Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Lægemiddelscreening mod alle livscyklusfaser af Trypanosoma cruzi ved hjælp af parasitter, der udtrykker β-galactosidase

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63210
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

Summary

Vi beskriver et kolorimetrisk assay med høj kapacitet, der måler β-galactosidaseaktivitet i tre livscyklusfaser af Trypanosoma cruzi, det forårsagende middel til Chagas sygdom. Dette assay kan bruges til at identificere trypanocidale forbindelser på en nem, hurtig og reproducerbar måde.

Abstract

Trypanosoma cruzi er årsag til Chagas sygdom (ChD), en endemisk sygdom af folkesundhedsmæssig betydning i Latinamerika, der også påvirker mange ikke-endemiske lande på grund af stigningen i migration. Denne sygdom rammer næsten 8 millioner mennesker, med nye tilfælde anslået til 50.000 om året. I 1960'erne og 70'erne blev der introduceret to lægemidler til ChD-behandling: nifurtimox og benznidazol (BZN). Begge er effektive hos nyfødte og i den akutte fase af sygdommen, men ikke i den kroniske fase, og deres anvendelse er forbundet med vigtige bivirkninger. Disse kendsgerninger understreger det presserende behov for at intensivere søgningen efter nye lægemidler mod T. cruzi.

T. cruzi overføres gennem hæmatofagiske insektvektorer af Familierne Reduviidae og Hemiptera. En gang i pattedyrværten multipliceres den intracellulært som den ikke-flagellerede amastigoteform og differentierer sig til trypomastigote, blodbanen ikke-replikativ infektiv form. Inde i insektvektoren omdannes trypomastigotes til epimastigotestadiet og formere sig gennem binær fission.

Dette papir beskriver et assay baseret på måling af aktiviteten af den cytoplasmatiske β-galactosidase frigivet i kulturen på grund af parasitter lysis ved anvendelse af substratet, chlorophenolrød β-D-galactopyranosid (CPRG). Til dette blev T. cruzi Dm28c-stammen transficeret med et β-galactosidase-overekspressionerende plasmid og anvendt til in vitro farmakologisk screening i epimastigote-, trypomastigote- og amastigotestadier. Dette papir beskriver også, hvordan man måler den enzymatiske aktivitet i dyrkede epimastigotes, inficerede Vero-celler med amastigotes og trypomastigotes frigivet fra de dyrkede celler ved hjælp af referencelægemidlet benznidazol, som et eksempel. Dette kolorimetriske assay udføres let og kan skaleres til et format med høj kapacitet og påføres andre T. cruzi-stammer .

Introduction

Chagas sygdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, er en parasitisk sygdom forårsaget af den flagellerede protozo, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begynder med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akut fase, der normalt er udiagnosticeret, efterfulgt af en livslang kronisk fase. I kronisk tilstand manifesterer ~ 30% af patienterne årtier efter infektionen - en række svækkende tilstande, herunder myokardopati, mega-fordøjelsessyndromer eller begge dele, med en dødelighed på mellem 0,2% og 20% 1,2,3. Asymptomatiske kroniske patienter har muligvis ingen kliniske tegn, men forbliver seropositive gennem hele deres liv.

Skøn tyder på, at ~ 7 millioner mennesker er smittet over hele verden, hovedsagelig fra Latinamerika, hvor ChD er endemisk. I disse lande overføres T. cruzi hovedsageligt gennem inficerede blodsugende triatominbugs (vektorbåren transmission) og sjældnere ved oral transmission gennem indtagelse af mad forurenet med triatominafføring indeholdende parasitterne2. Derudover kan parasitten overføres via moderkagen fra chagasiske mødre til nyfødte, gennem blodtransfusioner eller under organtransplantation. Disse vektoruafhængige måder at erhverve infektionen og menneskelig migration har bidraget til den verdensomspændende spredning af sygdommen, hvilket fremgår af et stigende antal tilfælde i Nordamerika, Europa og nogle afrikanske, østlige Middelhavs- og vestlige Stillehavslande4. ChD betragtes som en forsømt sygdom, da vektorbåren transmission er tæt forbundet med fattigdom og er et førende folkesundhedsproblem, især i latinamerikanske lavindkomstlande. Selvom der er tilgængelige behandlinger, er dødeligheden på grund af ChD i Latinamerika den højeste blandt parasitære sygdomme, herunder malaria2.

Der er to registrerede lægemidler til ChD-behandling introduceret i slutningen af 1960'erne og begyndelsen af 1970'erne: nifurtimox og benznidazol5. Begge lægemidler er effektive i den akutte fase af sygdommen hos voksne, børn og medfødt inficerede nyfødte såvel som hos børn med kronisk infektion, hvor helbredelse normalt opnås. Men kun få mennesker diagnosticeres tidligt nok til at blive behandlet i tide. Ifølge de seneste kliniske forsøg har begge lægemidler vigtige begrænsninger hos voksne og var ineffektive til at reducere symptomer hos mennesker med kronisk sygdom; derfor er deres anvendelse i denne fase kontroversiel. Andre ulemper er de forlængede behandlingsperioder, der kræves (60-90 dage) og de hyppige, alvorlige bivirkninger, der observeres, hvilket fører til seponering af behandlingen hos en andel af inficerede mennesker 6,7. Det anslås, at færre end 10% af befolkningen med ChD er blevet diagnosticeret, og endnu færre har adgang til behandling, da mange berørte personer bor i landdistrikter med ingen eller knap adgang til sundhedspleje8. Disse fakta understreger det presserende behov for at finde nye lægemidler mod T. cruzi for at muliggøre mere effektive, sikre og anvendelige behandlinger, især for den kroniske fase. I denne henseende er en anden udfordring i udviklingen af mere effektive forbindelser begrænsningen af systemer til vurdering af lægemiddeleffektivitet in vitro og in vivo9.

Selvom kemisk biologi og genomiske tilgange til identifikation af potentielle lægemiddelmål er blevet anvendt i kinetoplastidparasitter, er de tilgængelige genomiske værktøjer i T. cruzi begrænsede i modsætning til T. brucei eller Leishmania. Screening af forbindelser med trypanocidal aktivitet er således stadig den mest anvendte tilgang i søgen efter nye kemoterapeutiske lægemiddelkandidater mod ChD. Normalt skal lægemiddelopdagelse i T. cruzi starte med at teste virkningerne af et nyt lægemiddel i et in vitro-assay mod epimastigotestadiet. I årtier var den eneste måde at måle de hæmmende virkninger af kandidatforbindelser på T. cruzi manuel mikroskopisk tælling, hvilket er besværligt, tidskrævende og operatørafhængigt. Desuden er denne fremgangsmåde velegnet til analyse af et lille antal forbindelser, men er uacceptabel til screening med høj kapacitet af store sammensatte biblioteker. I dag begynder mange undersøgelser med analysen af et stort antal forbindelser fra forskellige oprindelser, der analyseres in vitro, og tester deres evne til at hæmme parasitvækst. Både kolorimetriske og fluorometriske metoder er udviklet til at øge gennemstrømningen i disse assays, forbedre objektiviteten af screeningen og gøre hele processen mindre kedelig9.

En af de mest anvendte kolorimetriske metoder er baseret på β-galactosidaseaktiviteten af transinficerede parasitter, der først blev beskrevet af Bucknet og samarbejdspartnere10. Det β-galactosidaseenzym udtrykt af de rekombinante parasitter hydrolyserer det kromoogene substrat, chlorophenolrødt β-D-galactopyranosid (CPRG), til chlorophenolrødt, som let kan måles kolorimetrisk ved hjælp af et mikropladespektrofotometer. Således kan parasitvækst i nærværelse af en række forbindelser samtidig evalueres og kvantificeres i mikrotiterplader. Denne metode er blevet anvendt til at teste lægemidler i epimastigoteformer (til stede i insektvektoren), trypomastigotes og intracellulære amastigotes, parasitens pattedyrstadier. Endvidere er flere rekombinante T. cruzi-stammer transficeret med pBS: CL-Neo-01 / BC-X-10 plasmid (pLacZ)10 til at udtrykke Escherichia coli β-galactosidase enzymet allerede tilgængelige (og nye kan konstrueres), hvilket gør det muligt at evaluere parasitter fra forskellige diskrete typningsenheder (DTU'er), der muligvis ikke opfører sig ens over for de samme forbindelser 10,11,12,13 . Denne metode er allerede blevet anvendt med succes til at evaluere forbindelser for aktivitet mod T. cruzi i screening med lav og høj kapacitet12,13. Lignende tilgange er også blevet anvendt i andre protozoiske parasitter, herunder Toxoplasma gondii og Leishmania mexicana14,15.

Dette papir beskriver og viser en detaljeret metode til en in vitro-lægemiddelscreening mod alle livscyklusstadier af T. cruzi ved hjælp af parasitter, der udtrykker β-galactosidase. De analyser, der præsenteres her, er udført med en β-galactosidase-ekspressiv T. cruzi-linje opnået ved transfektion af T. cruzi Dm28c stamme fra DTU I13 med pLacZ plasmid (Dm28c / pLacZ). Derudover kunne den samme protokol let tilpasses andre stammer for at sammenligne ydeevnen mellem forbindelser og mellem T. cruzi-stammer eller DTU'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: En oversigt over hele det eksperimentelle design er afbildet i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over in vitro screening assay af Trypanosoma cruzi Dm28c / pLacZ linje ved hjælp af CPRG som et substrat for den kolorimetriske reaktion. Analysen består i at så parasitterne (1), inkubere dem med BZN (2 og 3) og derefter tilføje det kolorimetriske substrat (4). Når parasitter lyses, frigives β-galactosidase og spalter CPRG til chlorophenolrød; denne farveændring kan måles spektrofotometrisk (5). Data kan analyseres i statistisk analysesoftware for at opnå den halvt hæmmende koncentration (IC50) af BZN. Forkortelser: CPRG = chlorophenol rød β-D-galactopyranosid; BZN = benznidazol. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Fremstilling af stamopløsninger

  1. Fremstilling af medier og opløsninger
    1. Heminopløsning (supplerende tabel S1)
      1. Tilsæt alle komponenterne til et 50 ml centrifugerør i den rækkefølge, der er angivet i opskriften, og homogeniser ved inversion flere gange.
      2. Steriliser ved filtrering gennem et 0,22 μm filter.
      3. 1 ml alikvoter klargøres i 1,5 ml mikrocentrifugerør, og de opbevares ved -80 °C indtil brug.
    2. Leverinfusion Tryptose (LIT) Medium (supplerende tabel S1)
      1. Alle bestanddele afvejes, og der omrøres for at homogenisere ved stuetemperatur i et 1 L bægerglas indeholdende mindst 700 ml destilleret vand.
      2. PH-værdien justeres til 7,2, og volumenet fyldes op til 900 ml i en 1 L gradueret cylinder med destilleret vand. sterilisere ved filtrering eller autoklavering (121 °C i 20 min).
      3. Suppler mediet ved at tilsætte 100 ml føtalt kalveserum (FCS), (10% FCS, sterilt og varmeinaktiveret ved 56 ° C i 45 minutter), 20 ml 40% steril glucoseopløsning (steriliseret ved autoklavering, 121 ° C i 20 minutter) og 5 ml heminopløsning (slutkoncentration 5 μM) til 900 ml LIT-medium.
    3. Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) fra pulveret efter producentens anvisninger.
    4. Fosfatbufferet saltvand (PBS) (supplerende tabel S1)
      1. Alle faste bestanddele opløses ved omrøring af opløsningen ved stuetemperatur i et 1 L bægerglas.
      2. PH-værdien justeres til 7,2, niveauer op til 1 L i en 1 L gradueret cylinder med destilleret vand, og steriliser ved filtrering eller autoklavering (121 °C, 20 min).
  2. Benznidazol (BZN) stamopløsninger og fortyndinger
    BEMÆRK: Intervallet for BZN-koncentration, der blev anvendt i dette arbejde, var 2,5 til 80 μM.
    1. Der fremstilles en stamopløsning på 1 M BZN ved at opløse 13 mg af lægemidlet i 50 μL dimethylsulfoxid (DMSO). Under aseptiske forhold fremstilles serielle fortyndinger fra denne 1 M BZN stamopløsning ved det dobbelte af den endelige ønskede koncentration (2x opløsninger) i et slutvolumen, der er tilstrækkeligt til det antal boringer, der skal analyseres.
      BEMÆRK: Beregn for 100 μL pr. brønd med et overskud på 10-20%. BZN-stamopløsningen og alle BZN-fortyndinger skal fremstilles umiddelbart før brug i analysen på grund af lægemidlets lave opløselighed i mediet.
    2. Forbered 2x BZN fortyndinger på 160, 80, 40, 20, 10 og 5 μM.
      1. 1 M BZN-stamopløsning fortyndes ved en fortynding på 100 gange (10 μL 1 M BZN + 990 μL medium) for at opnå en 10 mM opløsning i det passende medium, der anvendes for hvert livscyklustrin af T. cruzi. Bland kontinuerligt for at homogenisere suspensionen.
      2. 10 mM BZN-opløsning fortyndes for at fremstille 320 μM BZN i det passende medium: 32 μL 10 mM BZN + 968 μL medium. Bland kontinuerligt for at homogenisere suspensionen.
      3. 320 μM BZN fortyndes 2 gange for at opnå en koncentration på 160 μM (500 μL 320 μM BZN + 500 μL medium). Bland kontinuerligt for at homogenisere suspensionen. Denne 2-fold fortynding gentages med hver resulterende opløsning for at opnå 80, 40, 20, 10 og 5 μM opløsninger.
      4. DMSO fortyndes 1.000 gange i det passende medium til brug som ubehandlet kontrol (100 % overlevelseskontrol).
        BEMÆRK: Epimastigotes tolererer op til en 100 gange fortynding af DMSO, mens Vero-celler kun tolererer op til en 1.000 gange fortynding af DMSO. Om nødvendigt kan en dødskontrol med 50% DMSO medtages som 0% overlevelsestilstand.
  3. Substrat opløsning
    1. CPRG opløses ved 1 mM koncentration i destilleret vand. For en 96-brøndplade tilsættes 2,4 mg CPRG til 4 ml vand.
      BEMÆRK: CPRG-opløsning skal fremstilles umiddelbart før analysen.
  4. Lysis opløsning
    1. Der fremstilles en 2,5 % v/v opløsning af nonionisk, ikke-denaturerende vaskemiddel 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol (se materialetabellen) i 1x PBS. Forbered 1 ml af opløsningen pr. 96-brøndplade umiddelbart før analysen.

2. Forberedelse af parasitkultur

  1. Epimastigote forberedelse
    BEMÆRK: T. cruzi Dm28c/pLacZ linje13 anvendes i hele denne rapport.
    1. De β-galactosidase-ekspressive T. cruzi epimastigotes dyrkes aksenisk ved 28 °C i cellekulturkolber med et vækstareal på 25 cm2 (T-25 kolber). Bygerne vedligeholdes i logfasen ved at subkulturere hver 48-72 h (i 5 ml) i LIT-medium suppleret med 10% FCS (supplerende tabel S1) og geneticinsulfat (G418) i en slutkoncentration på 200 μg / ml. Kvantificer parasitvækst ved celletælling i et Neubauer-kammer før subkulturering. Luk hætten forsvarligt, og opbevar kulturkolben (ikke udluftet) ved 28 °C lodret.
      BEMÆRK: G418 sikrer valg og vedligeholdelse af pLacZ plasmid. Logfasekulturer har en epimastigotkoncentration på 1-5 × 107 parasitter / ml for Dm28c / pLacZ-linjen.
    2. Der fremstilles en suspension på 2 × 105 epimastigotes/ml fra en logfasekultur i LIT suppleret med G418 antibiotikum. Der dispenseres 100 μL epimastigotesuspension pr. brønd (20.000 epimastigotes i 100 μL LIT) af en mikroplade med 96 brønde, og det endelige volumen fyldes til 200 μL pr. brønd med mediet.
  2. Amastigote forberedelse
    1. Brug spontane metacykliske trypomastigotes opnået fra en alderen epimastigotekultur (i 7 dage i denne protokol) til at udføre en indledende infektion i en T-25-kolbe med 2 × 105 Vero-celler podet tidligere i DMEM suppleret med 2% FCS.
      1. Tæl antallet af metacykliske trypomastigotes i et Neubauer-kammer, inficer Vero-cellemonolaget med en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10 i 5 ml DMEM med 2% FCS, og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 16 timer. De resterende trypomastigotes vaskes ved at fjerne mediet fra kolben med en 5 ml steril pipette, hvorefter der tilsættes 5 ml 1x PBS og aspirerer. Til sidst tilsættes 5 ml DMEM med 2% FCS og inkuberes under de samme betingelser.
      2. Brug trypomastigotes, der kommer fra det inficerede Vero-cellemonolag, til at opretholde infektionen i T-25-kolber med 2 × 105 Vero-celler i DMEM med 2% FCS, der genererer en ny inficeret flaske hver uge.
        BEMÆRK: Efter 5-7 dage begynder trypomastigotes at dukke op og er synlige i supernatanten. Tilsæt ikke G418 til de trypomastigotes, der bruges til at inficere cellerne eller de inficerede celler, da Vero-cellelinjen ikke er resistent over for G418.
    2. Forbered en suspension af 1 × 105 Vero-celler / ml i DMEM suppleret med 2% FCS og frø 100 μL af suspensionen pr. Brønd i 96-brønd vævskulturplader (10.000 celler pr. Brønd). Inkuberes natten over (12-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2 for at sikre celleadhærens til bunden af brøndene.
    3. Efter inkubation natten over skylles Vero-cellemonolaget tre gange med 100 μL steril 1x PBS. Der tilsættes T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigotes (opnået ved en tidligere infektion i en T-25 kolbe, trin 2.2.1) ved en MOI på 10 ud af 100 μL DMEM suppleret med 2 % FCS pr. brønd (100.000 trypomastigotes pr. brønd).
    4. Pladerne inkuberes i 6 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Efter denne inkubationsperiode vaskes pladerne to gange med 1x PBS, og der tilsættes 100 μL DMEM uden phenolrød suppleret med 2% FCS.
      BEMÆRK: Efter 48 timer (2 dage efter infektion) er intracytoplasmatiske amastigotes synlige med et optisk mikroskop. Phenolrød, en pH-indikator i DMEM og andre cellekulturmedier, kan forstyrre absorbansmålingen af CPRG. Hvis DMEM uden phenolrød ikke er tilgængelig, se alternativerne nedenfor i pkt. 3.2.1.
  3. Trypomastigote forberedelse
    1. Der fremstilles en suspension på 1 × 106 Vero-celler/ml i DMEM suppleret med 2% FCS og frø 800.000 celler i 5 ml af mediet i T-25-kolber. Inkuber natten over (12-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2 for at sikre celleadhærens.
      BEMÆRK: For en T-75 kolbe, frø 2 × 106 celler i et endeligt volumen på 15 ml.
    2. Efter inkubation skylles to gange med 3 ml steril 1x PBS. Tilføj T. cruzi Dm28c/pLacZ trypomastigotes ved en MOI på 10 i 5 ml DMEM med 2% FCS (8 × 106 trypomastigotes for en T-25 kolbe).
      BEMÆRK: For en T-75 kolbe tilsættes 20 × 106 trypomastigotes i et endeligt volumen på 15 ml DMEM med 2% FCS.
    3. Inkuberes natten over (12-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2. Kolben vaskes to gange med 3 ml 1x PBS, og der tilsættes 5 ml frisk DMEM suppleret med 2% FCS. Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i fire dage.
    4. Kontroller supernatanten for trypomastigotes under et optisk mikroskop. Kvantificer trypomastigotes ved at tælle dem i et Neubauer-kammer. Supernatanten opsamles i et 15 ml rør, og centrifuger ved 7.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur.
    5. Supernatanten kasseres, og pelleten genanvendes for at opnå en koncentration på 1 × 106 trypomastigotes/ml i DMEM uden phenolrød suppleret med 2 % FCS. Frø 100 μL af trypomastigote suspensionen (100.000 trypomastigotes pr. Brønd) i en 96-brøndplade.
      BEMÆRK: Hvis DMEM uden phenolrød ikke er tilgængelig, se alternativer nedenfor i pkt. 3.2.1.

3. β-galactosidase assay

BEMÆRK: Kvantificering af β-galactosidaseaktivitet anvendes som en indirekte måde at bestemme antallet af parasitter på. Det forventes, at væksten vil blive hæmmet i nærværelse af en trypanocidal forbindelse, hvilket fører til et lavere antal parasitter sammenlignet med den ubehandlede kontrol, hvilket vil afspejles i en lavere β-galactosidaseaktivitet og derfor lavere absorbans.

  1. Inkuber parasitterne med BZN.
    1. Der tilsættes 100 μL tilsvarende 2x BZN-opløsning pr. brønd for at nå en endelig koncentration af BZN på 80, 40, 20, 10, 5 og 2,5 μM til 100 μL epimastigotespension (fra trin 2.1), Veroceller med amastigotes (2 dage efter infektion) (trin 2.2) eller trypomastigotes (trin 2.3) i en 96-brøndplade.
    2. Epimastigoterne inkuberes ved 28 °C i 72 timer, og trypomastigotes eller inficerede Vero-celler med amastigotes i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
      BEMÆRK: Hver lægemiddelkoncentration skal evalueres mindst i tre eksemplarer og omfatte kontrolkulturer af epimastigotes, trypomastigotes og inficerede Vero-celler med DMSO (se trin 1.2.2.4).
  2. Kolorimetrisk reaktion
    1. Efter behandlingsinkubationsperioden, hvis inficerede Vero-celler eller trypomastigotes er i DMEM med phenolrød, skal mediet udskiftes med 100 μL 1x PBS for at undgå interferens. Der udføres tredobbelte tomme huller, der kun indeholder 100 μL tilsvarende medium (eller 1x PBS alt efter hvad der er relevant).
      BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at fjerne kulturmediet for epimastigotes i tilfælde af LIT-medium eller DMEM uden phenolrødt. DMEM med phenolrød kan stadig bruges; forbered en tom brønd med DMEM alene for at måle basisabsorbansen, og træk derefter denne værdi under dataanalyse (trin 3.3.). Schneiders insektmedium, som er farveløst, er et alternativ til epimastigotes.
    2. Der tilsættes 40 μL CPRG-substratopløsning og 10 μL vaskemiddelopløsning til hver brønd, hvorved der opnås en slutkoncentration på 200 μM CPRG og 0,1 % vaskemiddel i et slutvolumen på 250 μL i hver brønd.
      BEMÆRK: CPRG-opløsningen og vaskemidlet kan tilsættes i et slutvolumen på 50 μL pr. Brønd.
    3. Der inkuberes ved 37 °C i 2 timer, og absorbansen måles ved 595 nm i et mikropladespektrofotometer.
      BEMÆRK: Den forventede farveændring er gul til rødbrun ved β-galactosidase enzymatisk spaltning (figur 2A). Inkubationstiden kan forlænges op til 4 timer, og absorbansspektrene af chlorophenolrød kan aflæses mellem 570 og 595 nm med lignende kurvefittings (supplerende figur S1A,B). Inkubation i op til 24 timer i nærværelse af CPRG-substrat har vist lignende kurvefittings (supplerende figur S1C).
      1. I et mikropladespektrofotometer med en monokromatorvælger skal du oprette en ny protokol i udstyrssoftwaren (supplerende figur S2).
      2. Klik på Absorbans som detektionsmetode | Slutpunkt som læsetype | Ok (supplerende figur S2A). Tilføj et læsetrin, skriv den valgte bølgelængde, og klik på Ok (supplerende figur S2B).
      3. I afsnittet Pladelayout skal du markere de brønde, der skal læses, og klikke på Ok (supplerende figur S2C). For at læse pladen skal du indsætte den i bakken og klikke på Læs plade. Vent på, at værdierne vises på skærmen (supplerende figur S2D), og eksporter dem til et regneark for at analysere resultaterne.
  3. Beregning af dataanalyse og mediehæmmerkoncentration (IC50)
    1. Træk den tomme målte værdi, der kun svarer til LIT-medium, 1x PBS eller DMEM med eller uden phenolrød plus CPRG-vaskemiddelopløsningen. Når man tester trypanocidalaktiviteten af farvede forbindelser, måles absorbansen af yderligere blindkontroller med LIT eller DMEM med hver anvendt koncentration af lægemiddel og trækker derefter disse værdier fra absorbansværdierne opnået med parasitterne ved hver koncentration.
      BEMÆRK: Supplerende tabel S2 viser typiske værdier opnået i dette assay med disse medier uden parasitter plus CPRG-vaskemiddelopløsning. Forskellene før og efter tilsætning af CPRG er signifikante, men forstyrrer ikke analysen med parasitter (supplerende tabel S2).
    2. I statistisk analysesoftware skal du plotte koncentrationen af BZN (i μM) versus absorbansen ved 595 nm i en xy-tabel. Transformer BZN-koncentrationerne til logaritmiske værdier ved at klikke på knappen Analyser, vælge indstillingen Transformer | transformere x-værdierne ved hjælp af x = log (x) og klikke på Ok knap.
    3. Hent IC50-værdierne fra den statistiske analysesoftware.
      BEMÆRK: IC50 er defineret som lægemiddelkoncentrationen, der reducerer parasitvæksten med 50% sammenlignet med den ubehandlede kontrol og beregnes som bøjningspunktet for den sigmoidale funktion, der passer til kurven.
      1. I den statistiske analysesoftware skal du klikke på knappen Analyser , vælge Ikke-lineær regression (kurvepas) på xy-analyselisten og klikke på Ok.
      2. I modelfanen i vinduet Parametre i dosis-respons-inhiberingsgruppen af indbyggede ligninger skal du vælge optionen dosis-respons-metode: log (inhibitor) vs. respons - Variabel hældning (fire parametre). Lad alle de andre faner være ved standardværdier; klik på Ok.
      3. Klik på resultatafsnittet i den statistiske analysesoftware for at finde IC50-værdien, SD og pasformens godhed.
      4. Klik på grafafsnittet for at finde xy-grafen for den logaritmiske koncentration af lægemidlet versus absorbansværdierne . Se efter kurvetilpasningen er også tegnet i en anden farve.
        BEMÆRK: Et gratis online IC50 beregningsværktøj kan findes på https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter den ovenfor beskrevne protokol blev β-galactosidase-ekspressive Dm28c epimastigotes inkuberet med 6 koncentrationer af BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (eller forbindelser af interesse) i 72 timer. Efter denne periode blev CPRG-reagens tilsat sammen med vaskemiddel, som lyser cellerne og frigiver β-galactosidase. CPRG spaltes af β-galactosidase for at producere chlorophenolrød, hvilket fører til en farveændring fra gul til rødlig (figur 2A). Chlorophenolrød blev målt ved at aflæse absorbansen ved 595 nm i en mikropladelæser efter 2 timer. En XY-tabel blev plottet med de logaritmiske koncentrationer af BZN versus absorbansen ved 595 nm. Plottet blev monteret ved hjælp af ikke-lineær regression (figur 2B). I dette særlige eksperiment var IC50 opnået for epimastigotes 20,59 ± 1,075 μM, svarende til den, der blev opnået fra litteraturen (tabel I)16,17. Repræsentative resultater ved hjælp af denne metode til trypomastigotes og amastigotes er blevet beskrevet tidligere13.

Figure 2
Figur 2: Beregning af IC50-værdi af benznidazol for epimastigoteform Dm28c. (A) En 96-brøndplade med epimastigotes behandlet med forskellige BZN-koncentrationer (2,5, 5, 10, 20, 40 og 80 μM) før tilsætning af CPRG (1), efter første tilsætning af CPRG og vaskemiddel (2) og efter inkubation med CPRG og vaskemiddel, der viser farveændringen (3). (B) XY-plot af de logaritmiske koncentrationer af BZN versus absorbans (OD) ved 595 nm for Dm28c/pLacZ epimastigotes. Plottet blev monteret ved hjælp af ikke-lineær regression for at estimere IC50-værdien . Hver værdi repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen (fejllinjer) for 6 uafhængige biologiske replikater. Den kontinuerlige blå linje repræsenterer kurvetilpasningen. Forkortelser: CPRG = chlorophenol rød β-D-galactopyranosid; BZN = benznidazol; OD = optisk tæthed; C = kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

BZN IC50 (μM) beregnet ved hjælp af Dm28c, der udtrykker β-galactosidase BZN IC50 (μM) rapporteret i litteraturen
Epimastigotes 17.08 til 20.59 11 til 18.72
Amastigotes 2.31 til 3.92 1.66 til 4.39
Trypomastigotes 27.07 til 44.74 24.68 til 50.72

Tabel 1: Interval af IC50-værdier opnået for epimastigotes, trypomastigotes og amastigotes ved hjælp af denne protokol sammenlignet med IC50 rapporteret i litteratur17,18.

Supplerende figur S1: Opsætning af mikropladelæsersoftwaren til læseabsorbans. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: β-galactosidase aktivitetsmålinger (optisk densitet ved 570 til 595 nm) ved hjælp af epimastigotes fra Dm28c / pLacZ-linjen af Trypanosoma cruzi efter inkubation med CPRG på forskellige tidspunkter. Værdier udtrykkes som middel- og standardafvigelse for tre uafhængige replikater. Farvede kontinuerlige linjer repræsenterer kurvetilpasningen. (A) Inkubation med 200 μM CPRG i 2 timer. (B) Inkubation med 200 μM CPRG i 4 timer. (C) Repræsentation af β-galactosidaseaktivitet (optisk densitet ved 570 nm) på forskellige tidspunkter (2, 4 og 24 timer). Forkortelse: CPRG = chlorophenol rød β-D-galactopyranosid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Sammensætning og fremstilling af LIT-medium, hemin og PBS. Forkortelser: LIT = Leverinfusion Tryptose; PBS = fosfatbufferet saltvand. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S2: Absorbansaflæsninger for LIT- og DMEM-medier uden parasitter. Værdier udtrykkes som tre eksemplarer af hvert medium; medierækken indeholder middelværdien af de tre replikater og SD-rækken indeholder standardafvigelsesværdierne for replikaterne. Forkortelser: SD = Standardafvigelse; LIT = Leverinfusion Tryptose; DMEM = Dulbeccos modificerede Eagle Medium. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver et assay baseret på bestemmelse af den cytoplasmatiske β-galactosidaseaktivitet frigivet på grund af membranlyse af T. cruzi epimastigotes, trypomastigotes eller inficerede celler med amastigotes i nærværelse af substratet CPRG. Vi brugte T. cruzi Dm28c /pLacZ parasitter, en stabil parasitstamme opnået efter transfektion med et β-galactosidase-bærende plasmid konstrueret af Buckner og medforfattere10. Dette assay er blevet brugt til at søge efter antitrypanocidale forbindelser 12,19,20,21. T. cruzi Dm28c/pLacZ-stammen blev brugt til at optimere screeningsprotokollen. Som opsummeret i figur 1 har denne protokol fire hovedpunkter; den første er parasitsåning i 96-brøndplader. Epimastigotes og trypomastigotes tælles og podes fra en suspension. I tilfælde af amastigotes, først frø Vero celler til at danne en vedhæftende monolag og derefter inficere med trypomastigotes. Amastigotes er til stede inde i cellerne efter 48 timer. For det andet forberede fortyndinger af lægemidlet, der skal testes i de ønskede koncentrationer og inkuberes med parasitterne. Endelig involverer det tredje trin tilsætning af CPRG og vaskemiddel til belysning af cellerne. CPRG spaltes ved β-galactosidase-frigivelse fra parasitcytoplasmaet, og chlorophenolrød genereres og måles spektrofotometrisk. Det fjerde kritiske trin involverer dataanalyse, konstruktion af x-y-grafer og tilpasning af kurven opnået til beregning af IC50-værdierne for de interessante lægemidler.

Et in vitro-assay for alle livscyklusfaser af T. cruzi er det første skridt i at studere virkningerne af et potentielt nyt lægemiddel. I disse assays evalueres virkningerne ved mikroskopisk tælling, en tidsdyr og subjektiv procedure, der er vanskelig at automatisere. Substitutionen af denne teknik med et kolorimetrisk assay kan forbedre objektiviteten af screeningen, hvilket også gør det mindre tidskrævende. Den kolorimetriske pladeaflæsning tager kun et par minutter i modsætning til de timer, der kræves til arbejdskrævende manuel mikroskopisk tælling, og letter screeningen af store biblioteker af nye forbindelser med potentiel terapeutisk værdi. Med hensyn til den overordnede lighed mellem de β-galactosidase-ekspressive parasitter (Dm28c/ pLacZ) sammenlignet med vildtype Dm28c-stammen, fastslog vi, at parasitterne var morfologisk normale med lignende vækstrater og differentierede ligeligt inden for livscyklusformerne. Desuden viste de opnåede lægemiddeltestresultater, der sammenlignede vildtypen Dm28c og Dm28c/pLacZ-linjen kvantificeret ved mikroskopisk tælling, ingen signifikante forskelle13.

En begrænsning af denne protokol er, at farvede kulturmedier kan forstyrre den målte absorbans. DMEM (eller RPMI) uden phenolrød anbefales at overvinde denne begrænsning. En blank brønd med DMEM blev med succes anvendt som en basal absorbansværdi i denne protokol. En anden begrænsning er den formodede interferens ved brug af farvede lægemidler, som kunne overvindes ved hjælp af medier med forbindelsen som et tomt eller ved at vælge absorbansbølgelængden mellem 570 og 595 nm for at give den laveste interferens. CPRG ændres ikke af tilstedeværelsen af et givet lægemiddel (farvet eller ej), hvilket gør dette assay ret robust. Ved anvendelse af medier med phenolrøde eller farvede lægemidler er det afgørende at udføre blanke kontroller for hver tilstand og derefter trække absorbansværdien opnået fra målingerne med parasitter for at undgå interferens.

Koncentrationen af CPRG-opløsning rapporteret for T. cruzi trypomastigotes og Toxoplasma gondii er 100 μM10,15. Den optimale koncentration, der er rapporteret for epimastigotes, er imidlertid 200 μM11. I denne Dm28c/pLacZ-linje blev en 200 μM CPRG-opløsning anvendt til epimastigotes, trypomastigotes og amastigotes med pålidelige resultater. Med hensyn til CPRG-inkubationstider blev den bedste kurvetilpasning opnået, når epimastigotes blev inkuberet med substratopløsningen i 2 timer (R2 = 0,9995). R2 var imidlertid meget ens (R2 = 0,9994), og β-galactosidaseaktivitet var lineær i området 6.250-200.000 epimastigotes pr. brønd (dvs. 62.500-2.000.000 epimastigotes / ml) ved 4 timer (supplerende figur S2). Et lineært interval på 3.150-100.000 trypomastigotes pr. brønd (dvs. 31.500-1.000.000 trypomastigotes/ml) blev rapporteret for trypomastigotes13. For at undgå at observere store standardafvigelser er det vigtigt at frø den korrekte mængde parasitter i hver brønd. Da mængderne er små, er det vigtigt at være konsekvent, når man tæller parasitterne før såning. Endvidere kunne der måles mere end tre replikater for hver eksperimentel tilstand, hvis det var nødvendigt.

I modsætning til andre kolorimetriske screeningsassays22 er efterfølgende manipulationstrin ikke nødvendige her, hvilket øger reproducerbarheden og pålideligheden af analysen samt dataindsamlingshastigheden. Dette er et nemt, hurtigt og pålideligt assay, der er egnet til screening af lægemidler med høj kapacitet af kandidatforbindelser til ChD-behandling og kan anvendes på andre T. cruzi-stammer . pLacZ-plasmidet er tilgængeligt efter anmodning fra Bucker-laboratoriet og kan bruges til at transfektere resistente stammer af for eksempel knockout-linjer for at evaluere linjens følsomhed over for forskellige lægemidler i forskellige genetiske baggrunde. Det eneste kritiske punkt, der skal huskes, er, at knockout-plasmiderne skal have en anden antibiotikaresistensmarkør end pLacZ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Buckner for venligt at levere pLacZ plasmid. Dette arbejde blev støttet af Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva fra Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) og Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art blev brugt til at producere figur 1 (https://smart.servier.com).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Tags

Biokemi udgave 177
<em>In vitro</em> Lægemiddelscreening mod alle livscyklusfaser af <em>Trypanosoma cruzi</em> ved hjælp af parasitter, der udtrykker β-galactosidase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, … More

Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter