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Biochemistry

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Wir beschreiben einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay zur Messung der β-Galactosidase-Aktivität in drei Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit. Dieser Assay kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren.

Abstract

Trypanosoma cruzi ist der Erreger der Chagas-Krankheit (ChD), einer endemischen Krankheit von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit in Lateinamerika, die aufgrund der Zunahme der Migration auch viele nicht-endemische Länder betrifft. Diese Krankheit betrifft fast 8 Millionen Menschen, wobei neue Fälle auf 50.000 pro Jahr geschätzt werden. In den 1960er und 70er Jahren wurden zwei Medikamente zur ChD-Behandlung eingeführt: Nifurtimox und Benznidazol (BZN). Beide sind wirksam bei Neugeborenen und während der akuten Phase der Krankheit, aber nicht in der chronischen Phase, und ihre Verwendung ist mit wichtigen Nebenwirkungen verbunden. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, die Suche nach neuen Medikamenten gegen T. cruzi zu intensivieren.

T. cruzi wird durch hämatophage Insektenvektoren der Familien Reduviidae und Hemiptera übertragen. Einmal im Säugetierwirt, multipliziert es sich intrazellulär als die nicht geißelte amastigote Form und differenziert sich in die Trypomastigote, die nicht-replizierende infektiöse Form des Blutkreislaufs. Innerhalb des Insektenvektors wandeln sich Trypomastigoten in das Epimastigote-Stadium um und vermehren sich durch binäre Spaltung.

Diese Arbeit beschreibt einen Assay, der auf der Messung der Aktivität der zytoplasmatischen β-Galactosidase, die aufgrund der Parasitenlyse in die Kultur freigesetzt wird, unter Verwendung des Substrats Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG) basiert. Zu diesem Zweck wurde der T. cruzi Dm28c-Stamm mit einem β-Galactosidase-überexprimierenden Plasmid transfiziert und für das pharmakologische In-vitro-Screening in Epimastigote-, Trypomastigote- und Amastigote-Stadien verwendet. Dieses Papier beschreibt auch, wie man die enzymatische Aktivität in kultivierten Epimastigoten, infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten und Trypomastigotes, die aus den kultivierten Zellen freigesetzt werden, am Beispiel des Referenzarzneimittels, Benznidazol, messen kann. Dieser kolorimetrische Assay ist einfach durchzuführen und kann auf ein Hochdurchsatzformat skaliert und auf andere T. cruzi-Stämme angewendet werden.

Introduction

Die Chagas-Krankheit (ChD) oder amerikanische Trypanosomiasis ist eine parasitäre Erkrankung, die durch den geißelten Protozoen Trypanosoma cruzi (T. cruzi) verursacht wird. ChD beginnt mit einer asymptomatischen oder oligosymptomatischen akuten Phase, die normalerweise nicht diagnostiziert wird, gefolgt von einer lebenslangen chronischen Phase. In der Chronizität manifestieren ~ 30% der Patienten Jahrzehnte nach der Infektion eine Vielzahl von schwächenden Zuständen, einschließlich Myokardiopathie, Mega-Verdauungssyndrome oder beides, mit einer Sterblichkeitsrate von 0,2% bis 20%1,2,3. Asymptomatische chronische Patienten haben möglicherweise keine klinischen Symptome, bleiben aber ihr ganzes Leben lang seropositiv.

Schätzungen zufolge sind weltweit ~ 7 Millionen Menschen infiziert, hauptsächlich aus Lateinamerika, wo ChD endemisch ist. In diesen Ländern wird T. cruzi hauptsächlich durch infizierte blutsaugende Triatomin-Käfer (vektorübertragene Übertragung) und seltener durch orale Übertragung durch die Aufnahme von Lebensmitteln übertragen, die mit Triatomin-Kot kontaminiert sind, der die Parasiten enthält2. Darüber hinaus kann der Parasit über die Plazenta von chagasischen Müttern auf Neugeborene, durch Bluttransfusionen oder während der Organtransplantation übertragen werden. Diese vektorunabhängigen Wege, die Infektion und die menschliche Migration zu erfassen, haben zur weltweiten Ausbreitung der Krankheit beigetragen, was sich in einer zunehmenden Zahl von Fällen in Nordamerika, Europa und einigen Ländern Afrikas, des östlichen Mittelmeerraums und des westlichen Pazifiks zeigt4. ChD gilt als vernachlässigte Krankheit, da die vektorübertragene Übertragung eng mit Armut verbunden ist und ein führendes Problem der öffentlichen Gesundheit ist, insbesondere in lateinamerikanischen Ländern mit niedrigem Einkommen. Obwohl es verfügbare Behandlungen gibt, ist die Mortalität aufgrund von ChD in Lateinamerika die höchste unter den parasitären Krankheiten, einschließlich Malaria2.

Es gibt zwei registrierte Medikamente für die ChD-Behandlung, die in den späten 1960er und frühen 1970er Jahren eingeführt wurden: Nifurtimox und Benznidazol5. Beide Medikamente sind in der akuten Phase der Erkrankung bei Erwachsenen, Kindern und angeborenen Neugeborenen sowie bei Kindern mit chronischer Infektion, bei denen die Heilung normalerweise erreicht wird, wirksam. Allerdings werden nur wenige Menschen früh genug diagnostiziert, um rechtzeitig behandelt zu werden. Nach den neuesten klinischen Studien haben beide Medikamente bei Erwachsenen erhebliche Einschränkungen und waren bei der Verringerung der Symptome bei Menschen mit chronischen Erkrankungen unwirksam; Daher ist ihre Verwendung in diesem Stadium umstritten. Weitere Nachteile sind die verlängerten Behandlungszeiten (60-90 Tage) und die häufigen, schwerwiegenden Nebenwirkungen, die bei einem Anteil der Infizierten 6,7 zum Absetzen der Therapie führen. Es wird geschätzt, dass weniger als 10% der Menschen mit ChD diagnostiziert wurden, und noch weniger haben Zugang zu Behandlung, da viele betroffene Personen in ländlichen Gebieten ohne oder mit knappem Zugang zur Gesundheitsversorgung leben8. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, neue Medikamente gegen T. cruzi zu finden, um effizientere, sicherere und auf das Feld anwendbare Behandlungen zu ermöglichen, insbesondere für die chronische Phase. In diesem Zusammenhang ist eine weitere Herausforderung bei der Entwicklung wirksamerer Verbindungen die Einschränkung von Systemen zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in vitro und in vivo9.

Obwohl chemische Biologie und genomische Ansätze zur Identifizierung potenzieller Wirkstoffziele in Kinetoplastid-Parasiten verwendet wurden, sind die verfügbaren genomischen Werkzeuge in T. cruzi im Gegensatz zu T. brucei oder Leishmania begrenzt. Daher ist das Screening von Verbindungen mit trypanozidaler Aktivität immer noch der am häufigsten verwendete Ansatz bei der Suche nach neuen chemotherapeutischen Arzneimittelkandidaten gegen ChD. Normalerweise muss die Arzneimittelentdeckung in T. cruzi mit der Prüfung der Wirkungen eines neuen Arzneimittels in einem In-vitro-Assay gegen das Epimastigote-Stadium beginnen. Jahrzehntelang war die einzige Möglichkeit, die hemmenden Wirkungen von Kandidatenverbindungen auf T. cruzi zu messen, die manuelle mikroskopische Zählung, die mühsam, zeitaufwendig und bedienerabhängig ist. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für die Untersuchung einer kleinen Anzahl von Verbindungen, ist jedoch für das Hochdurchsatz-Screening großer Verbindungsbibliotheken inakzeptabel. Heutzutage beginnen viele Untersuchungen mit der Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen unterschiedlicher Herkunft, die in vitro untersucht werden, um ihre Fähigkeit zur Hemmung des Parasitenwachstums zu testen. Sowohl kolorimetrische als auch fluorometrische Methoden wurden entwickelt, um den Durchsatz in diesen Assays zu erhöhen, die Objektivität des Screenings zu verbessern und den gesamten Prozess weniger langwierigzu machen 9.

Eine der am weitesten verbreiteten kolorimetrischen Methoden basiert auf der β-Galactosidase-Aktivität transfizierter Parasiten, die erstmals von Bucknet und Mitarbeiternbeschrieben wurde 10. Das von den rekombinanten Parasiten exprimierte β-Galactosidase-Enzym hydrolysiert das chromogene Substrat, Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG), zu Chlorphenolrot, das mit einem Mikroplattenspektralphotometer leicht kolorimetrisch gemessen werden kann. So kann das Parasitenwachstum in Gegenwart einer Vielzahl von Verbindungen gleichzeitig bewertet und in Mikrotiterplatten quantifiziert werden. Diese Methode wurde angewendet, um Medikamente in Epimastigot-Formen (im Insektenvektor vorhanden), Trypomastigotes und intrazellulären Amastigotes, den Säugetierstadien des Parasiten, zu testen. Darüber hinaus sind bereits mehrere rekombinante T. cruzi-Stämme verfügbar, die mit dem pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-Plasmid (pLacZ)10 transfiziert wurden, um das Escherichia coli-β-Galactosidase-Enzym zu exprimieren (und neue können konstruiert werden), was die Bewertung von Parasiten aus verschiedenen diskreten Typisierungseinheiten (DTUs) ermöglicht, die sich möglicherweise nicht gleichmäßig gegenüber denselben Verbindungen verhalten 10,11,12,13 . Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Bewertung von Verbindungen auf Aktivität gegen T. cruzi im Niedrig- und Hochdurchsatz-Screening12,13 eingesetzt. Ähnliche Ansätze wurden auch bei anderen Protozoenparasiten verwendet, darunter Toxoplasma gondii und Leishmania mexicana14,15.

Dieses Papier beschreibt und zeigt eine detaillierte Methode für ein In-vitro-Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von T. cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren. Die hier vorgestellten Assays wurden mit einer β-Galactosidase-exprimierenden T. cruzi-Linie durchgeführt, die durch Transfektion von T. cruzi Dm28c-Stamm aus DTU I13 mit pLacZ-Plasmid (Dm28c/pLacZ) erhalten wurde. Darüber hinaus könnte das gleiche Protokoll leicht an andere Stämme angepasst werden, um die Leistung zwischen Verbindungen und zwischen T. cruzi-Stämmen oder DTUs zu vergleichen.

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Protocol

HINWEIS: Ein Überblick über das gesamte Versuchsdesign ist in Abbildung 1 dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über den in vitro Screening-Assay der Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ-Linie unter Verwendung von CPRG als Substrat für die kolorimetrische Reaktion. Der Assay besteht aus der Aussaat der Parasiten (1), der Inkubation mit BZN (2 und 3) und der anschließenden Zugabe des kolorimetrischen Substrats (4). Wenn Parasiten lysiert werden, wird β-Galactosidase freigesetzt und spaltet CPRG zu Chlorphenolrot; Diese Farbänderung kann spektralphotometrisch gemessen werden (5). Die Daten können in einer statistischen Analysesoftware analysiert werden, um die halbe inhibitorische Konzentration (IC50) des BZN zu erhalten. Abkürzungen: CPRG = Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid; BZN = Benzidazol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Vorbereitung von Lagerlösungen

  1. Aufbereitung von Medien und Lösungen
    1. Häminlösung (Beistelltisch S1)
      1. Fügen Sie alle Komponenten zu einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in der im Rezept angegebenen Reihenfolge hinzu und homogenisieren Sie sie mehrmals durch Inversion.
      2. Sterilisieren durch Filtration durch einen 0,22 μm Filter.
      3. Bereiten Sie 1 mL Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen vor und halten Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.
    2. Leberinfusion Tryptose (LIT) Medium (Ergänzungstabelle S1)
      1. Wiegen Sie alle Komponenten und rühren Sie, um bei Raumtemperatur in einem 1-Liter-Becherglas mit mindestens 700 ml destilliertem Wasser zu homogenisieren.
      2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein und füllen Sie das Volumen in einem 1-Liter-Messzylinder mit destilliertem Wasser auf 900 ml auf. Sterilisieren durch Filtration oder Autoklavieren (121 °C für 20 min).
      3. Ergänzen Sie das Medium durch Zugabe von 100 ml fetalem Kälberserum (FCS) (10% FCS, steril und hitzeinaktiviert bei 56 °C für 45 min), 20 ml 40% steriler Glukoselösung (sterilisiert durch Autoklavieren, 121 °C für 20 min) und 5 ml Heminlösung (Endkonzentration 5 μM) bis 900 ml LIT-Medium.
    3. Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) aus dem Pulver gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    4. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Zusatztabelle S1)
      1. Lösen Sie alle festen Komponenten auf, indem Sie die Lösung bei Raumtemperatur in einem 1-Liter-Becherglas umrühren.
      2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein, legen Sie bis zu 1 l in einem 1 l Messzylinder mit destilliertem Wasser und sterilisieren Sie ihn durch Filtration oder Autoklavieren (121 ° C, 20 min).
  2. Benznidazol (BZN)-Stammlösungen und -verdünnungen
    HINWEIS: Der Bereich der BZN-Konzentration, der in dieser Arbeit verwendet wurde, betrug 2,5 bis 80 μM.
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M BZN vor, indem Sie 13 mg des Arzneimittels in 50 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Unter aseptischen Bedingungen sind serielle Verdünnungen aus dieser 1 M BZN-Stammlösung in der doppelten gewünschten Endkonzentration (2x Lösungen) in einem Endvolumen herzustellen, das für die Anzahl der zu untersuchenden Vertiefungen ausreicht.
      HINWEIS: Berechnen Sie für 100 μL pro Bohrloch mit einem Überschuss von 10-20%. Die BZN-Stammlösung und alle BZN-Verdünnungen müssen aufgrund der geringen Löslichkeit des Arzneimittels im Medium unmittelbar vor der Verwendung im Assay hergestellt werden.
    2. Bereiten Sie 2x BZN-Verdünnungen von 160, 80, 40, 20, 10 und 5 μM vor.
      1. Verdünnen Sie 1 M BZN-Stammlösung bei einer 100-fachen Verdünnung (10 μL 1 M BZN + 990 μL Medium), um eine 10 mM Lösung in dem geeigneten Medium zu erhalten, das für jede Lebenszyklusstufe von T. cruzi verwendet wird. Kontinuierlich mischen, um die Suspension zu homogenisieren.
      2. Verdünnen Sie 10 mM BZN-Lösung, um 320 μM BZN im entsprechenden Medium herzustellen: 32 μL 10 mM BZN + 968 μL Medium. Kontinuierlich mischen, um die Suspension zu homogenisieren.
      3. 320 μM BZN 2-fach verdünnen, um eine Konzentration von 160 μM (500 μL von 320 μM BZN + 500 μL Medium) zu erhalten. Kontinuierlich mischen, um die Suspension zu homogenisieren. Wiederholen Sie diese 2-fache Verdünnung mit jeder resultierenden Lösung, um 80-, 40-, 20-, 10- und 5-μM-Lösungen zu erhalten.
      4. DMSO 1.000-fach im geeigneten Medium zur Verwendung als unbehandelte Kontrolle verdünnen (100%ige Überlebenskontrolle).
        HINWEIS: Epimastigoten tolerieren eine bis zu 100-fache Verdünnung von DMSO, während Vero-Zellen nur eine 1.000-fache Verdünnung von DMSO tolerieren. Bei Bedarf kann eine Sterbekontrolle mit 50% DMSO als 0% Überlebensbedingung aufgenommen werden.
  3. Substratlösung
    1. CPRG bei einer Konzentration von 1 mM in destilliertem Wasser auflösen. Für eine 96-Well-Platte fügen Sie 2,4 mg CPRG zu 4 ml Wasser hinzu.
      HINWEIS: CPRG-Lösung muss unmittelbar vor dem Assay vorbereitet werden.
  4. Lyse-Lösung
    1. Es wird eine 2,5%ige v/v-Lösung aus nichtionischem, nicht denaturierendem Reinigungsmittel 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol (siehe Materialtabelle) in 1x PBS hergestellt. Bereiten Sie 1 ml der Lösung pro 96-Well-Platte unmittelbar vor dem Assay vor.

2. Vorbereitung der Parasitenkultur

  1. Epimastigote Zubereitung
    HINWEIS: T. cruzi Dm28c/pLacZ Linie 13 wird in diesem Bericht verwendet.
    1. Züchten Sie die β-Galactosidase-exprimierenden T . cruzi epimastigotes axenisch bei 28 °C in Zellkulturflaschen mit einer Wachstumsfläche von 25 cm 2 (T-25-Kolben). Halten Sie die Kulturen in der Log-Phase, indem Sie alle 48-72 h (in 5 ml) in LIT-Medium subkulturieren, ergänzt mit 10% FCS (Supplemental Table S1) und Genetinasulfat (G418) bei einer Endkonzentration von 200 μg/ml. Quantifizieren Sie das Parasitenwachstum durch Zellzählung in einer Neubauer-Kammer, bevor Sie subkultivieren. Schließen Sie die Kappe sicher und halten Sie den Kulturkolben (nicht belüftet) bei 28 °C in vertikaler Position.
      HINWEIS: G418 gewährleistet die Auswahl und Wartung von pLacZ-Plasmiden. Log-Phase-Kulturen haben eine Epimastigot-Konzentration von 1-5 × 107 Parasiten/ml für die Dm28c/pLacZ-Linie.
    2. Bereiten Sie eine Suspension von 2 × 105 Epimastigoten/ml aus einer Log-Phase-Kultur in LIT vor, die mit einem G418-Antibiotikum ergänzt wird. Dosieren Sie 100 μL der Epimastigot-Suspension pro Vertiefung (20.000 Epimastigoten in 100 μL LIT) einer 96-Well-Mikrotiterplatte und machen Sie das Endvolumen auf 200 μL pro Well mit dem Medium aus.
  2. Amastigote Zubereitung
    1. Verwenden Sie spontane metazyklische Trypomastigoten, die aus einer gealterten Epimastigotenkultur (für 7 Tage in diesem Protokoll) gewonnen werden, um eine Erstinfektion in einem T-25-Kolben mit 2 × 105 Vero-Zellen durchzuführen, die zuvor in DMEM gesät wurden, ergänzt mit 2% FCS.
      1. Zählen Sie die Anzahl der metazyklischen Trypomastigoten in einer Neubauer-Kammer, infizieren Sie die Vero-Zell-Monoschicht mit einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 10 in 5 ml DMEM mit 2% FCS und inkubieren Sie bei 37 ° C und 5% CO2 für 16 h. Waschen Sie die verbleibenden Trypomastigotes, indem Sie das Medium mit einer sterilen 5-ml-Pipette aus dem Kolben entfernen, fügen Sie dann 5 ml 1x PBS hinzu und aspirieren. Zum Schluss 5 ml DMEM mit 2% FCS hinzufügen und unter den gleichen Bedingungen inkubieren.
      2. Verwenden Sie die Trypomastigoten, die aus der infizierten Vero-Zell-Monoschicht austreten, um die Infektion in T-25-Kolben mit 2 × 105 Vero-Zellen in DMEM mit 2% FCS aufrechtzuerhalten und jede Woche eine neue infizierte Flasche zu erzeugen.
        HINWEIS: Nach 5-7 Tagen beginnen Trypomastigotes zu entstehen und sind im Überstand sichtbar. Fügen Sie G418 nicht zu den Trypomastigotes hinzu, die zur Infektion der Zellen oder der infizierten Zellen verwendet werden, da die Vero-Zelllinie nicht gegen G418 resistent ist.
    2. Bereiten Sie eine Suspension von 1 × 105 Vero-Zellen/ml in DMEM vor, ergänzt mit 2% FCS und Saat 100 μL der Suspension pro Vertiefung in 96-Well-Gewebekulturplatten (10.000 Zellen pro Well). Über Nacht (12-16 h) bei 37 °C und 5% CO 2 inkubieren, um die Zellhaftung am Boden der Vertiefungen sicherzustellen.
    3. Nach der Inkubation über Nacht die Vero-Zell-Monoschicht dreimal mit 100 μL sterilem 1x PBS abspülen. T. cruzi Dm28c/pLacZ Trypomastigotes (erhalten aus einer früheren Infektion in einem T-25-Kolben, Schritt 2.2.1) bei einem MOI von 10 in 100 μL DMEM, ergänzt mit 2% FCS pro Vertiefung (100.000 Trypomastigotes pro Bohrloch), zugeben.
    4. Inkubieren Sie die Platten für 6 h bei 37 °C und 5% CO2. Nach dieser Inkubationszeit waschen Sie die Platten zweimal mit 1x PBS und fügen Sie 100 μL DMEM ohne Phenolrot hinzu, ergänzt mit 2% FCS.
      HINWEIS: Nach 48 h (2 Tage nach der Infektion) sind intrazytoplasmatische Amastigoten mit einem Optikusmikroskop sichtbar. Phenolrot, ein pH-Indikator in DMEM und anderen Zellkulturmedien, könnte die Absorptionsmessung von CPRG stören. Wenn DMEM ohne Phenolrot nicht verfügbar ist, siehe die unten in Abschnitt 3.2.1 genannten Alternativen.
  3. Trypomastigote Präparat
    1. Bereiten Sie eine Suspension von 1 × 106 Vero-Zellen/ml in DMEM vor, ergänzt mit 2% FCS und Saatgut 800.000 Zellen in 5 ml des Mediums in T-25-Kolben. Inkubieren Sie über Nacht (12-16 h) bei 37 °C und 5% CO2, um die Zelladhärenz sicherzustellen.
      HINWEIS: Für einen T-75-Kolben Samen 2 × 106 Zellen in einem Endvolumen von 15 ml.
    2. Nach der Inkubation zweimal mit 3 ml sterilem 1x PBS abspülen. T. cruzi Dm28c/pLacZ Trypomastigotes bei einem MOI von 10 in 5 ml DMEM mit 2% FCS (8 ×10 6 Trypomastigotes für einen T-25-Kolben) hinzufügen.
      HINWEIS: Für einen T-75-Kolben fügen Sie 20 ×10 6 Trypomastigotes in einem Endvolumen von 15 ml DMEM mit 2% FCS hinzu.
    3. Inkubieren über Nacht (12-16 h) bei 37 °C und 5% CO2. Waschen Sie den Kolben zweimal mit 3 ml 1x PBS und fügen Sie 5 ml frisches DMEM hinzu, ergänzt durch 2% FCS. Bei 37 °C und 5% CO2 vier Tage lang inkubieren.
    4. Überprüfen Sie den Überstand auf Trypomastigoten unter einem optischen Mikroskop. Quantifizieren Sie die Trypomastigotes, indem Sie sie in einer Neubauer-Kammer zählen. Sammeln Sie den Überstand in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 7.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet, um eine Konzentration von 1 × 106 Trypomastigotes/ml in DMEM ohne Phenolrot, ergänzt mit 2% FCS, zu erhalten. Samen Sie 100 μL der Trypomastigot-Suspension (100.000 Trypomastigoten pro Well) in einer 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Wenn DMEM ohne Phenolrot nicht verfügbar ist, siehe Alternativen weiter unten in Abschnitt 3.2.1.

3. β-Galactosidase-Assay

HINWEIS: Die Quantifizierung der β-Galactosidase-Aktivität wird als indirekte Methode zur Bestimmung der Anzahl der Parasiten verwendet. Es wird erwartet, dass das Wachstum in Gegenwart einer trypanozidalen Verbindung gehemmt wird, was zu einer geringeren Anzahl von Parasiten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle führt, was sich in einer geringeren β-Galactosidase-Aktivität und damit einer geringeren Absorption widerspiegelt.

  1. Inkubieren Sie die Parasiten mit BZN.
    1. 100 μL entsprechender 2x BZN-Lösung pro Well, um eine Endkonzentration von BZN von 80, 40, 20, 10, 5 und 2,5 μM bis 100 μL Epimastigot-Suspension (aus Schritt 2.1), Vero-Zellen mit Amastigotes (2 Tage nach der Infektion) (Schritt 2.2) oder Trypomastigotes (Schritt 2.3) in einer 96-Well-Platte zu erreichen.
    2. Inkubieren Sie die Epimastigoten bei 28 °C für 72 h und die Trypomastigotes oder infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten für 24 h bei 37 °C und 5% CO2.
      HINWEIS: Jede Arzneimittelkonzentration sollte mindestens dreifach bewertet werden und Kontrollkulturen von Epimastigoten, Trypomastigoten und infizierten Vero-Zellen mit DMSO umfassen (siehe Schritt 1.2.2.4).
  2. Kolorimetrische Reaktion
    1. Wenn sich infizierte Vero-Zellen oder Trypomastigoten nach der Inkubationszeit der Behandlung in DMEM mit Phenolrot befinden, ersetzen Sie das Medium durch 100 μL 1x PBS, um Interferenzen zu vermeiden. Führen Sie dreifach leere Vertiefungen durch, die nur 100 μL des entsprechenden Mediums (oder 1x PBS) enthalten.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, das Kulturmedium für Epimastigoten bei LIT-Medium oder DMEM ohne Phenolrot zu entfernen. DMEM mit Phenolrot kann weiterhin verwendet werden; Bereiten Sie eine Leerbohrung mit DMEM allein vor, um die Basisabsorption zu messen, und subtrahieren Sie diesen Wert dann während der Datenanalyse (Schritt 3.3.). Schneiders Insektenmedium, das farblos ist, ist eine Alternative für Epimastigoten.
    2. Geben Sie 40 μL CPRG-Substratlösung und 10 μL der Reinigungsmittellösung zu jeder Vertiefung, um eine Endkonzentration von 200 μM CPRG und 0,1% Reinigungsmittel in einem Endvolumen von 250 μL in jeder Vertiefung zu erhalten.
      HINWEIS: Die CPRG-Lösung und das Reinigungsmittel können in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung hinzugefügt werden.
    3. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 h und messen Sie die Absorption bei 595 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer.
      HINWEIS: Die erwartete Farbänderung ist gelb zu rötlich-braun bei enzymatischer Spaltung der β-Galactosidase (Abbildung 2A). Die Inkubationszeit kann auf bis zu 4 h verlängert werden, und die Absorptionsspektren von Chlorphenolrot können mit ähnlichen Kurvenanpassungen zwischen 570 und 595 nm abgelesen werden (Ergänzende Abbildung S1A,B). Die Inkubation für bis zu 24 h in Gegenwart von CPRG-Substrat hat ähnliche Kurvenverschraubungen gezeigt (Ergänzende Abbildung S1C).
      1. Erstellen Sie in einem Mikroplatten-Spektralphotometer mit einem Monochromator-Selektor ein neues Protokoll in der Gerätesoftware (Ergänzende Abbildung S2).
      2. Klicken Sie auf Absorption als Erkennungsmethode | Endpunkt als Lesetyp | ok (ergänzende Abbildung S2A). Fügen Sie einen Leseschritt hinzu, geben Sie die ausgewählte Wellenlänge ein und klicken Sie auf OK (Ergänzende Abbildung S2B).
      3. Markieren Sie im Abschnitt Plattenlayout die zu lesenden Vertiefungen und klicken Sie auf OK (Ergänzende Abbildung S2C). Um die Platte zu lesen, legen Sie sie in das Fach ein und klicken Sie auf Read Plate. Warten Sie, bis die Werte auf dem Bildschirm angezeigt werden (Ergänzende Abbildung S2D) und exportieren Sie sie in eine Tabelle, um die Ergebnisse zu analysieren.
  3. Datenanalyse und Berechnung der Medieninhibitorkonzentration (IC50)
    1. Subtrahieren Sie den Blindwert, der nur dem LIT-Medium, 1x PBS oder DMEM mit oder ohne Phenolrot entspricht, zuzüglich der CPRG-Reinigungsmittellösung. Wenn Sie die trypanozide Aktivität farbiger Verbindungen testen, messen Sie die Absorption zusätzlicher Blindkontrollen mit LIT oder DMEM mit jeder Konzentration des verwendeten Arzneimittels und subtrahieren Sie diese Werte dann von den Absorptionswerten, die mit den Parasiten bei jeder Konzentration erhalten werden.
      HINWEIS: Die Ergänzungstabelle S2 zeigt typische Werte, die in diesem Assay mit diesen Medien ohne Parasiten plus CPRG-Reinigungsmittellösung erhalten wurden. Die Unterschiede vor und nach der Zugabe von CPRG sind signifikant, stören aber nicht den Assay mit Parasiten (Supplemental Table S2).
    2. In statistischer Analysesoftware wird die Konzentration von BZN (in μM) im Vergleich zur Absorption bei 595 nm in einer xy-Tabelle dargestellt. Transformieren Sie die BZN-Konzentrationen in logarithmische Werte, indem Sie auf die Schaltfläche Analysieren klicken, die Option Transformieren auswählen | die x-Werte mit der Option x=log(x) transformieren und auf die Schaltfläche OK klicken.
    3. Beziehen Sie die IC50-Werte aus der statistischen Analysesoftware.
      HINWEIS: Der IC 50 ist definiert als die Arzneimittelkonzentration, die das Parasitenwachstum im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um50 % reduziert und als Wendepunkt der sigmoidalen Funktion berechnet wird, die zur Kurve passt.
      1. Klicken Sie in der statistischen Analysesoftware auf die Schaltfläche Analysieren, wählen Sie in der xy-Analyseliste Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) und klicken Sie auf OK.
      2. Wählen Sie auf der Registerkarte Modell des Fensters Parameter in der Dosis-Wirkungs-Wirkungs-Gruppe der integrierten Gleichungen die Option Dosis-Wirkungs-Methode aus : log (inhibitor) vs. response - Variable Slope (vier Parameter). Lassen Sie alle anderen Registerkarten auf Standardwerten. Klicken Sie auf OK.
      3. Klicken Sie auf den Ergebnisbereich der statistischen Analysesoftware, um den IC50-Wert, den SD und die Güte der Passform zu finden.
      4. Klicken Sie auf den Diagrammabschnitt, um das XY-Diagramm der logarithmischen Konzentration des Arzneimittels im Vergleich zu den Absorptionswerten zu finden. Achten Sie darauf, dass die Kurvenanpassung auch in einer anderen Farbe grafisch dargestellt ist.
        HINWEIS: Ein kostenloses Online-IC50-Berechnungstool finden Sie unter https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

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Representative Results

Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden β-Galactosidase-exprimierende Dm28c-Epimastigoten mit 6 Konzentrationen von BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (oder interessanten Verbindungen) für 72 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurde CPRG-Reagenz zusammen mit Reinigungsmittel hinzugefügt, das die Zellen lysiert und β-Galactosidase freisetzt. CPRG wird durch die β-Galactosidase gespalten, um Chlorphenolrot zu erzeugen, was zu einer Farbänderung von gelb zu rötlich führt (Abbildung 2A). Chlorphenolrot wurde gemessen, indem die Absorption bei 595 nm in einem Mikroplattenleser nach 2 h abgelesen wurde. Eine XY-Tabelle wurde mit den logarithmischen Konzentrationen von BZN gegenüber der Absorption bei 595 nm dargestellt. Das Diagramm wurde mit Hilfe der nichtlinearen Regression angepasst (Abbildung 2B). In diesem speziellen Experiment betrug der für Epimastigoten erhaltene IC 5020,59 ± 1,075 μM, ähnlich dem, der aus der Literatur (Tabelle I) 16,17 gewonnen wurde. Repräsentative Ergebnisse mit dieser Methode für Trypomastigotes und Amastigotes wurden zuvorbeschrieben 13.

Figure 2
Abbildung 2: Berechnung des IC50-Wertes von Benznidazol für Epimastigote Form Dm28c. (A) Eine 96-Well-Platte mit Epimastigoten, die mit unterschiedlichen BZN-Konzentrationen (2,5, 5, 10, 20, 40 und 80 μM) vor der Zugabe von CPRG (1), nach der ersten Zugabe von CPRG und Detergenzium (2) und nach der Inkubation mit CPRG und Reinigungsmittel behandelt wurden und die Farbänderung zeigen (3). (B) XY-Diagramm der logarithmischen Konzentrationen von BZN versus Absorption (OD) bei 595 nm für Dm28c/pLacZ-Epimastigoten. Das Diagramm wurde mithilfe der nichtlinearen Regression angepasst, um den IC50-Wert zu schätzen. Jeder Wert stellt den Mittelwert und die Standardabweichung (Fehlerbalken) von 6 unabhängigen biologischen Replikaten dar. Die durchgehende blaue Linie stellt die Kurvenanpassung dar. Abkürzungen: CPRG = Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid; BZN = Benznidazol; OD = optische Dichte; C = Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

BZN IC50 (μM) berechnet mit Dm28c, der β-Galactosidase exprimiert BZN IC50 (μM) in der Literatur berichtet
Epimastigotes 17.08 bis 20.59 11 bis 18,72
Amastigotes 2,31 bis 3,92 1,66 bis 4,39
Trypomastigotes 27.07 bis 44.74 24,68 bis 50,72

Tabelle 1: Bereich der IC50-Werte, die für Epimastigotes, Trypomastigotes und Amastigotes unter Verwendung dieses Protokolls erhalten wurden, im Vergleich zu IC 50, berichtet in der Literatur17,18.

Ergänzende Abbildung S1: Aufbau der Mikrotiterplatten-Reader-Software zur Leseaufnahme. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: β-Galactosidase-Aktivitätsmessungen (optische Dichte bei 570 bis 595 nm) unter Verwendung von Epimastigoten aus der Dm28c/pLacZ-Linie von Trypanosoma cruzi nach Inkubation mit CPRG zu verschiedenen Zeitpunkten. Werte werden als Mittelwert und Standardabweichung von drei unabhängigen Replikaten ausgedrückt. Farbige durchgehende Linien stellen die Kurvenanpassung dar. (A) Inkubation mit 200 μM CPRG für 2 h. (B) Inkubation mit 200 μM CPRG für 4 h. (C) Darstellung der β-Galactosidase-Aktivität (optische Dichte bei 570 nm) zu verschiedenen Zeitpunkten (2, 4 und 24 h). Abkürzung: CPRG = Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Zusammensetzung und Herstellung von LIT-Medium, Hein und PBS. Abkürzungen: LIT = Liver Infusion Tryptose; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungstabelle S2: Absorptionswerte für LIT- und DMEM-Medien ohne Parasiten. Die Werte werden als Verdreifachungen jedes Mediums ausgedrückt; Die Medienzeile enthält den Mittelwert der drei Replikate; und die Zeile SD enthält die Standardabweichungswerte der Replikate. Abkürzungen: SD = Standard Deviation; LIT = Leberinfusionstryptose; DMEM = Dulbeccos modifiziertes Adlermedium. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Dieses Papier beschreibt einen Assay, der auf der Bestimmung der zytoplasmatischen β-Galactosidase-Aktivität basiert, die aufgrund der Membranlyse von T. cruzi epimastigotes, Trypomastigotes oder infizierten Zellen mit Amastigotes in Gegenwart des Substrats CPRG freigesetzt wird. Wir verwendeten T. cruzi Dm28c/pLacZ-Parasiten, einen stabilen Parasitenstamm, der nach Transfektion mit einem β-Galactosidase-tragenden Plasmid erhalten wurde, das von Buckner und Co-Autoren10 konstruiert wurde. Dieser Assay wurde verwendet, um nach antitrypanozidalen Verbindungen 12,19,20,21 zu suchen. Der T. cruzi Dm28c/pLacZ-Stamm wurde verwendet, um das Screening-Protokoll zu optimieren. Wie in Abbildung 1 zusammengefasst, hat dieses Protokoll vier Hauptpunkte; Die erste ist die Parasitenaussaat in 96-Well-Platten. Epimastigotes und Trypomastigotes werden gezählt und aus einer Suspension gesät. Im Falle von Amastigoten Samen Sie zuerst Vero-Zellen, um eine adhärente Monoschicht zu bilden und dann mit Trypomastigotes zu infizieren. Amastigotes sind nach 48 h in den Zellen vorhanden. Zweitens, bereiten Sie Verdünnungen des Arzneimittels vor, die in den gewünschten Konzentrationen getestet werden sollen, und inkubieren Sie mit den Parasiten. Schließlich beinhaltet der dritte Schritt die Zugabe von CPRG und Reinigungsmittel, um die Zellen zu lysieren. CPRG wird bei β-Galactosidase-Freisetzung aus dem parasitären Zytoplasma gespalten, und Chlorphenolrot wird erzeugt und spektralphotometrisch gemessen. Der vierte kritische Schritt umfasst die Datenanalyse, die Konstruktion von x-y-Graphen und die Anpassung der erhaltenen Kurve, um die IC50-Werte der interessierenden Medikamente zu berechnen.

Ein In-vitro-Assay für alle Lebenszyklusstadien von T. cruzi ist der erste Schritt zur Untersuchung der Auswirkungen eines potenziellen neuen Arzneimittels. In diesen Assays werden die Effekte durch mikroskopische Zählung bewertet, ein zeitaufwendiges und subjektives Verfahren, das schwer zu automatisieren ist. Die Substitution dieser Technik durch einen kolorimetrischen Assay kann die Objektivität des Screenings verbessern und es auch weniger zeitaufwendig machen. Die kolorimetrische Plattenablesung dauert nur wenige Minuten, im Gegensatz zu den Stunden, die für die arbeitsintensive manuelle mikroskopische Zählung erforderlich sind, und erleichtert das Screening großer Bibliotheken neuer Verbindungen mit potenziellem therapeutischem Wert. In Bezug auf die Gesamtähnlichkeit der β-Galactosidase-exprimierenden Parasiten (Dm28c/pLacZ) im Vergleich zum Wildtyp-Dm28c-Stamm stellten wir fest, dass die Parasiten morphologisch normal waren, ähnliche Wachstumsraten aufwiesen und sich innerhalb der Lebenszyklusformen gleichermaßen differenzierten. Darüber hinaus zeigten die Arzneimitteltestergebnisse, die beim Vergleich der Wildtyp-Dm28c- und der Dm28c/pLacZ-Linie durch mikroskopische Zählung erzielt wurden, keine signifikanten Unterschiede13.

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass farbige Kulturmedien die gemessene Absorption beeinträchtigen könnten. DMEM (oder RPMI) ohne Phenolrot wird empfohlen, um diese Einschränkung zu überwinden. Eine Leerbohrung mit DMEM wurde in diesem Protokoll erfolgreich als basaler Absorptionswert verwendet. Eine weitere Einschränkung ist die mutmaßliche Interferenz bei der Verwendung von farbigen Medikamenten, die mit Medien mit der Verbindung als Rohling oder durch Auswahl der Absorptionswellenlänge zwischen 570 und 595 nm überwunden werden könnte, um die geringste Interferenz zu erhalten. CPRG wird nicht durch das Vorhandensein eines bestimmten Medikaments (farbig oder nicht) verändert, was diesen Assay ziemlich robust macht. Bei der Verwendung von Medien mit phenolroten oder farbigen Arzneimitteln ist es wichtig, für jeden Zustand Leerkontrollen durchzuführen und dann den aus den Messungen mit Parasiten erhaltenen Absorptionswert abzuziehen, um Interferenzen zu vermeiden.

Die für T. cruzi trypomastigotes und Toxoplasma gondii berichtete CPRG-Lösung beträgt 100 μM 10,15. Die für Epimastigotes berichtete optimale Konzentration beträgt jedoch 200 μM11. In dieser Dm28c/pLacZ-Linie wurde eine 200-μM-CPRG-Lösung für Epimastigotes, Trypomastigotes und Amastigotes mit zuverlässigen Ergebnissen verwendet. In Bezug auf die CPRG-Inkubationszeiten wurde die beste Kurvenanpassung erreicht, wenn Epimastigoten mit der Substratlösung für 2 h inkubiert wurden (R 2 = 0,9995). Die R2-Aktivität war jedoch sehr ähnlich (R2 = 0,9994), und die β-Galactosidase-Aktivität war linear im Bereich von 6.250-200.000 Epimastigoten pro Vertiefung (d. h. 62.500-2.000.000 Epimastigoten/ml) bei 4 h (Ergänzende Abbildung S2). Ein linearer Bereich von 3.150-100.000 Trypomastigotes pro Bohrloch (d. h. 31.500-1.000.000 Trypomastigotes/ml) wurde für Trypomastigotes13 berichtet. Um zu vermeiden, dass große Standardabweichungen beobachtet werden, ist es wichtig, die richtige Menge an Parasiten in jedem Brunnen zu säen. Da die Volumina klein sind, ist es wichtig, beim Zählen der Parasiten vor der Aussaat konsistent zu sein. Darüber hinaus konnten bei Bedarf mehr als drei Replikate für jede experimentelle Bedingung gemessen werden.

Im Gegensatz zu anderen kolorimetrischen Screening-Assays22 sind hier nachfolgende Manipulationsschritte nicht notwendig, was die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit des Assays sowie die Geschwindigkeit der Datenerfassung erhöht. Dies ist ein einfacher, schneller und zuverlässiger Assay, der für das Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening von Wirkstoffkandidaten für die ChD-Behandlung geeignet ist und auf andere T. cruzi-Stämme angewendet werden kann. Das pLacZ-Plasmid ist auf Anfrage im Bucker-Labor erhältlich und könnte verwendet werden, um resistente Stämme von beispielsweise Knockout-Linien zu transfizieren, um die Empfindlichkeit der Leitung gegenüber verschiedenen Medikamenten mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zu bewerten. Der einzige kritische Punkt, der im Hinterkopf behalten werden sollte, ist, dass die Knockout-Plasmide einen anderen Antibiotikaresistenzmarker als pLacZ haben sollten.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Buckner für die freundliche Bereitstellung des pLacZ-Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, dem Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva aus Argentinien (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) und dem Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] unterstützt. Servier Medical Art wurde verwendet, um Abbildung 1 (https://smart.servier.com) zu erstellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

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References

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Biochemie Ausgabe 177
<em>In vitro</em> Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von <em>Trypanosoma cruzi</em> unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren
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Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

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