Summary
In diesem Protokoll wird ein biomimetischer Mikrofluid-Assay, der eine physiologisch relevante mikrovaskuläre Umgebung reproduzieren und die gesamte Leukozyten-Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren kann, eingesetzt, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen bei entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen.
Abstract
Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen Erkrankungen wie Sepsis. Während der Entzündung kann eine übermäßige Migration von aktivierten Leukozyten über das vaskuläre Endothel in Schlüsselorgane zu Organversagen führen. Ein physiologisch relevanter biomimetischer mikrofluidischer Assay (bMFA) wurde entwickelt und validiert unter Verwendung verschiedener experimenteller und rechnerischer Techniken, die die gesamte Leukozyten-Roll-/Adhäsions-/Migrationskaskade reproduzieren können, um die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten-Endothelzellen zu untersuchen. Mikrovaskuläre Netzwerke, die aus In-vivo-Bildern bei Nagetieren gewonnen wurden, wurden mit einem GIS-Ansatz (Geographic Information System) digitalisiert und mit Polydimethylsiloxan (PDMS) auf einem Objektträger mikrofabriziert. Um den Einfluss von Scherrate und vaskulärer Topologie auf Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen zu untersuchen, wurde ein CFD-Modell (Computational Fluid Dynamics) entwickelt, um eine entsprechende Karte der Scherraten und Geschwindigkeiten im gesamten Netzwerk zu erstellen. Die bMFA ermöglicht die Quantifizierung von Leukozyten-Endothelzellen-Interaktionen, einschließlich Rollgeschwindigkeit, Anzahl der anhaftenden Leukozyten als Reaktion auf unterschiedliche Scherraten, Anzahl der migrierten Leukozyten, Endothelzellpermeabilität, Adhäsionsmolekülexpression und anderer wichtiger Variablen. Darüber hinaus bietet bMFA durch die Verwendung von humanbezogenen Proben wie menschlichen Endothelzellen und Leukozyten ein Werkzeug für das schnelle Screening potenzieller Therapeutika, um ihre klinische Übersetzbarkeit zu erhöhen.
Introduction
Entzündung ist die Reaktion des Wirts auf Infektionen und Verletzungen, und das Endothel spielt eine wichtige Rolle bei der Entzündungsreaktion 1,2,3. Entzündliche Dysregulation ist die zugrunde liegende Ursache für eine Reihe von Krankheitspathologien wie Sepsis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen, Krebs und COVID-19. Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen spielen bei diesen entzündlichen Erkrankungen eine zentrale Rolle. Während der Entzündung aktiviert die Freisetzung von PAMPS (pathogen-assoziierte molekulare Muster) aus Krankheitserregern oder DAMPS (schadensassoziierte molekulare Muster) aus verletztem Gewebe Immunzellen, um Zytokine/Chemokine und andere proinflammatorische Mediatoren freizusetzen, die zur Aktivierung von Endothel führen, was zu Veränderungen der vaskulären Endothelbarrierefunktion und erhöhter Permeabilitätführt 3,4 . Eine erhöhte Aktivierung von Endothelzellen während einer Entzündung führt zu einer verstärkten Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen, was zu einer übermäßigen Migration aktivierter Leukozyten über das vaskuläre Endothel in Schlüsselorganeführt 1,5,6,7.
Die Rekrutierung von Leukozyten wird durch chemisch vielfältige Chemoattraktantien eingeleitet, die aus bioaktiven Lipiden, Zytokinen, Chemokinen und Komplementkomponenten bestehen 8,9. Die Leukozytenrekrutierung ist ein mehrstufiger Prozess, der fünf diskrete Schritte umfasst: 1) Leukozytenmarge und -einfang / -bindung, 2) Rollen, 3) fester Arrest, 4) Ausbreitung und Crawling und 5) Extravasation / Migration (Abbildung 1). Jeder Schritt dieses Prozesses erfordert ein Übersprechen zwischen Leukozyten und Endothelzellen, um dieses dynamische Phänomen zu orchestrieren1,9. Letztendlich extravasieren festsitzende Leukozyten über das Endothel hinaus zu entzündetem Gewebe über einen mehrstufigen Prozess, der durch gleichzeitige chemoattraktorabhängige Signale, Klebeereignisse und hämodynamische Scherkräfte 1,9,10,11,12 gesteuert wird.
Angesichts der zentralen Rolle der Scherspannung bei der Regulierung der Endothelzellfunktion und der Bedeutung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen13 wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere In-vitro-Modelle entwickelt, um verschiedene Aspekte der Leukozytenmigrationskaskade in einer kontrollierteren Umgebung zu untersuchen14. Traditionelle fluidische Geräte zur Untersuchung von Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen können in zwei große Kategorieneingeteilt werden 14: a) Vorrichtungen zur Untersuchung des Leukozytenrollens, der Adhäsion und der Adhäsionsmolekülexpression wie parallele Plattenflusskammern und b) Vorrichtungen zur Untersuchung der Leukozytenmigration unter statischen Bedingungen wie Transwell-Kammern. Systeme wie parallele Plattenströmungskammern wurden verwendet, um die Rolle von Adhäsionsmolekülen und ihren Liganden in der Adhäsionskaskade unter Scherkräften15 zu untersuchen. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch, dass diese vereinfachten, idealisierten Geräte (z. B. gerader Kanal) nicht in der Lage sind, den Maßstab und die Geometrie der In-vivo-Mikrovaskulatur (z. B. aufeinanderfolgende Gefäßverzweigungen, Gefäßmorphologie) und die daraus resultierenden Strömungsbedingungen (z. B. konvergierende oder divergierende Strömungen bei Bifurkationen) zu reproduzieren. Infolgedessen können diese Geräte nur die Adhäsion, aber nicht die Transmigration modellieren. Transwell-Kammern können die Transmigration nur unter statischen Bedingungen untersuchen, ohne die in vivo geometrischen Eigenschaften und Strömungsbedingungen zu berücksichtigen. Daher ahmen diese traditionellen Modelle nicht die Mikroumgebung lebender Gewebe nach oder lösen Adhäsions- und Migrationskaskade in einem einzigen Assay6 auf.
Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir einen neuartigen biomimetischen 3D-mikrofluidischen Assay (bMFA) entwickelt und umfassend validiert (Abbildung 2), der in vivo mikrovaskuläre Netzwerke auf einem Chip16,17,18 realistisch reproduziert. Das Protokoll zur Mikrofabrikation dieses Gerätes wurde bereits17 veröffentlicht und wird hier nur kurz beschrieben. Die Mikrovaskulatur des Maus-Cremaster-Muskels wurde mit einem modifizierten GIS-Ansatz (Geographic Information System)19 digitalisiert. Dann wurde das synthetische mikrovaskuläre Netzwerk auf Polydimethylsiloxan (PDMS) mittels Soft-Lithographie-Verfahren basierend auf dem digitalisierten mikrovaskulären Netzwerk 14,17,20,21,22 erzeugt. Kurz gesagt, die digitalisierten Netzwerkbilder wurden auf Mylar-Film gedruckt, der dann als Maske verwendet wurde, um einen SU-8-positiven Fotolack auf einem Siliziumwafer zu mustern, um die Master für die Herstellung zu erstellen. Mikrofabrizierte Säulen (10 μm Durchmesser, 3 μm hoch) wurden verwendet, um die 3 μm hohen und 100 μm breiten Poren zu erzeugen, eine optimale Größe für die Leukozytenmigration23,24,25, die die Gefäßkanäle und Gewebekompartimente verbinden. PDMS wurde nach Herstellerangaben vorbereitet und über die entwickelten Master gegossen. Darüber hinaus wurde das PDMS entgast und über Nacht in einem Ofen (65 °C) aushärten gelassen, um komplementäre Mikrokanäle in PDMS zu erzeugen. Anschließend wurde das ausgehärtete PDMS vom SU-8-Master abgezogen, gefolgt von Stanzanschlüssen für Ein- und Ausgänge. Dann wurde das PMDS mit einem Glasobjektträger mit Plasma verbunden. Die Oberfläche des mikrofluidischen Bauelements besteht aus nativem Glas und PDMS. Um die Zellanlagerung, -ausbreitung und -proliferation zu fördern, ist eine extrazelluare Matrixbeschichtung (ECM) erforderlich. Der bMFA umfasst ein mikrovaskuläres Netzwerk und ein Gewebekompartiment, das über 3 μm hohe und 100 μm breite Poren verbunden ist (Abbildung 2). Dieses mikrofluidische System reproduziert die gesamte Leukozytenadhäsions-/Migrationskaskade in einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung eines vollständigen mikrovaskulären Netzwerks mit miteinander verbundenen Gefäßen und Verzweigungen, einschließlich Zirkulation, Randbildung, Rolling, Adhäsion und Migration von Leukozyten in das extravaskuläre Gewebekompartiment in einem einzigen System 14,16,17,21,26.
Es sollte beachtet werden, dass selbst wenn die Durchflussrate am Einlass von bMFA fest ist, die Strömungsbedingungen im Netzwerk an verschiedenen Stellen variieren und nicht mit einer einfachen mathematischen Formel berechnet werden können. Ein auf Computational Fluid Dynamics (CFD) basierendes Modell wurde entwickelt, um verschiedene Strömungsparameter (z. B. Schubspannung, Schubgeschwindigkeit, Geschwindigkeit) an verschiedenen Stellen im Netzwerk zu berechnen. Dieses CFD-Modell wurde verwendet, um die Farbstoffperfusionsmuster und Durchflussparameter in der bMFA zu simulieren. Die Kreuzvalidierung mit experimentellen Ergebnissen deutete darauf hin, dass die Strömungswiderstände im gesamten Netzwerk vom Berechnungsmodell gut vorhergesagt werden (Abbildung 3)17. Dieses CFD-Modell wurde dann verwendet, um die Geschwindigkeit und das Schubratenprofil in jedem Behälter von bMFA zu schätzen (Abbildung 4), was eine Analyse der Auswirkungen von Scherfluss und Geometrie auf das Walzen, die Adhäsion und die Migration von Leukozytenermöglichte 16. Leukozyten haften bevorzugt in der Nähe von Bifurkationen und in Regionen mit geringer Scherung in vivo, und diese räumlichen Muster der Leukozytenadhäsion wurden in bMFA unter Verwendung von Neutrophilen erfolgreich nachgewiesen (Abbildung 5)16. Dieses Papier beschreibt das Protokoll zur Vorbereitung von bMFA zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion unter entzündlichen Bedingungen unter Verwendung von humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HLMVEC) und menschlichen Neutrophilen. Mikrophysiologische Systeme, wie die bMFA, können verwendet werden, um Endothelzellinteraktionen mit verschiedenen Zelltypen wie Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten und Tumorzellenzu untersuchen 18,27,28,29,30. Der bMFA kann mit primären Endothelzellen aus verschiedenen Organen (z. B. Lunge vs. Gehirn) und verschiedenen Spezies (z. B. menschliche vs. murine Endothelzellen) sowie mit Endothelzelllinien21,27,31,32 gesät werden. Der bMFA kann verwendet werden, um multiple zelluläre Reaktionen, Zell-Zell-Interaktionen, Barrierefunktion, Arzneimittelabgabe und Arzneimitteltoxizität zu untersuchen.
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Protocol
Heparinisiertes menschliches Blut wird zur Neutrophilenisolierung von gesunden erwachsenen Spendern (Männer und Frauen im Alter zwischen 21 und 60 Jahren) nach Einverständniserklärung, wie vom Institutional Review Board der Temple University (Philadelphia, PA, USA) genehmigt, gewonnen.
1. Grundierung und Beschichtung des Geräts mit humanem Fibronektin
HINWEIS: Der bMFA verfügt über zwei Einlassanschlüsse und zwei Auslassanschlüsse, die mit dem Gefäßfach verbunden sind. Es hat auch einen Anschluss, der mit dem Gewebefach verbunden ist (Abbildung 2).
- Führen Sie Schläuche (O.D. von 0,06" und I.D. von 0,02") (Tabelle des Materialss) in alle Anschlüsse mit Ausnahme eines Einlassanschlusses mit Feinpunktzange ein. Klemmen Sie die beiden Auslassöffnungen und den Gewebefachanschluss mit Kieferklemmen ein. Stellen Sie sicher, dass jeder Schlauch ~ 1 Zoll lang ist.
- Humanes Fibronektin mit PBS aus Fibronektin-Stammlösung (1 mg/ml) auf 100 μg/ml verdünnen. Laden Sie eine 1-ml-Spritze mit vorbereiteter Fibronektinlösung. Schließen Sie die Spritze an eine 24 G stumpfe Nadel und einen ~ 4 Zoll langen Schlauch an.
HINWEIS: Um eine Vernetzung zu verhindern, übermischen / pipettieren Sie menschliches Fibronektin. Andere extrazelluläre Matrizen (ECM) wie Kollagen können für verschiedene Zelltypen verwendet werden. - Führen Sie den Schlauch in den offenen Einlassanschluss ein, drücken Sie den Kolben, bis menschliches Fibronektin aus dem anderen Einlassanschluss kommt, und klemmen Sie ihn dann ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Rest der Ports, bis alle Kanäle, das Gewebefach und der Schlauch mit der menschlichen Fibronektinlösung gefüllt sind. Entfernen Sie die Nadel, aber halten Sie den 4 Zoll langen Schlauch eingelegt und ungeklemmt.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schlauch mit Fibronektin gefüllt ist, bevor er eingespannt wird. - Zum Entgasen schließen Sie den ungespannten Schlauch über den pneumatischen Primer an einen komprimierten Stickstofftank an, stellen den Druck auf ~ 5 psi ein und laufen für ~ 15 min.
- Überprüfen Sie nach 15 Minuten unter dem Mikroskop, ob keine Luftblasen im Gerät eingeschlossen sind. Wenn im Kanal oder Gewebefach Luftblasen eingeschlossen sind, schließen Sie das Gerät zur erneuten Entgasung wieder an den pneumatischen Primer an, d. h. wiederholen Sie Schritt 1.4.
HINWEIS: Das inverse Mikroskop wird in allen Schritten der Mikroskopie in diesem Protokoll verwendet. - Entfernen Sie das Gerät aus der pneumatischen Grundierung. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 °C für 1 h und spülen Sie dann alle Kanäle und das Gewebefach mit vorgewärmten HLMVEC-Kulturmedien (Table of Materials), ähnlich wie in Schritt 1.3. Der bMFA ist nun bereit für die Zellaussaat.
HINWEIS: Bevor Sie einen Schlauch aus dem Anschluss entfernen/einsetzen, legen Sie zunächst einen Wassertropfen mit einer Pipette um die Basis des Einlassrohrs, um zu verhindern, dass Luft in das Gerät gelangt.
2. Aussaat von bMFA mit HLMVEC
- Kultur HLMVEC zu 60% - 80% Konfluenz gemäß dem Protokoll des Anbieters in einem T-25-Kolben.
- Aspirieren Sie HLMVEC-Nährmedien aus dem Zellkulturkolben. Zweimal mit PBS waschen.
- 2 ml vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung (37 °C) in den T-25-Kolben geben. 3-5 min in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2) inkubieren, bis sich die meisten Zellen vom Kolben gelöst haben.
HINWEIS: Die Inkubationszeit kann für verschiedene Zelltypen und die Trypsin-EDTA-Konzentration variieren. - Geben Sie 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung (TNS, 37 °C) in den Kolben, um Trypsin-EDTA zu neutralisieren.
- Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie dann die Zellsuspensionslösung in ein 15 ml konisches Rohr.
- Zentrifuge für 5 min bei 150 x g , um die Endothelzellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml Zellkulturmedien. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
- Zentrigieren Sie erneut für 5 min bei 150 x g , um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen auf die gewünschte Aussaatdichte von 20 x 106 / ml.
HINWEIS: Abhängig von den Zelltypen und der Konfluenz können etwa 2 x 10 6 Endothelzellen aus zwei T-25-Kolben gesammelt werden, und mit der Aussaatdichte von 20 x 10 6 / ml reichen 100 μL der Zellsuspension (2 x 10 6 Endothelzellen) aus, um 5 Geräte zu säen. - Montieren Sie eine 1-ml-Spritze in die programmierbare Spritzenpumpe, befestigen Sie den Schlauch an der stumpfen Nadel.
- Ziehen Sie ~ 20 μL der Zellsuspension in den Schlauch und stellen Sie sicher, dass sich die Zellsuspension nur im Schlauch befindet, nicht im Spritzenfass.
- Nehmen Sie die Klemme von einem Auslassanschluss des Geräts ab. Schließen Sie den Schlauch an einen Einlass des Geräts an. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Kanal eingeführt werden.
- Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 4-8 μL/min. Beobachten Sie das Gerät unter einem Mikroskop.
- Wenn die Kanäle mit Zellen gefüllt sind, stoppen Sie die Pumpe, klemmen Sie den Auslass ein und schneiden Sie den Einlassschlauch ab.
HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Luftblasen in das Gerät einzubringen. - Stellen Sie das Gerät für 4 h bei 5% CO2 und 37 °C in den Inkubator.
- Nach 4 h Inkubation eine weitere Spritze vorbereiten, die mit frischen Zellkulturmedien gefüllt ist. Montieren Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe, schließen Sie die Spritze an den Einlassanschluss an und entfernen Sie die Klemme von einem Auslassanschluss.
- Lassen Sie frische Medien für ca. 5 Minuten mit 4-8 μL/min durch das Gerät laufen, um schwimmende/nicht angeschlossene Zellen auszuwaschen.
3. Zellkultur unter Strom für 48 h
- Bereiten Sie eine Spritze vor, die mit frischen Zellkulturmedien gefüllt ist. Montieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe, schließen Sie die Spritze an einen Einlassanschluss an und halten Sie einen Auslass offen. Stellen Sie das Gerät in den Inkubator (5% CO2, 37 °C).
- Programmieren Sie die Spritzenpumpe zur Kultivierung von Endothelzellen unter Durchfluss mit den folgenden Anweisungen in Tabelle 1.
- Überprüfen Sie bMFA unter dem Mikroskop nach 48 h Kultur unter dem Fluss. HLMVEC sollte Gefäßkanäle abdecken, die ein vollständiges Lumen bilden (Abbildung 6).
HINWEIS: Für verschiedene Zelltypen können andere Durchflussregime erforderlich sein.
4. Zytokin und/oder therapeutische Behandlung
HINWEIS: Als Beispiel beschreibt dieser Abschnitt die Verwendung von bMFA zur Untersuchung der Auswirkungen der Behandlung der Zellen mit Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und einem neuartigen entzündungshemmenden Inhibitor (Protein Kinase C delta-TAT peptide inhibitor, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.
- Bereiten Sie drei verschiedene bMFA-Geräte mit dem obigen Protokoll vor (Abschnitt 1-3).
- Laden Sie drei 1-ml-Spritzen mit Zellkulturmedien (TNF-α) (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) bzw. PKCδ-i (5 μM).
HINWEIS: Zytokine werden in Zellkulturmedien rekonstituiert. - Verbinden Sie die drei Spritzen mit drei bMFA-Geräten. Behandeln Sie HLMVEC mit Puffer TNF-α oder TNF-α + Inhibitor für 4 h bei 0,1 μL/min.
HINWEIS: Basierend auf spezifischen Studienanforderungen können andere Zytokine oder Zytokincocktails (z. B. TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)) zur Behandlung von Endothelzellen verwendet werden.
5. Menschliche Neutrophilenisolation
- Verwenden Sie alle Reagenzien bei Raumtemperatur (RT). Zu den Reagenzien gehören Leukozyten-Isolationsmedien, 1x HEPES-Puffer mit Ca 2+/Mg2+ (Tabelle 2), 6% Dextran in normaler Kochsalzlösung (0,9% NaCl), 3,6% NaCl-Lösung und deionisiertes Wasser (DI) Wasser.
- Pippen Sie 20 ml Leukozyten-Isolationsmedien in ein 50 ml konisches Röhrchen und schichten Sie 25 ml Blut vorsichtig über die Leukozyten-Isolationsmedien. Zentrifuge für 40 min bei 427 x g bei RT.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt langsam und vorsichtig durch, um eine Vermischung der Blut- und Leukozytenisolationsmedien zu vermeiden. - Aspirieren Sie bis zu ~ 5 ml über der Schicht der roten Blutkörperchen (RBC). Die weiße Buffy-Schicht auf dem RBC besteht überwiegend aus Neutrophilen.
- Fügen Sie den HEPES-Puffer hinzu, um das aktuelle Volume zu verdoppeln (vorhandenes Volume: HEPES-Puffer = 1:1).
- Fügen Sie einen Betrag von 6% Dextran hinzu, der 20% des endgültigen Volumens entspricht. (aktuelles Volumen/4 = Volumen von hinzugefügten 6% Dextran).
- Drehen Sie die Röhre einige Male vorsichtig um, um sich gut zu vermischen und lassen Sie die RBC sedimentieren (~ 25 min).
- Pipettieren Sie vorsichtig die obere Schicht (neutrophilenreiche Schicht) und übertragen Sie sie in eine neue 50-ml-Röhre, achten Sie darauf, nicht mit sedimentiertem RBC zu kontaminieren.
- Zentrifuge für 10 min bei 315 x g bei RT. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 8 ml HEPES-Puffer.
- Um den Rest-RBC zu lysieren, fügen Sie 24 ml DI-Wasser hinzu und mischen Sie vorsichtig für 50 s. Sofort 8 ml 3,6%ige NaCl-Lösung hinzufügen, mischen und zentrifugieren Sie für 10 min bei 315 x g bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das Zellpellet mit 15 ml HEPES-Puffer und zentrifugieren Sie für 5 min bei 315 x g. Suspendieren Sie das Pellet im HEPES-Puffer.
6. Neutrophiles Adhäsions- und Migrationsexperiment mit bMFA
- Resuspendiert die isolierten menschlichen Neutrophilen (15 Millionen) in 999 μL HEPES-Puffer.
- 1 μL CFDA-SE (Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester) Farbstoff-Stammlösung (10 mM) in die Neutrophilensuspension geben, um eine Arbeitskonzentration von 10 μM CFDA-SE zu erhalten, und 10 min bei RT inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit HEPES-Puffer, indem Sie 5 min bei 315 x g zentrifugieren.
- Zählen Sie die Neutrophilen mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie bei 2 Millionen Neutrophilen / ml mit Zellkulturmedien, TNF-α (10 ng / ml) und TNF-α (10 ng / ml) + PKCδ-i (5 μM); vor Beginn des Experiments 15 Minuten bei RT inkubieren.
- Bereiten Sie eine Spritze vor, die mit 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), dem Chemoattraktor für die Studie, in Zellkulturmedien gefüllt ist. Nehmen Sie bMFA und öffnen Sie einen Einlassanschluss und einen Auslassanschluss.
HINWEIS: Diese experimentellen Bedingungen werden verwendet, um die Bedingungen der Sepsis nachzuahmen, die eine systemische Entzündungsreaktion mit hohen Spiegeln von zirkulierenden Zytokinen / Chemokinen beinhalten. Darüber hinaus wird fMLP, ein gramnegatives, von Bakterien abgeleitetes Peptid, verwendet, um das Vorhandensein von Bakterien in der Lunge (dh im Gewebekompartiment) zu modellieren. - Entfernen Sie den Gewebefach-Port-Schlauch und setzen Sie den fMLP-Schlauch ein. Injizieren Sie ~ 20 μL fMLP in das Gewebekompartiment für alle bMFA, mit Ausnahme des mit Zellkulturmedien allein behandelten. Schneiden Sie dann den Schlauch ab und klemmen Sie ihn ein.
- Füllen Sie die Spritze mit ~200 μL der Neutrophilensuspension und montieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe.
- Stellen Sie das Gerät auf die inverse Mikroskopstufe (Materialtabelle).
- Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 1 μL / min und warten Sie, bis ein kleiner Tropfen der Neutrophilensuspension aus dem Schlauch kommt. Stecken Sie den Schlauch in den Einlassanschluss. Siehe Abbildung 7 für die Einrichtung.
7. Bilder aufnehmen
- Verwenden Sie die Scan Large Image-Funktion in der Mikroskop-Bildanalysesoftware (Table of Materials), um die Adhäsionskarte in bMFA (Abbildung 8) 10 Minuten nach Beginn des Experiments zu erhalten. Die meisten Neutrophilen treten während der ersten 10 Minuten in bMFA ein.
HINWEIS: Lassen Sie das Fluoreszenzlicht ausgeschaltet, wenn Sie keine Bilder aufnehmen, um das Photobleichen zu reduzieren. - Nehmen Sie in der nächsten Stunde Zeitrafferbilder (1 Bild alle 5 Minuten) des Gewebekompartiments (Abbildung 8B, C) für die Migrationsanalyse auf, um die Migrationskarte zu erhalten.
8. Digitale Bildanalyse
- Für die Adhäsionskarte zählen Sie die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen in jedem Gefäß. Erstellen Sie für jede Bifurkation einen kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI) mit einem Durchmesser, der dem Zweifachen des Gefäßdurchmessers entspricht, und zählen Sie die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen.
- Verwenden Sie die manuelle Zählung oder die automatisierte Objektzählfunktion , um die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen in jedem Gefäß und jeder Verzweigungsregion zu quantifizieren.
- Verwenden Sie die Schubratenkarte des Netzwerks, die mit der CFD-Simulation17 generiert wurde, um die Scherrate in jedem Behälter zu bestimmen. Zeichnen Sie dann die Anzahl der anhaftenden Neutrophilen in einem gegebenen Gefäß gegen die Scherrate in diesem Gefäß auf, um eine Scherratenkarte in bMFA zu erstellen, wie in Abbildung 9A gezeigt.
- Neutrophile gelten als migriert, wenn sie das Endothel in das Gewebekompartiment durchquert haben. Zählen Sie die Anzahl der migrierten Neutrophilen bei 10 min, 15 min, 30 min und 60 min. Zeichnen Sie die Anzahl der migrierten Neutrophilen im Vergleich zur Zeit auf, wie in Abbildung 9B dargestellt.
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Representative Results
Nach 48 h Kultur unter Scherfluss in bMFA bedeckten Endothelzellen die Oberfläche der Gefäßkanäle in bMFA und richteten sich in Strömungsrichtung aus (Abbildung 6). Die konfokale Mikroskopie zeigte, dass alle Oberflächen der Gefäßkanäle von Endothelzellen bedeckt waren und ein vollständiges 3D-Lumen in bMFA18 bildeten.
Mit diesem Protokoll kann eine neutrophile Adhäsionskarte gewonnen werden, die zeigt, dass es eine signifikante Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen in bMFA gibt (Abbildung 8). Die Korrelation der räumlichen Verteilung von Neutrophilen in dieser Adhäsionskarte mit der aus dem CFD-Modell generierten Scherratenkarte zeigt, dass die Neutrophilenadhäsion scherabhängig ist und Neutrophile bevorzugt in Regionen mit niedriger Scherrate und Bifurkation haften (Abbildung 9A). Die Adhäsion von Neutrophilen an TNF-α-aktivierten Endothelzellen nahm signifikant zu. Die Analyse von Zeitrafferbildern zeigte, dass die TNF-α Aktivierung von Endothelzellen die Neutrophilenmigration als Reaktion auf den Chemoattraktor fMLP erhöht (Abbildung 9B). Wie bereits erwähnt, kann bMFA verwendet werden, um die Wirksamkeit eines neuartigen Therapeutikums zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen schnell zu testen. Zum Beispiel reduzierte die Behandlung von Endothelzellen und Neutrophilen mit PKCδ-i signifikant die Adhäsion und Migration von Neutrophilen (Abbildung 9A,B)27.
Abbildung 1: Endothelzellaktivierung während einer Entzündung . (A) Unter normalen Bedingungen ist das vaskuläre Endothel vom Glykokalyx bedeckt und bildet eine enge Barriere, die die Barrieredurchlässigkeit, die Leukozytenmigration und die entzündungshemmenden Abwehrkräfte reguliert. (B) Während der Entzündung werden Leukozyten und Endothelzellen durch PAMPS und DAMPS aktiviert, um Zytokine und Chemoattraktantien zu produzieren, was zu einer erhöhten Expression von Oberflächenmolekülen sowohl auf Leukozyten als auch auf Endothelzellen führt, wodurch die Leukozyten-Endothel-Interaktionen verstärkt werden. Interaktionen von E/P-Selektin auf Endothelzellen und ihre Liganden (z. B. PSGL-1) auf Leukozyten sind am Rollen beteiligt, was die Neutrophilen verlangsamt. Die feste Adhäsion wird durch Endothel-exprimierte Adhäsionsmoleküle, einschließlich ICAM-1, ICAM-2 und VCAM-1, und deren Liganden, β2-Integrine, reguliert. Als Reaktion auf Chemoattraktanzgradienten wandern anhaftende Leukozyten durch Endothelverbindungen, die durch PECAM-1 und JAMs reguliert werden. Aktivierte Leukozyten wandern ins Gewebe, wo sie Zytokine, reaktive Sauerstoff- / Stickstoffspezies und Proteasen freisetzen, um Infektionen zu bekämpfen. Eine fehlregulierte Leukozytenmigration kann jedoch das Organgewebe schädigen, was zu Organversagen führt. Während der Entzündung wird der Glykokalyx abgebaut, Endothelzell-Engstellen werden beschädigt und es kommt zu einer erhöhten Endothelzellapoptose, was zu einer beschädigten Barrierefunktion und einer erhöhten Permeabilität führt. Diese Figur wurde von Yang et al.2 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Überblick über den bMFA. (A) Bilder des Maus-Cremaster-Muskels werden erhalten und (B) mit dem GIS-System digitalisiert, um das Netzwerk auf PDMS herzustellen. (C) Das Hellfeldbild des bMFA-Netzwerks zeigt, dass bei bMFA Gefäßkanäle durch eine 3-μm-Barriere mit dem Gewebekompartiment verbunden sind (der schematische Einsatz in Panel C). Die Fließrichtung der Gefäßkanäle wird angegeben. (D) Ein bMFA-Chip, bestehend aus einer PDMS-Schicht, die mit einem Objektträger verbunden ist, befindet sich auf der Mikroskopstufe. Der Schlauch wird in zwei Einlassöffnungen, zwei Auslassanschlüsse und einen Gewebefachanschluss eingeführt. (C: Skalenbalken = 500 μm) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Transiente Perfusionsstudien, die experimentelle und Simulationsergebnisse in bMFA vergleichen. (A) Das Netzwerk von bMFA, das die Einlass-, Auslass- und Strömungsrichtung anzeigt. (B) Oberes Panel: CFD-Perfusionsprofile. Unterseite: Experimentelle Perfusionsprofile. Bilder sind pseudofarben, um Farbverläufe anzuzeigen. Die Skala wird mit Blau (keine Perfusion; 0) und Magenta (vollständige Perfusion; 1) normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Geschwindigkeits- und Scherratenprofil in bMFA aus CFD-Simulationen. (A) Verteilung der Geschwindigkeitsgrößen (Vmag) über das Netzwerk. (B) Die Verteilung der Scherrate zeigt heterogene Scherraten im Netz an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Neutrophile Adhäsionsmuster in bMFA ähneln neutrophilen Adhäsionsmustern in vivo. Die Verteilungen der Anzahl der in vivo anhaftenden Neutrophilen und der Anzahl der Neutrophilen in bMFA sind beide nach links verzerrt, was darauf hindeutet, dass Neutrophile bevorzugt in der Nähe von Bifurkationen haften, wobei der Peak bei einem Gefäß- oder Kanaldurchmesser von der nächsten Bifurkation (Mittelwert ± SEM; N = 3). Der Abstand der anhaftenden Neutrophilen zur nächsten Bifurkation wurde wie folgt normalisiert: Normalisierter Abstand = Abstand zum Zentrum der nächsten Bifurkation/Durchmesser des Kanals. Diese Zahl wurde von Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716) geändert, weitere Genehmigungen in Bezug auf das Material sollten an die American Chemical Society gerichtet werden). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Endothelzellen bilden im bMFA ein komplettes 3D-Lumen. (A) Phasenkontrastbilder zeigen, dass Endothelzellen in Fließrichtung aufgereiht sind. (B) Fluoreszenzbilder zeigen, dass Endothelzellen den Gefäßkanal bedecken; F-Aktin wird mit Phalloidin grün und Kerne mit Draq5 rot markiert. (A: Skalenstab = 100 μm, B: Skalenbalken = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Ein computergesteuertes inverses Fluoreszenzmikroskop wird verwendet, um neutrophile-endotheliale Wechselwirkungen in bMFA zu untersuchen. Eine computergesteuerte Stufe mit einem Wärmer wird verwendet, um den bMFA bei 37 °C zu halten. Der bMFA ist über den Schlauch mit einer programmierbaren Spritzenpumpe verbunden. Das inverse Fluoreszenzmikroskop ist mit einer Videokamera ausgestattet, um Bilder / Videos für die weitere Offline-Analyse auf dem Computer aufzunehmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Repräsentative Bilder der Neutrophilenadhäsions- und Migrationskarte. (A) Neutrophile Adhäsionskarte in bMFA. Das Bild wurde 10 Minuten nach Beginn des Experiments mit der Funktion "Große Karte scannen" der Nikon-Software aufgenommen. Die weißen Punkte in der Karte sind fluoreszierend markierte Neutrophile mit CFDA-SE. Die vaskuläre Kanalgrenze wird digital beschriftet (Skalenbalken = 100 μm). (B) Neutrophile Migrationskarte in bMFA ohne TNF-α Aktivierung. Das Bild wurde 60 Minuten nach Beginn des Experiments aufgenommen. (C) Neutrophile Migrationskarte in bMFA mit TNF-α-Aktivierung. Das Bild wurde 60 Minuten nach Beginn des Experiments aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Muster der neutrophilen Adhäsion und Migration bei bMFA während einer Entzündung. (A) Die Behandlung mit TNF-α erhöhte signifikant die Adhäsion menschlicher Neutrophilen an humanen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen, die nach der Behandlung mit einem PKCδ-Inhibitor gehemmt wurde. Neutrophile Adhäsion trat bevorzugt in Gefäßen mit geringer Scherrate und nahe Bifurkationen in bMFA auf. (B) Als Reaktion auf fMLP war die Migration menschlicher Neutrophilen über TNF-α aktivierte Endothelzellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen signifikant erhöht. Die Behandlung mit dem PKCδ-Inhibitor reduzierte die Migration auf unbehandelte Werte. n = 4, Mittelwert ± REM, Einweg-ANOVA, ** p < 0,01 und *** p < 0,001). Die Figur wurde von Soroush et al.27 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Schritt 1: Konstante Rate | Kommentare | |
| Modus | Eingießen | |
| Durchfluss | 1 μL/min | |
| Zeit | 10 Minuten | |
| Schritt 2: Verzögerung (kein Fluss) | ||
| Modus | Verzögerung | |
| Zeit | 4 Std. | |
| Schritt 3: Wiederholen | Schritt 1 und Schritt 2 werden 6 Mal wiederholt, bevor mit Schritt 4 fortgefahren wird. | |
| Modus | Wiederholen | |
| Wiederholen von | Schritt 1 | |
| Wiederholen | 6 mal | |
| Schritt 4: Konstanter Durchfluss | ||
| Modus | Eingießen | |
| Durchfluss | 0,1 μL/min | |
| Zeit | 48 Std. |
Tabelle 1: Spritzenpumpenprogramm
| Formel | Name | MW | Hinzufügen | Konzentration | 10x HEPES-Puffer (Fügen Sie DI-Wasser zu 1000 ml hinzu und stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein. Vor Gebrauch auf 1x verdünnen) |
| NaCl | Natriumchlorid | 58.44 | 87,66 g | 1,5 Mio. | |
| KOH | Kaliumhydroxid | 56.11 | 2,81 g | 50 mM | |
| Hepes | Hepes | 238.3 | 23,83 g | 100 mM | |
| MgCl2 | Magnesiumchlorid | 203.31 | 2,44 g | 12 mM | |
| CaCl2 | Calciumchlorid | 147.62 | 1,90 g | 12,9 mM |
Tabelle 2: Zusammensetzung des HEPES-Puffers
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Discussion
Der bMFA reproduziert die Topographie und die Strömungsbedingungen der in vivo mikrovaskulären Netzwerke und kann verwendet werden, um die Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen und die Endothelfunktion in vitro unter physiologisch realistischen Bedingungen zu untersuchen. In der Mikrovaskulatur von Maus oder Mensch ist die Geometrie der mikrovaskulären Netzwerke selbstähnlich und fraktal und die Reynolds-Zahl << 1, was darauf hindeutet, dass die Gefäßgeometrie die Strömungsmuster nicht signifikant beeinflusst. Daher kann die bFMA verwendet werden, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen für verschiedene Spezies, einschließlich Menschen, zu untersuchen, obwohl die Mikrovaskulatur des Maus-Cremaster-Muskels zur Herstellung von bMFA kartiert wurde.
Der bMFA ermöglicht die Echtzeitbewertung einzelner Schritte der Neutrophilenmigrationskaskade in einem einzigen Assay, einschließlich Rollen, fester Adhäsion, Ausbreitung und Migration von Neutrophilen in das Gewebekompartiment. Primäre menschliche Zellen und klinisch relevante Proben können in bMFA verwendet werden, um die Übersetzbarkeit zu erhöhen und potenzielle Therapeutika schnell zu screenen. Im Vergleich zu herkömmlichen fluidischen Systemen wie parallelen Plattendurchflusskammern hat bMFA den Vorteil, dass es weniger als 95% der Reagenzien37 verwendet, da es kleine Gefäßgrößen hat und die gesamte Neutrophilenmigrationskaskade in einem einzigen Assay untersuchen kann. Diese geringe Größe erfordert jedoch auch, dass Benutzer mit einer sehr kleinen Menge an Reagenzien arbeiten, was eine Herausforderung darstellen kann und umfangreiche Übung erfordert. Das häufigste Problem mit diesem Protokoll ist das Vorhandensein von Luftblasen in bMFA, die den Kanal blockieren und die Strömungsmuster verändern können. Daher sollte beim Entfernen oder Einsetzen von Schläuchen in die Anschlüsse große Vorsicht walten gelassen werden, und ein Wassertropfen muss an der Basis des Schlauches an den Anschlüssen platziert werden, um zu verhindern, dass Luft in den Kanal gelangt, wenn Schläuche aus bMFA entfernt werden.
Neben der Anwendung von bMFA zur Untersuchung neutrophil-endothelialer Interaktionen wurde die bMFA auch verwendet, um die Integrität des Endothels während einer Entzündung zu untersuchen, indem Variablen wie Permeabilität und transendothelialer Endothelwiderstand (TEER) gemessen wurden27. Darüber hinaus kann bMFA durch die Funktionalisierung von Mikropartikeln mit spezifischen Antikörpern verwendet werden, um die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellenzu untersuchen 27. Es wurde gezeigt, dass die Entzündungsreaktion auch durch andere Reize im bMFA, wie ionisierende Strahlung, hochreguliert werden könnte, und bMFA wurde verwendet, um strahleninduzierte Endothelzellschäden und neutrophile-endotheliale Wechselwirkungenzu untersuchen 29. Ein weiterer Vorteil dieser Vorrichtung besteht darin, dass Endothelzellen, Neutrophile und/oder andere Blutzellen oder medikamententragende Partikel zur weiteren Analyse aus mikrovaskulären Kanälen und/oder Gewebekompartimenten isoliert werden können. Darüber hinaus können Zellen/Partikel, die nicht mit den Endothelzellen im Gerät interagiert haben, aus dem aus dem Gerät austretenden Abwasser isoliert werden. Perizyten und die entsprechenden Gewebetypen können auch im Gerät kultiviert werden, um die In-vivo-Bedingungen besser darzustellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll eine physiologisch relevante Umgebung in bMFA bietet, um Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen während einer Entzündung zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 und GM134701 (M.F.K. und L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), und Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. und L.E.K.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
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