Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av Trypanosoma cruzi med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Vi beskriver en kolorimetrisk analys med hög genomströmning som mäter β-galaktosidasaktivitet i tre livscykelstadier av Trypanosoma cruzi, orsaksmedlet till Chagas sjukdom. Denna analys kan användas för att identifiera trypanocidala föreningar på ett enkelt, snabbt och reproducerbart sätt.

Abstract

Trypanosoma cruzi är orsaksmedlet för Chagas sjukdom (ChD), en endemisk sjukdom av folkhälsobetydelse i Latinamerika som också påverkar många icke-endemiska länder på grund av ökad migration. Denna sjukdom drabbar nästan 8 miljoner människor, med nya fall som uppskattas till 50 000 per år. På 1960- och 70-talet introducerades två läkemedel för ChD-behandling: nifurtimox och bensnidazol (BZN). Båda är effektiva hos nyfödda och under den akuta fasen av sjukdomen men inte i den kroniska fasen, och deras användning är förknippad med viktiga biverkningar. Dessa fakta understryker det brådskande behovet av att intensifiera sökandet efter nya droger mot T. cruzi.

T. cruzi överförs genom hematofagiska insektsvektorer av familjerna Reduviidae och Hemiptera. En gång i däggdjursvärden multipliceras den intracellulärt som den icke-flagellerade amastigotformen och differentieras till trypomastigoten, blodomloppets icke-replikativa infektionsform. Inuti insektsvektorn omvandlas trypomastigoter till epimastigotstadiet och multipliceras genom binär fission.

Denna uppsats beskriver en analys baserad på mätning av aktiviteten hos den cytoplasmatiska β-galaktosidas som släpps ut i kulturen på grund av parasiterlys genom att använda substratet, klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG). För detta transinfekterades T. cruzi Dm28c-stammen med en β-galaktosidas-överuttryckande plasmid och användes för in vitro-farmakologisk screening i epimastigot-, trypomastigote- och amastigotstadier. Denna uppsats beskriver också hur man mäter den enzymatiska aktiviteten i odlade epimastigoter, infekterade Vero-celler med amastigotes och trypomastigotes som frigörs från de odlade cellerna med hjälp av referensläkemedlet bensnidazol som ett exempel. Denna kolorimetriska analys utförs enkelt och kan skalas till ett format med hög genomströmning och tillämpas på andra T. cruzi-stammar .

Introduction

Chagas sjukdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, är en parasitisk sjukdom som orsakas av den flagellerade protozoen, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD börjar med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akut fas som vanligtvis är odiagnostiserad, följt av en livslång kronisk fas. I kroniskhet manifesterar ~ 30% av patienterna årtionden efter infektionen - en mängd olika försvagande tillstånd, inklusive myokardiopati, mega-matsmältningssyndrom eller båda, med en dödlighet som sträcker sig från 0,2% till 20% 1,2,3. Asymptomatiska kroniska patienter kan inte ha några kliniska tecken men förblir seropositiva under hela livet.

Uppskattningar tyder på att ~ 7 miljoner människor är smittade över hela världen, mestadels från Latinamerika, där ChD är endemisk. I dessa länder överförs T. cruzi huvudsakligen genom infekterade blodsugande triatominbuggar (vektorburen överföring) och mindre ofta genom oral överföring genom intag av mat som är förorenad med triatomin avföring som innehåller parasiterna2. Dessutom kan parasiten överföras via moderkakan från chagasiska mödrar till nyfödda, genom blodtransfusioner eller under organtransplantation. Dessa vektoroberoende sätt att förvärva infektionen och mänsklig migration har bidragit till den globala spridningen av sjukdomen, vilket framgår av ett ökande antal fall i Nordamerika, Europa och vissa afrikanska, östra Medelhavet och västra Stilla havet4. ChD anses vara en försummad sjukdom eftersom vektorburen överföring är nära förknippad med fattigdom och är en ledande folkhälsofråga, särskilt i latinamerikanska låginkomstländer. Även om det finns tillgängliga behandlingar är dödligheten på grund av ChD i Latinamerika den högsta bland parasitsjukdomar, inklusive malaria2.

Det finns två registrerade läkemedel för ChD-behandling som introducerades i slutet av 1960-talet och början av 1970-talet: nifurtimox och bensnidazol5. Båda läkemedlen är effektiva i den akuta fasen av sjukdomen hos vuxna, barn och medfödda infekterade nyfödda, liksom hos barn med kronisk infektion, där botemedel vanligtvis uppnås. Men bara ett fåtal personer diagnostiseras tillräckligt tidigt för att behandlas i tid. Enligt de senaste kliniska prövningarna har båda läkemedlen viktiga begränsningar hos vuxna och var ineffektiva för att minska symtomen hos personer med kronisk sjukdom. därför är deras användning i detta skede kontroversiell. Andra nackdelar är de förlängda behandlingsperioder som krävs (60-90 dagar) och de frekventa, allvarliga biverkningar som observerats, vilket leder till att behandlingen avbryts hos en andel infekterade personer 6,7. Det uppskattas att färre än 10% av personerna med ChD har diagnostiserats, och ännu färre har tillgång till behandling, eftersom många drabbade individer bor på landsbygden med ingen eller knapp tillgång till vård8. Dessa fakta belyser det brådskande behovet av att hitta nya läkemedel mot T. cruzi för att möjliggöra mer effektiva, säkra och tillämpliga behandlingar på fältet, särskilt för den kroniska fasen. I detta avseende är en annan utmaning i utvecklingen av mer effektiva föreningar begränsningen av system för att bedöma läkemedelseffektivitet in vitro och in vivo9.

Även om kemisk biologi och genomiska metoder för identifiering av potentiella läkemedelsmål har använts i kinetoplastidparasiter, är de tillgängliga genomiska verktygen i T. cruzi begränsade i motsats till T. brucei eller Leishmania. Således är screening av föreningar med trypanocidal aktivitet fortfarande det mest använda tillvägagångssättet i sökandet efter nya kemoterapeutiska läkemedelskandidater mot ChD. Vanligtvis måste läkemedelsupptäckt i T. cruzi börja med att testa effekterna av ett nytt läkemedel i en in vitro-analys mot epimastigotstadiet. I årtionden var det enda sättet att mäta de hämmande effekterna av kandidatföreningar på T. cruzi manuell mikroskopisk räkning, vilket är mödosamt, tidskrävande och operatörsberoende. Dessutom är detta tillvägagångssätt lämpligt för analys av ett litet antal föreningar men är oacceptabelt för screening med hög genomströmning av stora sammansatta bibliotek. Numera börjar många undersökningar med analys av ett stort antal föreningar från olika ursprung som analyseras in vitro och testar deras förmåga att hämma parasittillväxt. Både kolorimetriska och fluorometriska metoder har utvecklats för att öka genomströmningen i dessa analyser, förbättra screeningens objektivitet och göra hela processen mindre tråkig9.

En av de mest använda kolorimetriska metoderna är baserad på β-galaktosidasaktiviteten hos transinfekterade parasiter som först beskrivits av Bucknet och medarbetare10. Enzymet β-galaktosidas uttryckt av de rekombinanta parasiterna hydrolyserar det kromogena substratet, klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG), till klorfenolrött, som lätt kan mätas kolorimetriskt med hjälp av en mikroplattspektrofotometer. Således kan parasittillväxt i närvaro av en mängd olika föreningar samtidigt utvärderas och kvantifieras i mikrotiterplattor. Denna metod har tillämpats på testläkemedel i epimastigotformer (närvarande i insektsvektorn), trypomastigoter och intracellulära amastigoter, parasitens däggdjursstadier. Vidare finns det redan flera rekombinanta T. cruzi-stammar transfekterade med pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-plasmiden (pLacZ)10 för att uttrycka enzymet Escherichia coli β-galaktosidas (och nya kan konstrueras), vilket möjliggör utvärdering av parasiter från olika diskreta skrivenheter (DTU) som kanske inte beter sig lika mot samma föreningar 10,11,12,13 . Denna metod har redan framgångsrikt använts för att utvärdera föreningar för aktivitet mot T. cruzi vid screening med låg och hög genomströmning12,13. Liknande metoder har också använts i andra protozoa parasiter, inklusive Toxoplasma gondii och Leishmania mexicana14,15.

Detta dokument beskriver och visar en detaljerad metod för en in vitro-läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av T. cruzi med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas. Analyserna som presenteras här har utförts med en β-galaktosidasuttryckande T. cruzi-linje erhållen genom transfektion av T. cruzi Dm28c-stam från DTU I13 med pLacZ-plasmid (Dm28c / pLacZ). Dessutom kan samma protokoll enkelt anpassas till andra stammar för att jämföra prestandan mellan föreningar och mellan T. cruzi-stammar eller DTU.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: En översikt över hela den experimentella designen visas i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Översikt över in vitro-screeninganalysen av Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ-linjen med CPRG som substrat för den kolorimetriska reaktionen. Analysen består av sådd av parasiterna (1), inkubera dem med BZN (2 och 3) och sedan tillsätta det kolorimetriska substratet (4). När parasiter lyseras frigörs β-galaktosidas och klyver HLRG till klorfenolrött; Denna färgförändring kan mätas spektrofotometriskt (5). Data kan analyseras i statistisk analysprogramvara för att erhålla den halva hämmande koncentrationen (IC50) av BZN. Förkortningar: CPRG = klorfenolröd β-D-galaktopyranosid; BZN = bensnidazol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1. Beredning av lagerlösningar

  1. Förberedelse av media och lösningar
    1. Heminlösning (kompletterande tabell S1)
      1. Tillsätt alla komponenter till ett 50 ml centrifugrör i den ordning som anges i receptet och homogenisera genom inversion flera gånger.
      2. Sterilisera genom filtrering genom ett 0,22 μm filter.
      3. Förbered 1 ml alikvoter i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara dem vid -80 °C tills de används.
    2. Leverinfusion Tryptos (LIT) Medium (Kompletterande tabell S1)
      1. Väg alla komponenter och rör om för att homogenisera vid rumstemperatur i en 1 L bägare som innehåller minst 700 ml destillerat vatten.
      2. Justera pH till 7,2 och fyll på volymen till 900 ml i en 1 L graderad cylinder med destillerat vatten; sterilisera genom filtrering eller autoklavering (121 °C i 20 min).
      3. Komplettera mediet genom att tillsätta 100 ml fetalt kalvserum (FCS), (10% FCS, sterilt och värmeinaktiverat vid 56 °C i 45 min), 20 ml 40% steril glukoslösning (steriliserad genom autoklavering, 121 °C i 20 min) och 5 ml heminlösning (slutlig koncentration 5 μM) till 900 ml LIT-medium.
    3. Förbered Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) från pulvret enligt tillverkarens anvisningar.
    4. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (tilläggstabell S1)
      1. Lös upp alla fasta komponenter genom att omröra lösningen vid rumstemperatur i en 1 L-bägare.
      2. Justera pH-värdet till 7,2, jämna upp till 1 liter i en 1 L graderad cylinder med destillerat vatten och sterilisera genom filtrering eller autoklavering (121 °C, 20 min).
  2. Bensnidazol (BZN) stamlösningar och utspädningar
    OBS: Intervallet för BZN-koncentration som användes i detta arbete var 2,5 till 80 μM.
    1. Förbered en stamlösning av 1 M BZN genom att lösa upp 13 mg av läkemedlet i 50 μl dimetylsulfoxid (DMSO). Under aseptiska förhållanden, bered seriella utspädningar från denna 1 M BZN stamlösning vid två gånger den slutliga önskade koncentrationen (2x lösningar) i en slutlig volym som är tillräcklig för antalet brunnar som ska analyseras.
      OBS: Beräkna för 100 μL per brunn med ett överskott på 10-20%. BZN-stamlösningen och alla BZN-utspädningar måste beredas omedelbart före användning i analysen på grund av läkemedlets låga löslighet i mediet.
    2. Bered 2x BZN-utspädningar på 160, 80, 40, 20, 10 och 5 μM.
      1. Späd 1 M BZN stamlösning vid en 100-faldig utspädning (10 μL 1 M BZN + 990 μL medium) för att erhålla en 10 mM-lösning i lämpligt medium som används för varje livscykelstadium av T. cruzi. Blanda kontinuerligt för att homogenisera suspensionen.
      2. Späd 10 mM BZN-lösning för att bereda 320 μM BZN i lämpligt medium: 32 μL 10 mM BZN + 968 μL medium. Blanda kontinuerligt för att homogenisera suspensionen.
      3. Späd 320 μM BZN 2 gånger för att erhålla en koncentration av 160 μM (500 μL av 320 μM BZN + 500 μL medium). Blanda kontinuerligt för att homogenisera suspensionen. Upprepa denna 2-faldiga utspädning med varje resulterande lösning för att erhålla 80, 40, 20, 10 och 5 μM lösningar.
      4. Späd DMSO 1 000 gånger i lämpligt medium för användning som obehandlad kontroll (100% överlevnadskontroll).
        OBS: Epimastigotes tolererar upp till en 100-faldig utspädning av DMSO, medan Vero-celler endast tolererar upp till en 1 000-faldig utspädning av DMSO. Vid behov kan en dödskontroll med 50% DMSO inkluderas som 0% överlevnadstillstånd.
  3. Substrat lösning
    1. Lös upp CPRG vid 1 mM koncentration i destillerat vatten. För en 96-brunnsplatta, tillsätt 2,4 mg CPRG till 4 ml vatten.
      OBS: CPRG-lösning måste beredas omedelbart före analysen.
  4. Lösning för lys
    1. Bered en 2,5% v/v-lösning av nonjoniskt, icke-denaturerande tvättmedel 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoxi]etanol (se materialförteckningen) i 1x PBS. Förbered 1 ml av lösningen per 96-brunnsplatta omedelbart före analysen.

2. Förberedelse av parasitkultur

  1. Epimastigote beredning
    OBS: T. cruzi Dm28c/pLacZ linje13 används i hela denna rapport.
    1. Odla β-galaktosidasuttryckande T. cruzi-epimastigoterna axeniskt vid 28 °C i cellodlingskolvar med en tillväxtarea på 25 cm2 (T-25-kolvar). Behåll kulturerna i loggfas genom att subkulturera varje 48-72 timmar (i 5 ml) i LIT-medium kompletterat med 10% FCS (kompletterande tabell S1) och genetiskt sulfat (G418) vid en slutlig koncentration av 200 μg / ml. Kvantifiera parasittillväxt genom cellräkning i en Neubauer-kammare före subkulturering. Stäng locket ordentligt och håll odlingskolven (ej ventilerad) vid 28 °C i vertikalt läge.
      OBS: G418 säkerställer pLacZ-plasmidval och underhåll. Logfaskulturer har en epimastigotkoncentration på 1-5 × 107 parasiter/ml för Dm28c/pLacZ-linjen.
    2. Bered en suspension på 2 × 105 epimastigoter/ml från en logfaskultur i LIT kompletterad med G418-antibiotikum. Dispensera 100 μL av epimastigotesuspensionen per brunn (20 000 epimastigoter i 100 μL LIT) av en 96-brunns mikroplatta och fyll den slutliga volymen till 200 μL per brunn med mediet.
  2. Amastigote beredning
    1. Använd spontana metacykliska trypomastigotes erhållna från en åldrad epimastigotkultur (i 7 dagar i detta protokoll) för att utföra en initial infektion i en T-25-kolv med 2 × 105 Vero-celler som tidigare yppats i DMEM kompletterat med 2% FCS.
      1. Räkna antalet metacykliska trypomastigotes i en Neubauer-kammare, infektera Vero-cellmonoskiktet med en mångfald av infektion (MOI) på 10 i 5 ml DMEM med 2% FCS och inkubera vid 37 ° C och 5%CO2 i 16 timmar. Tvätta de återstående trypomastigoterna genom att avlägsna mediet från kolven med en 5 ml steril pipett, tillsätt sedan 5 ml 1x PBS och aspirera. Slutligen tillsätt 5 ml DMEM med 2% FCS och inkubera under samma förhållanden.
      2. Använd trypomastigoterna som kommer från det infekterade Vero-cellmonolagret för att upprätthålla infektionen i T-25-kolvar med 2 × 105 Vero-celler i DMEM med 2% FCS, vilket genererar en ny infekterad flaska varje vecka.
        OBS: Efter 5-7 dagar börjar trypomastigoter dyka upp och är synliga i supernatanten. Lägg inte till G418 till trypomastigoterna som används för att infektera cellerna eller de infekterade cellerna, eftersom Vero-cellinjen inte är resistent mot G418.
    2. Bered en suspension på 1 × 105 Vero-celler/ml i DMEM kompletterad med 2 % FCS och frö 100 μL av suspensionen per brunn i vävnadsodlingsplattor med 96 brunnar (10 000 celler per brunn). Inkubera över natten (12-16 timmar) vid 37 °C och 5% CO2 för att säkerställa att cellerna fastnar på botten av brunnarna.
    3. Efter inkubation över natten, skölj Vero-cellmonoskiktet tre gånger med 100 μL steril 1x PBS. Tillsätt T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigotes (erhållna från en tidigare infektion i en T-25-kolv, steg 2.2.1) vid en MOI på 10 på 100 μL DMEM kompletterat med 2 % FCS per brunn (100 000 trypomastigotes per brunn).
    4. Inkubera plattorna i 6 timmar vid 37 °C och 5 %CO2. Efter denna inkubationsperiod, tvätta plattorna två gånger med 1x PBS och tillsätt 100 μL DMEM utan fenolrött kompletterat med 2% FCS.
      OBS: Efter 48 timmar (2 dagar efter infektion) är intracytoplasmatiska amastigotes synliga med ett optiskt mikroskop. Fenolrött, en pH-indikator i DMEM och andra cellodlingsmedier, kan störa absorbansmätningen av CPRG. Om DMEM utan fenolrött inte är tillgängligt, se alternativen som nämns nedan i avsnitt 3.2.1.
  3. Trypomastigot beredning
    1. Bered en suspension på 1 × 106 Vero-celler/ml i DMEM kompletterad med 2 % FCS och frö 800 000 celler i 5 ml av mediet i T-25-kolvar. Inkubera över natten (12-16 timmar) vid 37 °C och 5% CO2 för att säkerställa cellföljsamhet.
      ANMÄRKNING: För en T-75-kolv × 106 celler i en slutlig volym på 15 ml.
    2. Skölj två gånger med 3 ml steril 1x PBS efter inkubation. Tillsätt T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigotes vid en MOI på 10 i 5 ml DMEM med 2 % FCS (8 × 106 trypomastigotes för en T-25-kolv).
      ANMÄRKNING: För en T-75-kolv, tillsätt 20 × 106 trypomastigotes i en slutlig volym på 15 ml DMEM med 2% FCS.
    3. Inkubera över natten (12-16 timmar) vid 37 °C och 5 % CO2. Tvätta kolven två gånger med 3 ml 1x PBS och tillsätt 5 ml färsk DMEM kompletterad med 2% FCS. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i fyra dagar.
    4. Kontrollera supernatanten för trypomastigotes under ett optiskt mikroskop. Kvantifiera trypomastigoterna genom att räkna dem i en Neubauer-kammare. Samla supernatanten i ett 15 ml rör och centrifugera vid 7 000 × g i 10 minuter vid rumstemperatur.
    5. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten för att erhålla en koncentration på 1 × 106 trypomastigotes/ml i DMEM utan fenolrött kompletterat med 2 % FCS. Frö 100 μL av trypomastigotesuspensionen (100 000 trypomastigoter per brunn) i en 96-brunnsplatta.
      OBS: Om DMEM utan fenolrött inte är tillgängligt, se alternativ nedan i avsnitt 3.2.1.

3. β-galaktosidasanalys

OBS: Kvantifiering av β-galaktosidasaktivitet används som ett indirekt sätt att bestämma antalet parasiter. Det förväntas att tillväxten kommer att hämmas i närvaro av en trypanocidal förening, vilket leder till ett lägre antal parasiter jämfört med den obehandlade kontrollen, vilket kommer att återspeglas i en lägre β-galaktosidasaktivitet och därmed lägre absorbans.

  1. Inkubera parasiterna med BZN.
    1. Tillsätt 100 μL motsvarande 2x BZN-lösning per brunn för att nå en slutlig koncentration av BZN på 80, 40, 20, 10, 5 och 2,5 μM till 100 μL epimastigotesuspension (från steg 2.1), Vero-celler med amastigotes (2 dagar efter infektion) (steg 2.2) eller trypomastigotes (steg 2.3) i en 96-brunnsplatta.
    2. Inkubera epimastigoterna vid 28 °C i 72 timmar och trypomastigotes eller infekterade Vero-celler med amastigotes i 24 timmar vid 37 °C och 5 %CO2.
      OBS: Varje läkemedelskoncentration bör utvärderas åtminstone i tre exemplar och inkludera kontrollkulturer av epimastigoter, trypomastigotes och infekterade Vero-celler med DMSO (se steg 1.2.2.4).
  2. Kolorimetrisk reaktion
    1. Efter behandlingsinkubationsperioden, om infekterade Vero-celler eller trypomastigotes är i DMEM med fenolrött, ersätt mediet med 100 μL 1x PBS för att undvika störningar. Utför tredubbla blankbrunnar som endast innehåller 100 μl motsvarande medium (eller 1x PBS beroende på vad som är tillämpligt).
      OBS: Det är inte nödvändigt att ta bort odlingsmediet för epimastigoter vid LIT-medium eller DMEM utan fenolrött. DMEM med fenolrött kan fortfarande användas; förbereda en tom brunn med enbart DMEM för att mäta basabsorbansen och sedan subtrahera detta värde under dataanalysen (steg 3.3). Schneiders insektsmedium, som är färglöst, är ett alternativ för epimastigotes.
    2. Tillsätt 40 μL CPRG-substratlösning och 10 μL tvättmedelslösning till varje brunn, vilket ger en slutlig koncentration på 200 μM CPRG och 0,1% tvättmedel i en slutlig volym på 250 μL i varje brunn.
      OBS: CPRG-lösningen och tvättmedlet kan tillsättas i en slutlig volym på 50 μL per brunn.
    3. Inkubera vid 37 °C i 2 timmar och mät absorbansen vid 595 nm i en mikroplattspektrofotometer.
      OBS: Den förväntade färgförändringen är gul till rödbrun vid β-galaktosidas enzymatisk klyvning (figur 2A). Inkubationstiden kan förlängas upp till 4 timmar, och absorbansspektra för klorfenolrött kan läsas mellan 570 och 595 nm med liknande kurvbeslag (kompletterande figur S1A,B). Inkubation i upp till 24 timmar i närvaro av CPRG-substrat har visat liknande kurvbeslag (kompletterande figur S1C).
      1. I en mikroplattspektrofotometer med en monokromatorväljare skapar du ett nytt protokoll i utrustningsprogramvaran (Kompletterande figur S2).
      2. Klicka på Absorbans som detektionsmetod | Slutpunkt som | Ok (kompletterande figur S2A). Lägg till ett lässteg, skriv den valda våglängden och klicka på Ok (tilläggsfigur S2B).
      3. I avsnittet Plattlayout markerar du de brunnar som ska läsas och klickar på Ok (kompletterande figur S2C). För att läsa plattan, sätt in den i facket och klicka på Läsplatta. Vänta tills värdena visas på skärmen (kompletterande bild S2D) och exportera dem till ett kalkylblad för att analysera resultaten.
  3. Dataanalys och beräkning av mediehämmarekoncentration (IC50)
    1. Subtrahera det uppmätta blindvärdet, motsvarande endast LIT-medium, 1x PBS eller DMEM med eller utan fenolrött plus CPRG-tvättmedelslösningen. När du testar den trypanocidala aktiviteten hos färgade föreningar, mäta absorbansen för ytterligare blankkontroller med LIT eller DMEM med varje koncentration av läkemedel som används och subtrahera sedan dessa värden från de absorbansvärden som erhållits med parasiterna vid varje koncentration.
      OBS: Kompletterande tabell S2 visar typiska värden som erhålls i denna analys med dessa medier utan parasiter plus CPRG-tvättmedelslösning. Skillnaderna före och efter tillsats av HLRG är signifikanta men stör inte analysen med parasiter (Kompletterande tabell S2).
    2. I statistisk analysprogramvara, plotta koncentrationen av BZN (i μM) kontra absorbansen vid 595 nm i en xy-tabell. Transformera BZN-koncentrationerna till logaritmiska värden genom att klicka på knappen Analysera, välja alternativet Transformera | transformera x-värdena med alternativet x=log(x) och klicka på ok knapp.
    3. Hämta IC50-värdena från programvaran för statistisk analys.
      OBS: IC50 definieras som läkemedelskoncentrationen som minskar parasittillväxten med 50% jämfört med den obehandlade kontrollen och beräknas som böjpunkten för den sigmoidala funktionen som passar kurvan.
      1. I programvaran för statistisk analys klickar du på knappen Analysera , väljer Icke-linjär regression (kurvpassning) i xy-analyslistan och klickar på Ok.
      2. På modellfliken i fönstret Parametrar , i dos-respons-hämningsgruppen med inbyggda ekvationer, väljer du alternativet dos-responsmetod: log (inhibitor) vs. respons - Variabel lutning (fyra parametrar). Lämna alla andra flikar vid standardvärden; klicka på Ok.
      3. Klicka på resultatavsnittet i programvaran för statistisk analys för att hitta IC50-värdet, SD och passformens godhet.
      4. Klicka på grafavsnittet för att hitta xy-grafen för läkemedlets logaritmiska koncentration kontra absorbansvärdena . Leta efter kurvpassningen är också ritad i en annan färg.
        OBS: Ett gratis online IC50-beräkningsverktyg finns på https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter det protokoll som beskrivits ovan inkuberades β-galaktosidas-uttryckande Dm28c-epimastigoter med 6 koncentrationer av BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (eller föreningar av intresse) i 72 timmar. Efter denna period tillsattes CPRG-reagens tillsammans med tvättmedel, som lyserar cellerna och frigör β-galaktosidas. HLRG klyvs av β-galaktosidas för att producera klorfenolrött, vilket leder till en färgförändring från gult till rödaktigt (figur 2A). Klorfenolrött mättes genom att avläsa absorbansen vid 595 nm i en mikroplattläsare efter 2 timmar. En XY-tabell plottades med de logaritmiska koncentrationerna av BZN kontra absorbansen vid 595 nm. Diagrammet anpassades med hjälp av icke-linjär regression (figur 2B). I detta speciella experiment var IC50 erhållen för epimastigoter 20,59 ± 1,075 μM, liknande den som erhölls från litteraturen (tabell I)16,17. Representativa resultat med denna metod för trypomastigotes och amastigotes har beskrivits tidigare13.

Figure 2
Figur 2: Beräkning av IC50-värdet för bensnidazol för epimastigotform Dm28c. (A) En 96-brunnsplatta med epimastigoter behandlade med olika BZN-koncentrationer (2,5, 5, 10, 20, 40 och 80 μM) innan CPRG (1) tillsätts, efter den första tillsatsen av CPRG och tvättmedel (2) och efter inkubation med CPRG och tvättmedel som visar färgförändringen (3). B) XY-plot av de logaritmiska koncentrationerna av BZN kontra absorbans (OD) vid 595 nm för Dm28c/pLacZ-epimastigoter. Diagrammet anpassades med hjälp av icke-linjär regression för att uppskatta IC50-värdet . Varje värde representerar medelvärdet och standardavvikelsen (felstaplar) för 6 oberoende biologiska replikat. Den kontinuerliga blå linjen representerar kurvpassningen. Förkortningar: CPRG = klorfenolröd β-D-galaktopyranosid; BZN = bensnidazol; OD = optisk densitet; C = kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

BZN IC50 (μM) beräknat med Dm28c som uttrycker β-galaktosidas BZN IC50 (μM) rapporterad i litteraturen
Epimastigoter 17.08 till 20.59 11 till 18,72
Amastigotes 2,31 till 3,92 1,66 till 4,39
Trypomastigoter 27,07 till 44,74 24,68 till 50,72

Tabell 1: Intervall av IC50-värden erhållna för epimastigoter, trypomastigotes och amastigotes med hjälp av detta protokoll jämfört med IC50 som rapporterats ilitteraturen 17,18.

Kompletterande figur S1: Inställning av programvaran för mikroplattläsare för avläsningsabsorbans. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: β-galaktosidasaktivitetsmätningar (optisk densitet vid 570 till 595 nm) med epimastigoter från Dm28c / pLacZ-linjen av Trypanosoma cruzi efter inkubation med CPRG vid olika tidpunkter. Värdena uttrycks som medelvärde och standardavvikelse för tre oberoende replikat. Färgade kontinuerliga linjer representerar kurvpassningen. (A) Inkubation med 200 μM CPRG i 2 h. (B) Inkubation med 200 μM CPRG i 4 h. (C) Representation av β-galaktosidasaktivitet (optisk densitet vid 570 nm) vid olika tidpunkter (2, 4 och 24 timmar). Förkortning: CPRG = klorfenolröd β-D-galaktopyranosid. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S1: Sammansättning och beredning av LIT-medium, hemin och PBS. Förkortningar: LIT = Leverinfusion Tryptos; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell S2: Absorbansavläsningar för LIT- och DMEM-medier utan parasiter. Värden uttrycks som tredubblingar av varje medium; Medieraden innehåller medelvärdet för de tre replikaten. och SD-raden innehåller standardavvikelsevärdena för replikaten. Förkortningar: SD = Standardavvikelse; LIT = Tryptos för leverinfusion; DMEM = Dulbeccos modifierade örnmedium. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument beskriver en analys baserad på bestämning av cytoplasmatisk β-galaktosidasaktivitet som frigörs på grund av membranlys av T. cruzi-epimastigoter, trypomastigotes eller infekterade celler med amastigotes i närvaro av substratet CPRG. Vi använde T. cruzi Dm28c/pLacZ-parasiter, en stabil parasitstam som erhållits efter transfektion med en β-galaktosidasbärande plasmid konstruerad av Buckner och medförfattare10. Denna analys har använts för att söka efter antitrypanocidala föreningar 12,19,20,21. T. cruzi Dm28c/pLacZ-stammen användes för att optimera screeningprotokollet. Som sammanfattas i figur 1 har detta protokoll fyra huvudpunkter; den första är parasitsådd i 96-brunnsplattor. Epimastigotes och trypomastigotes räknas och seedas från en suspension. När det gäller amastigotes, först frö Vero celler för att bilda ett vidhäftande monolager och sedan infektera med trypomastigotes. Amastigotes är närvarande inuti cellerna efter 48 h. För det andra, förbered utspädningar av läkemedlet som ska testas i önskade koncentrationer och inkubera med parasiterna. Slutligen innebär det tredje steget att tillsätta HLRG och tvättmedel för att lysera cellerna. HLRG klyvs vid β-galaktosidasfrisättning från parasitcytoplasman, och klorfenolrött genereras och mäts spektrofotometriskt. Det fjärde kritiska steget innefattar dataanalys, konstruktion av x-y-grafer och anpassning av kurvan som erhållits för att beräkna IC50-värdena för läkemedlen av intresse.

En in vitro-analys för alla livscykelstadier av T. cruzi är det första steget i att studera effekterna av ett potentiellt nytt läkemedel. I dessa analyser utvärderas effekterna genom mikroskopisk räkning, ett tidsdyrt och subjektivt förfarande som är svårt att automatisera. Substitutionen av denna teknik med en kolorimetrisk analys kan förbättra screeningens objektivitet, vilket också gör den mindre tidskrävande. Den kolorimetriska plattavläsningen tar bara några minuter, i motsats till de timmar som krävs för arbetsintensiv manuell mikroskopisk räkning, och underlättar screening av stora bibliotek av nya föreningar med potentiellt terapeutiskt värde. När det gäller den övergripande likheten mellan de β-galaktosidasuttryckande parasiterna (Dm28c / pLacZ) jämfört med den vilda dm28c-stammen, bestämde vi att parasiterna var morfologiskt normala, med liknande tillväxthastigheter och differentierade lika inom livscykelformerna. Dessutom visade de drogtestresultat som erhölls genom att jämföra den vilda typen Dm28c och Dm28c / pLacZ-linjen som kvantifierades genom mikroskopisk räkning inga signifikanta skillnader13.

En begränsning med detta protokoll är att färgade odlingsmedier kan störa den uppmätta absorbansen. DMEM (eller RPMI) utan fenolrött rekommenderas för att övervinna denna begränsning. En tom brunn med DMEM användes framgångsrikt som ett basalt absorbansvärde i detta protokoll. En annan begränsning är den förmodade interferensen vid användning av färgade läkemedel, som kan övervinnas med hjälp av media med föreningen som ett ämne eller genom att välja absorbansvåglängden mellan 570 och 595 nm för att ge den lägsta störningen. HLRG förändras inte av närvaron av ett givet läkemedel (färgat eller inte), vilket gör denna analys ganska robust. Vid användning av media med fenolröda eller färgade läkemedel är det viktigt att utföra tomma kontroller för varje tillstånd och sedan subtrahera absorbansvärdet som erhållits från mätningarna med parasiter för att undvika störningar.

Koncentrationen av CPRG-lösning som rapporterats för T. cruzi trypomastigotes och Toxoplasma gondii är 100 μM10,15. Den optimala koncentrationen som rapporteras för epimastigotes är dock 200 μM11. I denna Dm28c / pLacZ-linje användes en 200 μM CPRG-lösning för epimastigotes, trypomastigotes och amastigotes med tillförlitliga resultat. När det gäller CPRG-inkubationstider uppnåddes den bästa kurvpassningen när epimastigoter inkuberades med substratlösningen i 2 timmar (R2 = 0,9995). R2 var dock mycket lik (R2 = 0,9994), och β-galaktosidasaktiviteten var linjär i intervallet 6 250-200 000 epimastigoter per brunn (dvs. 62 500-2 000 000 epimastigoter/ml) vid 4 timmar (kompletterande figur S2). Ett linjärt intervall på 3 150-100 000 trypomastigoter per brunn (dvs. 31 500-1 000 000 trypomastigoter/ml) rapporterades för trypomastigoter13. För att undvika att observera stora standardavvikelser är det viktigt att fröa rätt mängd parasiter i varje brunn. Eftersom volymerna är små är det viktigt att vara konsekvent när man räknar parasiterna före sådd. Vidare kan mer än tre replikat mätas för varje experimentellt tillstånd vid behov.

Till skillnad från andra kolorimetriska screeninganalyser22 är efterföljande manipulationssteg inte nödvändiga här, vilket ökar reproducerbarheten och tillförlitligheten hos analysen samt hastigheten på datainsamlingen. Detta är en enkel, snabb och pålitlig analys som är lämplig för läkemedelsscreening med hög genomströmning av kandidatföreningar för ChD-behandling och kan appliceras på andra T. cruzi-stammar . pLacZ-plasmiden är tillgänglig på begäran från Bucker-labbet och kan användas för att transfektera resistenta stammar av till exempel knockout-linjer för att utvärdera linjens känslighet för olika läkemedel i olika genetiska bakgrunder. Den enda kritiska punkten att tänka på är att knockoutplasmiderna ska ha en annan antibiotikaresistensmarkör än pLacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Buckner för att han vänligt tillhandahöll pLacZ-plasmiden. Detta arbete stöddes av Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva från Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) och Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art användes för att producera figur 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

Biokemi utgåva 177
<em>In vitro</em> Läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av <em>Trypanosoma cruzi</em> med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter