worden gemeten voor elke experimentele toestand.

In tegenstelling tot andere colorimetrische screeningstests22 zijn latere manipulatiestappen hier niet nodig, waardoor de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de test en de snelheid van gegevensverzameling toenemen. Dit is een eenvoudige, snelle en betrouwbare test die geschikt is voor high-throughput geneesmiddelenscreening van kandidaat-verbindingen voor ChD-behandeling en kan worden toegepast op andere T. cruzi-stammen . Het pLacZ-plasmide is op verzoek verkrijgbaar bij het Bucker-lab en kan worden gebruikt om resistente stammen van bijvoorbeeld knock-outlijnen te transfecteren om de gevoeligheid van de lijn voor verschillende geneesmiddelen met verschillende genetische achtergronden te evalueren. Het enige kritische punt dat in gedachten moet worden gehouden, is dat de knock-out plasmiden een andere antibioticaresistentiemarker moeten hebben dan pLacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Buckner voor het vriendelijk verstrekken van de pLacZ plasmide. Dit werk werd ondersteund door Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva uit Argentinië (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) en Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art werd gebruikt om Figuur 1 (https://smart.servier.com) te produceren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

Biochemie Nummer 177
<em>In vitro</em> Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van <em>Trypanosoma cruzi</em> met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter