Summary
In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.
Abstract
Leukocyten-endotheelcelinteracties spelen een belangrijke rol bij ontstekingsziekten zoals sepsis. Tijdens ontsteking kan overmatige migratie van geactiveerde leukocyten over het vasculaire endotheel naar belangrijke organen leiden tot orgaanfalen. Een fysiologisch relevante biomimetische microfluïdische assay (bMFA) is ontwikkeld en gevalideerd met behulp van verschillende experimentele en computationele technieken, die de volledige leukocyten rollende / adhesie / migratiecascade kunnen reproduceren om leukocyten-endotheelcelinteracties te bestuderen. Microvasculaire netwerken verkregen uit in vivo beelden bij knaagdieren werden gedigitaliseerd met behulp van een Geografisch Informatie Systeem (GIS) benadering en gemicrofabriceerd met polydimethylsiloxaan (PDMS) op een microscoopglaasje. Om het effect van afschuifsnelheid en vasculaire topologie op leukocyten-endotheelcelinteracties te bestuderen, werd een Computational Fluid Dynamics (CFD) -model ontwikkeld om een overeenkomstige kaart van afschuifsnelheden en -snelheden in het hele netwerk te genereren. De bMFA maakt de kwantificering van leukocyten-endotheelcelinteracties mogelijk, waaronder rolsnelheid, aantal geconh adhered leukocyten in reactie op verschillende afschuifsnelheden, aantal gemigreerde leukocyten, endotheelceldoorlaatbaarheid, adhesiemolecuulexpressie en andere belangrijke variabelen. Bovendien biedt bMFA, door gebruik te maken van mensgerelateerde monsters, zoals menselijke endotheelcellen en leukocyten, een hulpmiddel voor snelle screening van potentiële therapieën om hun klinische vertaalbaarheid te vergroten.
Introduction
Ontsteking is de reactie van de gastheer op infectie en letsel, en het endotheel speelt een belangrijke rol in de ontstekingsreactie 1,2,3. Inflammatoire ontregeling is de onderliggende oorzaak van een aantal ziektepathologieën zoals sepsis, hart- en vaatziekten, astma, inflammatoire darmaandoeningen, kanker en COVID-19. Leukocyten-endotheelcelinteracties spelen een centrale rol bij deze ontstekingsziekten. Tijdens ontsteking activeert de afgifte van PAMPS (pathogen-associated molecular patterns) uit pathogenen of DAMPS (damage-associated molecular patterns) uit gewonde weefsels immuuncellen om cytokines/chemokines en andere pro-inflammatoire mediatoren vrij te maken die leiden tot de activering van endotheel, resulterend in veranderingen in de vasculaire endotheelbarrièrefunctie en verhoogde permeabiliteit 3,4 . Verhoogde activering van endotheelcellen tijdens ontsteking resulteert in verbeterde interactie tussen leukocyten en endotheelcellen, wat leidt tot overmatige migratie van geactiveerde leukocyten over het vasculaire endotheel naar sleutelorganen 1,5,6,7.
De rekrutering van leukocyten wordt geïnitieerd door chemisch diverse chemoattractanten bestaande uit bioactieve lipiden, cytokines, chemokines en complementcomponenten 8,9. Leukocytenrekrutering is een proces in meerdere stappen dat vijf afzonderlijke stappen omvat: 1) leukocytenmargeatie en vangst/ hechting, 2) rollen, 3) stevige arrestatie, 4) spreiden en kruipen en 5) extravasatie / migratie (figuur 1). Elke stap van dit proces vereist overspraak tussen leukocyten en endotheelcellen om dit dynamische fenomeen te orkestreren 1,9. Uiteindelijk extravaseren gestileerde leukocyten naar ontstoken weefsels over endotheel via een meerstapsproces dat wordt gecontroleerd door gelijktijdige chemoattractant-afhankelijke signalen, kleefgebeurtenissen en hemodynamische schuifkrachten 1,9,10,11,12.
Gezien de centrale rol van schuifstress bij het reguleren van de endotheelcelfunctie en de betekenis van de leukocyten-endotheelcelinteracties13, zijn er de afgelopen decennia verschillende in vitro modellen ontwikkeld om verschillende aspecten van de leukocytenmigratiecascade in een meer gecontroleerde omgeving te bestuderen14. Traditionele fluidische apparaten om leukocyten-endotheelcelinteracties te bestuderen, kunnen worden ingedeeld in twee brede categorieën14: a) apparaten voor het bestuderen van leukocytenrollen, adhesie en adhesiemolecuulexpressie zoals parallelle plaatstroomkamers en b) apparaten voor het bestuderen van leukocytenmigratie onder statische omstandigheden zoals transwellkamers. Systemen zoals parallelle plaatstroomkamers zijn gebruikt om de rol van adhesiemoleculen en hun liganden in de adhesiecascade onder schuifkrachten15 te bestuderen. Een belangrijk nadeel is echter dat deze simplistische, geïdealiseerde apparaten (bijv. Recht kanaal) niet in staat zijn om de schaal en geometrie van de in vivo microvasculatuur (bijv. Opeenvolgende vasculaire bifurcaties, vasculaire morfologie) en de resulterende stroomomstandigheden (bijv. Convergerende of divergerende stromen bij bifurcaties) te reproduceren. Als gevolg hiervan kunnen deze apparaten alleen adhesie modelleren, maar geen transmigratie. Transwellkamers kunnen transmigratie alleen onder statische omstandigheden bestuderen zonder rekening te houden met de in vivo geometrische kenmerken en stromingsomstandigheden. Deze traditionele modellen bootsen dus niet de micro-omgeving van levende weefsels na of lossen adhesie- en migratiecascade op in een enkele test6.
Om deze beperking aan te pakken, hebben we een nieuwe 3D-biomimetische microfluïdische assay (bMFA) ontwikkeld en uitgebreid gevalideerd (figuur 2), die realistisch in vivo microvasculaire netwerken reproduceert op een chip 16,17,18. Het protocol voor microfabricage van dit apparaat is eerdergepubliceerd 17 en wordt hier slechts kort beschreven. De microvasculatuur van muis cremaster spier werd gedigitaliseerd met behulp van een gemodificeerd Geografisch Informatie Systeem (GIS) benadering19. Vervolgens werd het synthetische microvasculaire netwerk gegenereerd op polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van softlithografieprocessen op basis van het gedigitaliseerde microvasculaire netwerk 14,17,20,21,22. Kortom, de gedigitaliseerde netwerkbeelden werden afgedrukt op Mylar-film, die vervolgens werd gebruikt als een masker om een SU-8 positieve fotoresist bovenop een siliciumwafer te patroon om de meesters voor fabricage te maken. Microfabricated pilaren (10 μm diameter, 3 μm hoog) werden gebruikt om de 3 μm hoge en 100 μm brede poriën te creëren, een optimale grootte voor leukocytenmigratie 23,24,25, die de vasculaire kanalen en weefselcompartimenten met elkaar verbinden. PDMS werd bereid volgens de instructies van de fabrikant en over de ontwikkelde meesters gegoten. Verder werd het PDMS ontgast en een nacht in een oven (65 °C) uitharden om complementaire microkanalen in PDMS te creëren. Vervolgens werd het uitgeharde PDMS van de SU-8 master geschild, gevolgd door ponspoorten voor inlaten/uitgangen. Vervolgens werd de PMDS plasma gebonden aan een glasplaat. Het oppervlak van het microfluïdische apparaat bestaat uit native glas en PDMS. Om celaanhechting, verspreiding en proliferatie te bevorderen, is extracelluar matrix (ECM) coating vereist. De bMFA omvat een microvasculair netwerk en een weefselcompartiment verbonden via 3 μm hoge en 100 μm brede poriën (figuur 2). Dit microfluïdische systeem reproduceert de volledige leukocytenadhesie/migratiecascade in een fysiologisch relevante 3D-omgeving van een compleet microvasculair netwerk met onderling verbonden vaten en bifurcaties, inclusief circulatie, marginatie, rollen, adhesie en migratie van leukocyten naar het extra vasculaire weefselcompartiment in een enkel systeem 14,16,17,21,26.
Opgemerkt moet worden dat zelfs wanneer het debiet bij de inlaat van bMFA vaststaat, de stroomomstandigheden in het netwerk op verschillende locaties variëren en niet kunnen worden berekend met een eenvoudige wiskundige formule. Een op COMPUTATIONAL FLUID DYNAMICS (CFD) gebaseerd model werd ontwikkeld om verschillende stroomparameters (bijv. Schuifspanning, afschuifsnelheid, snelheid) op verschillende locaties in het netwerk te berekenen. Dit CFD-model werd gebruikt om de kleurstofperfusiepatronen en stromingsparameters in de bMFA te simuleren. Kruisvalidatie met experimentele resultaten suggereerde dat de stroomweerstanden over het netwerk goed worden voorspeld door het computationele model (figuur 3)17. Dit CFD-model werd vervolgens gebruikt om de snelheid en het afschuifsnelheidsprofiel in elk vat van bMFA te schatten (figuur 4), waardoor de effecten van afschuifstroom en geometrie op leukocytenrollen, adhesie en migratiekonden worden geanalyseerd 16. Leukocyten hechten zich bij voorkeur in de buurt van bifurcaties en in lage schuifgebieden in vivo, en deze ruimtelijke patronen van leukocytenadhesie werden met succes aangetoond in bMFA met behulp van neutrofielen (figuur 5)16. Dit artikel beschrijft het protocol voor het voorbereiden van bMFA om leukocyten-endotheelcelinteractie onder inflammatoire omstandigheden te bestuderen met behulp van menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen (HLMVEC) en menselijke neutrofielen. Microfysiologische systemen, zoals de bMFA, kunnen worden gebruikt om endotheelcelinteracties te bestuderen met verschillende soorten cellen zoals neutrofielen, monocyten, lymfocyten en tumorcellen 18,27,28,29,30. De bMFA kan worden bezaaid met primaire endotheelcellen uit verschillende organen (bijv. Long versus hersenen) en verschillende soorten (bijv. Menselijke versus muriene endotheelcellen), evenals endotheelcellijnen 21,27,31,32. De bMFA kan worden gebruikt om meerdere cellulaire responsen, cel-cel interacties, barrièrefunctie, medicijnafgifte en geneesmiddeltoxiciteit te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hepariniseerd menselijk bloed wordt verkregen voor neutrofiele isolatie van gezonde volwassen donoren (mannen en vrouwen, tussen 21 en 60 jaar oud), na geïnformeerde toestemming zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van Temple University (Philadelphia, PA, VS).
1. Het apparaat primen en coaten met menselijke fibronectine
OPMERKING: De bMFA heeft twee inlaatpoorten en twee uitlaatpoorten die zijn aangesloten op het vasculaire compartiment. Het heeft ook één poort aangesloten op het weefselcompartiment (figuur 2).
- Steek buizen (O.D. van 0,06" en I.D. van 0,02") (Tabel van materiaals) in alle poorten behalve één inlaatpoort met fijnpunttang. Klem de twee uitlaatpoorten en de poort van het tissuecompartiment vast met kaakklemmen. Zorg ervoor dat elke buis ~ 1 inch lang is.
- Verdun humaan fibronectine tot 100 μg/ml met PBS uit fibronectine stockoplossing (1mg/ml). Laad een spuit van 1 ml met bereide fibronectine-oplossing. Sluit de spuit aan op een stompe naald van 24 G en een slang van ~ 4 inch.
OPMERKING: Om crosslinking te voorkomen, mag u humane fibronectine niet te veel mengen/pipetten. Andere extracellulaire matrices (ECM) zoals collageen kunnen worden gebruikt voor verschillende celtypen. - Steek de slang in de open inlaatpoort, duw de zuiger totdat humaan fibronectine uit de andere inlaatpoort komt en klem deze vervolgens vast. Herhaal dit proces voor de rest van de poorten totdat alle kanalen, weefselcompartiment en slangen zijn gevuld met de menselijke fibronectine-oplossing. Verwijder de naald, maar houd de 4-inch lange slang ingebracht en ongecensureerd.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de slang gevuld is met fibronectine voordat deze wordt geklemd. - Sluit voor het ontgassen de niet-verlichte buis aan op een gecomprimeerde stikstoftank via de pneumatische primer, stel de druk in op ~ 5 psi en laat gedurende ~ 15 minuten lopen.
- Controleer na 15 minuten onder de microscoop of er geen luchtbellen in het apparaat vastzitten. Als er luchtbellen in het kanaal of weefselcompartiment zijn opgesloten, sluit u het apparaat opnieuw aan op de pneumatische primer om opnieuw te ontgassen, d.w.z. herhaal stap 1.4.
OPMERKING: Omgekeerde microscoop wordt gebruikt in alle stappen met betrekking tot microscopie in dit protocol. - Verwijder het apparaat uit de pneumatische primer. Incubeer het apparaat gedurende 1 uur bij 37 °C en spoel vervolgens alle kanalen en het weefselcompartiment door met voorverwarmde HLMVEC-kweekmedia (Materiaaltabel), vergelijkbaar met stap 1.3. De bMFA is nu klaar voor celzaaien.
OPMERKING: Voordat u een slang uit de poort verwijdert/plaatst, plaatst u eerst een druppel water met een pipet rond de basis van de inlaatpoortbuis om te voorkomen dat er lucht in het apparaat komt.
2. BMFA zaaien met HLMVEC
- Cultuur HLMVEC tot 60%- 80% confluency volgens het protocol van de leverancier in een T-25 kolf.
- Aspirate HLMVEC kweekmedia uit celkweekfles. Was tweemaal met PBS.
- Voeg 2 ml voorverwarmde trypsine-EDTA-oplossing (37 °C) toe aan de T-25-kolf. Incubeer gedurende 3-5 minuten in een incubator (37 °C, 5% CO2) totdat de meeste cellen uit de kolf zijn losgemaakt.
OPMERKING: Incubatietijd kan variëren voor verschillende celtypen en trypsine-EDTA-concentratie. - Voeg 2 ml trypsineneutralisatieoplossing (TNS, 37 °C) toe aan de kolf om trypsine-EDTA te neutraliseren.
- Tik zachtjes op de kolf om de cellen te helpen dissociëren. Breng vervolgens de celsuspensieoplossing over naar een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 x g om de endotheelcellen te pelleteren. Verwijder de supernatant- en resuspendcellen in 3 ml celkweekmedia. Tel het aantal cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten bij 150 x g om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen tot de gewenste zaaidichtheid van 20 x 106/ml.
OPMERKING: Afhankelijk van de celtypen en de confluentie kan ongeveer 2 x 106 endotheelcellen worden verzameld uit twee T-25-kolven en met de zaaidichtheid van 20 x 106 / ml is 100 μL van de celsuspensie (2 x 106 endotheelcellen) voldoende om 5 apparaten te zaaien. - Monteer een spuit van 1 ml in de programmeerbare spuitpomp en bevestig de slang aan de stompe naald.
- Trek ~ 20 μL van de celsuspensie in de slang en zorg ervoor dat de celsuspensie zich alleen in de slang bevindt, niet in de spuitcilinder.
- Haal de klem van een uitlaatpoort van het apparaat. Sluit de slang aan op één inlaat van het apparaat. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal worden ingebracht.
- Start de pomp met een debiet van 4-8 μL/min. Observeer het apparaat onder een microscoop.
- Wanneer de kanalen zijn gevuld met cellen, stopt u de pomp, klemt u de uitlaat vast en snijdt u de inlaatbuis door.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen luchtbellen in het apparaat introduceert. - Zet het apparaat gedurende 4 uur in de couveuse bij 5% CO2 en 37 °C.
- Bereid na 4 uur incubatie nog een spuit gevuld met verse celkweekmedia. Monteer de spuit op een spuitpomp, sluit de spuit aan op de inlaatpoort en verwijder de klem uit een uitlaatpoort.
- Laat nieuwe media ongeveer 5 minuten door het apparaat lopen bij 4-8 μL /min om zwevende / niet-vastgemaakte cellen uit te spoelen.
3. Celcultuur onder stroom gedurende 48 uur
- Bereid een spuit gevuld met verse celkweekmedia. Monteer de spuit in een spuitpomp, sluit de spuit aan op één inlaatpoort en houd een uitlaat open. Plaats het apparaat in de incubator (5% CO2, 37 °C).
- Programmeer de spuitpomp voor het kweken van endotheelcellen onder stroom aan de hand van de volgende instructies in tabel 1.
- Controleer bMFA onder een microscoop na 48 uur cultuur onder stroom. HLMVEC moet vasculaire kanalen bedekken die een volledig lumen vormen (figuur 6).
OPMERKING: Andere stroomregimes kunnen nodig zijn voor verschillende celtypen.
4. Cytokine en/of therapeutische behandeling
OPMERKING: Als voorbeeld beschrijft deze sectie het gebruik van bMFA om de impact te bestuderen van de behandeling van de cellen met Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) en een nieuwe ontstekingsremmer (Protein Kinase C delta-TAT peptide inhibitor, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.
- Bereid drie verschillende bMFA-apparaten voor met behulp van het bovenstaande protocol (sectie 1-3).
- Laad drie spuiten van 1 ml met celkweekmedia (TNF-α) (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) + PKCδ-i (5 μM).
OPMERKING: Cytokines worden gereconstitueerd in celkweekmedia. - Sluit de drie spuiten aan op drie bMFA-apparaten. Behandel HLMVEC met buffer TNF-α of TNF-α + remmer gedurende 4 uur bij 0,1 μL/min.
OPMERKING: Op basis van specifieke onderzoeksvereisten kunnen andere cytokines of cytokinecocktails (bijv. TNF-α + Interleukine 1 bèta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)) worden gebruikt om endotheelcellen te behandelen.
5. Menselijke neutrofiele isolatie
- Gebruik alle reagentia bij kamertemperatuur (RT). Reagentia omvatten leukocytenisolatiemedia, 1x HEPES-buffer met Ca2+/Mg2+ (tabel 2), 6% Dextran in normaal zoutoplossing (0,9% NaCl), 3,6% NaCl-oplossing en gedeïoniseerd water (DI) water.
- Pipetteer 20 ml leukocytenisolatiemedia in een conische buis van 50 ml en leg voorzichtig 25 ml bloed over de leukocytenisolatiemedia. Centrifugeer gedurende 40 minuten bij 427 x g bij RT.
OPMERKING: Voer deze stap langzaam en voorzichtig uit om te voorkomen dat de bloed- en leukocytenisolatiemedia worden gemengd. - Aspirateer tot ~ 5 ml boven de rode bloedcellen (RBC) laag. De witte buffy laag bovenop de RBC bestaat voornamelijk uit neutrofielen.
- Voeg hepes-buffer toe om het huidige volume te verdubbelen (bestaand volume: HEPES-buffer = 1:1).
- Voeg een bedrag van 6% Dextran toe, wat 20% van het uiteindelijke volume zal zijn. (huidig volume/4 = volume van toegevoegd 6% Dextran).
- Keer de buis een paar keer voorzichtig om om goed te mengen en laat het RBC-sediment (~ 25 min).
- Pipetteer voorzichtig de bovenste laag (neutrofielrijke laag) en breng over naar een nieuwe buis van 50 ml, pas op dat u niet verontreinigt met gesedimenteerde RBC.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 315 x g bij RT. Verwijder het supernatant en vul de pellet opnieuw op in 8 ml HEPES-buffer.
- Om de resterende RBC te lyseren, voegt u 24 ml DI-water toe en mengt u voorzichtig gedurende 50 s. Voeg onmiddellijk 8 ml 3,6% NaCl-oplossing toe, meng en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 315 x g bij RT.
- Verwijder het supernatant, was de celkorrel met 15 ml HEPES-buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 315 x g. Resuspend de pellet in HEPES-buffer.
6. Neutrofielenadhesie en migratie-experiment met bMFA
- Resuspensie van de geïsoleerde menselijke neutrofielen (15 miljoen) in 999 μL HEPES-buffer.
- Voeg 1 μL CFDA-SE (carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester) kleurstofvoorraadoplossing (10 mM) toe aan neutrofielensuspensie om een werkconcentratie van 10 μM CFDA-SE te verkrijgen en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Was de cellen tweemaal met HEPES-buffer door 5 minuten te centrifugeren bij 315 x g.
- Tel de neutrofielen met behulp van een hemocytometer en resuspend bij 2 miljoen neutrofielen / ml met celkweekmedia, TNF-α (10 ng / ml) en TNF-α (10 ng / ml) + PKCδ-i (5 μM), respectievelijk; incubeer gedurende 15 minuten bij RT voor aanvang van het experiment.
- Bereid een spuit gevuld met 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), het chemoattractant voor het onderzoek, in celkweekmedia. Neem bMFA en open één inlaatpoort en één uitlaatpoort.
OPMERKING: Deze experimentele voorwaarden worden gebruikt om de omstandigheden van sepsis na te bootsen die een systemische ontstekingsreactie met hoge niveaus van circulerende cytokine / chemokines omvatten. Bovendien wordt fMLP, een gramnegatief van bacteriën afgeleid peptide, gebruikt om de aanwezigheid van bacteriën in de longen (d.w.z. weefselcompartiment) te modelleren. - Verwijder de poortslang van het tissuecompartiment en plaats de fMLP-slang. Injecteer ~20 μL fMLP in het weefselcompartiment voor alle bMFA, behalve degene die alleen met celkweekmedia wordt behandeld. Knip vervolgens de slang af en klem deze vast.
- Vul de spuit met ~200 μL neutrofiele suspensie en monteer de spuit op de spuitpomp.
- Plaats het apparaat op de omgekeerde microscooptrap (Materiaaltabel).
- Start de pomp met een debiet van 1 μL/min en wacht tot er een kleine druppel neutrofiele suspensie uit de slang komt. Steek de slang in de inlaatpoort. Zie figuur 7 voor de installatie.
7. Verkrijg afbeeldingen
- Gebruik de functie Grote afbeelding scannen in de microscoopbeeldanalysesoftware (Tabel met materialen) om de adhesiekaart in bMFA (figuur 8) 10 minuten na het starten van het experiment te verkrijgen. De meeste neutrofielen komen tijdens de eerste 10 minuten in bMFA.
OPMERKING: Houd het fluorescentielicht uit wanneer u geen foto's maakt om het fotograferen te verminderen. - Maak het volgende uur timelapse-beelden (1 afbeelding om de 5 minuten) van het weefselcompartiment (figuur 8B, C) voor migratieanalyse om de migratiekaart te verkrijgen.
8. Digitale beeldanalyse
- Tel voor de adhesiekaart het aantal aangehechte neutrofielen in elk vat. Maak voor elke bifurcatie een cirkelvormig interessegebied (ROI) met een diameter gelijk aan twee keer de diameter van het vat en tel het aantal aangehechte neutrofielen.
- Gebruik handmatig tellen of de geautomatiseerde objecttellingfunctie om het aantal aanhangende neutrofielen in elk vat en bifurcatiegebied te kwantificeren.
- Gebruik de afschuifsnelheidskaart van het netwerk die is gegenereerd met CFD-simulatie17 om de afschuifsnelheid in elk schip te bepalen. Zet vervolgens het aantal aangehechte neutrofielen in een bepaald vat uit tegen de afschuifsnelheid in dat vat om een afschuifsnelheidskaart in bMFA te maken zoals weergegeven in figuur 9A.
- Neutrofielen worden als gemigreerd geteld als ze door het endotheel in het weefselcompartiment zijn gekruist. Tel het aantal gemigreerde neutrofielen op 10 min, 15 min, 30 min en 60 min. Plot het aantal gemigreerde neutrofielen versus tijd zoals weergegeven in figuur 9B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 48 uur cultuur onder schuifstroom in bMFA bedekten endotheelcellen het oppervlak van de vasculaire kanalen in bMFA en uitgelijnd in de stroomrichting (figuur 6). Confocale microscopie gaf aan dat alle oppervlakken van de vasculaire kanalen bedekt waren door endotheelcellen, die een volledig 3D-lumen vormden in bMFA18.
Met behulp van dit protocol kan een neutrofielenadhesiekaart worden verkregen, waaruit blijkt dat er een significante hechting van neutrofielen aan endotheelcellen is in bMFA (figuur 8). Het correleren van de ruimtelijke verdeling van neutrofielen in deze adhesiekaart met de afschuifsnelheidskaart gegenereerd uit het CFD-model laat zien dat neutrofielenadhesie afschuifafhankelijk is en dat neutrofielen zich bij voorkeur houden aan regio's met een lage afschuifsnelheid en bifurcatie (figuur 9A). De hechting van neutrofielen aan TNF-α-geactiveerde endotheelcellen nam aanzienlijk toe. Analyse van timelapsebeelden gaf aan dat TNF-α activering van endotheelcellen de neutrofielenmigratie verhoogt als reactie op het chemoattractant fMLP (figuur 9B). Zoals hierboven vermeld, kan bMFA worden gebruikt om snel de werkzaamheid van een nieuw therapeutisch middel voor de behandeling van ontstekingsziekten te testen. Behandeling van endotheelcellen en neutrofielen met PKCδ-i verminderde bijvoorbeeld significant de adhesie en migratie van neutrofielen (figuur 9A,B)27.
Figuur 1: Endotheelcelactivering tijdens ontsteking. (A) Onder normale omstandigheden wordt het vasculaire endotheel bedekt door de glycocalyx en vormt het een strakke barrière die de barrièredoorlaatbaarheid, leukocytenmigratie en ontstekingsremmende afweer reguleert. (B) Tijdens ontsteking worden leukocyten en endotheelcellen geactiveerd door PAMPS en DAMPS om cytokines en chemoattractanten te produceren, wat leidt tot de verhoogde expressie van oppervlaktemoleculen op zowel leukocyten als endotheelcellen, waardoor leukocyten-endotheelinteracties worden verbeterd. Interacties van E / P-selectine op endotheelcellen en hun liganden (bijv. PSGL-1) op leukocyten zijn betrokken bij het rollen, wat de neutrofielen vertraagt. Stevige adhesie wordt gereguleerd door endotheel-uitgedrukte adhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, ICAM-2 en VCAM-1, en hun liganden, β2 integrinen. Als reactie op chemoattractante gradiënten migreren aangehechte leukocyten door endotheelverbindingen gereguleerd door PECAM-1 en JAMs. Geactiveerde leukocyten migreren naar weefsel, waar ze cytokines, reactieve zuurstof / stikstofsoorten en proteasen afgeven om infecties te bestrijden. Ontregelde leukocytenmigratie kan echter orgaanweefsel beschadigen, wat resulteert in orgaanfalen. Tijdens ontsteking wordt de glycocalyx afgebroken, worden endotheelcel tight junctions beschadigd en is er verhoogde endotheelcelapoptose, wat leidt tot een beschadigde barrièrefunctie en verhoogde permeabiliteit. Dit cijfer is aangepast van Yang et al.2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de bMFA. (A) Afbeeldingen van de muiscremasterspier worden verkregen en (B) gedigitaliseerd met behulp van het GIS-systeem om het netwerk op PDMS te fabriceren. (C) Bright-field afbeelding van het bMFA-netwerk laat zien dat in bMFA vasculaire kanalen verbonden zijn met het weefselcompartiment via een barrière van 3 μm (de schematische insert in Panel C). Stroomrichting van de vasculaire kanalen is aangegeven. (D) Een bMFA-chip, bestaande uit een PDMS-laag die aan een microscoopglaasje is gebonden, bevindt zich op het microscoopstadium. De slang wordt in twee inlaatpoorten, twee uitlaatpoorten en één weefselcompartimentpoort geplaatst. (C: schaalbalk = 500 μm) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Transiënte perfusiestudies waarin experimentele en simulatieresultaten in bMFA worden vergeleken. (A) Het netwerk van bMFA dat de inlaat-, uitlaat- en stroomrichting weergeeft. (B) Bovenpaneel: CFD-perfusieprofielen. Onderste paneel: Experimentele perfusieprofielen. Afbeeldingen zijn pseudo-gekleurd om verlopen weer te geven. De schaal is genormaliseerd met blauw (geen perfusie; 0) en magenta (volledige perfusie; 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Velocity and shear rates profile in bMFA from CFD simulations. (A) Distribution of velocity magnitudes (Vmag) across the network. (B) De verdeling van de afschuifsnelheid geeft heterogene afschuifsnelheden in het netwerk aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Neutrofiele adhesiepatronen in bMFA zijn vergelijkbaar met neutrofiele adhesiepatronen in vivo. De verdelingen van het aantal aangehangen neutrofielen in vivo en het aantal neutrofielen in bMFA zijn beide naar links scheefgetrokken, wat aangeeft dat neutrofielen zich bij voorkeur hechten in de buurt van bifurcaties waarbij de piek optreedt bij één vat of kanaaldiameter van de dichtstbijzijnde bifurcatie (gemiddelde ± SEM; N = 3). De afstand van aangehangen neutrofielen tot de dichtstbijzijnde bifurcatie werd als volgt genormaliseerd: genormaliseerde afstand = afstand tot het centrum van de dichtstbijzijnde bifurcatie/diameter van het kanaal. Dit cijfer is gewijzigd van Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716 moeten verdere toestemmingen met betrekking tot het materiaalfragment worden gericht aan de American Chemical Society). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Endotheelcellen vormen een compleet 3D-lumen in de bMFA. (A) Fasecontrastbeelden laten zien dat endotheelcellen in de stroomrichting staan opgesteld. (B) Fluorescentiebeelden laten zien dat endotheelcellen het vasculaire kanaal bedekken; F-actine wordt groen gelabeld met falloïdine en kernen worden rood gelabeld met Draq5. (A: schaalbalk = 100 μm, B: schaalbalk = 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Een computergestuurde omgekeerde fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt om neutrofiel-endotheelinteracties in bMFA te bestuderen. Een computergestuurd podium met een warmer wordt gebruikt om de bMFA op 37 °C te houden. De bMFA is aangesloten op een programmeerbare spuitpomp door de slang. De omgekeerde fluorescentiemicroscoop is uitgerust met een videocamera om foto's/video's te maken voor verdere offline analyse op de computer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Representatieve beelden van neutrofielenadhesie en migratiekaart. (A) Neutrofiel adhesiekaart in bMFA. De opname werd 10 minuten na het begin van het experiment gemaakt met behulp van de "Scan grote kaart" -functie van Nikon-software. De witte stippen in de kaart zijn fluorescerend gelabeld neutrofielen met CFDA-SE. Vasculaire kanaalgrens wordt digitaal gelabeld (schaalbalk = 100 μm). (B) Neutrofielen migratiekaart in bMFA zonder TNF-α activering. De foto is 60 min na aanvang van het experiment gemaakt. (C) Neutrofielen migratiekaart in bMFA met TNF-α activering. De foto is 60 min na aanvang van het experiment gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Patronen van neutrofielenadhesie en migratie in bMFA tijdens ontsteking. (A) Behandeling met TNF-α verhoogde significant de adhesie van neutrofielen bij de mens aan menselijke pulmonale microvasculaire endotheelcellen, die werd geremd na behandeling met een PKCδ-remmer. Neutrofielenadhesie trad bij voorkeur op in vaten met een lage afschuifsnelheid en bijna-bifurcaties in bMFA. (B) Als reactie op fMLP was de migratie van menselijke neutrofielen over TNF-α geactiveerde endotheelcellen significant verhoogd in vergelijking met onbehandelde cellen. Behandeling met de PKCδ-remmer verminderde de migratie tot onbehandelde niveaus. n = 4, gemiddelde ± SEM, eenrichtings-ANOVA, ** p < 0,01 en *** p < 0,001). Het cijfer is aangepast van Soroush et al.27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stap 1: Constante snelheid | Opmerkingen | |
| Wijze | Zetten | |
| Debiet | 1 μL/min | |
| Tijd | 10 min. | |
| Stap 2: Vertraging (geen stroom) | ||
| Wijze | Uitstellen | |
| Tijd | 4 uur | |
| Stap 3: Herhaal | Stap 1 en stap 2 worden 6 keer herhaald voordat ze naar stap 4 gaan. | |
| Wijze | Herhalen | |
| Herhaal van | Stap 1 | |
| Herhalen | 6 keer | |
| Stap 4: Constant debiet | ||
| Wijze | Zetten | |
| Debiet | 0,1 μL/min | |
| Tijd | 48 u |
Tabel 1: Spuitpompprogramma
| Formule | Naam | MW | Toevoegen | Concentratie | 10x HEPES buffer (Voeg DI-water toe aan 1000 ml en stel de pH in op 7,3. Verdun tot 1x voor gebruik) |
| NaCl | Tafelzout | 58.44 | 87,66 g | 1,5 m | |
| KOH | Kaliumhydroxide | 56.11 | 2,81 g | 50 meter | |
| Hepes | Hepes | 238.3 | 23,83 g | 100m | |
| MgCl2 | Magnesiumchloride | 203.31 | 2,44 g | 12m | |
| CaCl2 Zoekertjes | Calciumchloride | 147.62 | 1,90 g | 12,9 mM |
Tabel 2: HEPES-buffersamenstelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bMFA reproduceert de topografie en stromingscondities van de in vivo microvasculaire netwerken en kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteractie en endotheelfunctie in vitro te bestuderen onder fysiologisch realistische omstandigheden. In de microvasculatuur van muis of mens is de geometrie van de microvasculaire netwerken zelfgelijkaardig en fractaal, en het Reynolds-getal << 1, wat aangeeft dat vasculaire geometrie geen significante invloed heeft op stromingspatronen. Daarom kan de bFMA worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties voor verschillende soorten, waaronder mensen, te bestuderen, hoewel de microvasculatuur van muizencremasterspier in kaart werd gebracht om bMFA te produceren.
De bMFA maakt de real-time beoordeling van individuele stappen van de neutrofielenmigratiecascade in één enkele test mogelijk, inclusief rollende, stevige adhesie, verspreiding en migratie van neutrofielen in het weefselcompartiment. Primaire menselijke cellen en klinisch relevante monsters kunnen in bMFA worden gebruikt om de vertaalbaarheid te vergroten en potentiële therapieën snel te screenen. In vergelijking met traditionele vloeistofsystemen zoals parallelle plaatstroomkamers, heeft bMFA het voordeel dat het minder dan 95% van de reagentia37 gebruikt vanwege de kleine vatgroottes en het feit dat het de hele neutrofiele migratiecascade in één enkele test kan bestuderen. Dit kleine formaat vereist echter ook dat gebruikers met een zeer klein volume reagentia werken, wat een uitdaging kan zijn en uitgebreide oefening vereist. Het meest voorkomende probleem met dit protocol is de aanwezigheid van luchtbellen in bMFA, die het kanaal kunnen blokkeren en de stroompatronen kunnen veranderen. Daarom moet grote zorg worden besteed aan het verwijderen of inbrengen van buizen in de poorten en moet een druppel water aan de basis van de buis in de poorten worden geplaatst om te voorkomen dat lucht het kanaal binnendringt wanneer buizen uit bMFA worden verwijderd.
Naast de toepassing van bMFA voor het bestuderen van neutrofiel-endotheelinteracties, is de bMFA ook gebruikt om de integriteit van endotheel tijdens ontsteking te bestuderen door variabelen zoals permeabiliteit en transendotheliale endotheelresistentie (TEER) te meten27. Bovendien kan bMFA, door microdeeltjes te functionaliseren met specifieke antilichamen, worden gebruikt om de expressie van adhesiemoleculen op endotheelcellen tebestuderen 27. Er werd aangetoond dat de ontstekingsreactie ook kon worden geupreguleerd door andere stimuli in de bMFA, zoals ioniserende straling, en bMFA is gebruikt om door straling geïnduceerde endotheelcelbeschadiging en neutrofiel-endotheelinteracties te bestuderen29. Een ander voordeel van dit apparaat is dat endotheelcellen, neutrofielen en/of andere bloedcellen of geneesmiddeldragende deeltjes kunnen worden geïsoleerd uit microvasculaire kanalen en/of weefselcompartiment voor verdere analyse. Bovendien kunnen cellen/deeltjes die geen interactie hebben gehad met de endotheelcellen in het apparaat worden geïsoleerd uit het effluent dat het apparaat verlaat. Pericyten en de bijbehorende weefseltypen kunnen ook in het apparaat worden gekweekt om de in vivo omstandigheden beter weer te geven. Kortom, het hier gepresenteerde protocol biedt een fysiologisch relevante omgeving in bMFA om leukocyten-endotheelcelinteracties tijdens ontsteking te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 en GM134701 (M.F.K. en L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), en Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. en L.E.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
