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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Published: December 9, 2021 doi: 10.3791/63312
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 1,2,6
1Department of Mechanical Engineering, Temple University, 2Department of Bioengineering, Temple University, 3Department of Bioengineering, University of Toledo, 4Biomedical Technology, CFD Research Corporation, 5Center for Inflammation and Lung Research, Department of Microbiology, Immunology and Inflammation, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 6Department of Radiation Oncology, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

Summary

En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.

Abstract

Las interacciones entre leucocitos y células endoteliales juegan un papel importante en enfermedades inflamatorias como la sepsis. Durante la inflamación, la migración excesiva de leucocitos activados a través del endotelio vascular hacia órganos clave puede conducir a la insuficiencia orgánica. Se ha desarrollado y validado un ensayo microfluídico biomimético fisiológicamente relevante (bMFA) utilizando varias técnicas experimentales y computacionales, que pueden reproducir toda la cascada de rodadura/adhesión/migración de leucocitos para estudiar las interacciones leucocitario-célula endotelial. Las redes microvasculares obtenidas a partir de imágenes in vivo en roedores se digitalizaron utilizando un enfoque de Sistema de Información Geográfica (SIG) y se microfabricaron con polidimetilsiloxano (PDMS) en un portaobjetos de microscopio. Para estudiar el efecto de la velocidad de cizallamiento y la topología vascular en las interacciones entre leucocitos y células endoteliales, se desarrolló un modelo de Dinámica de Fluidos Computacional (CFD) para generar un mapa correspondiente de las tasas de cizallamiento y las velocidades en toda la red. El bMFA permite cuantificar las interacciones entre leucocitos y células endoteliales, incluida la velocidad de rodadura, el número de leucocitos adheridos en respuesta a diferentes tasas de cizallamiento, el número de leucocitos migrados, la permeabilidad de las células endoteliales, la expresión de moléculas de adhesión y otras variables importantes. Además, mediante el uso de muestras relacionadas con humanos, como células endoteliales humanas y leucocitos, bMFA proporciona una herramienta para la detección rápida de posibles terapias para aumentar su traducibilidad clínica.

Introduction

La inflamación es la respuesta del huésped a la infección y la lesión, y el endotelio juega un papel importante en la respuesta inflamatoria 1,2,3. La desregulación inflamatoria es la causa subyacente de una serie de patologías de enfermedades como la sepsis, las enfermedades cardiovasculares, el asma, la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer y el COVID-19. Las interacciones leucocitarios-células endoteliales juegan un papel central en estas enfermedades inflamatorias. Durante la inflamación, la liberación de PAMPS (patrones moleculares asociados a patógenos) de patógenos o DAMPS (patrones moleculares asociados al daño) de los tejidos lesionados activa las células inmunes para liberar citoquinas / quimiocinas y otros mediadores proinflamatorios que conducen a la activación del endotelio, lo que resulta en alteraciones en la función de barrera del endotelio vascular y una mayor permeabilidad 3,4 . El aumento de la activación de las células endoteliales durante la inflamación da como resultado una mayor interacción entre leucocitos y células endoteliales, lo que lleva a una migración excesiva de leucocitos activados a través del endotelio vascular hacia órganos clave 1,5,6,7.

El reclutamiento de leucocitos es iniciado por quimioatrayentes químicamente diversos compuestos por lípidos bioactivos, citoquinas, quimiocinas y componentes del complemento 8,9. El reclutamiento de leucocitos es un proceso de varios pasos que incluye cinco pasos discretos: 1) marginación de leucocitos y captura/fijación, 2) rodaje, 3) arresto firme, 4) propagación y rastreo y 5) extravasación/migración (Figura 1). Cada paso de este proceso requiere diafonía entre leucocitos y células endoteliales para orquestar este fenómeno dinámico 1,9. En última instancia, los leucocitos detenidos extravasan a los tejidos inflamados a través del endotelio a través de un proceso de varios pasos controlado por señales concurrentes dependientes de quimioatrayentes, eventos adhesivos y fuerzas de cizallamiento hemodinámicas 1,9,10,11,12.

Dado el papel central del esfuerzo cortante en la regulación de la función de las células endoteliales y la importancia de las interacciones entre leucocitos y células endoteliales13, durante las últimas décadas se han desarrollado varios modelos in vitro para estudiar diversos aspectos de la cascada de migración de leucocitos en un entorno más controlado14. Los dispositivos fluídicos tradicionales para estudiar las interacciones entre leucocitos y células endoteliales se pueden clasificar en dos grandes categorías14: a) dispositivos para estudiar laminación de leucocitos, adhesión y expresión de moléculas de adhesión, como cámaras de flujo de placas paralelas y b) dispositivos para estudiar la migración de leucocitos en condiciones estáticas como las cámaras de transwell. Sistemas como las cámaras de flujo de placas paralelas se han utilizado para estudiar el papel de las moléculas de adhesión y sus ligandos en la cascada de adhesión bajo fuerzas de cizallamiento15. Sin embargo, un inconveniente significativo es que estos dispositivos simplistas e idealizados (por ejemplo, canal recto) no son capaces de reproducir la escala y la geometría de la microvasculatura in vivo (por ejemplo, bifurcaciones vasculares sucesivas, morfología vascular) y las condiciones de flujo resultantes (por ejemplo, flujos convergentes o divergentes en bifurcaciones). Como resultado, estos dispositivos solo pueden modelar la adhesión, pero no la transmigración. Las cámaras transwell solo pueden estudiar la transmigración en condiciones estáticas sin considerar las características geométricas in vivo y las condiciones de flujo. Por lo tanto, estos modelos tradicionales no imitan el microambiente de los tejidos vivos ni resuelven la adhesión y la cascada de migración en un solo ensayo6.

Para abordar esta limitación, hemos desarrollado y validado ampliamente un nuevo ensayo microfluídico biomimético 3D (bMFA) (Figura 2), que reproduce de manera realista las redes microvasculares in vivo en un chip16,17,18. El protocolo para la microfabricación de este dispositivo se ha publicado anteriormente17 y solo se describe brevemente aquí. La microvasculatura del músculo cremaster del ratón se digitalizó utilizando un enfoque modificado del Sistema de Información Geográfica (SIG)19. Luego, se generó la red microvascular sintética sobre polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando procesos de litografía blanda basados en la red microvascular digitalizada 14,17,20,21,22. Brevemente, las imágenes de red digitalizadas se imprimieron en una película mylar, que luego se usó como máscara para modelar una fotorresistencia positiva SU-8 sobre una oblea de silicio para crear los maestros para la fabricación. Se utilizaron pilares microfabricados (10 μm de diámetro, 3 μm de altura) para crear los poros de 3 μm de alto y 100 μm de ancho, un tamaño óptimo para la migración de leucocitos 23,24,25, conectando los canales vasculares y los compartimentos tisulares. PDMS se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se vertió sobre los maestros desarrollados. Además, el PDMS se desgasificó y se dejó curar durante la noche en un horno (65 ° C) para crear microcanales complementarios en el PDMS. Posteriormente, el PDMS curado se peló del maestro SU-8, seguido de puertos de punzonado para entradas / salidas. Luego, el PMDS se unió con plasma a un portaobjetos de vidrio. La superficie del dispositivo microfluídico comprende vidrio nativo y PDMS. Para promover la unión, propagación y proliferación celular, se requiere un recubrimiento de matriz extracelular (ECM). El bMFA incluye una red microvascular y un compartimento de tejido conectado a través de poros de 3 μm de alto y 100 μm de ancho (Figura 2). Este sistema microfluídico reproduce toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos en un entorno 3D fisiológicamente relevante de una red microvascular completa con vasos interconectados y bifurcaciones, incluyendo circulación, marginación, balanceo, adhesión y migración de leucocitos en el compartimento tisular extravascular en un solo sistema 14,16,17,21,26.

Cabe señalar que incluso cuando el caudal en la entrada de bMFA es fijo, las condiciones de flujo en la red varían en diferentes ubicaciones y no se pueden calcular mediante una fórmula matemática simple. Se desarrolló un modelo basado en dinámica de fluidos computacional (CFD) para calcular diferentes parámetros de flujo (por ejemplo, tensión de cizallamiento, velocidad de cizallamiento, velocidad) en diferentes ubicaciones de la red. Este modelo CFD se utilizó para simular los patrones de perfusión de tinte y los parámetros de flujo en el bMFA. La validación cruzada con resultados experimentales sugirió que las resistencias de flujo a través de la red están bien predichas por el modelo computacional (Figura 3)17. Este modelo CFD se utilizó para estimar la velocidad y el perfil de la velocidad de cizallamiento en cada recipiente de bMFA (Figura 4), lo que permitió analizar los efectos del flujo de cizallamiento y la geometría en el laminado, la adhesión y la migración de leucocitos16. Los leucocitos se adhieren preferentemente cerca de bifurcaciones y en regiones de bajo cizallamiento in vivo, y estos patrones espaciales de adhesión leucocitaria se demostraron con éxito en bMFA utilizando neutrófilos (Figura 5)16. Este artículo describe el protocolo para preparar bMFA para estudiar la interacción leucocitario-endotelial en condiciones inflamatorias utilizando células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) y neutrófilos humanos. Los sistemas microfisiológicos, como el bMFA, se pueden utilizar para estudiar las interacciones de las células endoteliales con diferentes tipos de células como neutrófilos, monocitos, linfocitos y células tumorales 18,27,28,29,30. El bMFA se puede sembrar con células endoteliales primarias de diferentes órganos (por ejemplo, pulmón vs. cerebro) y diferentes especies (por ejemplo, células endoteliales humanas vs. murinas), así como líneas celulares endoteliales 21,27,31,32. El bMFA se puede utilizar para estudiar múltiples respuestas celulares, interacciones célula-célula, función de barrera, administración de fármacos y toxicidad de fármacos.

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Protocol

La sangre humana heparinizada se obtiene para el aislamiento de neutrófilos de donantes adultos sanos (hombres y mujeres, de entre 21 y 60 años de edad), previo consentimiento informado aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Temple (Filadelfia, PA, EE.

1. Imprimación y recubrimiento del dispositivo con fibronectina humana

NOTA: El bMFA tiene dos puertos de entrada y dos puertos de salida conectados al compartimento vascular. También tiene un puerto conectado al compartimento de tejido (Figura 2).

  1. Inserte tubos (O.D. de 0.06" e I.D. de 0.02") (Tabla de Materials) en todos los puertos excepto en un puerto de entrada con fórceps de punto fino. Sujete los dos puertos de salida y el puerto del compartimento de tejido con abrazaderas de mandíbula. Asegúrese de que cada tubo tenga ~ 1 pulgada de longitud.
  2. Diluir la fibronectina humana a 100 μg/ml con PBS a partir de una solución madre de fibronectina (1 mg/ml). Cargue una jeringa de 1 ml con solución de fibronectina preparada. Conecte la jeringa a una aguja roma de 24 G y un tubo de ~ 4 pulgadas de largo.
    NOTA: Para evitar la reticulación, no mezcle/pipete en exceso la fibronectina humana. Otras matrices extracelulares (ECM) como el colágeno se pueden utilizar para diferentes tipos de células.
  3. Inserte el tubo en el puerto de entrada abierto, empuje el émbolo hasta que la fibronectina humana salga del otro puerto de entrada y, a continuación, sujete. Repita este proceso para el resto de los puertos hasta que todos los canales, el compartimento de tejido y el tubo se llenen con la solución de fibronectina humana. Retire la aguja, pero mantenga el tubo de 4 pulgadas de largo insertado y sin enganchar.
    NOTA: Asegúrese de que el tubo esté lleno de fibronectina antes de sujetarlo.
  4. Para la desgasificación, conecte el tubo sin enganchar a un tanque de nitrógeno comprimido a través de la imprimación neumática, ajuste la presión a ~ 5 psi y funcione durante ~ 15 min.
  5. Después de 15 minutos, verifique bajo el microscopio para asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas en el dispositivo. Si hay burbujas de aire atrapadas en el canal o compartimento de tejido, vuelva a conectar el dispositivo a la imprimación neumática para desgasificarlo nuevamente, es decir, repita el paso 1.4.
    NOTA: El microscopio invertido se utiliza en todos los pasos que involucran la microscopía en este protocolo.
  6. Retire el dispositivo de la imprimación neumática. Incubar el dispositivo a 37 °C durante 1 h, luego enjuagar todos los canales y el compartimento de tejido con medios de cultivo HLMVEC precalentados (Tabla de materiales), similar al paso 1.3. El bMFA ya está listo para la siembra celular.
    NOTA: Antes de retirar/insertar un tubo del puerto, primero coloque una gota de agua con una pipeta alrededor de la base del tubo del puerto de entrada para evitar que el aire entre en el dispositivo.

2. Siembra de bMFA con HLMVEC

  1. Cultive HLMVEC al 60%- 80% de confluencia según el protocolo del proveedor en un matraz T-25.
  2. Aspirar medios de cultivo HLMVEC a partir de matraz de cultivo celular. Lavar dos veces con PBS.
  3. Añadir 2 ml de solución de tripsina-EDTA precalentada (37 °C) en el matraz T-25. Incubar durante 3-5 min en una incubadora (37 °C, 5% CO2) hasta que la mayoría de las células se separen del matraz.
    NOTA: El tiempo de incubación puede variar para diferentes tipos de células y concentración de tripsina-EDTA.
  4. Añadir 2 ml de solución de neutralización de tripsina (TNS, 37 °C) al matraz para neutralizar la tripsina-EDTA.
  5. Golpee suavemente el matraz para ayudar a disociar las células. Luego, transfiera la solución de suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
  6. Centrifugar durante 5 min a 150 x g para granular las células endoteliales. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 3 ml de medios de cultivo celular. Cuente el número de células con un hemocitómetro.
  7. Centrifugar de nuevo durante 5 min a 150 x g para granular las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células a la densidad de siembra deseada de 20 x 106/mL.
    NOTA: Dependiendo de los tipos de células y la confluencia, se pueden recolectar aproximadamente 2 x 106 células endoteliales de dos matraces T-25, y con la densidad de siembra de 20 x 106 / ml, 100 μL de la suspensión celular (2 x 106 células endoteliales), es suficiente para sembrar 5 dispositivos.
  8. Monte una jeringa de 1 ml en la bomba de jeringa programable, conecte el tubo a la aguja roma.
  9. Extraiga ~ 20 μL de la suspensión celular en el tubo, asegurándose de que la suspensión celular esté solo en el tubo, no en el barril de la jeringa.
  10. Retire la abrazadera de un puerto de salida del dispositivo. Conecte el tubo a una entrada del dispositivo. Asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en el canal.
  11. Arranque la bomba con un caudal de 4-8 μL/min. Observe el dispositivo bajo un microscopio.
  12. Cuando los canales estén llenos de celdas, detenga la bomba, sujete la salida y corte el tubo de entrada.
    NOTA: Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el dispositivo.
  13. Coloque el dispositivo en la incubadora durante 4 h al 5% de CO2 y 37 °C.
  14. Después de 4 h de incubación, prepare otra jeringa llena de medios de cultivo celular frescos. Monte la jeringa en una bomba de jeringa, conecte la jeringa al puerto de entrada y retire la abrazadera de un puerto de salida.
  15. Pase medios frescos a través del dispositivo durante aproximadamente 5 minutos a 4-8 μL / min para eliminar las células flotantes / no unidas.

3. Cultivo celular en flujo durante 48 h

  1. Prepare una jeringa llena de medios de cultivo celular frescos. Monte la jeringa en una bomba de jeringa, conecte la jeringa a un puerto de entrada y mantenga una salida abierta. Coloque el dispositivo en la incubadora (5% CO2, 37 °C).
  2. Programe la bomba de jeringa para el cultivo de células endoteliales bajo flujo utilizando las siguientes instrucciones mencionadas en la Tabla 1.
  3. Compruebe el bMFA bajo un microscopio después de 48 h de cultivo bajo flujo. HLMVEC debe cubrir los canales vasculares formando un lumen completo (Figura 6).
    NOTA: Es posible que se requieran otros regímenes de flujo para diferentes tipos de células.

4. Citoquinas y/o tratamiento terapéutico

NOTA: Como ejemplo, esta sección describe el uso de bMFA para estudiar el impacto del tratamiento de las células con factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y un nuevo inhibidor antiinflamatorio (inhibidor del péptido delta-TAT de la proteína quinasa C, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.

  1. Prepare tres dispositivos bMFA diferentes utilizando el protocolo anterior (sección 1-3).
  2. Cargue tres jeringas de 1 ml con medios de cultivo celular, (TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM), respectivamente.
    NOTA: Las citoquinas se reconstituyen en medios de cultivo celular.
  3. Conecte las tres jeringas a tres dispositivos bMFA. Tratar HLMVEC con tampón TNF-α o TNF-α + inhibidor durante 4 h a 0,1 μL/min.
    NOTA: Según los requisitos específicos del estudio, se pueden usar otras citoquinas o cócteles de citoquinas (por ejemplo, TNF-α + Interleucina 1 beta (IL1-β) + Interferón-gamma (IFN-γ)), para tratar las células endoteliales.

5. Aislamiento de neutrófilos humanos

  1. Use todos los reactivos a temperatura ambiente (RT). Los reactivos incluyen medios de aislamiento de leucocitos, 1 tampón HEPES con Ca2+/Mg2+ (Tabla 2), Dextrano al 6% en solución salina normal (NaCl al 0,9%), solución de NaCl al 3,6% y agua desionizada (DI).
  2. Pipetear 20 ml de medios de aislamiento de leucocitos en un tubo cónico de 50 ml y colocar cuidadosamente 25 ml de sangre sobre los medios de aislamiento de leucocitos. Centrífuga durante 40 min a 427 x g a RT.
    NOTA: Realice este paso lenta y cuidadosamente para evitar mezclar los medios de aislamiento de sangre y leucocitos.
  3. Aspire hasta ~ 5 ml por encima de la capa de glóbulos rojos (RBC). La capa blanca de buffy en la parte superior del RBC es predominantemente neutrófilos.
  4. Agregue el búfer HEPES para duplicar el volumen actual (volumen existente: búfer HEPES = 1:1).
  5. Agregue una cantidad de 6% de dextrano, que será el 20% del volumen final. (volumen actual/4 = volumen de Dextrano añadido al 6%).
  6. Invierta el tubo suavemente un par de veces para mezclar bien y deje que el rbc sedimente (~ 25 min).
  7. Pipetee cuidadosamente la capa superior (capa rica en neutrófilos) y transfiérala a un nuevo tubo de 50 ml, tenga cuidado de no contaminar con glóbulos rojos sedimentados.
  8. Centrifugar durante 10 min a 315 x g en RT. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 8 ml de tampón HEPES.
  9. Para lisar el RBC residual, agregue 24 ml de agua DI y mezcle suavemente durante 50 s. Inmediatamente, agregue 8 ml de solución de NaCl al 3,6%, mezcle y centrifugue durante 10 min a 315 x g en RT.
  10. Retire el sobrenadante, lave el pellet celular con 15 ml de tampón HEPES y centrífuga durante 5 min a 315 x g. Vuelva a suspender el pellet en tampón HEPES.

6. Experimento de adhesión y migración de neutrófilos con bMFA

  1. Resuspend los neutrófilos humanos aislados (15 millones) en 999 μL de tampón HEPES.
  2. Añadir 1 μL de CFDA-SE (carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster) solución madre de colorante (10 mM) a la suspensión de neutrófilos para obtener una concentración de trabajo de 10 μM de CFDA-SE e incubar durante 10 min a RT. Lavar las células dos veces con tampón HEPES centrifugando durante 5 min a 315 x g.
  3. Contar los neutrófilos utilizando un hemocitómetro y resuspend a 2 millones de neutrófilos/ml con medios de cultivo celular, TNF-α (10 ng/mL) y TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM), respectivamente; incubar durante 15 min en RT antes del inicio del experimento.
  4. Preparar una jeringa llena de 1 μM N-formil-met-leu-phe (fMLP), el quimioatrayente para el estudio, en medios de cultivo celular. Tome bMFA y abra un puerto de entrada y un puerto de salida.
    NOTA: Estas condiciones experimentales se utilizan para imitar las condiciones de sepsis que incluyen una respuesta inflamatoria sistémica con altos niveles de citoquinas / quimiocinas circulantes. Además, fMLP, un péptido derivado de bacterias Gram-negativas, se utiliza para modelar la presencia de bacterias en el pulmón (es decir, el compartimiento de tejido).
  5. Retire el tubo de puerto del compartimento de tejido e inserte el tubo fMLP. Inyecte ~ 20 μL de fMLP en el compartimiento tisular para todos los bMFA, excepto el tratado con medios de cultivo celular solos. Luego corte el tubo y sujete.
  6. Llene la jeringa con ~200 μL de la suspensión de neutrófilos y monte la jeringa en la bomba de la jeringa.
  7. Coloque el dispositivo en la etapa de microscopio invertido (Tabla de materiales).
  8. Arranque la bomba a un caudal de 1 μL/min y espere hasta que salga una pequeña gota de la suspensión de neutrófilos del tubo. Inserte el tubo en el puerto de entrada. Consulte la Figura 7 para ver la configuración.

7. Adquirir imágenes

  1. Utilice la función Escanear imagen grande en el software de análisis de imágenes del microscopio (Tabla de materiales) para obtener el mapa de adhesión en bMFA (Figura 8) 10 minutos después de comenzar el experimento. La mayoría de los neutrófilos entran en bMFA durante los primeros 10 min.
    NOTA: Mantenga la luz de fluorescencia apagada cuando no tome imágenes para reducir el fotoblanqueo.
  2. Durante la siguiente hora, tome imágenes de lapso de tiempo (1 imagen cada 5 minutos) del compartimento de tejido (Figura 8B, C) para el análisis de migración para obtener el mapa de migración.

8. Análisis de imágenes digitales

  1. Para el mapa de adhesión, cuente el número de neutrófilos adheridos en cada vaso. Para cada bifurcación, cree una región circular de interés (ROI) con un diámetro igual a dos veces el diámetro del vaso y cuente el número de neutrófilos adheridos.
  2. Utilice el conteo manual o la función automatizada de recuento de objetos para cuantificar el número de neutrófilos adheridos en cada vaso y región de bifurcación.
  3. Utilice el mapa de velocidad de cizallamiento de la red generada mediante la simulación CFD17 para determinar la velocidad de cizallamiento en cada buque. A continuación, trace el número de neutrófilos adheridos en un vaso dado contra la velocidad de cizallamiento en ese vaso para crear un mapa de velocidad de cizallamiento en bMFA como se muestra en la Figura 9A.
  4. Los neutrófilos se cuentan como migrados si han cruzado a través del endotelio hacia el compartimiento tisular. Cuente el número de neutrófilos migrados a 10 min, 15 min, 30 min y 60 min. Grafique el número de neutrófilos migrados frente al tiempo como se muestra en la Figura 9B.

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Representative Results

Después de 48 h de cultivo bajo flujo de cizallamiento en bMFA, las células endoteliales cubrieron la superficie de los canales vasculares en bMFA y se alinearon en la dirección del flujo (Figura 6). La microscopía confocal indicó que todas las superficies de los canales vasculares estaban cubiertas por células endoteliales, formando un lumen 3D completo en bMFA18.

Utilizando este protocolo, se puede adquirir un mapa de adhesión de neutrófilos, que muestra que existe una adhesión significativa de neutrófilos a la célula endotelial en bMFA (Figura 8). La correlación de la distribución espacial de los neutrófilos en este mapa de adhesión con el mapa de velocidad de cizallamiento generado a partir del modelo CFD muestra que la adhesión de neutrófilos depende del cizallamiento, y los neutrófilos se adhieren preferentemente en regiones de baja tasa de cizallamiento y bifurcación (Figura 9A). La adhesión de los neutrófilos a las células endoteliales activadas por TNF-α aumentó significativamente. El análisis de imágenes de lapso de tiempo indicó que la activación de TNF-α de las células endoteliales aumenta la migración de neutrófilos en respuesta al quimioatrayente fMLP (Figura 9B). Como se indicó anteriormente, bMFA se puede utilizar para probar rápidamente la eficacia de una nueva terapéutica para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria. Por ejemplo, el tratamiento de células endoteliales y neutrófilos con PKCδ-i redujo significativamente la adhesión y migración de neutrófilos (Figura 9A,B)27.

Figure 1
Figura 1: Activación de las células endoteliales durante la inflamación. (A) En condiciones normales, el endotelio vascular está cubierto por el glicocáliz y forma una barrera estrecha que regula la permeabilidad de la barrera, la migración de leucocitos y las defensas antiinflamatorias. (B) Durante la inflamación, los leucocitos y las células endoteliales son activados por PAMPS y DAMPS para producir citoquinas y quimioatrayentes, lo que lleva a la expresión elevada de moléculas de superficie tanto en leucocitos como en células endoteliales, mejorando las interacciones leucocitarios-endoteliales. Las interacciones de E/P-selectina en las células endoteliales y sus ligandos (por ejemplo, PSGL-1) en los leucocitos están involucradas en el balanceo, lo que ralentiza el neutrófilo. La adhesión firme está regulada por moléculas de adhesión expresadas en endotelio, incluyendo ICAM-1, ICAM-2 y VCAM-1, y sus ligandos, integrinas β2. En respuesta a los gradientes quimioatrayentes, los leucocitos adheridos migran a través de uniones endoteliales reguladas por PECAM-1 y JAMs. Los leucocitos activados migran al tejido, donde liberan citoquinas, especies reactivas de oxígeno/nitrógeno y proteasas para luchar contra las infecciones. Sin embargo, la migración desregulada de leucocitos puede dañar el tejido de los órganos, lo que resulta en insuficiencia orgánica. Durante la inflamación, el glicocáliz se degrada, las uniones estrechas de las células endoteliales se dañan y hay un aumento de la apoptosis de las células endoteliales, lo que lleva a una función de barrera dañada y una mayor permeabilidad. Esta cifra ha sido modificada a partir de Yang et al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Visión general del bMFA. (A) Se obtienen imágenes del músculo cremaster del ratón y (B) se digitalizan utilizando el sistema SIG para fabricar la red en PDMS. (C) La imagen de campo brillante de la red bMFA muestra que en bMFA, los canales vasculares están conectados al compartimiento tisular a través de una barrera de 3 μm (el inserto esquemático en el Panel C). La dirección del flujo de los canales vasculares está indicada. (D) Un chip bMFA, que consiste en una capa PDMS unida a un portaobjetos de microscopio, está en etapa de microscopio. El tubo se inserta en dos puertos de entrada, dos puertos de salida y un puerto de compartimento de tejido. (C: barra de escala = 500 μm) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estudios de perfusión transitoria que comparan resultados experimentales y de simulación en bMFA. (A) La red de bMFA que muestra la dirección de entrada, salida y flujo. (B) Panel superior: perfiles de perfusión CFD. Panel inferior: Perfiles de perfusión experimental. Las imágenes son pseudo-coloreadas para mostrar degradados. La escala se normaliza con azul (sin perfusión; 0) y magenta (perfusión completa; 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Perfil de velocidad y velocidades de cizallamiento en bMFA a partir de simulaciones CFD. (A) Distribución de magnitudes de velocidad (Vmag) en toda la red. (B) La distribución de la tasa de cizallamiento indica tasas de cizallamiento heterogéneas en la red. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los patrones de adhesión de neutrófilos en bMFA son similares a los patrones de adhesión de neutrófilos in vivo. Las distribuciones del número de neutrófilos adheridos in vivo y el número de neutrófilos en bMFA están sesgadas hacia la izquierda, lo que indica que los neutrófilos se adhieren preferentemente cerca de bifurcaciones con el pico que ocurre en un vaso o diámetro de canal desde la bifurcación más cercana (media ± SEM; N = 3). La distancia de los neutrófilos adheridos a la bifurcación más cercana se normalizó por lo siguiente: distancia normalizada = distancia al centro de la bifurcación/diámetro más cercano del canal. Esta figura ha sido modificada de Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, los permisos adicionales relacionados con el material extraído deben dirigirse a la American Chemical Society). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Las células endoteliales forman un lumen 3D completo en el bMFA. (A) Las imágenes de contraste de fase muestran que las células endoteliales están alineadas en la dirección del flujo. (B) Las imágenes de fluorescencia muestran que las células endoteliales cubren el canal vascular; La F-actina se etiqueta en verde con faloidina y los núcleos se etiquetan en rojo con Draq5. (A: barra de escala = 100 μm, B: barra de escala = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Se utiliza un microscopio de fluorescencia invertida controlado por computadora para estudiar las interacciones neutrófilo-endotelial en bMFA. Se utiliza una etapa controlada por computadora con un calentador para mantener el bMFA a 37 ° C. El bMFA está conectado a una bomba de jeringa programable a través del tubo. El microscopio de fluorescencia invertida está equipado con una cámara de video para tomar imágenes / video para un mayor análisis fuera de línea en la computadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Imágenes representativas del mapa de adhesión y migración de neutrófilos. (A) Mapa de adhesión de neutrófilos en bMFA. La imagen fue tomada 10 minutos después del inicio del experimento utilizando la función "Escanear mapa grande" del software Nikon. Los puntos blancos en el mapa son neutrófilos marcados fluorescentemente con CFDA-SE. El límite del canal vascular se marca digitalmente (barra de escala = 100 μm). (B) Mapa de migración de neutrófilos en bMFA sin activación de TNF-α. La imagen fue tomada 60 minutos después del inicio del experimento. (C) Mapa de migración de neutrófilos en bMFA con activación de TNF-α. La imagen fue tomada 60 minutos después del inicio del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Patrones de adhesión y migración de neutrófilos en bMFA durante la inflamación. (A) El tratamiento con TNF-α aumentó significativamente la adhesión de neutrófilos humanos a las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas, que se inhibió después del tratamiento con un inhibidor de PKCδ. La adhesión de neutrófilos ocurrió preferentemente en vasos con baja tasa de cizallamiento y casi bifurcaciones en bMFA. (B) En respuesta a fMLP, la migración de neutrófilos humanos a través de las células endoteliales activadas por TNF-α aumentó significativamente en comparación con las células no tratadas. El tratamiento con el inhibidor de PKCδ redujo la migración a niveles no tratados. n = 4, Media ± SEM, ANOVA unidireccional, ** p < 0,01 y *** p < 0,001). La figura ha sido modificada a partir de Soroush et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso 1: Tasa constante Comentarios
Modo Infundir
Gasto 1 μL/min
Hora 10 minutos
Paso 2: Retardo (sin flujo)
Modo Demorar
Hora 4 horas
Paso 3: Repetir El paso 1 y el paso 2 se repetirán 6 veces antes de ir al paso 4.
Modo Repetir
Repetir desde Paso 1
Repetir 6 veces
Paso 4: Caudal constante
Modo Infundir
Gasto 0,1 μL/min
Hora 48 horas

Tabla 1: Programa de bomba de jeringa

Fórmula Nombre MW Agregar Concentración 10x búfer HEPES
(Agregue agua DI a 1000 ml y ajuste el pH a 7.3. Diluir a 1x antes de usar)
NaCl Cloruro de sodio 58.44 87,66 g 1,5 M
KOH Hidróxido de potasio 56.11 2,81 g 50 metros
Hepes Hepes 238.3 23,83 g 100 metros
MgCl2 Cloruro de magnesio 203.31 2,44 g 12 mM
CaCl2 Cloruro de calcio 147.62 1,90 g 12,9 mM

Tabla 2: Composición del tampón HEPES.

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Discussion

El bMFA reproduce la topografía y las condiciones de flujo de las redes microvasculares in vivo y se puede utilizar para estudiar la interacción leucocito-célula endotelial y la función endotelial in vitro en condiciones fisiológicamente realistas. En la microvasculatura de ratón o humano, la geometría de las redes microvasculares es autosimilar y fractal, y el número de Reynolds << 1, lo que indica que la geometría vascular no afecta significativamente los patrones de flujo. Por lo tanto, la bFMA se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales para diferentes especies, incluidos los humanos, aunque la microvasculatura del músculo cremaster del ratón se mapeó para fabricar bMFA.

El bMFA permite la evaluación en tiempo real de los pasos individuales de la cascada de migración de neutrófilos en un solo ensayo, que incluye el laminado, la adhesión firme, la propagación y la migración de neutrófilos en el compartimiento tisular. Las células humanas primarias y las muestras clínicamente relevantes se pueden utilizar en bMFA para aumentar la traducibilidad y para detectar rápidamente posibles terapias. En comparación con los sistemas fluídicos tradicionales, como las cámaras de flujo de placas paralelas, bMFA tiene la ventaja de usar menos del 95% de los reactivos37 debido a sus pequeños tamaños de vasos y al hecho de que puede estudiar toda la cascada de migración de neutrófilos en un solo ensayo. Sin embargo, este pequeño tamaño también requiere que los usuarios trabajen con un volumen muy pequeño de reactivos, lo que puede ser un desafío y requiere una práctica extensa. El problema más común con este protocolo es la presencia de burbujas de aire en bMFA, que pueden bloquear el canal y alterar los patrones de flujo. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado al retirar o insertar tubos en los puertos, y se debe colocar una gota de agua en la base del tubo en los puertos para evitar que el aire ingrese al canal cada vez que se retira el tubo de bMFA.

Además de la aplicación de bMFA para el estudio de las interacciones neutrófilo-endotelial, el bMFA también se ha utilizado para estudiar la integridad del endotelio durante la inflamación mediante la medición de variables como la permeabilidad y la resistencia endotelial transendotelial (TEER)27. Además, mediante la funcionalización de micropartículas con anticuerpos específicos, el bMFA se puede utilizar para estudiar la expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales27. Se demostró que la respuesta inflamatoria también podría ser regulada al alza por otros estímulos en el bMFA, como la radiación ionizante, y el bMFA se ha utilizado para estudiar el daño celular endotelial inducido por la radiación y las interacciones neutrófilo-endotelial29. Otra ventaja de este dispositivo es que las células endoteliales, neutrófilos y / u otras células sanguíneas o partículas portadoras de medicamentos se pueden aislar de los canales microvasculares y / o el compartimiento de tejido para su posterior análisis. Además, las células/partículas que no interactuaron con las células endoteliales del dispositivo se pueden aislar del efluente que sale del dispositivo. Los pericitos y los tipos de tejido correspondientes también se pueden cultivar en el dispositivo para representar mejor las condiciones in vivo . En conclusión, el protocolo presentado aquí proporciona un entorno fisiológicamente relevante en bMFA para estudiar las interacciones leucocitario-célula endotelial durante la inflamación.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, Número de subvención: GM114359 y GM134701 (M.F.K. y L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), y la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa, Número de subvención: HDTRA11910012 (M.F.K. y L.E.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Fisher Scientific 14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) SynVivo SMN1-C001 Exclusive at SynVivo
Blunt needle Jensen Global JG24-0.5
Calcium Chloride Fisher Scientific C70-500
CFDA, SE ThermoFisher C1157
Dextran, 250,000, Powder Spectrum Chemical Mfg. Corp DE-130
Ficoll-Paque Premium GE Health Care 17-5442-02 Leukocyte isolation media
fMLP Sigma-Aldrich F3506
Hepes Fisher Scientific AAJ1692630
Human fibronectin Fisher Scientific 33-016-015 use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza cc-3202 Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells Lonza cc-2527 use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride Fisher Scientific BP214-500
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments Inc. Microscope
NIS-elements, 5.20.01 Nikon Instruments Inc. Imaging software
PBS Fisher Scientific MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3007 Syringe Pump
Potassium Hydroxide Fisher Scientific 02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha R&D Systems 210-TA
Slide clamp SynVivo
Sodium Chloride Fisher Scientific S640-500
Synvivo Pneumatic Primer SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) Lonza cc-5034
Tygon tubing Fisher Scientific 50-206-8921 Tubing

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Yang, Q., Langston, J. C., Tang, Y., Prabhakarpandian, B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation. J. Vis. Exp. (178), e63312, doi:10.3791/63312 (2021).

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