Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

В пробирке Медикаментозный скрининг на всех стадиях жизненного цикла Trypanosoma cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Описан высокопроизводительный колориметрический анализ, измеряющий активность β-галактозидазы на трех стадиях жизненного цикла Trypanosoma cruzi, возбудителя болезни Шагаса. Этот анализ может быть использован для идентификации трипаноцидных соединений простым, быстрым и воспроизводимым способом.

Abstract

Trypanosoma cruzi является возбудителем болезни Шагаса (ИБС), эндемического заболевания, имеющего значение для общественного здравоохранения в Латинской Америке, которое также поражает многие неэндемические страны из-за увеличения миграции. Это заболевание поражает почти 8 миллионов человек, причем новые случаи оцениваются в 50 000 в год. В 1960-х и 70-х годах были введены два препарата для лечения ИБС: нифуртимокс и бензнидазол (БЗН). Оба эффективны у новорожденных и во время острой фазы заболевания, но не в хронической фазе, и их использование связано с важными побочными эффектами. Эти факты подчеркивают настоятельную необходимость активизации поиска новых препаратов против T. cruzi.

T. cruzi передается через гематофаговых насекомых-переносчиков семейств Reduviidae и Hemiptera. Попав в хозяина млекопитающих, он размножается внутриклеточным образом как небигеллированная амастиготная форма и дифференцируется в трипомастигот, нерепликативную инфекционную форму кровотока. Внутри насекомого-переносчика трипомастиготы превращаются в стадию эпимастигота и размножаются посредством бинарного деления.

В данной работе описан анализ, основанный на измерении активности цитоплазматической β-галактозидазы, высвобождаемой в культуру вследствие лизиса паразитов с использованием субстрата хлорфенола красного β-D-галактопиранозида (CPRG). Для этого штамм T. cruzi Dm28c трансфектировался β-галактозидазой-сверхэкспрессирующей плазмидой и использовался для фармакологического скрининга in vitro на стадиях эпимастигота, трипомастигота и амастигота. В этой статье также описывается, как измерить ферментативную активность в культивируемых эпимастиготах, инфицированных клетках Vero амастиготами и трипомастиготах, высвобождаемых из культивируемых клеток, используя в качестве примера референтный препарат бензнидазол. Этот колориметрический анализ легко выполняется и может быть масштабирован до высокопроизводительного формата и применен к другим штаммам T. cruzi .

Introduction

Болезнь Шагаса (ChD), или американский трипаносомоз, является паразитарным заболеванием, вызванным жгутиковым простейшим, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ИБС начинается с бессимптомной или олигосимптомной острой фазы, которая обычно не диагностируется, за которой следует пожизненная хроническая фаза. При хроничности ~ 30% пациентов проявляются через десятилетия после заражения различные изнурительные состояния, включая миокардиопатию, мега-пищеварительные синдромы или и то, и другое, с коэффициентом смертности от 0,2% до 20%1,2,3. Бессимптомные хронические пациенты могут не иметь клинических признаков, но оставаться серопозитивными на протяжении всей своей жизни.

Оценки показывают, что ~ 7 миллионов человек инфицированы во всем мире, в основном из Латинской Америки, где ИБС является эндемичным. В этих странах T. cruzi в основном передается через инфицированных кровососущих триатоминовых насекомых (трансмиссивная передача) и реже перорально через прием пищи, загрязненной триатоминовыми фекалиями, содержащими паразитов2. Кроме того, паразит может передаваться через плаценту от чагасических матерей новорожденным, через переливание крови или во время трансплантации органов. Эти независимые от переносчиков способы заражения инфекцией и миграции людей способствовали всемирному распространению болезни, о чем свидетельствует увеличение числа случаев заболевания в Северной Америке, Европе и некоторых странах Африки, Восточного Средиземноморья и Западной части Тихогоокеана4. ИБС считается забытой болезнью, поскольку трансмиссивная передача тесно связана с нищетой и является ведущей проблемой общественного здравоохранения, особенно в странах Латинской Америки с низким уровнем дохода. Несмотря на наличие доступных методов лечения, смертность от ИБС в Латинской Америке является самой высокой среди паразитарных заболеваний, включая малярию2.

Существует два зарегистрированных препарата для лечения ИБС, введенных в конце 1960-х и начале 1970-х годов: нифуртимокс и бензнидазол5. Оба препарата эффективны в острой фазе заболевания у взрослых, детей и врожденно инфицированных новорожденных, а также у детей с хронической инфекцией, где обычно достигается излечение. Тем не менее, только несколько человек диагностируются достаточно рано, чтобы вовремя лечиться. Согласно последним клиническим испытаниям, оба препарата имеют важные ограничения у взрослых и были неэффективны в уменьшении симптомов у людей с хроническими заболеваниями; следовательно, их использование на данном этапе является спорным. Другими недостатками являются длительные сроки лечения (60-90 дней) и наблюдаемые частые, тяжелые побочные эффекты, которые приводят к прекращению терапии у доли инфицированных людей 6,7. По оценкам, менее 10% людей с ИБС были диагностированы, и еще меньше людей имеют доступ к лечению, поскольку многие пострадавшие люди живут в сельских районах без или с ограниченным доступом к здравоохранению8. Эти факты подчеркивают настоятельную необходимость поиска новых лекарств против T. cruzi, чтобы обеспечить более эффективные, безопасные и применимые к полевым методам лечения, особенно для хронической фазы. В связи с этим еще одной проблемой в разработке более эффективных соединений является ограничение систем оценки эффективности препарата in vitro и in vivo9.

Хотя химическая биология и геномные подходы для идентификации потенциальных мишеней лекарств использовались у кинетопластидных паразитов, доступные геномные инструменты у T. cruzi ограничены в отличие от T. brucei или Leishmania. Таким образом, скрининг соединений с трипаноцидной активностью по-прежнему является наиболее используемым подходом в поиске новых химиотерапевтических препаратов-кандидатов против ИПК. Обычно открытие препарата у T. cruzi должно начинаться с тестирования эффектов нового препарата в анализе in vitro против стадии эпимастигота. В течение десятилетий единственным способом измерения ингибирующего воздействия соединений-кандидатов на T. cruzi был ручной микроскопический подсчет, который является трудоемким, трудоемким и зависящим от оператора. Кроме того, этот подход подходит для анализа небольшого количества соединений, но неприемлем для высокопроизводительного скрининга больших библиотек соединений. В настоящее время многие исследования начинаются с анализа огромного количества соединений различного происхождения, которые анализируются in vitro, проверяя их способность ингибировать рост паразитов. Как колориметрические, так и флуорометрические методы были разработаны для увеличения пропускной способности в этих анализах, повышения объективности скрининга и делая весь процесс менее утомительным9.

Один из наиболее широко используемых колориметрических методов основан на β-галактозидазной активности трансфекторазных паразитов, впервые описанной Бакнетом и соавторами10. Фермент β-галактозидазы, экспрессируемый рекомбинантными паразитами, гидролизует хромогенный субстрат, хлорфенол красный β-D-галактопиранозид (CPRG), до хлорфенол-красного, который можно легко измерить колориметрически с помощью микропластичного спектрофотометра. Таким образом, рост паразитов в присутствии различных соединений может быть одновременно оценен и количественно определен в микротитрных пластинах. Этот метод был применен для тестирования лекарств в формах эпимастигот (присутствующих в насекомом переносчике), трипомастиготах и внутриклеточных амастиготах, стадиях млекопитающих паразита. Кроме того, несколько рекомбинантных штаммов T. cruzi, трансфектированных плазмидой pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 для экспрессии фермента Escherichia coli β-галактозидазы, уже доступны (и могут быть построены новые), что позволяет оценивать паразитов из разных дискретных типографских единиц (DTU), которые могут не вести себя одинаково по отношению к одним и тем же соединениям 10,11,12,13 . Этот метод уже успешно использовался для оценки активности соединений в отношении T. cruzi при низко- и высокопроизводительном скрининге12,13. Аналогичные подходы также использовались у других простейших паразитов, включая Toxoplasma gondii и Leishmania mexicana14,15.

В этой статье описан и показан подробный метод скрининга препарата in vitro против всех стадий жизненного цикла T. cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу. Представленные здесь анализы были выполнены с β-галактозидазой-экспрессирующей линией T. cruzi , полученной путем трансфекции штамма T. cruzi Dm28c из DTU I13 с плазмидой pLacZ (Dm28c/pLacZ). Кроме того, тот же протокол может быть легко адаптирован к другим штаммам для сравнения производительности между соединениями и между штаммами T. cruzi или DTU.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор всего экспериментального проекта показан на рисунке 1.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор скринингового анализа in vitro линии Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ с использованием CPRG в качестве подложки для колориметрической реакции. Анализ состоит из посева паразитов (1), инкубации их с BZN (2 и 3), а затем добавления колориметрического субстрата (4). Когда паразиты лизируются, высвобождается β-галактозидаза и расщепляет CPRG до хлорфенол-красного цвета; это изменение цвета может быть измерено спектрофотометрически (5). Данные могут быть проанализированы в программном обеспечении статистического анализа для получения полуингибирующей концентрации (IC50) BZN. Сокращения: CPRG = хлорфенол красный β-D-галактопиранозид; BZN = бензнидазол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка стоковых решений

  1. Подготовка носителей и растворов
    1. Раствор гемина (Дополнительная таблица S1)
      1. Добавьте все компоненты в 50 мл центрифужной трубки в порядке, указанном в рецепте, и гомогенизируйте путем инверсии несколько раз.
      2. Стерилизуют путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм.
      3. Приготовьте 1 мл аликвоты в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл и держите их при -80 °C до использования.
    2. Инфузия печени триптоза (LIT) Среда (Дополнительная таблица S1)
      1. Взвесьте все компоненты и перемешайте для гомогенизации при комнатной температуре в стакане объемом 1 л, содерущем не менее 700 мл дистиллированной воды.
      2. Отрегулируйте pH до 7,2 и добавьте объем до 900 мл в градуированном цилиндре объемом 1 л с дистиллированной водой; стерилизовать путем фильтрации или автоклавирования (121 °C в течение 20 мин).
      3. Дополнить среду добавлением 100 мл сыворотки для телят плода (FCS) (10% FCS, стерильной и термоинактивированной при 56 °C в течение 45 мин), 20 мл 40% стерильного раствора глюкозы (стерилизованного автоклавированием, 121 °C в течение 20 мин) и 5 мл раствора гемина (конечная концентрация 5 мкМ) до 900 мл ЛИТ-среды.
    3. Приготовьте модифицированную орлиную среду (DMEM) от Dulbecco из порошка, следуя инструкциям производителя.
    4. Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (Дополнительная таблица S1)
      1. Растворите все твердые компоненты, перемешав раствор при комнатной температуре в стакане объемом 1 л.
      2. Отрегулируйте рН до 7,2, выровняйте до 1 л в градуированном цилиндре объемом 1 л с дистиллированной водой и стерилизуйте фильтрацией или автоклавированием (121 °C, 20 мин).
  2. Исходные растворы и разведения бензнидазола (BZN)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон концентрации BZN, использованный в этой работе, составлял от 2,5 до 80 мкМ.
    1. Готовят готовый раствор 1 М БЗН путем растворения 13 мг препарата в 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). В асептических условиях подготавливают серийные разбавления из этого запасного раствора размером 1 млн БЗН с удвоенной конечной желаемой концентрацией (2-кратные растворы) в конечном объеме, достаточном для количества скважин, подлежащих анализу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитать за 100 мкл на скважину с превышением 10-20%. Исходный раствор БЗН и все разведения БЗН необходимо приготовить непосредственно перед применением в анализе из-за низкой растворимости препарата в среде.
    2. Приготовьте 2 разведения BZN по 160, 80, 40, 20, 10 и 5 мкМ.
      1. Разбавляют 1 М БЗН в 100-кратном разведении (10 мкл 1 М БЗН + 990 мкл среды) для получения раствора 10 мМ в соответствующей среде, используемой для каждой стадии жизненного цикла T. cruzi. Непрерывно перемешивать, чтобы гомогенизировать суспензию.
      2. Развести 10 мМ раствора БЗН для приготовления 320 мкМ БЗН в соответствующей среде: 32 мкл 10 мМ БЗН + 968 мкл среды. Непрерывно перемешивать, чтобы гомогенизировать суспензию.
      3. Разбавляют 320 мкМ BZN в 2 раза до получения концентрации 160 мкМ (500 мкл 320 мкМ BZN + 500 мкл среды). Непрерывно перемешивать, чтобы гомогенизировать суспензию. Повторите это 2-кратное разведение с каждым полученным раствором для получения 80, 40, 20, 10 и 5 мкМ растворов.
      4. Развести ДМСО в 1000 раз в соответствующей среде для использования в качестве необработанного контроля (100% контроль выживаемости).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эпимастиготы переносят до 100-кратного разведения ДМСО, тогда как клетки Веро переносят только до 1000-кратного разведения ДМСО. При необходимости контроль смертности с 50% ДМСО может быть включен в качестве состояния выживаемости 0%.
  3. Решение для подложки
    1. Растворить CPRG в концентрации 1 мМ в дистиллированной воде. Для 96-луночной пластины добавьте 2,4 мг CPRG к 4 мл воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор CPRG должен быть приготовлен непосредственно перед анализом.
  4. Раствор лизиса
    1. Готовят 2,5% v/v раствор неионного, неденатурирующего детергента 2-[4-(2,4,4-триметилпентана-2-ил)фенокси]этанола (см. Таблицу материалов) в 1x PBS. Подготовьте 1 мл раствора на 96-луночную пластину непосредственно перед анализом.

2. Подготовка культуры паразитов

  1. Приготовление эпимастигота
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем докладе используется строка13 T. cruzi Dm28c/pLacZ.
    1. Выращивают β-галактозидазо-экспрессирующий T. cruzi epimastigotes аксенически при 28 °C в колбах клеточной культуры с площадью роста 25см2 (колбы Т-25). Поддерживать культуры в бревенчатой фазе путем субкультурации каждые 48-72 ч (в 5 мл) в ЛИТ среде, дополненной 10% FCS (дополнительная таблица S1) и генетинсульфатом (G418) в конечной концентрации 200 мкг/мл. Количественная оценка роста паразита путем подсчета клеток в камере Нойбауэра перед субкультурой. Надежно закройте колпачок и держите колбу для культивирования (не вентилируемую) при температуре 28 °C в вертикальном положении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: G418 обеспечивает выбор и поддержание плазмиды pLacZ. Культуры логарифмической фазы имеют концентрацию эпимастигота 1-5 × 107 паразитов/мл для линии Dm28c/pLacZ.
    2. Готовят суспензию 2 × 105 эпимастиготов/мл из культуры логарифмической фазы в ЛИТ, дополненной антибиотиком G418. Дозируют 100 мкл суспензии эпимастигота на лунку (20 000 эпимастиготов в 100 мкл LIT) 96-луночной микропластины и составляют конечный объем до 200 мкл на скважину со средой.
  2. Приготовление Амастиготе
    1. Используйте спонтанные метациклические трипомастиготы, полученные из старой культуры эпимастигота (в течение 7 дней в этом протоколе), для выполнения первоначальной инфекции в колбе Т-25 с 2 × 105 клетками Vero, посеянными ранее в DMEM, дополненной 2% FCS.
      1. Подсчитайте количество метациклических трипомастиготов в камере Нойбауэра, заразите монослой клеток Веро кратностью инфекции (MOI) 10 в 5 мл DMEM с 2% FCS и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 16 ч. Вымойте оставшиеся трипомастиготы, удалив среду из колбы стерильной пипеткой объемом 5 мл, затем добавьте 5 мл 1x PBS и аспират. Наконец, добавьте 5 мл DMEM с 2% FCS и инкубируйте в тех же условиях.
      2. Используйте трипомастиготы, возникающие из инфицированного монослоя клеток Vero, для поддержания инфекции в колбах Т-25 с 2 × 105 клетками Vero в DMEM с 2% FCS, генерируя новую инфицированную бутылку каждую неделю.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Через 5-7 дней трипомастиготы начинают появляться и видны в надводном веществе. Не добавляйте G418 к трипомастиготам, используемым для заражения клеток или инфицированных клеток, так как клеточная линия Vero не устойчива к G418.
    2. Готовят суспензию из 1 × 105 клеток Vero/мл в DMEM, дополненную 2% FCS, и семена 100 мкл суспензии на лунку в 96-луночных тканевых культуральных пластинах (10 000 клеток на лунку). Инкубировать в течение ночи (12-16 ч) при 37 °C и 5% CO2 для обеспечения прилипания клеток ко дну скважин.
    3. После ночной инкубации промыть клеточный монослой Vero три раза 100 мкл стерильного 1x PBS. Добавьте трипомастиготы T. cruzi Dm28c/pLacZ (полученные из предыдущей инфекции в колбе Т-25, стадия 2.2.1) при MOI 10 на 100 мкл DMEM, дополненного 2% FCS на лунку (100 000 трипомастиготов на лунку).
    4. Инкубировать пластины в течение 6 ч при 37 °C и 5% CO2. После этого инкубационного периода дважды промыть пластины 1x PBS и добавить 100 мкл DMEM без фенольного красного с добавлением 2% FCS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Через 48 ч (2 дня после заражения) интрацитоплазматические амастиготы видны с помощью оптического микроскопа. Фенол красный, индикатор рН в DMEM и других клеточных культуральных средах, может мешать измерению абсорбции CPRG. Если DMEM без фенольного красного цвета недоступен, см. альтернативы, упомянутые ниже в разделе 3.2.1.
  3. Приготовление трипомастигота
    1. Готовят суспензию из 1 × 106 клеток Vero/мл в DMEM, дополненную 2% FCS, и семена 800 000 клеток в 5 мл среды в колбах Т-25. Инкубировать в течение ночи (12-16 ч) при 37 °C и 5% CO2 для обеспечения адгезии клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для колбы Т-75 семена 2 × 106 клеток в конечном объеме 15 мл.
    2. После инкубации промыть два раза 3 мл стерильного 1x PBS. Добавьте трипомастиготы T. cruzi Dm28c/pLacZ при MOI 10 в 5 мл DMEM с 2% FCS (8 × 106 трипомастиготов для колбы T-25).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для колбы Т-75 добавьте 20 × 106 трипомастиготов в конечный объем 15 мл DMEM с 2% FCS.
    3. Инкубировать в течение ночи (12-16 ч) при 37 °C и 5% CO2. Дважды вымойте колбу 3 мл 1x PBS и добавьте 5 мл свежего DMEM, дополненного 2% FCS. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение четырех дней.
    4. Проверьте супернатант на трипомастиготы под оптическим микроскопом. Количественно оцените трипомастиготы, подсчитав их в камере Нойбауэра. Соберите супернатант в пробирку объемом 15 мл и центрифугу по 7000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу до получения концентрации 1 × 106 трипомастиготов/мл в ДМЭМ без фенолового красного, дополненного 2% FCS. Посейте 100 мкл суспензии трипомастигота (100 000 трипомастиготов на лунку) в 96-луночную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если DMEM без фенольного красного цвета недоступен, см. альтернативы ниже в разделе 3.2.1.

3. анализ β-галактозидазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественное определение активности β-галактозидазы используется как косвенный способ определения количества паразитов. Ожидается, что рост будет ингибироваться в присутствии трипаноцидного соединения, что приведет к меньшему количеству паразитов по сравнению с необработанным контролем, что будет отражаться в более низкой активности β-галактозидазы и, следовательно, более низкой абсорбции.

  1. Инкубируйте паразитов с помощью BZN.
    1. Добавьте 100 мкл соответствующего 2x раствора BZN на лунку для достижения конечной концентрации BZN 80, 40, 20, 10, 5 и 2,5 мкМ до 100 мкл суспензии эпимастигота (со стадии 2.1), клеток Vero с амастиготами (через 2 дня после заражения) (стадия 2.2) или трипомастиготов (стадия 2.3) в 96-луночной пластине.
    2. Инкубируют эпимастиготы при 28 °C в течение 72 ч, а трипомастиготы или инфицированные клетки Vero с амастиготами в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая концентрация лекарственного средства должна оцениваться, по крайней мере, в трех экземплярах и включать контрольные культуры эпимастиготов, трипомастиготов и инфицированных клеток Веро с ДМСО (см. этап 1.2.2.4).
  2. Колориметрическая реакция
    1. После инкубационного периода лечения, если инфицированные клетки Vero или трипомастиготы находятся в DMEM с феноловым красным, замените среду 100 мкл 1x PBS, чтобы избежать вмешательства. Выполняйте тройной заготовка скважин, содержащих только 100 мкл соответствующей среды (или 1x PBS в зависимости от обстоятельств).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости удалять культуральную среду для эпимастиготов в случае LIT среды или DMEM без фенольного красного цвета. DMEM с феноловым красным все еще можно использовать; подготовьте пустой колодец только с DMEM для измерения поглощения основания, а затем вычтите это значение во время анализа данных (шаг 3.3.). Насекомая среда Шнайдера, которая бесцветна, является альтернативой эпимастиготам.
    2. Добавляют в каждую скважину 40 мкл раствора субстрата CPRG и 10 мкл раствора моющего средства, получая конечную концентрацию 200 мкМ CPRG и 0,1% моющего средства в конечном объеме 250 мкл в каждой скважине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор CPRG и моющее средство могут быть добавлены вместе в конечном объеме 50 мкл на лунку.
    3. Инкубируют при 37 °C в течение 2 ч и измеряют поглощение при 595 нм в микропластинчатом спектрофотометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое изменение цвета от желтого до красновато-коричневого при ферментативном расщеплении β-галактозидазы (рисунок 2A). Время инкубации может быть увеличено до 4 ч, а спектры поглощения хлорфенола красного могут быть считаны между 570 и 595 нм с аналогичными кривыми фитингами (дополнительный рисунок S1A, B). Инкубация в течение 24 ч в присутствии подложки CPRG показала аналогичные кривые фитинги (дополнительный рисунок S1C).
      1. В микропластинчатом спектрофотометре с селектором монохроматора создайте новый протокол в программном обеспечении оборудования (дополнительный рисунок S2).
      2. Щелкните Поглощение в качестве метода обнаружения | Конечная точка как | типа чтения Ok (дополнительный рисунок S2A). Добавьте шаг чтения, введите выбранную длину волны и нажмите ok (дополнительный рисунок S2B).
      3. В разделе Компоновка плит отметьте скважины для считывания и нажмите ok (дополнительный рисунок S2C). Чтобы прочитать пластину, вставьте ее в лоток и нажмите « Прочитать пластину». Дождитесь появления значений на экране (Дополнительный рисунок S2D) и экспортируйте их в электронную таблицу для анализа результатов.
  3. Анализ данных и расчет концентрации ингибиторов среды (IC50)
    1. Вычтите пустое измеренное значение, соответствующее только среде LIT, 1x PBS или DMEM с фенольным красным или без него плюс раствор CPRG-моющего средства. При тестировании трипаноцидной активности окрашенных соединений измеряют абсорбцию дополнительных пустых контрольных элементов с LIT или DMEM с каждой концентрацией используемого лекарственного средства, а затем вычитают эти значения из значений абсорбции, полученных с паразитами при каждой концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительной таблице S2 приведены типичные значения, полученные в этом анализе с этими средами без паразитов плюс раствор CPRG-моющего средства. Различия до и после добавления CPRG значительны, но не мешают анализу паразитов (Дополнительная таблица S2).
    2. В программном обеспечении для статистического анализа построить график концентрации BZN (в мкМ) по сравнению с поглощением при 595 нм в таблице xy. Преобразуйте концентрации BZN в логарифмические значения, нажав кнопку «Анализ», выбрав опцию «Преобразовать» | преобразовать x-значения с помощью параметра x=log(x) и нажав кнопку «ОК».
    3. Получите значения IC50 из программного обеспечения для статистического анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: IC50 определяется как концентрация лекарственного средства, которая уменьшает рост паразитов на 50% по сравнению с необработанным контролем, и рассчитывается как точка перегиба сигмоидальной функции, которая соответствует кривой.
      1. В программном обеспечении для статистического анализа нажмите кнопку «Анализировать », выберите «Нелинейная регрессия (соответствие кривой)» в списке анализа xy и нажмите « ОК».
      2. Во вкладке модель окна Параметры, в группе встроенных уравнений доза-реакция - ингибирование , выберите вариант метода доза-ответ: log(ингибитор) vs. response - Variable Slope (четыре параметра). Оставьте все остальные вкладки со значениями по умолчанию; нажмите кнопку ОК.
      3. Нажмите на раздел результатов программного обеспечения для статистического анализа, чтобы найти значение IC50, SD и качество соответствия.
      4. Нажмите на раздел графика , чтобы найти график xy логарифмической концентрации лекарственного средства по сравнению со значениями абсорбции . Ищите кривую, подгонка также отображается в другом цвете.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Бесплатный онлайн-инструмент расчета IC50 можно найти на https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя описанному выше протоколу, β-галактозидазо-экспрессирующие Dm28c эпимастиготы инкубировали с 6 концентрациями BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 мкМ) (или представляющих интерес соединений) в течение 72 ч. По истечении этого периода вместе с моющим средством добавляли реагент CPRG, который лизирует клетки и высвобождает β-галактозидазу. CPRG расщепляется β-галактозидазы с образованием хлорфенола красного цвета, что приводит к изменению цвета с желтого на красноватый (рисунок 2A). Хлорфенол красный измеряли путем считывания поглощения при 595 нм в микропластинчатом считывателе через 2 ч. Была построена таблица XY с логарифмическими концентрациями BZN по сравнению с поглощением при 595 нм. График был подогнан с использованием нелинейной регрессии (рисунок 2B). В данном конкретном эксперименте IC50, полученный для эпимастиготов, составил 20,59 ± 1,075 мкМ, аналогично полученному из литературы (таблица I)16,17. Репрезентативные результаты использования этого метода для трипомастиготов и амастигот были описаны ранее13.

Figure 2
Рисунок 2: Расчет значения IC50 бензнидазола для эпимастиготной формы Dm28c. (A) 96-луночная пластина с эпимастиготами, обработанными различными концентрациями BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 и 80 мкМ) перед добавлением CPRG (1), после первоначального добавления CPRG и моющего средства (2) и после инкубации с CPRG и моющим средством, показывающим изменение цвета (3). (B) XY-график логарифмических концентраций BZN в сравнении с абсорбцией (OD) при 595 нм для эпимастиготов Dm28c/pLacZ. График был установлен с использованием нелинейной регрессии для оценки значения IC50 . Каждое значение представляет собой среднее и стандартное отклонение (полосы погрешностей) 6 независимых биологических реплик. Непрерывная синяя линия представляет собой соответствие кривой. Сокращения: CPRG = хлорфенол красный β-D-галактопиранозид; BZN = бензнидазол; OD = оптическая плотность; C = контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

BZN IC50 (мкМ), рассчитанный с использованием Dm28c, экспрессирующего β-галактозидазу BZN IC50 (мкМ), о котором сообщается в литературе
Эпимастиготы с 17.08 до 20.59 11 до 18.72
Амастиготы 2.31 до 3.92 1.66 до 4.39
Трипомастиготы 27.07 до 44.74 24.68 до 50.72

Таблица 1: Диапазон значений IC50, полученных для эпимастиготов, трипомастиготов и амастигот с использованием этого протокола, по сравнению с IC50, о котором сообщалось в литературе17,18.

Дополнительный рисунок S1: Настройка программного обеспечения считывателя микропластин для поглощения считывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: измерения активности β-галактозидазы (оптическая плотность при 570-595 нм) с использованием эпимастиготов из линии Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi после инкубации с CPRG в разные моменты времени. Значения выражаются как среднее и стандартное отклонение трех независимых реплик. Цветные непрерывные линии представляют собой соответствие кривой. (A) Инкубация с 200 мкм CPRG в течение 2 ч. (B) Инкубация с 200 мкМ CPRG в течение 4 ч. (C) Представление активности β-галактозидазы (оптическая плотность при 570 нм) в различные моменты времени (2, 4 и 24 ч). Аббревиатура: CPRG = хлорфенол красный β-D-галактопиранозид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Состав и препарат ЛИТ среды, гемина и ПБС. Сокращения: LIT = инфузия печени триптоза; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S2: Показания абсорбции для сред LIT и DMEM без паразитов. Значения выражаются в виде триплицитов каждой среды; строка носителя содержит среднее значение трех реплик; и строка SD содержит значения стандартного отклонения реплик. Сокращения: SD = стандартное отклонение; LIT = инфузия печени триптоза; DMEM = Модифицированный орлиный медиум Дульбекко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной работе описан анализ, основанный на определении активности цитоплазматической β-галактозидазы, высвобождаемой в результате мембранного лизиса T. cruzi epimastigotes, трипомастиготов или инфицированных клеток амастиготами в присутствии субстрата CPRG. Мы использовали паразитов T. cruzi Dm28c/pLacZ, стабильный штамм паразита, полученный после трансфекции плазмидой, содержащей β галактозидазу, построенную Бакнером и соавторами10. Этот анализ был использован для поиска антитрипаноцидных соединений 12,19,20,21. Штамм T. cruzi Dm28c/pLacZ использовался для оптимизации протокола скрининга. Как показано на рисунке 1, этот протокол имеет четыре основных момента; первый – это посев паразитов в 96-луночных пластинах. Эпимастиготы и трипомастиготы подсчитывают и высевают из суспензии. В случае амастигот сначала семена клеток Vero образуют адгезивный монослой, а затем заражают трипомастиготами. Амастиготы присутствуют внутри клеток через 48 ч. Во-вторых, подготовьте разведения препарата для тестирования в нужных концентрациях и инкубируйте с паразитами. Наконец, третий шаг включает в себя добавление CPRG и моющего средства для лизирования клеток. CPRG расщепляется при высвобождении β-галактозидазы из цитоплазмы паразита, а хлорфенол красный генерируется и измеряется спектрофотометрически. Четвертый критический этап включает в себя анализ данных, построение графиков x-y и подгонку полученной кривой для расчета значений IC50 интересующих препаратов.

Анализ in vitro для всех стадий жизненного цикла T. cruzi является начальным шагом в изучении эффектов потенциального нового препарата. В этих анализах эффекты оцениваются с помощью микроскопического подсчета, дорогостоящей и субъективной процедуры, которую трудно автоматизировать. Замена этого метода колориметрическим анализом может повысить объективность скрининга, а также сделать его менее трудоемким. Чтение колориметрической пластины занимает всего несколько минут, в отличие от часов, необходимых для трудоемкого ручного микроскопического подсчета, и облегчает скрининг больших библиотек новых соединений с потенциальной терапевтической ценностью. Что касается общего сходства β-галактозидазо-экспрессирующих паразитов (Dm28c/pLacZ) по сравнению со штаммом Dm28c дикого типа, мы определили, что паразиты были морфологически нормальными, с аналогичными темпами роста и дифференцированными в равной степени в пределах форм жизненного цикла. Кроме того, результаты тестирования на наркотики, полученные при сравнении линии Dm28c дикого типа и линии Dm28c/pLacZ, количественно оцененной микроскопическим подсчетом, не показали существенных различий13.

Одним из ограничений этого протокола является то, что цветные питательные среды могут влиять на измеренное поглощение. DMEM (или RPMI) без фенол красного рекомендуется для преодоления этого ограничения. Пустой колодец с DMEM был успешно использован в качестве базального значения поглощения в этом протоколе. Другим ограничением является предполагаемая интерференция при использовании цветных лекарств, которую можно преодолеть с помощью среды с соединением в виде заготовки или путем выбора длины волны поглощения между 570 и 595 нм для получения наименьшей интерференции. CPRG не изменяется присутствием данного препарата (цветного или нет), что делает этот анализ довольно надежным. При использовании среды с фенольно-красными или цветными препаратами крайне важно выполнить пустой контроль для каждого состояния, а затем вычесть значение поглощения, полученное из измерений с паразитами, чтобы избежать каких-либо помех.

Концентрация раствора CPRG для T. cruzi trypomastigotes и Toxoplasma gondii составляет 100 мкМ10,15. Однако оптимальная концентрация, сообщаемая для эпимастиготов, составляет 200 мкМ11. В этой линии Dm28c/pLacZ для эпимастиготов, трипомастиготов и амастигот с надежными результатами использовался раствор CPRG объемом 200 мкм. Что касается времени инкубации CPRG, то наилучшее соответствие кривой было достигнуто, когда эпимастиготы инкубировали с раствором субстрата в течение 2 ч (R2 = 0,9995). ОднакоR2 был очень похож (R2 = 0,9994), а активность β-галактозидазы была линейной в диапазоне 6 250-200 000 эпимастиготов на лунку (т.е. 62 500-2 000 000 эпимастиготов/мл) через 4 ч (дополнительный рисунок S2). Линейный диапазон 3,150-100,000 трипомастиготов на лунку (т.е. 31,500-1,000,000 трипомастиготов/мл) был сообщен для трипомастиготов13. Чтобы избежать наблюдения больших стандартных отклонений, важно посеять правильное количество паразитов в каждой лунке. Поскольку объемы небольшие, важно быть последовательным при подсчете паразитов перед посевом. Кроме того, при необходимости для каждого экспериментального условия может быть измерено более трех реплик.

В отличие от других колориметрических скрининговых анализов22, последующие этапы манипуляции здесь не нужны, повышая воспроизводимость и надежность анализа, а также скорость сбора данных. Это простой, быстрый и надежный анализ, подходящий для высокопроизводительного лекарственного скрининга соединений-кандидатов для лечения ИБС и может быть применен к другим штаммам T. cruzi . Плазмида pLacZ доступна по запросу в лаборатории Бакера и может быть использована для трансфекции резистентных штаммов, например, нокаутирующих линий для оценки чувствительности линии к различным препаратам в разных генетических фонах. Единственный критический момент, который следует иметь в виду, заключается в том, что нокаутирующие плазмиды должны иметь другой маркер устойчивости к антибиотикам, чем pLacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Бакнера за любезное предоставление плазмиды pLacZ. Эта работа была поддержана Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva из Аргентины (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) и Исследовательским советом Соединенного Королевства [MR/P027989/1]. Медицинское искусство Сервье было использовано для создания рисунка 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

Биохимия выпуск 177
<em>В пробирке</em> Медикаментозный скрининг на всех стадиях жизненного цикла <em>Trypanosoma cruzi</em> с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter