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Biochemistry

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Nous décrivons un test colorimétrique à haut débit mesurant l’activité de la β-galactosidase à trois stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas. Ce test peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides de manière facile, rapide et reproductible.

Abstract

Trypanosoma cruzi est l’agent causal de la maladie de Chagas (ChD), une maladie endémique d’importance pour la santé publique en Amérique latine qui affecte également de nombreux pays non endémiques en raison de l’augmentation de la migration. Cette maladie touche près de 8 millions de personnes, avec de nouveaux cas estimés à 50 000 par an. Dans les années 1960 et 70, deux médicaments pour le traitement de la maladie coronarienne ont été introduits: le nifurtimox et le benznidazole (BZN). Les deux sont efficaces chez les nouveau-nés et pendant la phase aiguë de la maladie, mais pas dans la phase chronique, et leur utilisation est associée à des effets secondaires importants. Ces faits soulignent le besoin urgent d’intensifier la recherche de nouveaux médicaments contre T. cruzi.

T. cruzi est transmis par les insectes vecteurs hématophages des familles Reduviidae et Hemiptera. Une fois dans l’hôte mammifère, il se multiplie intracellulairement sous forme d’amastigote non flagellée et se différencie en trypomastigote, la forme infectieuse non réplicative de la circulation sanguine. À l’intérieur de l’insecte vecteur, les trypomastigotes se transforment au stade de l’épimastigote et se multiplient par fission binaire.

Cet article décrit un essai basé sur la mesure de l’activité de la β-galactosidase cytoplasmique libérée dans la culture en raison de la lyse des parasites en utilisant le substrat, le rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG). Pour cela, la souche T. cruzi Dm28c a été transfectée avec un plasmide surexprimant la β-galactosidase et utilisée pour le dépistage pharmacologique in vitro dans les stades épimastigote, trypomastigote et amastigote. Cet article décrit également comment mesurer l’activité enzymatique dans les épimastigotes en culture, les cellules Vero infectées avec des amastigotes et les trypomastigotes libérées par les cellules cultivées en utilisant le médicament de référence, le benznidazole, comme exemple. Ce test colorimétrique est facilement effectué et peut être mis à l’échelle à un format à haut débit et appliqué à d’autres souches de T. cruzi .

Introduction

La maladie de Chagas (ChD), ou trypanosomiase américaine, est une maladie parasitaire causée par le protozoaire flagellé, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La maladie coronarienne commence par une phase aiguë asymptomatique ou oligosymptomatique qui n’est généralement pas diagnostiquée, suivie d’une phase chronique à vie. Dans la chronicité, ~ 30% des patients manifestent - des décennies après l’infection - une variété de conditions débilitantes, y compris la myocardiopathie, les méga-syndromes digestifs, ou les deux, avec un taux de mortalité allant de 0,2% à 20%1,2,3. Les patients chroniques asymptomatiques peuvent ne présenter aucun signe clinique, mais rester séropositifs tout au long de leur vie.

Les estimations suggèrent qu’environ 7 millions de personnes sont infectées dans le monde, principalement en Provenance d’Amérique latine, où la maladie coronarienne est endémique. Dans ces pays, T. cruzi est principalement transmis par des punaises triatomines hématophages infectées (transmission à transmission vectorielle) et moins fréquemment par transmission orale par l’ingestion d’aliments contaminés par des excréments de triatomines contenant les parasites2. De plus, le parasite peut être transmis par le placenta des mères chagasiques aux nouveau-nés, par transfusion sanguine ou lors d’une transplantation d’organe. Ces moyens indépendants du vecteur de contracter l’infection et la migration humaine ont contribué à la propagation mondiale de la maladie, comme en témoigne un nombre croissant de cas en Amérique du Nord, en Europe et dans certains pays d’Afrique, de la Méditerranée orientale et du Pacifique occidental4. La maladie coronarienne est considérée comme une maladie négligée, car la transmission à transmission vectorielle est étroitement associée à la pauvreté et constitue un problème de santé publique majeur, en particulier dans les pays à faible revenu d’Amérique latine. Bien qu’il existe des traitements disponibles, la mortalité due à la maladie coronarienne en Amérique latine est la plus élevée parmi les maladies parasitaires, y compris le paludisme2.

Il existe deux médicaments homologués pour le traitement de la coronaropathie introduits à la fin des années 1960 et au début des années 1970 : le nifurtimox et le benznidazole5. Les deux médicaments sont efficaces dans la phase aiguë de la maladie chez les adultes, les enfants et les nouveau-nés infectés congénitalement, ainsi que chez les enfants atteints d’une infection chronique, où la guérison est généralement obtenue. Cependant, seules quelques personnes sont diagnostiquées assez tôt pour être traitées à temps. Selon les derniers essais cliniques, les deux médicaments ont des limites importantes chez les adultes et étaient inefficaces pour réduire les symptômes chez les personnes atteintes de maladies chroniques; par conséquent, leur utilisation à ce stade est controversée. D’autres inconvénients sont les périodes de traitement prolongées requises (60-90 jours) et les effets indésirables fréquents et graves observés, qui conduisent à l’arrêt du traitement chez une proportion de personnes infectées 6,7. On estime que moins de 10 % des personnes atteintes de coronaropathie ont été diagnostiquées, et encore moins ont accès à un traitement, car de nombreuses personnes touchées vivent dans des zones rurales où l’accès aux soins de santé est inexistant ou rare8. Ces faits soulignent le besoin urgent de trouver de nouveaux médicaments contre T. cruzi pour permettre des traitements plus efficaces, sûrs et applicables sur le terrain, en particulier pour la phase chronique. À cet égard, un autre défi dans le développement de composés plus efficaces est la limitation des systèmes d’évaluation de l’efficacité des médicaments in vitro et in vivo9.

Bien que la biologie chimique et les approches génomiques pour l’identification de cibles médicamenteuses potentielles aient été utilisées chez les parasites kinétoplastes, les outils génomiques disponibles chez T. cruzi sont limités contrairement à T. brucei ou Leishmania. Ainsi, le criblage des composés ayant une activité trypanocide reste l’approche la plus utilisée dans la recherche de nouveaux candidats médicaments chimiothérapeutiques contre la maladie de Huntington. Habituellement, la découverte de médicaments chez T. cruzi doit commencer par tester les effets d’un nouveau médicament dans un essai in vitro contre le stade épimastigote. Pendant des décennies, la seule façon de mesurer les effets inhibiteurs des composés candidats sur T. cruzi était le comptage microscopique manuel, qui est laborieux, long et dépendant de l’opérateur. De plus, cette approche convient pour l’analyse d’un petit nombre de composés, mais est inacceptable pour le criblage à haut débit de grandes bibliothèques de composés. De nos jours, de nombreuses recherches commencent par l’analyse d’un grand nombre de composés de différentes origines qui sont testés in vitro, testant leur capacité à inhiber la croissance des parasites. Des méthodes colorimétriques et fluorométriques ont été développées pour augmenter le débit dans ces essais, améliorant l’objectivité du criblage et rendant l’ensemble du processus moins fastidieux9.

L’une des méthodes colorimétriques les plus largement utilisées est basée sur l’activité β-galactosidase des parasites transfectés décrite pour la première fois par Bucknet et ses collaborateurs10. L’enzyme β-galactosidase exprimée par les parasites recombinants hydrolyse le substrat chromogène, le rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG), en rouge chlorophénol, qui peut être facilement mesuré colorimétriquement à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Ainsi, la croissance des parasites en présence d’une variété de composés peut être simultanément évaluée et quantifiée dans des plaques de microtitrage. Cette méthode a été appliquée pour tester des médicaments sous forme d’épimastigote (présents dans l’insecte vecteur), des trypomastigotes et des amastigotes intracellulaires, les stades mammifères du parasite. De plus, plusieurs souches recombinantes de T. cruzi transfectées avec le plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 pour exprimer l’enzyme Escherichia coli β-galactosidase sont déjà disponibles (et de nouvelles peuvent être construites), ce qui permet d’évaluer les parasites de différentes unités de typage discrètes (DTU) qui peuvent ne pas se comporter également envers les mêmes composés 10,11,12,13 . Cette méthode a déjà été utilisée avec succès pour évaluer l’activité des composés contre T. cruzi dans le criblage à faible et à haut débit12,13. Des approches similaires ont également été utilisées chez d’autres parasites protozoaires, notamment Toxoplasma gondii et Leishmania mexicana14,15.

Cet article décrit et montre une méthode détaillée pour un dépistage in vitro des médicaments contre tous les stades du cycle de vie de T. cruzi en utilisant des parasites exprimant β-galactosidase. Les essais présentés ici ont été réalisés avec une lignée T. cruzi exprimant la β-galactosidase obtenue par transfection de la souche T. cruzi Dm28c du DTU I13 avec du plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). De plus, le même protocole pourrait être facilement adapté à d’autres souches pour comparer les performances entre les composés et entre les souches de T. cruzi ou DTU.

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Protocol

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu de l’ensemble de la conception expérimentale.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble du test de dépistage in vitro de la lignée Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilisant le CPRG comme substrat pour la réaction colorimétrique. Le test consiste à ensemencer les parasites (1), à les incuber avec du BZN (2 et 3), puis à ajouter le substrat colorimétrique (4). Lorsque les parasites sont lysés, β-galactosidase est libérée et clive CPRG en rouge chlorophénol; ce changement de couleur peut être mesuré spectrophotométriquement (5). Les données peuvent être analysées dans un logiciel d’analyse statistique pour obtenir la concentration semi-inhibitrice (IC50) de BZN. Abréviations : CPRG = rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside; BZN = benznidazole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation des solutions de stock

  1. Préparation des supports et des solutions
    1. Solution d’hémine (tableau supplémentaire S1)
      1. Ajouter tous les composants dans un tube centrifuge de 50 mL dans l’ordre indiqué dans la recette et homogénéiser par inversion plusieurs fois.
      2. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 μm.
      3. Préparer les aliquotes de 1 mL dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et les maintenir à -80 °C jusqu’à utilisation.
    2. Tryptose de perfusion hépatique (LIT) moyenne (tableau supplémentaire S1)
      1. Peser tous les composants et remuer pour homogénéiser à température ambiante dans un bécher de 1 L contenant au moins 700 mL d’eau distillée.
      2. Ajuster le pH à 7,2 et augmenter le volume à 900 mL dans un cylindre gradué de 1 L avec de l’eau distillée; stériliser par filtration ou autoclavage (121 °C pendant 20 min).
      3. Compléter le milieu en ajoutant 100 mL de sérum de veau fœtal (FCS), (10 % FCS, stérile et inactivé thermiquement à 56 °C pendant 45 min), 20 mL de solution de glucose stérile à 40 % (stérilisée par autoclavage, 121 °C pendant 20 min) et 5 mL de solution d’hémine (concentration finale 5 μM) à 900 mL de milieu LIT.
    3. Préparez le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco à partir de la poudre en suivant les instructions du fabricant.
    4. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (tableau supplémentaire S1)
      1. Dissoudre tous les composants solides en remuant la solution à température ambiante dans un bécher de 1 L.
      2. Ajuster le pH à 7,2, niveler jusqu’à 1 L dans un cylindre gradué de 1 L avec de l’eau distillée et stériliser par filtration ou autoclavage (121 °C, 20 min).
  2. Benznidazole (BZN) solutions mères et dilutions
    REMARQUE : La plage de concentration de BZN utilisée dans ce travail était de 2,5 à 80 μM.
    1. Préparer une solution mère de 1 M BZN en dissolvant 13 mg du médicament dans 50 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Dans des conditions aseptiques, préparer des dilutions en série à partir de cette solution mère de BZN 1 M à deux fois la concentration finale souhaitée (2x solutions) dans un volume final suffisant pour le nombre de puits à analyser.
      REMARQUE: Calculer pour 100 μL par puits avec un excès de 10-20%. La solution mère de BZN et toutes les dilutions de BZN doivent être préparées immédiatement avant l’utilisation dans le dosage en raison de la faible solubilité du médicament dans le milieu.
    2. Préparer 2x dilutions BZN de 160, 80, 40, 20, 10 et 5 μM.
      1. Diluer 1 M BZN solution mère à une dilution de 100 fois (10 μL de 1 M BZN + 990 μL de milieu) pour obtenir une solution de 10 mM dans le milieu approprié utilisé pour chaque étape du cycle de vie de T. cruzi. Mélanger en continu pour homogénéiser la suspension.
      2. Diluer 10 mM de solution de BZN pour préparer 320 μM de BZN dans le milieu approprié : 32 μL de 10 mM de BZN + 968 μL de milieu. Mélanger en continu pour homogénéiser la suspension.
      3. Diluer 320 μM BZN 2 fois pour obtenir une concentration de 160 μM (500 μL de 320 μM BZN + 500 μL de milieu). Mélanger en continu pour homogénéiser la suspension. Répétez cette dilution 2 fois avec chaque solution obtenue pour obtenir des solutions de 80, 40, 20, 10 et 5 μM.
      4. Diluer le DMSO 1 000 fois dans le milieu approprié pour une utilisation comme témoin non traité (contrôle de survie à 100 %).
        REMARQUE: Les épimastigotes tolèrent jusqu’à une dilution de 100 fois du DMSO, tandis que les cellules Vero ne tolèrent qu’une dilution jusqu’à 1 000 fois du DMSO. Si nécessaire, un contrôle de la mort avec 50% de DMSO peut être inclus comme condition de survie de 0%.
  3. Solution de substrat
    1. Dissoudre le CPRG à une concentration de 1 mM dans de l’eau distillée. Pour une plaque de 96 puits, ajouter 2,4 mg de CPRG à 4 mL d’eau.
      REMARQUE: La solution de CPRG doit être préparée immédiatement avant le dosage.
  4. Solution de lyse
    1. Préparer une solution à 2,5 % v/v de détergent non ionique et non dénaturant 2-[4-(2,4,4-triméthylpentan-2-yl)phénoxy]éthanol (voir la Table des matériaux) dans 1x PBS. Préparer 1 mL de la solution par plaque de 96 puits immédiatement avant l’essai.

2. Préparation de la culture parasitaire

  1. Préparation d’épimastigote
    REMARQUE : T. cruzi Dm28c/pLacZ ligne13 est utilisée tout au long de ce rapport.
    1. Cultiver les épimastigotes de T. cruzi exprimant la β-galactosidase de manière axenique à 28 °C dans des flacons de culture cellulaire d’une surface de croissance de 25 cm2 (flacons T-25). Maintenir les cultures en phase logarithmique en sous-cultivant toutes les 48-72 h (en 5 mL) dans un milieu LIT complété par 10% fcS (tableau supplémentaire S1) et sulfate de génétiqueine (G418) à une concentration finale de 200 μg / mL. Quantifier la croissance du parasite par comptage cellulaire dans une chambre de Neubauer avant la sous-culture. Fermez solidement le bouchon et maintenez la fiole de culture (non ventilée) à 28 °C en position verticale.
      REMARQUE: G418 assure la sélection et l’entretien du plasmide pLacZ. Les cultures en phase logarithmique ont une concentration d’épimastigote de 1 à 5 × 10à 7 parasites/mL pour la lignée Dm28c/pLacZ.
    2. Préparer une suspension de 2 × 105 épimastigotes/mL à partir d’une culture en phase logarithmique en LIT supplémentée avec l’antibiotique G418. Distribuer 100 μL de la suspension d’épimastigote par puits (20 000 épimastigotes dans 100 μL de LIT) d’une microplaque de 96 puits et porter le volume final à 200 μL par puits avec le milieu.
  2. Préparation d’amastigote
    1. Utiliser des trypomastigotes métacycliques spontanées obtenues à partir d’une culture d’épimastigote vieillie (pendant 7 jours dans ce protocole) pour effectuer une infection initiale dans une fiole T-25 avec 2 × 105 cellules Vero ensemencées précédemment dans du DMEM complété par 2% fcS.
      1. Compter le nombre de trypomastigotes métacycliques dans une chambre de Neubauer, infecter la monocouche de cellules Vero avec une multiplicité d’infection (MOI) de 10 dans 5 mL de DMEM avec 2% fcS, et incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 16 h. Laver les trypomastigotes restantes en retirant le milieu de la fiole avec une pipette stérile de 5 mL, puis ajouter 5 mL de 1x PBS et aspirer. Enfin, ajoutez 5 mL de DMEM avec 2% de FCS et incubez dans les mêmes conditions.
      2. Utilisez les trypomastigotes émergeant de la monocouche de cellules Vero infectées pour maintenir l’infection dans des flacons T-25 avec 2 × 105 cellules Vero dans le DMEM avec 2% fcS, générant un nouveau flacon infecté chaque semaine.
        REMARQUE: Après 5-7 jours, les trypomastigotes commencent à émerger et sont visibles dans le surnageant. N’ajoutez pas de G418 aux trypomastigotes utilisés pour infecter les cellules ou les cellules infectées, car la lignée cellulaire Vero n’est pas résistante à G418.
    2. Préparer une suspension de 1 × 105 cellules Vero/mL dans du DMEM complété par 2 % de FCS et ensemencer 100 μL de la suspension par puits dans des plaques de culture tissulaire de 96 puits (10 000 cellules par puits). Incuber pendant la nuit (12-16 h) à 37 °C et 5 % de CO2 pour assurer l’adhérence des cellules au fond des puits.
    3. Après l’incubation pendant la nuit, rincer la monocouche de cellules Vero trois fois avec 100 μL de PBS stérile 1x. Ajouter les trypomamastigotes T. cruzi Dm28c/pLacZ (obtenues à partir d’une infection antérieure dans une fiole de T-25, étape 2.2.1) à un MOI de 10 sur 100 μL de DMEM complété par 2 % de FCS par puits (100 000 trypomastigotes par puits).
    4. Incuber les plaques pendant 6 h à 37 °C et 5 % de CO2. Après cette période d’incubation, lavez les plaques deux fois avec 1x PBS, et ajoutez 100 μL de DMEM sans rouge phénolique complété par 2% de FCS.
      REMARQUE: Après 48 h (2 jours après l’infection), les amastigotes intracytoplasmiques sont visibles au microscope optique. Le rouge de phénol, un indicateur de pH dans le DMEM et d’autres milieux de culture cellulaire, pourrait interférer avec la mesure de l’absorbance du CPRG. Si le DMEM sans rouge phénol n’est pas disponible, voir les alternatives mentionnées ci-dessous à la rubrique 3.2.1.
  3. Préparation de trypomastigote
    1. Préparer une suspension de 1 × 106 cellules Vero/mL dans du DMEM complété par 2% de FCS et ensemencer 800 000 cellules dans 5 mL du milieu dans des flacons T-25. Incuber pendant la nuit (12-16 h) à 37 °C et 5 % de CO2 pour assurer l’adhérence des cellules.
      REMARQUE: Pour une fiole T-75, semer 2 × 106 cellules dans un volume final de 15 mL.
    2. Après incubation, rincer deux fois avec 3 mL de PBS stérile 1x. Ajouter les trypomastigotes T. cruzi Dm28c/pLacZ à un MOI de 10 en 5 mL de DMEM avec 2% de FCS (8 × 106 trypomastigotes pour une fiole T-25).
      REMARQUE: Pour une fiole T-75, ajouter 20 × 106 trypomastigotes dans un volume final de 15 mL de DMEM avec 2% FCS.
    3. Incuber toute la nuit (12-16 h) à 37 °C et 5 % de CO2. Laver la fiole deux fois avec 3 mL de 1x PBS, et ajouter 5 mL de DMEM frais complété par 2% FCS. Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant quatre jours.
    4. Vérifiez le surnageant pour les trypomastigotes sous un microscope optique. Quantifiez les trypomastigotes en les comptant dans une chambre de Neubauer. Recueillir le surnageant dans un tube de 15 mL et centrifuger à 7 000 × g pendant 10 min à température ambiante.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille pour obtenir une concentration de 1 × 106 trypomastigotes/mL dans le DMEM sans rouge phénol complété par 2% de FCS. Ensemencez 100 μL de la suspension de trypomastigote (100 000 trypomastigotes par puits) dans une plaque de 96 puits.
      REMARQUE: Si le DMEM sans rouge de phénol n’est pas disponible, voir les alternatives ci-dessous à la rubrique 3.2.1.

3. Dosage de la β-galactosidase

REMARQUE: La quantification de l’activité de la β-galactosidase est utilisée comme moyen indirect de déterminer le nombre de parasites. On s’attend à ce que la croissance soit inhibée en présence d’un composé trypanocide, ce qui entraînera un nombre inférieur de parasites par rapport au témoin non traité, ce qui se traduira par une activité β-galactosidase plus faible et donc une absorbance plus faible.

  1. Incuber les parasites avec du BZN.
    1. Ajouter 100 μL de solution de BZN 2x correspondante par puits pour atteindre une concentration finale de BZN de 80, 40, 20, 10, 5 et 2,5 μM à 100 μL de suspension d’épimastigote (à partir de l’étape 2.1), de cellules Vero avec amastigotes (2 jours après l’infection) (étape 2.2) ou de trypomastigotes (étape 2.3) dans une plaque de 96 puits.
    2. Incuber les épimastigotes à 28 °C pendant 72 h, et les trypomastigotes ou cellules Vero infectées avec des amastigotes pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2.
      REMARQUE: Chaque concentration de médicament doit être évaluée au moins en trois exemplaires et inclure des cultures témoins d’épimastigotes, de trypomastigotes et de cellules Vero infectées avec DMSO (voir étape 1.2.2.4).
  2. Réaction colorimétrique
    1. Après la période d’incubation du traitement, si des cellules Vero infectées ou des trypomastigotes sont dans le DMEM avec du rouge phénol, remplacez le milieu par 100 μL de 1x PBS pour éviter toute interférence. Effectuer des puits vierges triples contenant seulement 100 μL de milieu correspondant (ou 1x PBS selon le cas).
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’enlever le milieu de culture des épimastigotes en cas de milieu LIT ou DMEM sans rouge phénol. Le DMEM avec du rouge phénol peut encore être utilisé; préparer un puits vierge avec du DMEM seul pour mesurer l’absorbance de base, puis soustraire cette valeur lors de l’analyse des données (étape 3.3.). Le milieu insecte de Schneider, qui est incolore, est une alternative aux épimastigotes.
    2. Ajouter 40 μL de solution de substrat CPRG et 10 μL de solution détergente à chaque puits, obtenant une concentration finale de 200 μM de CPRG et 0,1 % de détergent dans un volume final de 250 μL dans chaque puits.
      REMARQUE: La solution CPRG et le détergent peuvent être ajoutés ensemble dans un volume final de 50 μL par puits.
    3. Incuber à 37 °C pendant 2 h et mesurer l’absorbance à 595 nm dans un spectrophotomètre à microplaques.
      REMARQUE: Le changement de couleur attendu est jaune à brun rougeâtre sur β-galactosidase décolleté enzymatique (Figure 2A). Le temps d’incubation peut être prolongé jusqu’à 4 h, et les spectres d’absorbance du rouge chlorophénol peuvent être lus entre 570 et 595 nm avec des raccords de courbe similaires (figure supplémentaire S1A, B). L’incubation jusqu’à 24 h en présence de substrat CPRG a montré des raccords de courbe similaires (figure supplémentaire S1C).
      1. Dans un spectrophotomètre à microplaques avec un sélecteur monochromateur, créez un nouveau protocole dans le logiciel de l’équipement (figure supplémentaire S2).
      2. Cliquez sur Absorbance comme méthode de détection | Point de terminaison en tant que type de lecture | Ok (Figure supplémentaire S2A). Ajoutez une étape de lecture, tapez la longueur d’onde sélectionnée, puis cliquez sur OK (Figure supplémentaire S2B).
      3. Dans la section Disposition des plaques , marquez les puits à lire et cliquez sur OK (figure supplémentaire S2C). Pour lire la plaque, insérez-la dans le bac et cliquez sur Lire la plaque. Attendez que les valeurs apparaissent à l’écran (Figure supplémentaire S2D) et exportez-les dans une feuille de calcul pour analyser les résultats.
  3. Analyse des données et calcul de la concentration d’inhibiteurs de milieu (CI50)
    1. Soustrayez la valeur mesurée à blanc, correspondant uniquement au milieu LIT, 1x PBS ou DMEM avec ou sans rouge phénol plus la solution de détergent CPRG. Lorsque vous testez l’activité trypanocide des composés colorés, mesurez l’absorbance de témoins à blanc supplémentaires avec LIT ou DMEM avec chaque concentration de médicament utilisée, puis soustrayez ces valeurs des valeurs d’absorbance obtenues avec les parasites à chaque concentration.
      REMARQUE: Le tableau supplémentaire S2 montre les valeurs typiques obtenues dans ce test avec ces milieux sans parasites plus solution de détergent CPRG. Les différences avant et après l’ajout de CPRG sont significatives mais n’interfèrent pas avec le dosage avec les parasites (tableau supplémentaire S2).
    2. Dans un logiciel d’analyse statistique, tracer la concentration de BZN (en μM) par rapport à l’absorbance à 595 nm dans un tableau xy. Transformez les concentrations BZN en valeurs logarithmiques en cliquant sur le bouton Analyser, en sélectionnant l’option Transformer | transformer les valeurs x à l’aide de l’option x=log(x), puis en cliquant sur le bouton Ok.
    3. Obtenez les valeurs IC50 à partir du logiciel d’analyse statistique.
      REMARQUE: L’IC50 est défini comme la concentration de médicament qui réduit la croissance du parasite de 50% par rapport au témoin non traité et est calculé comme le point d’inflexion de la fonction sigmoïdale qui s’adapte à la courbe.
      1. Dans le logiciel d’analyse statistique, cliquez sur le bouton Analyser , sélectionnez Régression non linéaire (ajustement de courbe) dans la liste d’analyse xy, puis cliquez sur OK.
      2. Dans l’onglet modèle de la fenêtre Paramètres , dans le groupe dose-réponse - inhibition des équations intégrées, sélectionnez l’option méthode dose-réponse : log(inhibiteur) vs réponse - Pente variable (quatre paramètres). Laissez tous les autres onglets aux valeurs par défaut ; cliquez sur OK.
      3. Cliquez sur la section des résultats du logiciel d’analyse statistique pour trouver la valeur IC50, le SD et la qualité de l’ajustement.
      4. Cliquez sur la section graphique pour trouver le graphique xy de la concentration logarithmique du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance . Recherchez l’ajustement de la courbe est également représenté graphiquement dans une couleur différente.
        REMARQUE: Un outil de calcul IC50 en ligne gratuit peut être trouvé à https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

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Representative Results

Suivant le protocole décrit ci-dessus, β-galactosidase exprimant Dm28c épimastigotes ont été incubées avec 6 concentrations de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (ou composés d’intérêt) pendant 72 h. Après cette période, un réactif CPRG a été ajouté avec un détergent, qui lyse les cellules et libère de la β-galactosidase. Le CPRG est clivé par la β-galactosidase pour produire du rouge chlorophénol, ce qui entraîne un changement de couleur du jaune au rougeâtre (Figure 2A). Le rouge de chlorophénol a été mesuré en lisant l’absorbance à 595 nm dans un lecteur de microplaques après 2 h. Un tableau XY a été tracé avec les concentrations logarithmiques de BZN par rapport à l’absorbance à 595 nm. Le diagramme a été ajusté à l’aide d’une régression non linéaire (figure 2B). Dans cette expérience particulière, la CI50 obtenue pour les épimastigotes était de 20,59 ± 1,075 μM, similaire à celle obtenue dans la littérature (tableau I)16,17. Des résultats représentatifs utilisant cette méthode pour les trypomastigotes et les amastigotes ont été décrits précédemment13.

Figure 2
Figure 2 : Calcul de la valeur IC50 du benznidazole pour l’épimastigote sous forme de Dm28c. (A) Une plaque de 96 puits avec des épimastigotes traitées avec différentes concentrations de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 et 80 μM) avant d’ajouter du CPRG (1), après addition initiale de CPRG et de détergent (2), et après incubation avec CPRG et détergent montrant le changement de couleur (3). (B) Diagramme XY des concentrations logarithmiques de BZN par rapport à l’absorbance (OD) à 595 nm pour les épimastigotes Dm28c/pLacZ. Le diagramme a été ajusté à l’aide d’une régression non linéaire pour estimer la valeur IC50. Chaque valeur représente la moyenne et l’écart-type (barres d’erreur) de 6 répliques biologiques indépendantes. La ligne bleue continue représente l’ajustement de la courbe. Abréviations : CPRG = rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside; BZN = benznidazole; OD = densité optique; C = contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

BZN IC50 (μM) calculé en utilisant Dm28c exprimant β-galactosidase BZN IC50 (μM) rapporté dans la littérature
Épimastigotes 17.08 à 20.59 11 à 18,72
Amastigotes 2,31 à 3,92 1,66 à 4,39
Trypomastigotes 27,07 à 44,74 24,68 à 50,72

Tableau 1 : Plage des valeurs de la CI50 obtenues pour les épimastigotes, les trypomastigotes et les amastigotes à l’aide de ce protocole par rapport à la CI50 rapportée dans la littérature17,18.

Figure supplémentaire S1 : Configuration du logiciel de lecture de microplaques pour la lecture de l’absorbance. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Mesures de l’activité de la β-galactosidase (densité optique de 570 à 595 nm) à l’aide d’épimastigotes de la lignée Dm28c/pLacZ de Trypanosoma cruzi après incubation avec CPRG à différents moments. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne et d’écart-type de trois répétitions indépendantes. Les lignes continues colorées représentent l’ajustement de la courbe. (A) Incubation avec 200 μM CPRG pendant 2 h. (B) Incubation avec 200 μM CPRG pendant 4 h. (C) Représentation de l’activité de la β-galactosidase (densité optique à 570 nm) à différents points temporels (2, 4 et 24 h). Abréviation : CPRG = rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Composition et préparation du milieu LIT, de l’hémine et du PBS. Abréviations: LIT = Liver Infusion Tryptose; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Lectures d’absorbance pour les milieux LIT et DMEM sans parasites. Les valeurs sont exprimées en trois exemplaires de chaque milieu; la ligne média contient la valeur moyenne des trois répliques; et la ligne SD contient les valeurs d’écart type des réplications. Abréviations : SD = écart-type; LIT = Tryptose de perfusion hépatique; DMEM = Milieu Eagle modifié de Dulbecco. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Cet article décrit un test basé sur la détermination de l’activité cytoplasmique de la β-galactosidase libérée par la lyse membranaire des épimastigotes de T. cruzi, des trypomastigotes ou des cellules infectées par des amastigotes en présence du substrat CPRG. Nous avons utilisé des parasites T. cruzi Dm28c/pLacZ, une souche parasitaire stable obtenue après transfection avec un plasmide contenant de la β-galactosidase construit par Buckner et les co-auteurs10. Ce test a été utilisé pour rechercher des composés antitrypanocides 12,19,20,21. La souche T. cruzi Dm28c/pLacZ a été utilisée pour optimiser le protocole de dépistage. Comme le résume la figure 1, ce protocole comporte quatre points principaux; le premier est l’ensemencement de parasites dans des plaques de 96 puits. Les épimastigotes et les trypomastigotes sont comptés et ensemencés à partir d’une suspension. Dans le cas des amastigotes, commencez par ensemencer les cellules Vero pour former une monocouche adhérente, puis infecter avec des trypomastigotes. Les amastigotes sont présents à l’intérieur des cellules après 48 h. Deuxièmement, préparez des dilutions du médicament à tester aux concentrations souhaitées et incubez avec les parasites. Enfin, la troisième étape consiste à ajouter du CPRG et du détergent pour lyser les cellules. Le CPRG est clivé lors de la libération de β-galactosidase par le cytoplasme du parasite, et le rouge chlorophénol est généré et mesuré spectrophotométriquement. La quatrième étape critique implique l’analyse des données, la construction de graphiques x-y et l’ajustement de la courbe obtenue pour calculer les valeurs IC50 des médicaments d’intérêt.

Un test in vitro pour toutes les étapes du cycle de vie de T. cruzi est la première étape de l’étude des effets d’un nouveau médicament potentiel. Dans ces essais, les effets sont évalués par comptage microscopique, une procédure longue et subjective difficile à automatiser. La substitution de cette technique par un test colorimétrique peut améliorer l’objectivité du dépistage, le rendant également moins chronophage. La lecture colorimétrique des plaques ne prend que quelques minutes, contrairement aux heures nécessaires pour un comptage microscopique manuel à forte intensité de main-d’œuvre, et facilite le criblage de grandes bibliothèques de nouveaux composés ayant une valeur thérapeutique potentielle. En ce qui concerne la similitude globale des parasites exprimant la β-galactosidase (Dm28c/pLacZ) par rapport à la souche Dm28c de type sauvage, nous avons déterminé que les parasites étaient morphologiquement normaux, avec des taux de croissance similaires et différenciés de manière égale au sein des formes du cycle de vie. De plus, les résultats des tests de dépistage de drogues obtenus en comparant le Dm28c de type sauvage et la lignée Dm28c/pLacZ quantifiés par comptage microscopique n’ont montré aucune différence significative13.

Une limitation de ce protocole est que les milieux de culture colorés pourraient interférer avec l’absorbance mesurée. Le DMEM (ou RPMI) sans rouge phénol est recommandé pour surmonter cette limitation. Un puits vierge avec DMEM a été utilisé avec succès comme valeur d’absorbance basale dans ce protocole. Une autre limitation est l’interférence putative lors de l’utilisation de médicaments colorés, qui pourrait être surmontée en utilisant un milieu avec le composé comme un blanc ou en sélectionnant la longueur d’onde d’absorbance entre 570 et 595 nm pour donner l’interférence la plus faible. Le CPRG n’est pas altéré par la présence d’un médicament donné (coloré ou non), ce qui rend ce test assez robuste. Lors de l’utilisation de milieux contenant des médicaments rouge phénol ou colorés, il est essentiel d’effectuer des contrôles à blanc pour chaque condition, puis de soustraire la valeur d’absorbance obtenue des mesures avec des parasites pour éviter toute interférence.

La concentration de solution de CPRG rapportée pour T. cruzi trypomastigotes et Toxoplasma gondii est de 100 μM10,15. Cependant, la concentration optimale rapportée pour les épimastigotes est de 200 μM11. Dans cette lignée Dm28c/pLacZ, une solution de CPRG de 200 μM a été utilisée pour les épimastigotes, les trypomastigotes et les amastigotes avec des résultats fiables. En ce qui concerne les temps d’incubation CPRG, le meilleur ajustement de courbe a été obtenu lorsque les épimastigotes ont été incubées avec la solution de substrat pendant 2 h (R2 = 0,9995). Cependant, leR2 était très similaire (R2 = 0,9994), et l’activité de la β-galactosidase était linéaire dans la gamme de 6 250 à 200 000 épimastigotes par puits (c’est-à-dire 62 500 à 2 000 000 épimastigotes/ mL) à 4 h (figure supplémentaire S2). Une plage linéaire de 3 150 à 100 000 trypomastigotes par puits (c.-à-d. 31 500 à 1 000 000 de trypomastigotes/mL) a été rapportée pour les trypomastigotes13. Pour éviter d’observer de grands écarts-types, il est important d’ensemencer la bonne quantité de parasites dans chaque puits. Comme les volumes sont faibles, il est important d’être cohérent lors du comptage des parasites avant l’ensemencement. De plus, plus de trois répétitions pourraient être mesurées pour chaque condition expérimentale si nécessaire.

Contrairement à d’autres tests de dépistage colorimétrique22, les étapes de manipulation ultérieures ne sont pas nécessaires ici, ce qui augmente la reproductibilité et la fiabilité du test ainsi que la vitesse de collecte des données. Il s’agit d’un test facile, rapide et fiable adapté au dépistage médicamenteux à haut débit de composés candidats pour le traitement de la maladie coronarienne et peut être appliqué à d’autres souches de T. cruzi . Le plasmide pLacZ est disponible sur demande auprès du laboratoire Bucker et pourrait être utilisé pour transfecter des souches résistantes, par exemple, de lignées knockout afin d’évaluer la sensibilité de la lignée à différents médicaments dans différents contextes génétiques. Le seul point critique à garder à l’esprit est que les plasmides knockout devraient avoir un marqueur de résistance aux antibiotiques différent de celui de pLacZ.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Buckner d’avoir aimablement fourni le plasmide pLacZ. Ce travail a été soutenu par Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva d’Argentine (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) et Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art a été utilisé pour produire la figure 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

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References

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Biochimie numéro 177
<em>In vitro</em> Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du <em>trypanosoma cruzi</em> à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase
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Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

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