Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

इन विट्रो में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ ड्रग स्क्रीनिंग β-गैलेक्टोसिडेस व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

हम चगास रोग के प्रेरक एजेंट ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के तीन जीवन चक्र चरणों में β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि को मापने वाले एक उच्च-थ्रूपुट वर्णमितीय परख का वर्णन करते हैं। इस परख का उपयोग ट्रिपैनोसिडल यौगिकों को एक आसान, तेज़ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से पहचानने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी चागास रोग (सीएचडी) का प्रेरक एजेंट है, जो लैटिन अमेरिका में सार्वजनिक स्वास्थ्य महत्व की एक स्थानिक बीमारी है जो प्रवास में वृद्धि के कारण कई गैर-स्थानिक देशों को भी प्रभावित करती है। यह बीमारी लगभग 8 मिलियन लोगों को प्रभावित करती है, जिसमें प्रति वर्ष 50,000 नए मामलों का अनुमान है। 1 9 60 और 70 के दशक में, सीएचडी उपचार के लिए दो दवाएं पेश की गईं: निफर्टिमॉक्स और बेंज़निडाज़ोल (बीजेडएन)। दोनों नवजात शिशुओं में और बीमारी के तीव्र चरण के दौरान प्रभावी होते हैं लेकिन पुराने चरण में नहीं, और उनका उपयोग महत्वपूर्ण दुष्प्रभावों से जुड़ा होता है। ये तथ्य टी क्रूज़ी के खिलाफ नई दवाओं की खोज को तेज करने की तत्काल आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।

क्रूजी रेडुविडे और हेमिप्टेरा परिवारों के हेमटोफैगस कीट वैक्टर के माध्यम से प्रेषित होता है। एक बार स्तनधारी मेजबान में, यह इंट्रासेल्युलर रूप से गैर-फ्लैगेलेटेड अमास्टिगोट रूप के रूप में गुणा करता है और ट्रिपोमास्टिगोट में अंतर करता है, रक्तप्रवाह गैर-प्रतिकृति संक्रामक रूप। कीट वेक्टर के अंदर, ट्रिपोमास्टिगोट्स एपिमास्टिगोट चरण में बदल जाते हैं और बाइनरी विखंडन के माध्यम से गुणा करते हैं।

यह पेपर सब्सट्रेट, क्लोरोफेनोल लाल β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड (सीपीआरजी) का उपयोग करके परजीवी लसीका के कारण संस्कृति में जारी साइटोप्लाज्मिक β-गैलेक्टोसिडेस की गतिविधि को मापने के आधार पर एक परख का वर्णन करता है। इसके लिए, टी क्रूज़ी डीएम 28 सी तनाव को β-गैलेक्टोसिडेस-ओवरएक्सप्रेसिंग प्लास्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया था और एपिमास्टिगोट, ट्रिपोमास्टिगोट और अमास्टिगोट चरणों में इन विट्रो फार्माकोलॉजिकल स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता था। यह पत्र यह भी वर्णन करता है कि सुसंस्कृत एपिमास्टिगोट्स में एंजाइमेटिक गतिविधि को कैसे मापा जाए, अमास्टिगोट्स के साथ संक्रमित वेरो कोशिकाएं, और एक उदाहरण के रूप में संदर्भ दवा, बेंज़निडाज़ोल का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं से जारी ट्रिपोमास्टिगोट्स। यह वर्णमितीय परख आसानी से किया जाता है और इसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में स्केल किया जा सकता है और अन्य टी क्रूज़ी उपभेदों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

चगास रोग (सीएचडी), या अमेरिकी ट्रिपैनोसोमियासिस, फ्लैगेलेटेड प्रोटोजोआ, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी) के कारण होने वाली एक परजीवी बीमारी है। सीएचडी एक स्पर्शोन्मुख या ऑलिगोसिम्प्टोमैटिक तीव्र चरण से शुरू होता है जो आमतौर पर अनियंत्रित होता है, इसके बाद आजीवन क्रोनिक चरण होता है। क्रोनिकता में, ~ 30% रोगी संक्रमण के दशकों बाद प्रकट होते हैं- मायोकार्डियोपैथी, मेगा-पाचन सिंड्रोम, या दोनों सहित विभिन्न प्रकार की दुर्बल स्थितियां, मृत्यु दर 0.2% से 20% 1,2,3 तक होती है। स्पर्शोन्मुख पुराने रोगियों में कोई नैदानिक संकेत नहीं हो सकते हैं लेकिन जीवन भर सीरोपॉजिटिव रहते हैं।

अनुमान बताते हैं कि दुनिया भर में ~ 7 मिलियन लोग संक्रमित हैं, ज्यादातर लैटिन अमेरिका से, जहां सीएचडी स्थानिक है। इन देशों में, टी क्रूज़ी मुख्य रूप से संक्रमित रक्त चूसने वाले ट्रायटोमाइन बग (वेक्टर-जनित संचरण) के माध्यम से प्रेषित होता है और परजीवी युक्त ट्रायटोमाइन मल से दूषित भोजन के अंतर्ग्रहण के माध्यम से मौखिक संचरण द्वारा कम बारप्रेषित होता है 2. इसके अतिरिक्त, परजीवी को नाल के माध्यम से चगासिक माताओं से नवजात शिशुओं में, रक्त आधान के माध्यम से, या अंग प्रत्यारोपण के दौरान प्रेषित किया जा सकता है। संक्रमण और मानव प्रवास प्राप्त करने के इन वेक्टर-स्वतंत्र तरीकों ने बीमारी के दुनिया भर में प्रसार में योगदान दिया है, जो उत्तरी अमेरिका, यूरोप और कुछ अफ्रीकी, पूर्वी भूमध्यसागरीय और पश्चिमी प्रशांत देशों में मामलों की बढ़ती संख्या से प्रमाणितहै। सीएचडी को एक उपेक्षित बीमारी माना जाता है क्योंकि वेक्टर-जनित संचरण गरीबी से निकटता से जुड़ा हुआ है और विशेष रूप से लैटिन अमेरिकी कम आय वाले देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है। यद्यपि उपलब्ध उपचार हैं, लैटिन अमेरिका में सीएचडी के कारण मृत्यु दर परजीवी रोगों में सबसे अधिक है, जिसमें मलेरिया2 भी शामिल है।

1960 के दशक के अंत और 1970 के दशक की शुरुआत में पेश किए गए सीएचडी उपचार के लिए दो पंजीकृत दवाएं हैं: निफर्टिमॉक्स और बेंज़निडाज़ोल5। दोनों दवाएं वयस्कों, बच्चों और जन्मजात रूप से संक्रमित नवजात शिशुओं के साथ-साथ पुराने संक्रमण वाले बच्चों में बीमारी के तीव्र चरण में प्रभावी हैं, जहां इलाज आमतौर पर प्राप्त किया जाता है। हालांकि, केवल कुछ ही लोगों को समय पर इलाज करने के लिए पर्याप्त जल्दी निदान किया जाता है। नवीनतम नैदानिक परीक्षणों के अनुसार, दोनों दवाओं की वयस्कों में महत्वपूर्ण सीमाएं हैं और पुरानी बीमारी वाले लोगों में लक्षणों को कम करने में अप्रभावी थीं; इसलिए, इस चरण में उनका उपयोग विवादास्पद है। अन्य कमियां लंबे समय तक आवश्यक उपचार अवधि (60-90 दिन) और लगातार, गंभीर प्रतिकूल प्रभाव देखी जाती हैं, जिससे संक्रमित लोगों के अनुपात में चिकित्सा बंद हो जाती है 6,7. यह अनुमान लगाया गया है कि सीएचडी वाले 10% से कम लोगों का निदान किया गया है, और यहां तक कि कम लोगों के पास उपचार तक पहुंच है, क्योंकि कई प्रभावित व्यक्ति ग्रामीण क्षेत्रों में रहते हैं, जिनके पास स्वास्थ्य सेवा तक कोई या दुर्लभ पहुंच नहींहै। ये तथ्य टी क्रूज़के खिलाफ नई दवाओं को खोजने की तत्काल आवश्यकता को उजागर करते हैं ताकि विशेष रूप से पुराने चरण के लिए अधिक कुशल, सुरक्षित और लागू-से-क्षेत्र उपचार की अनुमति मिल सके। इस संबंध में, अधिक प्रभावशाली यौगिकों के विकास में एक और चुनौती इन विट्रो और विवो9 में दवा प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए सिस्टम की सीमा है।

यद्यपि संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए रासायनिक जीव विज्ञान और जीनोमिक दृष्टिकोण का उपयोग कीनेटोप्लास्टिड परजीवी में किया गया है, टी क्रूज़ी में उपलब्ध जीनोमिक उपकरण टी। इस प्रकार, ट्रिपैनोसिडल गतिविधि के साथ यौगिकों की स्क्रीनिंग अभी भी सीएचडी के खिलाफ नए कीमोथेरेप्यूटिक दवा उम्मीदवारों की खोज में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है आमतौर पर, टी क्रूज़ी में दवा की खोज एपिमास्टिगोट चरण के खिलाफ इन विट्रो परख में एक नई दवा के प्रभावों का परीक्षण करने के साथ शुरू होनी चाहिए। दशकों से, टी क्रूज़ी पर उम्मीदवार यौगिकों के निरोधात्मक प्रभावों को मापने का एकमात्र तरीका मैनुअल सूक्ष्म गिनती थी, जो श्रमसाध्य, समय लेने वाली और ऑपरेटर-निर्भर है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण यौगिकों की एक छोटी संख्या परख के लिए उपयुक्त है, लेकिन बड़े यौगिक पुस्तकालयों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अस्वीकार्य है। आजकल, कई जांच विभिन्न मूल से यौगिकों की एक विशाल संख्या के विश्लेषण के साथ शुरू होती है जो इन विट्रो में परख की जाती हैं, परजीवी वृद्धि को बाधित करने के लिए उनकी क्षमता का परीक्षण करती हैं। इन परखों में थ्रूपुट बढ़ाने, स्क्रीनिंग की निष्पक्षता में सुधार करने और पूरी प्रक्रिया को कम थकाऊ बनाने के लिए वर्णमितीय और फ्लोरोमेट्रिक दोनों विधियों को विकसित किया गया है।

सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली वर्णमिति विधियों में से एक ट्रांसफेक्टेड परजीवी की β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि पर आधारित है जिसे पहले बकनेट और सहयोगियों10 द्वारा वर्णित किया गया है। पुनः संयोजक परजीवियों द्वारा व्यक्त β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट, क्लोरोफेनोल रेड β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड (सीपीआरजी) को क्लोरोफेनोल लाल में हाइड्रोलाइज करता है, जिसे माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आसानी से मापा जा सकता है। इस प्रकार, विभिन्न यौगिकों की उपस्थिति में परजीवी वृद्धि का मूल्यांकन और माइक्रोटिटर प्लेटों में एक साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस विधि को एपिमास्टिगोट रूपों (कीट वेक्टर में मौजूद), ट्रिपोमास्टिगोट्स और इंट्रासेल्युलर अमास्टिगोट्स, परजीवी के स्तनधारी चरणों में दवाओं का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, एस्चेरिचिया कोलाई β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम को व्यक्त करने के लिए पीबीएस: सीएल-नियो -01 / बीसी-एक्स -10 प्लास्मिड (पीएलएसीजेड) 10 से संक्रमित कई पुनः संयोजक टी क्रूज़ी उपभेद पहले से ही उपलब्ध हैं (और नए लोगों का निर्माण किया जा सकता है), जो विभिन्न असतत टाइपिंग इकाइयों (डीटीयू) से परजीवी के मूल्यांकन की अनुमति देता है जोसमान रूप से व्यवहार नहीं कर सकते हैं . इस विधि का उपयोग पहले से ही कम और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग12,13 में टी क्रूज़ी के खिलाफ गतिविधि के लिए यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग अन्य प्रोटोजोआ परजीवी में भी किया गया है, जिसमें टोक्सोप्लाज्मा गोंडी और लीशमैनिया मैक्सिकना14,15 शामिल हैं।

यह पत्र β-गैलेक्टोसिडेस को व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके टी क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है और दिखाता है। यहां प्रस्तुत परखों को पीएलएसीजेड प्लास्मिड (डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड) के साथ डीटीयू आई13 से टी क्रूज़ी डीएम 28 सी तनाव के अभिकर्मक द्वारा प्राप्त β-गैलेक्टोसिडेस-एक्सप्रेसिंग टी क्रूज़ी लाइन के साथ किया गया है। इसके अतिरिक्त, यौगिकों के बीच और टी क्रूज़ी उपभेदों या डीटीयू के बीच प्रदर्शन की तुलना करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: पूरे प्रयोगात्मक डिजाइन का अवलोकन चित्रा 1 में दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: वर्णमितीय प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट के रूप में सीपीआरजी का उपयोग करके ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड लाइन के इन विट्रो स्क्रीनिंग परख का अवलोकन। परख में परजीवी (1) को बोना, उन्हें बीजेडएन (2 और 3) के साथ इनक्यूबेट करना और फिर वर्णमितीय सब्सट्रेट (4) जोड़ना शामिल है। जब परजीवी को लाइसेड किया जाता है, तो β-गैलेक्टोसिडेस जारी किया जाता है और सीपीआरजी को क्लोरोफेनॉल लाल में क्लीव करता है; रंग में इस परिवर्तन को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जा सकता है (5). बीजेडएन की आधी निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) प्राप्त करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: सीपीआरजी = क्लोरोफेनोल लाल β-डी-गैलेक्टोपीरानोसाइड; बीजेडएन = बेंज़निडाज़ोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. मीडिया और समाधान की तैयारी
    1. हेमिन समाधान (पूरक तालिका एस 1)
      1. नुस्खा में दिए गए क्रम में 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी घटकों को जोड़ें और कई बार उलटा करके होमोजेनाइज करें।
      2. एक 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा निष्फल।
      3. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल विभाज्य तैयार करें और उपयोग होने तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. यकृत जलसेक ट्रिप्टोज (एलआईटी) मध्यम (पूरक तालिका एस 1)
      1. सभी घटकों का वजन करें और कम से कम 700 मिलीलीटर आसुत जल युक्त 1 एल बीकर में कमरे के तापमान पर होमोजेनाइज करने के लिए हलचल करें।
      2. पीएच को 7.2 में समायोजित करें और आसुत जल के साथ 1 एल स्नातक सिलेंडर में वॉल्यूम को 900 एमएल तक ऊपर रखें; निस्पंदन या ऑटोक्लेविंग (20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस) द्वारा निष्फल करें।
      3. भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), (10% एफसीएस, बाँझ और गर्मी 45 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय), 40% बाँझ ग्लूकोज समाधान के 20 मिलीलीटर (आटोक्लेविंग द्वारा निष्फल, 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस), और 5 एमएल हेमिन समाधान (अंतिम एकाग्रता 5 μM) एलआईटी माध्यम के 900 एमएल को जोड़कर माध्यम को पूरक करें।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पाउडर से डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) तैयार करें।
    4. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) (पूरक तालिका एस 1)
      1. 1 एल बीकर में कमरे के तापमान पर समाधान को हिलाकर सभी ठोस घटकों को भंग करें।
      2. पीएच को 7.2 में समायोजित करें, आसुत जल के साथ 1 एल स्नातक सिलेंडर में 1 एल तक का स्तर, और निस्पंदन या ऑटोक्लेविंग (121 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) द्वारा निष्फल करें।
  2. बेंज़निडाज़ोल (बीजेडएन) स्टॉक समाधान और कमजोर पड़ने
    नोट: इस काम में उपयोग किए जाने वाले बीजेडएन एकाग्रता की सीमा 2.5 से 80 μM थी।
    1. डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 50 μL में दवा के 13 मिलीग्राम को भंग करके 1 एम बीजेडएन का स्टॉक समाधान तैयार करें। सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत, एक अंतिम मात्रा में अंतिम वांछित एकाग्रता (2x समाधान) से दो बार इस 1 एम बीजेडएन स्टॉक समाधान से धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें जो कुओं की संख्या परख के लिए पर्याप्त है।
      नोट: 10-20% की अधिकता के साथ अच्छी तरह से 100 μL के लिए गणना करें। बीजेडएन स्टॉक समाधान और सभी बीजेडएन कमजोर पड़ने को माध्यम में दवा की कम घुलनशीलता के कारण परख में उपयोग करने से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए।
    2. 160, 80, 40, 20, 10, और 5 μM के 2x BZN कमजोर पड़ने तैयार करें।
      1. टी क्रूज़ी के प्रत्येक जीवन चक्र चरण के लिए उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त माध्यम में 10 एमएम समाधान प्राप्त करने के लिए 100 गुना कमजोर पड़ने (1 एम बीजेडएन + 990 μL माध्यम का 10 μL) पर 1 एम बीजेडएन स्टॉक समाधान को पतला करें। निलंबन को समरूप बनाने के लिए लगातार मिलाएं।
      2. उपयुक्त माध्यम में 320 μM BZN तैयार करने के लिए 10 एमएम बीजेडएन समाधान पतला करें: 10 एमएम बीजेडएन का 32 μL + मध्यम के 968 μL। निलंबन को समरूप बनाने के लिए लगातार मिलाएं।
      3. 160 μM (मध्यम के 320 μM BZN + 500 μL का 500 μL) की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 320 μM BZN 2 गुना पतला। निलंबन को समरूप बनाने के लिए लगातार मिलाएं। 80, 40, 20, 10, और 5 μM समाधान प्राप्त करने के लिए प्रत्येक परिणामी समाधान के साथ इस 2 गुना कमजोर पड़ने को दोहराएं।
      4. अनुपचारित नियंत्रण (100% उत्तरजीविता नियंत्रण) के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त माध्यम में डीएमएसओ 1,000 गुना पतला करें।
        नोट: एपिमास्टिगोट्स डीएमएसओ के 100 गुना कमजोर पड़ने तक सहन करते हैं, जबकि वेरो कोशिकाएं डीएमएसओ के केवल 1,000 गुना कमजोर पड़ने तक सहन करती हैं। यदि आवश्यक हो, तो 50% डीएमएसओ के साथ एक मृत्यु नियंत्रण को 0% जीवित रहने की स्थिति के रूप में शामिल किया जा सकता है।
  3. सब्सट्रेट समाधान
    1. आसुत जल में 1 एमएम एकाग्रता पर सीपीआरजी को भंग करें। 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, 4 मिलीलीटर पानी में 2.4 मिलीग्राम सीपीआरजी जोड़ें।
      नोट: सीपीआरजी समाधान परख से ठीक पहले तैयार किया जाना चाहिए।
  4. लाइसिस समाधान
    1. 1x पीबीएस में नॉनोनिक, गैर-विकृत डिटर्जेंट 2-[4-(2,4,4-ट्राइमेथिलपेंटन-2-वाईएल) फेनोक्सी] इथेनॉल ( सामग्री की तालिका देखें) का 2.5% वी / परख से ठीक पहले 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रति समाधान के 1 एमएल तैयार करें।

2. परजीवी संस्कृति की तैयारी

  1. एपिमास्टिगोट की तैयारी
    नोट: इस रिपोर्ट में टी क्रूज़ी डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड लाइन13 का उपयोग किया जाता है।
    1. क्रूज़ी एपिमास्टिगोट्स β को 25सेमी 2 (टी -25 फ्लास्क) के विकास क्षेत्र के साथ सेल संस्कृति फ्लास्क में 28 डिग्री सेल्सियस पर एक्सेनिकल रूप से बढ़ाएं। एमएल की अंतिम एकाग्रता पर 10% एफसीएस (पूरक तालिका एस 1) और आनुवंशिकी सल्फेट (जी 418) के साथ पूरक एलआईटी माध्यम में हर 48-72 घंटे (5 एमएल में) उपसंस्कृति करके लॉग चरण में संस्कृतियों को बनाए रखें। उपसंस्कृति से पहले न्यूबॉयर कक्ष में सेल गिनती द्वारा परजीवी वृद्धि की मात्रा निर्धारित करें। सुरक्षित रूप से टोपी को बंद करें और संस्कृति फ्लास्क (वेंट नहीं) को ऊर्ध्वाधर स्थिति में 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: जी 418 पीएलएसीजेड प्लास्मिड चयन और रखरखाव सुनिश्चित करता है। लॉग चरण संस्कृतियों में डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड लाइन के लिए 1-5 × 107 परजीवी / एमएल की एपिमास्टिगोट एकाग्रता होती है।
    2. जी 418 एंटीबायोटिक के साथ पूरक एलआईटी में लॉग चरण संस्कृति से 2 × 105 एपिमास्टिगोट्स / एमएल का निलंबन तैयार करें। 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के प्रति अच्छी तरह से एपिमास्टिगोट निलंबन के 100 μL (एलआईटी के 100 μL में 20,000 एपिमास्टिगोट्स) का वितरण करें और माध्यम के साथ प्रति अच्छी तरह से 200 μL तक अंतिम मात्रा बनाएं।
  2. अमास्टिगोट की तैयारी
    1. 2% एफसीएस के साथ पूरक डीएमईएम में पहले वरीयता प्राप्त 2 ×10 5 वेरो कोशिकाओं के साथ टी -25 फ्लास्क में प्रारंभिक संक्रमण करने के लिए एक वृद्ध एपिमास्टिगोट संस्कृति (इस प्रोटोकॉल में 7 दिनों के लिए) से प्राप्त सहज मेटासाइक्लिक ट्रिपोमास्टिगोट्स का उपयोग करें।
      1. न्यूबॉयर चैंबर में मेटासाइक्लिक ट्रिपोमास्टिगोट्स की संख्या की गणना करें, 2% एफसीएस के साथ डीएमईएम के 5 एमएल में 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता के साथ वेरो सेल मोनोलेयर को संक्रमित करें, और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेते हैं। 5 एमएल बाँझ पिपेट के साथ फ्लास्क से माध्यम को हटाकर शेष ट्रिपोमास्टिगोट्स को धो लें, फिर 1 एक्स पीबीएस और एस्पिरेट के 5 एमएल जोड़ें। अंत में, 2% एफसीएस के साथ डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें और समान परिस्थितियों में सेते हैं।
      2. 2% एफसीएस के साथ डीएमईएम में 2 ×10 5 वेरो कोशिकाओं के साथ टी -25 फ्लास्क में संक्रमण को बनाए रखने के लिए संक्रमित वेरो सेल मोनोलेयर से उभरने वाले ट्रिपोमास्टिगोट्स का उपयोग करें, हर हफ्ते एक नई संक्रमित बोतल उत्पन्न करें।
        नोट: 5-7 दिनों के बाद, ट्रिपोमास्टिगोट्स उभरने लगते हैं और सतह पर तैरनेवाला में दिखाई देते हैं। कोशिकाओं या संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रिपोमास्टिगोट्स में जी 418 न जोड़ें, क्योंकि वेरो सेल लाइन जी 418 के लिए प्रतिरोधी नहीं है।
    2. डीएमईएम में 1 × 105 वेरो कोशिकाओं / एमएल का निलंबन तैयार करें जो 2% एफसीएस और 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों (10,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से) में निलंबन के 100 μL के बीज के साथ पूरक है। कुओं के तल के लिए सेल पालन सुनिश्चित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रात भर (12-16 घंटे) सेते हैं।
    3. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, बाँझ 1x पीबीएस के 100 μL के साथ तीन बार वेरो सेल मोनोलेयर कुल्ला। पीएलएसीजेड ट्रिपोमास्टिगोट्स (टी -25 फ्लास्क में पिछले संक्रमण से प्राप्त, चरण 2.2.1) डीएमईएम के 100 μL में 10 के एमओआई पर 2% एफसीएस प्रति अच्छी तरह से (100,000 ट्रिपोमास्टिगोट्स प्रति अच्छी तरह से) के साथ पूरक जोड़ें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 6 घंटे के लिए प्लेटों सेते हैं। इस इनक्यूबेशन अवधि के बाद, प्लेटों को 1x पीबीएस के साथ दो बार धो लें, और 2% एफसीएस के साथ पूरक फिनोल लाल के बिना डीएमईएम के 100 μL जोड़ें।
      नोट: 48 घंटे (संक्रमण के बाद 2 दिन) के बाद, इंट्रासाइटोप्लाज्मिक अमास्टिगोट्स ऑप्टिक माइक्रोस्कोप के साथ दिखाई देते हैं। फिनोल लाल, डीएमईएम और अन्य सेल संस्कृति मीडिया में एक पीएच संकेतक, सीपीआरजी के अवशोषण माप में हस्तक्षेप कर सकता है। यदि फिनोल लाल के बिना डीएमईएम उपलब्ध नहीं है, तो धारा 3.2.1 में नीचे उल्लिखित विकल्प देखें।
  3. ट्रिपोमास्टिगोट की तैयारी
    1. डीएमईएम में 1 × 106 वेरो कोशिकाओं / एमएल का निलंबन तैयार करें जो 2% एफसीएस के साथ पूरक है और टी -25 फ्लास्क में माध्यम के 5 एमएल में बीज 800,000 कोशिकाएं हैं। सेल पालन सुनिश्चित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रात भर (12-16 घंटे) सेते हैं।
      नोट: एक टी -75 फ्लास्क के लिए, बीज 2 × 15 एमएल की अंतिम मात्रा में 106 कोशिकाएं।
    2. इनक्यूबेशन बाद, बाँझ 1x पीबीएस के 3 एमएल के साथ दो बार कुल्ला। 2% एफसीएस (टी -25 फ्लास्क के लिए 8 × 106 ट्रिपोमास्टिगोट्स) के साथ डीएमईएम के 5 एमएल में 10 के एमओआई पर टी क्रूज़ी डीएम 28 सी /
      नोट: टी -75 फ्लास्क के लिए, 2% एफसीएस के साथ डीएमईएम के 15 एमएल की अंतिम मात्रा में 20 × 106 ट्रिपोमास्टिगोट्स जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रात भर (12-16 घंटे) सेते हैं। 1x पीबीएस के 3 एमएल के साथ दो बार फ्लास्क को धो लें, और 2% एफसीएस के साथ पूरक ताजा डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें। चार दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेते हैं।
    4. एक ऑप्टिक माइक्रोस्कोप के तहत ट्रिपोमास्टिगोट्स के लिए सतह पर तैरनेवाला की जांच करें। न्यूबॉयर कक्ष में उन्हें गिनकर ट्रिपोमास्टिगोट्स को मापें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 7,000 × ग्राम पर एक 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2% एफसीएस के साथ पूरक फिनोल लाल के बिना डीएमईएम में 1 × 106 ट्रिपोमास्टिगोट्स / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गोली को फिर से निलंबित करें। 96-अच्छी तरह से प्लेट में ट्रिपोमास्टिगोट निलंबन के 100 μL बीज (100,000 ट्रिपोमास्टिगोट्स प्रति अच्छी तरह से)।
      नोट: यदि फिनोल लाल के बिना डीएमईएम उपलब्ध नहीं है, तो अनुभाग 3.2.1 में नीचे दिए गए विकल्प देखें।

3. β-गैलेक्टोसिडेस परख

नोट: β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि की मात्रा का उपयोग परजीवी की संख्या निर्धारित करने के अप्रत्यक्ष तरीके के रूप में किया जाता है। यह उम्मीद की जाती है कि ट्रिपैनोसिडल यौगिक की उपस्थिति में विकास बाधित होगा, जिससे अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में परजीवी की संख्या कम होगी, जो कम β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि में परिलक्षित होगी और इसलिए कम अवशोषण होगा।

  1. बीजेडएन के साथ परजीवी सेते हैं।
    1. 80, 40, 20, 10, 5, और 2.5 μM के BZN की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए प्रति अच्छी तरह से संबंधित 2x BZN समाधान के 100 μL जोड़ें एपिमास्टिगोट निलंबन के 100 μL (चरण 2.1 से), अमास्टिगोट्स के साथ वेरो कोशिकाएं (संक्रमण के 2 दिन बाद) (चरण 2.2), या ट्रिपोमास्टिगोट्स (चरण 2.3) एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में
    2. 72 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एपिमास्टिगोट्स सेते हैं, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए अमास्टिगोट्स के साथ ट्रिपोमास्टिगोट्स या संक्रमित वेरो कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: प्रत्येक दवा एकाग्रता का मूल्यांकन कम से कम ट्रिप्लिकेट में किया जाना चाहिए और डीएमएसओ के साथ एपिमास्टिगोट्स, ट्रिपोमास्टिगोट्स और संक्रमित वेरो कोशिकाओं की नियंत्रण संस्कृतियों को शामिल किया जाना चाहिए (चरण 1.2.2.4 देखें)।
  2. वर्णमितीय प्रतिक्रिया
    1. उपचार इनक्यूबेशन अवधि के बाद, यदि संक्रमित वेरो कोशिकाएं या ट्रिपोमास्टिगोट्स फिनोल लाल के साथ डीएमईएम में हैं, तो हस्तक्षेप से बचने के लिए 1 एक्स पीबीएस के 100 μL के साथ माध्यम को बदलें। संबंधित माध्यम के केवल 100 μL (या उपयुक्त के रूप में 1x पीबीएस) युक्त तीन गुना रिक्त कुओं का प्रदर्शन करें।
      नोट: फिनोल लाल के बिना एलआईटी माध्यम या डीएमईएम के मामले में एपिमास्टिगोट्स के लिए संस्कृति माध्यम को हटाना आवश्यक नहीं है। फिनोल लाल के साथ डीएमईएम का उपयोग अभी भी किया जा सकता है; आधार अवशोषण को मापने के लिए अकेले डीएमईएम के साथ एक रिक्त अच्छी तरह से तैयार करें और फिर डेटा विश्लेषण (चरण 3.3.) के दौरान इस मान को घटाएं। श्नाइडर का कीट माध्यम, जो रंगहीन है, एपिमास्टिगोट्स के लिए एक विकल्प है।
    2. प्रत्येक कुएं में 250 μL की अंतिम मात्रा में 200 μM CPRG और 0.1% डिटर्जेंट की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करते हुए, प्रत्येक कुएं में 40 μL और डिटर्जेंट समाधान के 10 μL जोड़ें।
      नोट: सीपीआरजी समाधान और डिटर्जेंट को अच्छी तरह से प्रति 50 μL की अंतिम मात्रा में एक साथ जोड़ा जा सकता है।
    3. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 595 एनएम पर अवशोषण को मापते हैं।
      नोट: अपेक्षित रंग परिवर्तन β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइमेटिक दरार (चित्रा 2 ए) पर लाल-भूरे रंग के लिए पीला है। इनक्यूबेशन समय को 4 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है, और क्लोरोफेनोल लाल के अवशोषण स्पेक्ट्रा को समान वक्र फिटिंग (पूरक चित्रा एस 1 ए, बी) के साथ 570 और 595 एनएम के बीच पढ़ा जा सकता है। सीपीआरजी सब्सट्रेट की उपस्थिति में 24 घंटे तक के लिए इनक्यूबेशन ने समान वक्र फिटिंग (पूरक चित्रा एस 1 सी) दिखाया है।
      1. एक मोनोक्रोमेटर चयनकर्ता के साथ एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में, उपकरण सॉफ्टवेयर (पूरक चित्रा एस 2) में एक नया प्रोटोकॉल बनाएं।
      2. डिटेक्शन विधि के रूप में अवशोषण | क्लिक करें पठन प्रकार के रूप में समापन बिंदु | ठीक है (पूरक चित्रा एस 2 ए)। एक पठन चरण जोड़ें, चयनित तरंग दैर्ध्य टाइप करें, और ठीक (पूरक चित्रा S2B) क्लिक करें।
      3. प्लेट लेआउट अनुभाग में, पढ़ने के लिए कुओं को चिह्नित करें और ठीक (पूरक चित्रा एस 2 सी) पर क्लिक करें। प्लेट को पढ़ने के लिए इसे ट्रे में डालें और रीड प्लेट पर क्लिक करें। स्क्रीन (पूरक चित्रा एस 2 डी) पर प्रकट होने के लिए मानों की प्रतीक्षा करें और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए उन्हें स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
  3. डेटा विश्लेषण और मीडिया अवरोधक एकाग्रता (आईसी50) गणना
    1. केवल एलआईटी माध्यम, 1 एक्स पीबीएस, या डीएमईएम के अनुरूप रिक्त मापा मूल्य को फिनोल लाल प्लस सीपीआरजी-डिटर्जेंट समाधान के साथ या बिना घटाएं। रंगीन यौगिकों की ट्रिपैनोसाइडल गतिविधि का परीक्षण करते समय, उपयोग की जाने वाली दवा की प्रत्येक एकाग्रता के साथ एलआईटी या डीएमईएम के साथ अतिरिक्त रिक्त नियंत्रण के अवशोषण को मापें और फिर प्रत्येक एकाग्रता में परजीवी के साथ प्राप्त अवशोषण मूल्यों से उन मूल्यों को घटाएं।
      नोट: पूरक तालिका एस 2 परजीवी प्लस सीपीआरजी-डिटर्जेंट समाधान के बिना इन मीडिया के साथ इस परख में प्राप्त विशिष्ट मूल्यों से पता चलता है। सीपीआरजी जोड़ने से पहले और बाद में मतभेद महत्वपूर्ण हैं लेकिन परजीवी (पूरक तालिका एस 2) के साथ परख में हस्तक्षेप नहीं करते हैं।
    2. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, एक एक्सवाई तालिका में 595 एनएम पर अवशोषण बनाम बीजेडएन (μM में) की एकाग्रता की साजिश करें। विश्लेषण बटन पर क्लिक करके, एक्स = लॉग (एक्स) विकल्प का उपयोग करके एक्स-मानों को बदलने के | ट्रांसफ़ॉर्म विकल्प का चयन करके और ओके बटन पर क्लिक करके बीजेडएन सांद्रता को लघुगणकीय मानों में बदलें।
    3. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से आईसी50 मान प्राप्त करें।
      नोट: आईसी50 को दवा एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है जो अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में परजीवी वृद्धि को 50% तक कम कर देता है और इसकी गणना सिग्मोइडल फ़ंक्शन के विभक्ति बिंदु के रूप में की जाती है जो वक्र फिट बैठती है।
      1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, विश्लेषण बटन पर क्लिक करें, xy विश्लेषण सूची में गैर-रैखिक प्रतिगमन (वक्र फिट) का चयन करें, और ठीक क्लिक करें।
      2. पैरामीटर विंडो के मॉडल टैब में, खुराक-प्रतिक्रिया - अंतर्निहित समीकरणों के निषेध समूह में, विकल्प खुराक-प्रतिक्रिया विधि का चयन करें: लॉग (अवरोधक) बनाम प्रतिक्रिया - चर ढलान (चार पैरामीटर)। अन्य सभी टैब को डिफ़ॉल्ट मानों पर छोड़ दें; क्लिक करें,OK.
      3. आईसी50 मूल्य, एसडी और फिट की भलाई खोजने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के परिणाम अनुभाग पर क्लिक करें।
      4. अवशोषण मूल्यों बनाम दवा की लघुगणक एकाग्रता के एक्सवाई ग्राफ को खोजने के लिए ग्राफ अनुभाग पर क्लिक करें। वक्र फिट की तलाश भी एक अलग रंग में रेखांकित है।
        नोट: एक मुफ्त ऑनलाइन आईसी50 गणना उपकरण https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator पर पाया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, β-गैलेक्टोसिडेस-एक्सप्रेसिंग डीएम 28 सी एपिमास्टिगोट्स को 72 घंटे के लिए बीजेडएन (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (या ब्याज के यौगिकों) की 6 सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। इस अवधि के बाद, सीपीआरजी अभिकर्मक को डिटर्जेंट के साथ जोड़ा गया था, जो कोशिकाओं को लाइज़ करता है और β-गैलेक्टोसिडेज़ जारी करता है। सीपीआरजी को क्लोरोफेनोल लाल का उत्पादन करने के लिए β-गैलेक्टोसिडेस द्वारा क्लीव किया जाता है, जिससे पीले से लाल रंग (चित्रा 2 ए) में रंग में बदलाव होता है। क्लोरोफेनोल लाल को 2 घंटे के बाद माइक्रोप्लेट रीडर में 595 एनएम पर अवशोषण पढ़कर मापा गया था। एक एक्सवाई तालिका को 595 एनएम पर अवशोषण बनाम बीजेडएन की लघुगणक सांद्रता के साथ प्लॉट किया गया था। भूखंड गैर रैखिक प्रतिगमन (चित्रा 2 बी) का उपयोग कर फिट किया गया था। इस विशेष प्रयोग में, एपिमास्टिगोट्स के लिए प्राप्त आईसी50 20.59 ± 1.075 μM था, जो साहित्य (तालिका I) 16,17 से प्राप्त समान था। ट्रिपोमास्टिगोट्स और एमास्टिगोट्स के लिए इस पद्धति का उपयोग करने वाले प्रतिनिधि परिणामों को पहले13 वर्णित किया गया है।

Figure 2
चित्रा 2: एपिमास्टिगोट फॉर्म डीएम 28 सी के लिए बेंज़निडाज़ोल के आईसी50 मूल्य की गणना। (ए) सीपीआरजी (1) जोड़ने से पहले विभिन्न बीजेडएन सांद्रता (2.5, 5, 10, 20, 40, और 80 μM) के साथ इलाज किए गए एपिमास्टिगोट्स के साथ एक 96-अच्छी तरह से प्लेट, सीपीआरजी और डिटर्जेंट (2) के प्रारंभिक जोड़ के बाद, और रंग के परिवर्तन को दिखाते हुए सीपीआरजी और डिटर्जेंट के साथ इनक्यूबेशन के बाद (3). (बी) डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड एपिमास्टिगोट्स के लिए 595 एनएम पर बीजेडएन बनाम अवशोषण (ओडी) के लघुगणक सांद्रता का एक्सवाई-प्लॉट। आईसी50 मूल्य का अनुमान लगाने के लिए भूखंड को गैर-रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके फिट किया गया था। प्रत्येक मान 6 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के माध्य और मानक विचलन (त्रुटि सलाखों) का प्रतिनिधित्व करता है। निरंतर नीली रेखा वक्र फिट का प्रतिनिधित्व करती है। संक्षिप्त नाम: सीपीआरजी = क्लोरोफेनोल लाल β-डी-गैलेक्टोपीरानोसाइड; बीजेडएन = बेंज़निडाज़ोल; आयुध डिपो = ऑप्टिकल घनत्व; सी = नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बीजेडएन आईसी50 (μM) डीएम 28 सी का उपयोग करके गणना की जाती है जो β-गैलेक्टोसिडेस व्यक्त करती है बीजेडएन आईसी50 (μM) साहित्य में रिपोर्ट की गई
एपिमास्टिगोट्स 17.08 से 20.59 11 से 18.72
अमास्टिगोट्स 2.31 से 3.92 1.66 से 4.39
ट्रिपोमास्टिगोट्स 27.07 से 44.74 24.68 से 50.72

तालिका 1: साहित्य 17,18 में रिपोर्ट किए गए आईसी 50 की तुलना में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एपिमास्टिगोट्स, ट्रिपोमास्टिगोट्स और एमास्टिगोट्स के लिए प्राप्त आईसी50 मूल्यों की सीमा।

पूरक चित्रा एस 1: पढ़ने के अवशोषण के लिए माइक्रोप्लेट रीडर सॉफ्टवेयर का सेटअप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि माप (570 से 595 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) अलग-अलग समय बिंदुओं पर सीपीआरजी के साथ इनक्यूबेशन के बाद ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी की डीएम 28 सी / मानों को तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों के माध्य और मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है। रंगीन निरंतर रेखाएं वक्र फिट का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) इनक्यूबेशन 4 घंटे के लिए 200 μM सीपीआरजी के साथ इनक्यूबेशन (C) अलग-अलग समय बिंदुओं (2, 4, और 24 घंटे) पर β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि (570 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) का प्रतिनिधित्व। संक्षिप्त नाम: सीपीआरजी = क्लोरोफेनोल लाल β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: एलआईटी माध्यम, हेमिन और पीबीएस की संरचना और तैयारी। संक्षिप्त नाम: एलआईटी = लिवर इन्फ्यूजन ट्रिप्टोज; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका एस 2: परजीवी के बिना एलआईटी और डीएमईएम मीडिया के लिए अवशोषण रीडिंग। मूल्यों को प्रत्येक माध्यम के ट्रिप्लिकेट्स के रूप में व्यक्त किया जाता है; मीडिया पंक्ति में तीन प्रतिकृतियों का औसत मान होता है; और एसडी पंक्ति में प्रतिकृतियों के मानक विचलन मान होते हैं। संक्षिप्त नाम: एसडी = मानक विचलन; एलआईटी = यकृत जलसेक ट्रिप्टोज; डीएमईएम = दुलबेको का संशोधित ईगल माध्यम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह पेपर सब्सट्रेट सीपीआरजी की उपस्थिति में एमास्टिगोट्स के साथ टी क्रूज़ी एपिमास्टिगोट्स, ट्रिपोमास्टिगोट्स, या संक्रमित कोशिकाओं के झिल्ली लिसिस के कारण जारी साइटोप्लाज्मिक β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि का निर्धारण करने के आधार पर एक परख का वर्णन करता है। हमने टी क्रूज़ी डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड परजीवी का उपयोग किया, बकनर और सह-लेखकों10 द्वारा निर्मित β-गैलेक्टोसिडेस-असर प्लास्मिड के साथ अभिकर्मक के बाद प्राप्त एक स्थिर परजीवी तनाव। इस परख का उपयोग एंटीट्रिपैनोसिडलयौगिकों 12,19,20,21 की खोज के लिए किया गया है। स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए टी क्रूज़ी डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड तनाव का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्रा 1 में संक्षेप में बताया गया है, इस प्रोटोकॉल में चार प्रमुख बिंदु हैं; पहला 96-अच्छी तरह से प्लेटों में परजीवी बोना है। एपिमास्टिगोट्स और ट्रिपोमास्टिगोट्स को एक निलंबन से गिना और वरीयता दी जाती है। अमास्टिगोट्स के मामले में, पहले बीज वेरो कोशिकाएं एक अनुयायी मोनोलेयर बनाती हैं और फिर ट्रिपोमास्टिगोट्स से संक्रमित होती हैं। अमास्टिगोट्स 48 घंटे के बाद कोशिकाओं के अंदर मौजूद होते हैं। दूसरा, वांछित सांद्रता में परीक्षण करने के लिए दवा के कमजोर पड़ने को तैयार करें और परजीवी के साथ सेते हैं। अंत में, तीसरे चरण में कोशिकाओं को लाइज करने के लिए सीपीआरजी और डिटर्जेंट जोड़ना शामिल है। सीपीआरजी को परजीवी साइटोप्लाज्म से β-गैलेक्टोसिडेस रिलीज पर क्लीव किया जाता है, और क्लोरोफेनोल लाल स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से उत्पन्न और मापा जाता है। चौथे महत्वपूर्ण चरण में डेटा विश्लेषण, एक्स-वाई ग्राफ का निर्माण, और ब्याज की दवाओं के आईसी50 मूल्यों की गणना करने के लिए प्राप्त वक्र को फिट करना शामिल है।

टी क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के लिए एक इन विट्रो परख एक संभावित नई दवा के प्रभावों का अध्ययन करने में प्रारंभिक कदम है। इन परखों में, प्रभावों का मूल्यांकन सूक्ष्म गिनती द्वारा किया जाता है, एक समय-महंगा और व्यक्तिपरक प्रक्रिया जिसे स्वचालित करना मुश्किल है। वर्णमितीय परख द्वारा इस तकनीक का प्रतिस्थापन स्क्रीनिंग की निष्पक्षता में सुधार कर सकता है, जिससे यह कम समय लेने वाला भी हो सकता है। वर्णमितीय प्लेट पढ़ने में श्रम-गहन मैनुअल माइक्रोस्कोपिक गिनती के लिए आवश्यक घंटों के विपरीत केवल कुछ मिनट लगते हैं, और संभावित चिकित्सीय मूल्य के साथ नए यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करता है। जंगली प्रकार के डीएम 28 सी तनाव की तुलना में β-गैलेक्टोसिडेस-एक्सप्रेसिंग परजीवी (डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड) की समग्र समानता के बारे में, हमने निर्धारित किया कि परजीवी रूपात्मक रूप से सामान्य थे, समान विकास दर के साथ और जीवन चक्र रूपों के भीतर समान रूप से विभेदित थे। इसके अलावा, सूक्ष्म गिनती द्वारा निर्धारित जंगली प्रकार के डीएम 28 सी और डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड लाइन की तुलना में प्राप्त दवा परीक्षण परिणामों ने कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया13.

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि रंगीन संस्कृति मीडिया मापा अवशोषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। फिनोल लाल के बिना डीएमईएम (या आरपीएमआई) को इस सीमा को दूर करने की सिफारिश की जाती है। डीएमईएम के साथ एक खाली अच्छी तरह से सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल में बेसल अवशोषण मूल्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था। रंगीन दवाओं का उपयोग करते समय एक और सीमा पुटेटिव हस्तक्षेप है, जिसे खाली के रूप में यौगिक के साथ मीडिया का उपयोग करके या सबसे कम हस्तक्षेप देने के लिए 570 और 595 एनएम के बीच अवशोषण तरंग दैर्ध्य का चयन करके दूर किया जा सकता है। सीपीआरजी किसी दिए गए दवा (रंगीन या नहीं) की उपस्थिति से नहीं बदला जाता है, जिससे यह परख काफी मजबूत हो जाती है। फिनोल लाल या रंगीन दवाओं के साथ मीडिया का उपयोग करते समय, प्रत्येक स्थिति के लिए रिक्त नियंत्रण करना और फिर किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए परजीवी के साथ माप से प्राप्त अवशोषण मूल्य को घटाना महत्वपूर्ण है।

क्रूजी ट्रिपोमास्टिगोट्स और टोक्सोप्लाज्मा गोंडी के लिए रिपोर्ट किए गए सीपीआरजी समाधान की एकाग्रता 100 μM10,15 है। हालांकि, एपिमास्टिगोट्स के लिए रिपोर्ट की गई इष्टतम एकाग्रता 200 μM11 है। पीएलएसीजेड लाइन में, विश्वसनीय परिणामों के साथ एपिमास्टिगोट्स, ट्रिपोमास्टिगोट्स और एमास्टिगोट्स के लिए 200 μM CPRG समाधान का उपयोग किया गया था। सीपीआरजी इनक्यूबेशन समय के बारे में, सबसे अच्छा वक्र फिटिंग तब हासिल किया गया था जब एपिमास्टिगोट्स को 2 घंटे (आर2 = 0.9995) के लिए सब्सट्रेट समाधान के साथ ऊष्मायन किया गया था। हालांकि, आर2 बहुत समान था (आर2 = 0.9994), और β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि 6,250-200,000 एपिमास्टिगोट्स प्रति अच्छी तरह से (यानी, 62,500-2,000,000 एपिमास्टिगोट्स / एमएल) की सीमा में रैखिक थी। ट्रिपोमास्टिगोट्स 13 के लिए 3,150-100,000 ट्रिपोमास्टिगोट्स प्रति अच्छी तरह से (यानी, 31,500-1,000,000 ट्रिपोमास्टिगोट्स / एमएल) की एक रैखिक सीमा की सूचना दी गईथी। बड़े मानक विचलनों को देखने से बचने के लिए, प्रत्येक कुएं में परजीवियों की सही मात्रा को बीज देना महत्वपूर्ण है। चूंकि वॉल्यूम छोटे होते हैं, इसलिए बोने से पहले परजीवी की गिनती करते समय सुसंगत होना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए तीन से अधिक प्रतिकृतियों को मापा जा सकता है।

अन्य वर्णमितीय स्क्रीनिंग परख22 के विपरीत, बाद में हेरफेर कदम यहाँ आवश्यक नहीं हैं, परख की प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता के साथ-साथ डेटा संग्रह की गति में वृद्धि। यह एक आसान, त्वरित और विश्वसनीय परख है जो सीएचडी उपचार के लिए उम्मीदवार यौगिकों की उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है और इसे अन्य टी क्रूज़ी उपभेदों पर लागू किया जा सकता है। पीएलएसीजेड प्लास्मिड बकर प्रयोगशाला के अनुरोध पर उपलब्ध है और इसका उपयोग प्रतिरोधी उपभेदों को ट्रांसफेक्ट करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न दवाओं के लिए लाइन की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए नॉकआउट लाइनें। ध्यान में रखा जाने वाला एकमात्र महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि नॉकआउट प्लास्मिड में पीएलएसीजेड की तुलना में एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर होना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम कृपया पीएलएसीजेड प्लास्मिड प्रदान करने के लिए डॉ बकनर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को अर्जेंटीना से अगेन्सिया नैशनल डी प्रोमोसियोन सिएंटिफिका वाई टेक्नोलोजिका, मिनिस्टरियो डी सिएन्सिया ई इनोवासियोन प्रोडक्टिवा (पीआईसीटी 2016-0439, पीआईसीटी 2019-0526, पीआईसीटी 2019-4212), और रिसर्च काउंसिल यूनाइटेड किंगडम [एमआर / सर्वियर मेडिकल आर्ट का उपयोग चित्रा 1 (https://smart.servier.com) का उत्पादन करने के लिए किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

जैव रसायन अंक 177
<em>इन विट्रो में</em> <em>ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी</em> के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ ड्रग स्क्रीनिंग β-गैलेक्टोसिडेस व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter