Summary
우리는 Chagas 질병의 원인 인자 인 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 β-galactosidase 활성을 측정하는 고처리량 비색 분석을 설명합니다. 이 분석은 트립파노시달 화합물을 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
트리파노소마 크루 지는 라틴 아메리카에서 공중 보건이 중요한 발병 질환인 샤가스병(ChD)의 원인균으로, 이주의 증가로 인해 많은 비발병 국가에도 영향을 미친다. 이 질병은 거의 8 백만 명의 사람들에게 영향을 미치며 새로운 사례는 연간 50,000 명으로 추산됩니다. 1960 년대와 70 년대에는 ChD 치료를위한 두 가지 약물, 즉 nifurtimox와 benznidazole (BZN)이 도입되었습니다. 둘 다 신생아와 질병의 급성기에는 효과적이지만 만성기에는 효과적이지 않으며 그 사용은 중요한 부작용과 관련이 있습니다. 이러한 사실은 T. cruzi에 대한 신약 검색을 강화할 긴급한 필요성을 강조합니다.
T. cruzi 는 Reduviidae 및 Hemiptera 가족의 hematophagous 곤충 벡터를 통해 전달됩니다. 일단 포유동물 숙주에 들어가면, 편모가 없는 아마스티고테 형태로서 세포내 증식하고, 트립포마스티고테, 혈류 비복제성 감염 형태로 분화된다. 곤충 벡터 내부에서, trypomastigotes는 epimastigote 단계로 변형되고 이진 분열을 통해 증식합니다.
본 논문은 기질인 클로로페놀 레드β-D-갈락토피라노사이드(CPRG)를 이용하여 기생충 용해로 인한 배양물 내로 방출된 세포질 β-갈락토시다제의 활성을 측정하는 것에 기초한 검정을 설명한다. 이를 위해, T. cruzi Dm28c 균주를 β-갈락토시다아제-과발현 플라스미드로 형질감염시키고, 에피마스티고테, 트리포마스티고테 및 아마스티고테 단계에서 시험관내 약리학적 스크리닝에 사용하였다. 이 논문은 또한 예를 들어 참조 약물인 벤즈니다졸을 사용하여 배양된 에피마스티고트, 아마티고트로 감염된 베로 세포, 및 트리포마스티고트에서 효소 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 이 비색 분석은 쉽게 수행되며 고처리량 형식으로 스케일링하고 다른 T. cruzi 균주에 적용할 수 있습니다.
Introduction
샤가스병(ChD) 또는 미국의 트리파노소마증은 편모 원생동물인 트리파노소마 크루지(T. cruzi)에 의해 유발되는 기생충 질환이다. ChD는 일반적으로 진단되지 않은 무증상 또는 올리고 증상 급성기로 시작하여 평생 만성 단계가 뒤 따릅니다. 만성적으로, 환자의 ~ 30 %는 감염 후 수십 년 후에 나타납니다 - 심근 병증, 메가 소화 증후군 또는 둘 다를 포함한 다양한 쇠약 한 상태가 나타나며 사망률은 0.2 %에서 20 % 1,2,3 사이입니다. 무증상 만성 환자는 임상 징후가 없지만 평생 동안 혈청 양성으로 남아있을 수 있습니다.
추정에 따르면 전 세계적으로 약 7 백만 명의 사람들이 ChD가 풍토병이있는 라틴 아메리카에서 주로 감염되었습니다. 이들 국가에서 T. cruzi 는 주로 감염된 피를 빨아 먹는 트리아토민 벌레 (벡터 매개 전염)를 통해 전염되며 기생충을 포함하는 트리아토민 배설물로 오염 된 음식의 섭취를 통한 경구 전달에 의해 덜 빈번합니다2. 또한, 기생충은 chagasic 어머니에서 신생아로, 수혈을 통해 또는 장기 이식 중에 태반을 통해 전염 될 수 있습니다. 감염 및 인간 이동을 획득하는 이러한 벡터 독립적 인 방법은 북미, 유럽 및 일부 아프리카, 동부 지중해 및 서태평양 국가에서 점점 더 많은 사례에 의해 입증 된이 질병의 전 세계적인 확산에 기여했습니다4. ChD는 벡터 매개 전염이 빈곤과 밀접한 관련이 있으며 특히 라틴 아메리카 저소득 국가에서 주요 공중 보건 문제이기 때문에 방치 된 질병으로 간주됩니다. 이용 가능한 치료법이 있지만 라틴 아메리카의 ChD로 인한 사망률은 말라리아2를 포함한 기생충 질환 중에서 가장 높습니다.
1960 년대 후반과 1970 년대 초에 도입 된 ChD 치료에 등록 된 두 가지 약물이 있습니다 : nifurtimox와 benznidazole5. 두 약물 모두 성인, 어린이 및 선천적으로 감염된 신생아뿐만 아니라 만성 감염이있는 어린이뿐만 아니라 치료가 일반적으로 이루어지는 어린이의 급성 단계에 효과적입니다. 그러나 소수의 사람들 만이 제 시간에 치료할 수있을만큼 일찍 진단됩니다. 최신 임상 시험에 따르면, 두 약물 모두 성인에게 중요한 한계가 있으며 만성 질환을 앓고있는 사람들의 증상을 줄이는 데 효과적이지 않았습니다. 따라서이 단계에서 그들의 사용은 논란의 여지가 있습니다. 다른 단점은 장기간 치료 기간 (60-90 일)과 빈번하고 심각한 부작용이 관찰되어 감염된 사람 6,7의 비율에서 치료를 중단하게됩니다. ChD 환자의 10 % 미만이 진단을 받았으며 많은 영향을받는 사람들이 의료 서비스에 대한 접근성이 없거나 부족한 농촌 지역에 살고 있기 때문에 치료에 접근 할 수있는 사람은 훨씬 적습니다8. 이러한 사실은 특히 만성 단계에 대해보다 효율적이고 안전하며 적용 가능한 현장 치료를 허용하기 위해 T. cruzi에 대한 신약을 찾아야 할 긴급한 필요성을 강조합니다. 이와 관련하여, 보다 효과적인 화합물의 개발에서 또 다른 과제는 시험관내 및 생체내9에서 약물 효능을 평가하기 위한 시스템의 제한이다.
잠재적 약물 표적의 확인을 위한 화학 생물학 및 게놈 접근법이 키네토플라스티드 기생충에서 사용되었지만, T. cruzi 에서 사용 가능한 게놈 도구는 T. brucei 또는 Leishmania와는 대조적으로 제한적이다. 따라서, 트립파노시드 활성을 갖는 화합물의 스크리닝은 ChD에 대한 새로운 화학요법 약물 후보물질을 찾는 데 여전히 가장 많이 사용되는 접근법이다. 보통, T. cruzi 에서의 약물 발견은 에피마스티고테 단계에 대한 시험관내 분석에서 신약의 효과를 시험하는 것으로 시작해야 한다. 수십 년 동안 T. cruzi 에 대한 후보 화합물의 억제 효과를 측정하는 유일한 방법은 수동 현미경 계수였으며, 이는 힘들고 시간이 많이 걸리며 운영자에 따라 다릅니다. 더욱이, 이 접근법은 적은 수의 화합물을 어세싱하는 데 적합하지만 큰 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝에는 허용되지 않는다. 요즘 많은 조사는 시험관 내에서 분석 된 다양한 기원의 방대한 수의 화합물을 분석하여 기생충 성장을 억제하는 능력을 테스트하는 것으로 시작됩니다. 비색 및 불소 방법 모두 이러한 분석에서 처리량을 증가시켜 스크리닝의 객관성을 향상시키고 전체 프로세스를 덜 지루하게 만들기 위해 개발되었습니다9.
가장 널리 사용되는 비색 방법 중 하나는 Bucknet 및 공동 작업자(10)에 의해 처음 설명 된 형질감염된 기생충의 β-갈락토시다제 활성에 기초한다. 재조합 기생충에 의해 발현되는 β-갈락토시다제 효소는 발색성 기질인 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노시드(CPRG)를 클로로페놀 레드로 가수분해하며, 이는 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 비색적으로 쉽게 측정할 수 있다. 따라서, 다양한 화합물의 존재하에서의 기생충 성장은 마이크로타이터 플레이트에서 동시에 평가되고 정량될 수 있다. 이 방법은 epimastigote 형태 (곤충 벡터에 존재), trypomastigotes, 및 기생충의 포유동물 단계 인 세포 내 amastigotes에서 약물을 시험하기 위해 적용되었습니다. 또한, 에스케리치아 콜라이 β-갈락토시다제 효소를 발현하기 위해 pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 플라스미드(pLacZ)10으로 형질감염된 몇몇 재조합 T. cruzi 균주가 이미 이용가능하고(그리고 새로운 것들이 구축될 수 있음), 이는 동일한 화합물10,11,12,13에 대해 동등하게 행동하지 않을 수 있는 상이한 이산 타이핑 유닛(DTU)으로부터의 기생충의 평가를 허용한다. . 이 방법은 저처리량 및 고처리량 스크리닝12,13에서 T. cruzi에 대한 화합물에 대한 활성을 평가하기 위해 이미 성공적으로 사용되었다. 유사한 접근법이 Toxoplasma gondii 및 Leishmania mexicana14,15를 포함한 다른 원생 동물 기생충에서도 사용되었습니다.
이 논문은 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 사용하여 T. cruzi의 모든 수명주기 단계에 대한 시험관내 약물 스크리닝을 위한 상세한 방법을 설명하고 보여준다. 여기에 제시된 검정은 DTUI13으로부터 T. cruzi Dm28c 균주를 pLacZ 플라스미드 (Dm28c/pLacZ)로 형질감염시킴으로써 수득된 β-갈락토시다아제-발현 T. cruzi 라인으로 수행되었다. 추가적으로, 동일한 프로토콜은 화합물 사이의 성능과 T. cruzi 균주 또는 DTU 사이의 성능을 비교하기 위해 다른 균주에 쉽게 적응될 수 있다.
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Protocol
참고: 전체 실험 설계에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
도 1: 비색 반응을 위한 기질로서 CPRG를 사용하는 트리파노소마 크루지 Dm28c/pLacZ 라인의 시험관내 스크리닝 분석의 개요. 이 분석은 기생충 (1)을 시드하고 BZN (2 및 3)으로 배양 한 다음 비색 기질 (4)을 추가하는 것으로 구성됩니다. 기생충이 용해되면 β-갈락토시다제가 방출되고 CPRG를 클로로페놀 레드로 절단합니다. 이러한 색상 변화는 분광 광도법으로 측정 할 수 있습니다 (5). 데이터는 BZN의 절반 억제 농도(IC50)를 얻기 위해 통계 분석 소프트웨어에서 분석될 수 있다. 약어: CPRG = 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노사이드; BZN = 벤즈니다졸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 스톡 솔루션의 준비
- 미디어 및 솔루션 준비
- 헤민 용액 (보충 표 S1)
- 모든 성분을 레시피에 주어진 순서대로 50 mL 원심분리 튜브에 첨가하고 여러 번 반전하여 균질화하십시오.
- 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 멸균한다.
- 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 1 mL 분취량을 준비하고 사용 전까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 간 주입 트립토오스 (LIT) 배지 (보충 표 S1)
- 모든 성분을 계량하고 적어도 700 mL의 증류수를 함유하는 1 L 비이커에서 실온에서 균질화되도록 교반한다.
- pH를 7.2로 조정하고, 증류수로 1 L 눈금 실린더에 부피를 900 mL로 충전하고; 여과 또는 오토클레이빙(20분 동안 121°C)으로 멸균한다.
- 배지에 100 mL의 태아 송아지 혈청(FCS), (10% FCS, 56°C에서 45분 동안 멸균 및 열 불활성화), 20 mL의 40% 멸균 글루코스 용액(오토클레이빙으로 멸균, 20분 동안 121°C), 및 헤민 용액 5 mL(최종 농도 5 μM)를 LIT 배지 900 mL에 첨가하여 배지를 보충한다.
- Dulbecco의 변형 이글 미디엄 (DMEM)을 제조업체의 지침에 따라 분말에서 준비하십시오.
- 인산완충식염수(PBS)(보충표 S1)
- 용액을 실온에서 교반하여 모든 고체 성분을 1 L 비이커에 용해시킨다.
- pH를 7.2로 조정하고, 증류수로 1 L 눈금 실린더에서 최대 1 L까지 레벨링하고, 여과 또는 오토클레이빙(121°C, 20분)에 의해 멸균한다.
- 헤민 용액 (보충 표 S1)
- 벤즈니다졸 (BZN) 스톡 용액 및 희석액
참고: 이 작업에 사용된 BZN 농도의 범위는 2.5 내지 80 μM이었다.- 약물 13 mg을 50 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 1 M BZN의 원액을 제조하였다. 무균 조건 하에서, 이 1 M BZN 원액으로부터 최종 원하는 농도(2x 용액)의 2배로 연속 희석물을 최종 부피로 준비하여 분석할 웰의 수에 적합하다.
참고: 10-20%를 초과하는 웰당 100μL를 계산합니다. BZN 원액 및 모든 BZN 희석액은 배지에서 약물의 낮은 용해도로 인해 분석에서 사용 직전에 제조되어야 한다. - 160, 80, 40, 20, 10 및 5 μM의 2x BZN 희석액을 제조하였다.
- 1 M BZN 원액을 100배 희석액(10 μL의 1 M BZN + 990 μL의 배지)으로 희석하여 T. cruzi의 각 라이프 사이클 단계에 사용되는 적절한 배지에 10 mM 용액을 얻었다. 현탁액을 균질화하기 위해 연속적으로 혼합한다.
- 10 mM BZN 용액을 희석하여 적절한 배지에서 320 μM BZN을 제조하였다: 32 μL의 10 mM BZN + 968 μL의 배지. 현탁액을 균질화하기 위해 연속적으로 혼합한다.
- 320 μM BZN을 2배 희석하여 160 μM의 농도(320 μM BZN + 500 μL의 배지 중 500 μL)를 얻었다. 현탁액을 균질화하기 위해 연속적으로 혼합한다. 이 2배 희석을 각각의 생성된 용액으로 반복하여 80, 40, 20, 10 및 5 μM 용액을 얻었다.
- DMSO를 처리되지 않은 대조군(100% 생존 대조군)으로 사용하기 위한 적절한 배지에 1,000배 희석한다.
참고: 에피마스티고테스는 DMSO의 100배 희석까지 견딜 수 있는 반면, 베로 세포는 DMSO의 1,000배 희석까지만 견딜 수 있습니다. 필요한 경우, 50% DMSO를 사용한 사멸 대조군이 0% 생존 조건으로서 포함될 수 있다.
- 약물 13 mg을 50 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 1 M BZN의 원액을 제조하였다. 무균 조건 하에서, 이 1 M BZN 원액으로부터 최종 원하는 농도(2x 용액)의 2배로 연속 희석물을 최종 부피로 준비하여 분석할 웰의 수에 적합하다.
- 기판 용액
- CPRG를 증류수에 1 mM 농도로 용해시킨다. 96웰 플레이트의 경우, CPRG 2.4mg을 물 4mL에 첨가한다.
참고: CPRG 용액은 분석 직전에 준비해야 합니다.
- CPRG를 증류수에 1 mM 농도로 용해시킨다. 96웰 플레이트의 경우, CPRG 2.4mg을 물 4mL에 첨가한다.
- 용해 용액
- 1x PBS에서 비이온성, 비변성 세제 2-[4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시]에탄올 ( 물질의 표 참조)의 2.5% v/v 용액을 제조하였다. 분석 직전에 96-웰 플레이트 당 용액 1 mL를 준비한다.
2. 기생충 문화 준비
- 에피마스티고테 준비
참고: T. cruzi Dm28c/pLacZ 라인13 은 이 보고서 전체에서 사용됩니다.- β갈락토시다아제-발현 T. cruzi epimastigotes를 25cm2 의 성장 면적을 갖는 세포 배양 플라스크에서 28°C에서 축선적으로 성장시킨다 (T-25 플라스크). 배양물을 10% FCS(보충 표 S1) 및 제네티신 설페이트(G418)가 보충된 LIT 배지에서 48-72시간마다(5mL 중) 200μg/mL의 최종 농도로 계대배양하여 로그 페이즈로 유지한다. 계대 배양하기 전에 Neubauer 챔버에서 세포 계수에 의해 기생충 성장을 정량화하십시오. 뚜껑을 안전하게 닫고 배양 플라스크를 28°C에서 수직 위치에 유지(배출되지 않음)한다.
참고: G418은 pLacZ 플라스미드 선택 및 유지를 보장합니다. 로그상 배양물은 Dm28c/pLacZ 라인에 대해 1-5 × 107개의 기생충/mL의 에피마스티고트 농도를 갖는다. - G418 항생제가 보충된 LIT의 로그상 배양물에서 2 × 105 epimastigotes/mL의 현탁액을 준비하십시오. 96-웰 마이크로플레이트의 웰 당 100 μL의 에피마스티고트 현탁액 (100 μL의 LIT에서 20,000 에피마스티고트)을 분주하고, 최종 부피를 배지로 웰 당 200 μL로 구성한다.
- β갈락토시다아제-발현 T. cruzi epimastigotes를 25cm2 의 성장 면적을 갖는 세포 배양 플라스크에서 28°C에서 축선적으로 성장시킨다 (T-25 플라스크). 배양물을 10% FCS(보충 표 S1) 및 제네티신 설페이트(G418)가 보충된 LIT 배지에서 48-72시간마다(5mL 중) 200μg/mL의 최종 농도로 계대배양하여 로그 페이즈로 유지한다. 계대 배양하기 전에 Neubauer 챔버에서 세포 계수에 의해 기생충 성장을 정량화하십시오. 뚜껑을 안전하게 닫고 배양 플라스크를 28°C에서 수직 위치에 유지(배출되지 않음)한다.
- 아마스티고테 준비
- 노화된 epimastigote 배양물로부터 수득된 자발적 메타시클릭 트리포마스티고트를 사용하여(이 프로토콜에서 7일 동안) 2% FCS로 보충된 DMEM에 이전에 시딩된 2 × 10,5 Vero 세포가 있는T-25 플라스크에서 초기 감염을 수행한다.
- 노이바우어 챔버 내의 메타시클릭 트리포마스티고트의 수를 계수하고, 베로 세포 단층을 DMEM 5 mL 중 10의 감염 다중(MOI)으로 감염시키고, 16시간 동안 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다. 플라스크로부터 배지를 제거하여 나머지 트리포마스티고트를 5 mL 멸균 피펫으로 세척한 다음, 5 mL의 1x PBS 및 흡인물을 첨가한다. 마지막으로, 5 mL의 DMEM을 2% FCS와 함께 첨가하고, 동일한 조건 하에서 인큐베이션한다.
- 감염된 베로 세포 단층에서 나오는 트리포마스티고트를 사용하여 2% FCS를 갖는 DMEM에서 2 × 10,5 베로 세포로T-25 플라스크에서 감염을 유지하고, 매주 새로운 감염된 병을 생성한다.
참고 : 5-7 일 후, trypomastigotes가 나타나기 시작하고 상청액에서 볼 수 있습니다. Vero 세포주가 G418에 내성이 없으므로 세포 또는 감염된 세포를 감염시키는 데 사용되는 트립포 유방 고트에 G418을 첨가하지 마십시오.
- 96웰 조직 배양 플레이트(웰당 10,000 세포)에서 웰당 현탁액의 2% FCS와 시드 100 μL가 보충된 DMEM에서 1 × 105 Vero cells/mL의 현탁액을 준비한다. 웰의 바닥에 대한 세포 부착을 보장하기 위해 37°C 및 5% CO2에서 밤새도록(12-16 h) 인큐베이션한다.
- 밤새 인큐베이션 후, 베로 세포 단일층을 100 μL의 멸균 1x PBS로 세 번 헹구었다. T. cruzi Dm28c/pLacZ 트립포마스티고트(T-25 플라스크에서의 이전 감염으로부터 수득됨, 단계 2.2.1)를 웰당 2% FCS(웰당 100,000개의 트립포마스티고트)로 보충된 DMEM의 100μL에서 10의 MOI로 첨가한다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 이 인큐베이션 기간 후에, 플레이트를 1x PBS로 2회 세척하고, 2% FCS로 보충된 페놀 레드 없이 DMEM 100 μL를 첨가한다.
참고 : 48 시간 (감염 후 2 일) 후, 세포질 내 아마스티고트는 광학 현미경으로 볼 수 있습니다. DMEM 및 기타 세포 배양 배지의 pH 지시약인 페놀 레드는 CPRG의 흡광도 측정을 방해할 수 있습니다. 페놀 레드가 없는 DMEM을 사용할 수 없는 경우 섹션 3.2.1에서 아래에 언급된 대안을 참조하십시오.
- 노화된 epimastigote 배양물로부터 수득된 자발적 메타시클릭 트리포마스티고트를 사용하여(이 프로토콜에서 7일 동안) 2% FCS로 보충된 DMEM에 이전에 시딩된 2 × 10,5 Vero 세포가 있는T-25 플라스크에서 초기 감염을 수행한다.
- 트리포마스티고트 준비
- T-25 플라스크의 배지 5 mL에 2% FCS와 시드 800,000 세포가 보충된 DMEM에서 1 × 106 Vero cells/mL의 현탁액을 준비하십시오. 세포 부착을 보장하기 위해 37°C 및 5% CO2에서 밤새도록(12-16 h) 인큐베이션한다.
참고: T-75 플라스크의 경우, 시드 2 × 106 세포를 15 mL의 최종 부피로 한다. - 인큐베이션 후, 멸균된 1x PBS 3 mL로 두 번 헹구었다. T. cruzi Dm28c/pLacZ 트립포마스티고트를 2% FCS가 있는 DMEM 5mL 중 10개 중 10개의 MOI에 첨가합니다(T-25 플라스크의 경우 8개× 10개의 트립포 마스티고트).
참고: T-75 플라스크의 경우, 2% FCS× 함께 DMEM 15mL의 최종 부피에 20개의 10개의트립 포마스티고트를 첨가하십시오. - 37°C 및 5% CO2에서 밤새도록(12-16 h) 인큐베이션한다. 플라스크를 3 mL의 1x PBS로 2회 세척하고, 2% FCS로 보충된 신선한 DMEM 5 mL를 첨가한다. 나흘 동안 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다.
- 광학 현미경으로 트립포마스티고트에 대한 상청액을 확인하십시오. 트리포마스티고테를 노이바우어 챔버에서 계산하여 정량화하십시오. 상층액을 15 mL 튜브에 수집하고, 실온에서 10분 동안 7,000 × g 에서 원심분리한다.
- 상층액을 버리고 펠렛을 재현탁하여 2% FCS로 보충된 페놀 레드가 없는 DMEM에서 1 × 106 트립포마스티고트/mL의 농도를 얻었다. 100 μL의 트리포마스티고트 현탁액 (웰 당 100,000 트립포마스티고트)을 96-웰 플레이트에 시드한다.
참고: 페놀 레드가 없는 DMEM을 사용할 수 없는 경우 아래 섹션 3.2.1의 대안을 참조하십시오.
- T-25 플라스크의 배지 5 mL에 2% FCS와 시드 800,000 세포가 보충된 DMEM에서 1 × 106 Vero cells/mL의 현탁액을 준비하십시오. 세포 부착을 보장하기 위해 37°C 및 5% CO2에서 밤새도록(12-16 h) 인큐베이션한다.
3. β-갈락토시다제 분석
참고 : β-갈락토시다제 활성의 정량화는 기생충의 수를 결정하는 간접적 인 방법으로 사용됩니다. 트립파노시달 화합물의 존재하에 성장이 억제되어 처리되지 않은 대조군에 비해 기생충 수가 줄어들 것으로 예상되며, 이는 더 낮은 β-갈락토시다제 활성에 반영되어 흡수율이 낮아질 것으로 예상됩니다.
- 기생충을 BZN으로 배양하십시오.
- 웰 당 100 μL의 상응하는 2x BZN 용액을 첨가하여 80, 40, 20, 10, 5, 및 2.5 μM의 BZN의 최종 농도에 도달하여 100 μL의 에피마스티고트 현탁액 (단계 2.1로부터), 아마스티고트를 갖는 베로 세포 (감염 후 2일) (단계 2.2), 또는 트리포마스티고트 (단계 2.3)를 96-웰 플레이트에 첨가한다.
- 에피마스티고테스를 28°C에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 트립포마스티고트 또는 베로 세포를 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 아마스티고테스로 감염시켰다.
참고: 각 약물 농도는 적어도 삼중으로 평가되어야 하며, 상피유방 고체, 트리포유방고테 및 DMSO로 감염된 베로 세포의 대조군 배양물을 포함한다(단계 1.2.2.4 참조).
- 비색 반응
- 처리 인큐베이션 기간 후, 감염된 Vero 세포 또는 트립포마스티고트가 페놀 레드로 DMEM에 있는 경우, 간섭을 피하기 위해 배지를 100 μL의 1x PBS로 교체한다. 100 μL의 상응하는 배지 (또는 적절하게 1x PBS)만을 함유하는 트리플리케이트 블랭크 웰을 수행한다.
참고: 페놀 레드가 없는 LIT 배지 또는 DMEM의 경우 에피마스티고테스에 대한 배양 배지를 제거할 필요가 없습니다. 페놀 레드를 갖는 DMEM은 여전히 사용될 수 있다; DMEM 단독으로, 빈 웰을 준비하여 기본 흡광도를 측정한 다음, 데이터 분석 동안 이 값을 뺍니다(단계 3.3.). 무색의 슈나이더의 곤충 배지는 epimastigotes의 대안입니다. - 각 웰에 CPRG 기질 용액 40 μL와 세제 용액 10 μL를 첨가하고, 각 웰에서 250 μL의 최종 부피에서 200 μM CPRG 및 0.1% 세제의 최종 농도를 얻었다.
참고: CPRG 용액과 세제는 웰 당 50 μL의 최종 부피로 함께 첨가될 수 있다. - 37°C에서 2시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 분광광도계에서 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
참고: 예상되는 색 변화는 β-갈락토시다제 효소 절단시 황색에서 적갈색입니다(그림 2A). 배양 시간은 최대 4 시간까지 연장 될 수 있으며, 클로로페놀 레드의 흡광도 스펙트럼은 유사한 곡선 피팅으로 570 ~ 595 nm 사이에서 판독 될 수 있습니다 (보충 그림 S1A, B). CPRG 기질의 존재 하에 최대 24시간 동안 인큐베이션은 유사한 피팅 곡선을 나타내었다(보충도 S1C).- 단색화 선택기가 있는 마이크로플레이트 분광 광도계에서 장비 소프트웨어에 새 프로토콜을 만듭니다(보충 그림 S2).
- 검출 방법이 | 흡광도를 클릭하십시오 . 읽기 유형으로서의 끝점 | Ok (보충 그림 S2A). 읽기 단계를 추가하고 선택한 파장을 입력한 다음 확인을 클릭합니다(보충 그림 S2B).
- 플레이트 레이아웃 섹션에서 읽을 웰을 표시하고 확인을 클릭합니다(보충 그림 S2C). 플레이트를 읽으려면 트레이에 넣고 플레이트 읽기를 클릭하십시오. 값이 화면에 나타날 때까지 기다렸다가 스프레드시트로 내보내 결과를 분석합니다(그림 S2D 보충).
- 처리 인큐베이션 기간 후, 감염된 Vero 세포 또는 트립포마스티고트가 페놀 레드로 DMEM에 있는 경우, 간섭을 피하기 위해 배지를 100 μL의 1x PBS로 교체한다. 100 μL의 상응하는 배지 (또는 적절하게 1x PBS)만을 함유하는 트리플리케이트 블랭크 웰을 수행한다.
- 데이터 분석 및 배지 억제제 농도 (IC50) 계산
- LIT 배지, 1x PBS, 또는 페놀 레드가 있거나 없는 DMEM에만 해당하는 블랭크 측정값을 CPRG-세제 용액에 더한 값에서 뺍니다. 유색 화합물의 트립파노시달 활성을 테스트 할 때 사용 된 약물의 각 농도와 함께 LIT 또는 DMEM을 사용하여 추가 블랭크 대조군의 흡광도를 측정 한 다음 각 농도에서 기생충으로 얻은 흡광도 값에서 해당 값을 뺍니다.
참고 : 보충 표 S2는 기생충과 CPRG 세제 용액이없는 이러한 배지로이 분석에서 얻은 전형적인 값을 보여줍니다. CPRG 추가 전후의 차이는 유의하지만 기생충 분석을 방해하지 않습니다 (보충 표 S2). - 통계 분석 소프트웨어에서 BZN의 농도(μM) 대 595nm에서의 흡광도를 xy 표에 플로팅합니다. 분석 단추를 클릭하고 변환 옵션을 선택 하 | x=log(x) 옵션을 사용하여 x-값을 변환한 다음 확인 단추를 클릭하여 BZN 농도를 로그 값으로 변환합니다.
- 통계 분석 소프트웨어로부터IC50 값을 구한다.
참고:IC50 은 처리되지 않은 대조군에 비해 기생충 성장을 50% 감소시키는 약물 농도로 정의되며 곡선에 맞는 시그모이드 함수의 변곡점으로 계산됩니다.- 통계 분석 소프트웨어에서 분석 버튼을 클릭하고 xy 분석 목록에서 비선형 회귀(곡선 맞춤)를 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
- 파라미터 윈도우의 모델 탭에서, 용량-반응-억제 그룹에서, 내장 방정식들에서, 옵션인 용량-반응 방법들을 선택한다: log(억제제) vs. 반응 - 가변 기울기(네 개의 파라미터). 다른 모든 탭은 기본값으로 둡니다. 확인을 클릭합니다.
- 통계 분석 소프트웨어의 결과 섹션을 클릭하여 IC50 값, SD 및 적합성의 우수성을 찾으십시오.
- 그래프 섹션을 클릭하여 약물의 로그 농도 대 흡광도 값의 xy 그래프를 찾으십시오. 곡선 핏을 찾아 다른 색상으로 그래프로 표시하기도 한다.
참고: 무료 온라인 IC50 계산 도구는 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator 에서 찾을 수 있습니다.
- LIT 배지, 1x PBS, 또는 페놀 레드가 있거나 없는 DMEM에만 해당하는 블랭크 측정값을 CPRG-세제 용액에 더한 값에서 뺍니다. 유색 화합물의 트립파노시달 활성을 테스트 할 때 사용 된 약물의 각 농도와 함께 LIT 또는 DMEM을 사용하여 추가 블랭크 대조군의 흡광도를 측정 한 다음 각 농도에서 기생충으로 얻은 흡광도 값에서 해당 값을 뺍니다.
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Representative Results
상기 기재된 프로토콜에 따라, β-갈락토시다제-발현 Dm28c 에피마스티고테스를 72시간 동안 6개의 농도의 BZN (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (또는 관심있는 화합물)과 함께 인큐베이션하였다. 이 기간 후, CPRG 시약을 세제와 함께 첨가하여 세포를 용해시키고 β-갈락토시다제를 방출합니다. CPRG는 β-갈락토시다제에 의해 절단되어 클로로페놀 적색을 생성하고, 노란색에서 적색으로 변색을 유도한다(도 2A). 클로로페놀 레드는 2시간 후 마이크로플레이트 리더에서 595 nm에서 흡광도를 판독하여 측정하였다. XY 표를 595 nm에서의 흡광도 대 BZN의 로그 농도와 함께 플롯팅하였다. 플롯은 비선형 회귀를 사용하여 피팅되었다(그림 2B). 이 특정 실험에서, 에피마스티고테스에 대해 수득된IC50은 20.59 ± 1.075 μM이었으며, 이는 문헌 (표 I)16,17로부터 수득된 것과 유사하다. 트립포마스티고테스 및 아마스티고테스에 대해 이 방법을 사용한 대표적인 결과는 이전에13에 기술되었다.
도 2: 에피마스티고테 형태 Dm28c에 대한 벤즈니다졸의IC50 값의 계산. (A) CPRG (1)을 첨가하기 전에, CPRG 및 세제의 초기 첨가 후 (2.5, 5, 10, 20, 40, 및 80 μM) 상이한 BZN 농도 (2.5, 5, 10, 20, 40 및 80 μM)로 처리된 에피마스티고테를 갖는 96-웰 플레이트, 및 CPRG 및 세제와 함께 인큐베이션한 후 색의 변화를 나타내는 (3). (B) Dm28c/pLacZ epimastigotes에 대한 595 nm에서의 BZN 대 흡광도 (OD)의 로그 농도의 XY 플롯. 플롯을 비선형 회귀를 사용하여IC50 값을 추정하기 위해 적합시켰다. 각 값은 6개의 독립적인 생물학적 반복실험의 평균 및 표준 편차(오차 막대)를 나타낸다. 연속 파란색 선은 커브 맞춤을 나타냅니다. 약어: CPRG = 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노사이드; BZN = 벤즈니다졸; OD = 광학 밀도; C = 제어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| BZNIC50 (μM) 발현 β-갈락토시다제를 사용하여 계산된 | 문헌에 보고된 BZN IC50 (μM) | |
| 에피마스티고테스 | 17.08 ~ 20.59 | 11 ~ 18.72 |
| 아마스티고테스 | 2.31 ~ 3.92 | 1.66 ~ 4.39 |
| 트리포마스티고테스 | 27.07 ~ 44.74 | 24.68 ~ 50.72 |
표 1: 문헌17,18에 보고된 IC50과 비교하여 이 프로토콜을 사용하여 epimastigotes, trypomastigotes 및 amastigotes에 대해 수득된 IC50 값의 범위.
보충 그림 S1: 흡광도 읽기를 위한 마이크로플레이트 리더 소프트웨어 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 S2: 상이한 시점에서 CPRG로 인큐베이션한 후 트리파노소마 크루지의 Dm28c/pLacZ 라인으로부터의 에피마스티고테를 이용한 β-갈락토시다제 활성 측정(570 내지 595 nm에서의 광학 밀도). 값은 세 개의 독립적인 반복실험의 평균 및 표준 편차로 표현됩니다. 컬러 연속 선은 곡선 맞춤을 나타냅니다. (A) 2시간 동안 200 μM CPRG로 인큐베이션한다. (B) 4시간 동안 200 μM CPRG로 인큐베이션한다. (C) 상이한 시점(2, 4, 및 24 h)에서 β-갈락토시다제 활성(570 nm에서의 광학 밀도)의 표현. 약어: CPRG = 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노사이드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: LIT 배지, 헤민, 및 PBS의 조성 및 제조. 약어: LIT = 간 주입 트립토스; PBS = 포스페이트-완충 식염수. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: 기생충이 없는 LIT 및 DMEM 배지에 대한 흡광도 판독값. 값은 각 매질의 삼중으로 표현된다; 미디어 행에는 세 번의 반복실험의 평균값이 포함됩니다. SD 행에는 반복실험의 표준 편차 값이 포함됩니다. 약어: SD = 표준 편차; LIT = 간 주입 트립토스; DMEM = 둘베코의 수정된 이글 미디엄. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 기질 CPRG의 존재하에 T. cruzi epimastigotes, trypomastigotes, 또는 amastigotes로 감염된 세포의 막 용해로 인해 방출되는 세포질 β-갈락토시다제 활성을 결정하는 것에 기초한 검정을 기술한다. 우리는 T. cruzi Dm28c / pLacZ 기생충을 사용했는데, 이는 Buckner와 공동 저자10에 의해 구축 된 β 갈락토시다제 함유 플라스미드로 형질 감염 후 얻은 안정한 기생충 균주입니다. 이 분석은 항트립파노시돈 화합물12,19,20,21을 검색하는데 사용되어 왔다. T. cruzi Dm28c/pLacZ 균주를 스크리닝 프로토콜을 최적화하기 위해 사용하였다. 그림 1에 요약된 것처럼 이 프로토콜에는 네 가지 주요 사항이 있습니다. 첫 번째는 96 웰 플레이트에 기생충 파종입니다. Epimastigotes 및 trypomastigotes는 서스펜션에서 계산되고 시드됩니다. amastigotes의 경우, 먼저 베로 세포를 시드하여 부착성 단층을 형성 한 다음 트리포 마스티고테로 감염시킵니다. 아마스티고테스는 48 시간 후에 세포 내부에 존재합니다. 둘째, 원하는 농도로 테스트 할 약물의 희석을 준비하고 기생충과 함께 배양하십시오. 마지막으로, 세 번째 단계는 세포를 용해시키기 위해 CPRG와 세제를 첨가하는 것입니다. CPRG는 기생충 세포질로부터 β-갈락토시다제 방출시 절단되고, 클로로페놀 레드는 분광광도법적으로 생성되고 측정된다. 네 번째 중요한 단계는 데이터 분석, xy 그래프의 구성 및 관심있는 약물의 IC50 값을 계산하기 위해 얻은 곡선을 피팅하는 것입니다.
T. cruzi의 모든 수명주기 단계에 대한 시험관 내 분석은 잠재적 인 신약의 효과를 연구하는 초기 단계입니다. 이러한 분석에서 효과는 자동화하기 어려운 시간 비싸고 주관적인 절차인 현미경 계수에 의해 평가됩니다. 이 기술을 비색 분석법에 의한 치환은 스크리닝의 객관성을 향상시킬 수 있으며 또한 시간이 덜 소요됩니다. 비색 플레이트 판독은 노동 집약적 인 수동 현미경 계산에 필요한 시간과 달리 단 몇 분 밖에 걸리지 않으며 잠재적 인 치료 가치를 지닌 새로운 화합물의 대규모 라이브러리의 스크리닝을 용이하게합니다. 야생형 Dm28c 균주와 비교하여 β-갈락토시다제 발현 기생충 (Dm28c / pLacZ)의 전반적인 유사성에 관해서, 우리는 기생충이 형태 학적으로 정상이며 비슷한 성장 속도를 가지며 수명주기 형태 내에서 동등하게 분화되었음을 확인했습니다. 더욱이, 야생형 Dm28c와 현미경 계수로 정량된 Dm28c/pLacZ 선을 비교하여 얻은 약물 검사 결과는 유의한 차이13을 나타내지 않았다.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 착색된 배양 배지가 측정된 흡광도를 방해할 수 있다는 것이다. 이러한 제한을 극복하기 위해 페놀 레드가 없는 DMEM(또는 RPMI)을 사용하는 것이 좋습니다. DMEM을 갖는 빈 웰은 이 프로토콜에서 기초 흡광도 값으로 성공적으로 사용되었다. 또 다른 한계는 화합물을 블랭크로 사용하여 매체를 사용하거나 570 내지 595 nm 사이의 흡광도 파장을 선택하여 가장 낮은 간섭을 부여하는 착색 약물을 사용할 때 추정적인 간섭이다. CPRG는 주어진 약물 (유색 여부에 관계없이)의 존재에 의해 변경되지 않으며,이 분석은 매우 강력합니다. 페놀 레드 또는 컬러 약물과 함께 매체를 사용할 때, 각 조건에 대해 빈 제어를 수행 한 다음 간섭을 피하기 위해 기생충과의 측정에서 얻은 흡광도 값을 뺀 것이 중요합니다.
T. cruzi trypomastigotes 및 Toxoplasma gondii에 대해 보고된 CPRG 용액의 농도는 100 μM10,15이다. 그러나, epimastigotes에 대해 보고된 최적 농도는 200 μM11이다. 이 Dm28c/pLacZ 라인에서는 200μM CPRG 용액을 에피마스티고테스, 트립포마스티고테스 및 아마스티고트에 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻었습니다. CPRG 인큐베이션 시간과 관련하여, 에피마스티고테스를 기질 용액과 함께 2시간 동안 인큐베이션할 때 최상의 곡선 피팅이 달성되었다(R2=0.9995). 그러나, R2는 매우 유사하였고 (R2=0.9994), β-갈락토시다제 활성은 4 h에서 웰 당 6,250-200,000 에피마스티고테스(즉, 62,500-2,000,000 에피마스티고테스/mL)의 범위에서 선형이었다(보충 도 S2). 웰당 3,150-100,000 트리포마스티고트의 선형 범위(즉, 31,500-1,000,000 트립포마스티고트/mL)가 트리포마스티고트13에 대해 보고되었다. 큰 표준 편차를 관찰하지 않으려면 각 웰에 정확한 양의 기생충을 뿌리는 것이 중요합니다. 부피가 작기 때문에 씨를 뿌리기 전에 기생충을 세를 때 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 필요한 경우 각 실험 조건에 대해 세 개 이상의 반복실험을 측정할 수 있었다.
다른 비색 스크리닝 분석(22)과는 달리, 후속 조작 단계는 여기에서 필요하지 않으며, 데이터 수집의 속도뿐만 아니라 분석의 재현성 및 신뢰성을 증가시킨다. 이것은 ChD 치료를 위한 후보 화합물의 고처리량 약물 스크리닝에 적합한 쉽고 빠르며 신뢰할 수 있는 분석법이며 다른 T. cruzi 균주에 적용할 수 있습니다. pLacZ 플라스미드는 버커 실험실로부터의 요청에 따라 이용가능하며, 상이한 유전적 배경에서 상이한 약물에 대한 라인의 민감성을 평가하기 위해, 예를 들어, 녹아웃 라인의 내성 균주를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 명심해야 할 유일한 중요한 점은 녹아웃 플라스미드가 pLacZ와 다른 항생제 내성 마커를 가져야한다는 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
pLacZ 플라스미드를 친절하게 제공해 주신 Buckner 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, 아르헨티나의 Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) 및 영국 연구위원회 [MR / P027989 / 1]가 지원했습니다. Servier Medical Art는 도 1( https://smart.servier.com)을 제작하기 위해 사용되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
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