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Bioengineering

सूजन के दौरान ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम

Published: December 9, 2021 doi: 10.3791/63312
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 1,2,6
1Department of Mechanical Engineering, Temple University, 2Department of Bioengineering, Temple University, 3Department of Bioengineering, University of Toledo, 4Biomedical Technology, CFD Research Corporation, 5Center for Inflammation and Lung Research, Department of Microbiology, Immunology and Inflammation, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 6Department of Radiation Oncology, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, एक बायोमिमेटिक माइक्रोफ्लुइड परख, जो एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोवैस्कुलर वातावरण को पुन: पेश कर सकता है और पूरे ल्यूकोसाइट आसंजन / माइग्रेशन कैस्केड को पुन: पेश कर सकता है, भड़काऊ बीमारी में ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है।

Abstract

ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन सेप्सिस जैसे भड़काऊ रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सूजन के दौरान, संवहनी एंडोथेलियम में सक्रिय ल्यूकोसाइट्स के अत्यधिक प्रवास को प्रमुख अंगों में अंग विफलता का कारण बन सकता है। एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बायोमिमेटिक माइक्रोफ्लुइडिक परख (बीएमएफए) को कई प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल तकनीकों का उपयोग करके विकसित और मान्य किया गया है, जो ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पूरे ल्यूकोसाइट रोलिंग / आसंजन / माइग्रेशन कैस्केड को पुन: पेश कर सकता है। कृन्तकों में विवो छवियों से प्राप्त माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क को एक भौगोलिक सूचना प्रणाली (जीआईएस) दृष्टिकोण का उपयोग करके डिजिटाइज़ किया गया था और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) के साथ माइक्रोफैब्रिकेटेड किया गया था। ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन पर कतरनी दर और संवहनी टोपोलॉजी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, पूरे नेटवर्क में कतरनी दरों और वेगों का एक संबंधित नक्शा उत्पन्न करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल द्रव गतिशीलता (सीएफडी) मॉडल विकसित किया गया था। बीएमएफए ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल कोशिकाओं की बातचीत के परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है, जिसमें रोलिंग वेग, विभिन्न कतरनी दरों के जवाब में पालन किए गए ल्यूकोसाइट्स की संख्या, माइग्रेटेड ल्यूकोसाइट्स की संख्या, एंडोथेलियल सेल पारगम्यता, आसंजन अणु अभिव्यक्ति और अन्य महत्वपूर्ण चर शामिल हैं। इसके अलावा, मानव से संबंधित नमूनों का उपयोग करके, जैसे कि मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं और ल्यूकोसाइट्स, बीएमएफए संभावित चिकित्सीय की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए एक उपकरण प्रदान करता है ताकि उनकी नैदानिक अनुवादक्षमता को बढ़ाया जा सके।

Introduction

सूजन संक्रमण और चोट के लिए मेजबान प्रतिक्रिया है, और एंडोथेलियम भड़काऊ प्रतिक्रिया 1,2,3 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। भड़काऊ विकृति सेप्सिस, हृदय रोग, अस्थमा, सूजन आंत्र रोग, कैंसर और कोविड -19 जैसे कई रोग विकृतियों का अंतर्निहित कारण है। ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन इन भड़काऊ बीमारियों में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। सूजन के दौरान, रोगजनकों या घायल ऊतकों से DAMPS (क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न) से पीएएमपीएस (रोगज़नक़-संबद्ध आणविक पैटर्न) की रिहाई साइटोकिन्स / केमोकाइन्स और अन्य प्रोइंफ्लेमेटरी मध्यस्थों को छोड़ने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करती है जो एंडोथेलियम के सक्रियण का कारण बनती है, जिसके परिणामस्वरूप संवहनी एंडोथेलियम बाधा समारोह में परिवर्तन होता है और पारगम्यता में वृद्धि होतीहै 3,4 . सूजन के दौरान एंडोथेलियल कोशिकाओं की बढ़ती सक्रियता के परिणामस्वरूप ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन में वृद्धि होती है, जिससे संवहनी एंडोथेलियम में सक्रिय ल्यूकोसाइट्स का अत्यधिक प्रवास होताहै 1,5,6,7।

ल्यूकोसाइट्स की भर्ती बायोएक्टिव लिपिड, साइटोकिन्स, केमोकिन्स और पूरक घटकों 8,9 से बने रासायनिक रूप से विविध chemoattractants द्वारा शुरू की जाती है। ल्यूकोसाइट भर्ती एक बहु-चरणीय प्रक्रिया है जिसमें पांच असतत चरण शामिल हैं: 1) ल्यूकोसाइट मार्जिनेशन और कैप्चर / अनुलग्नक, 2) रोलिंग, 3) फर्म गिरफ्तारी, 4) प्रसार और रेंगना और 5) एक्सट्रावेशन / माइग्रेशन (चित्रा 1)। इस प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में ल्यूकोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच क्रॉसस्टॉक की आवश्यकता होती है ताकि इस गतिशील घटनाको व्यवस्थित किया जा सके। आखिरकार, गिरफ्तार ल्यूकोसाइट्स एंडोथेलियम में सूजन वाले ऊतकों को समवर्ती केमोअट्रैक्टेंट-निर्भर संकेतों, चिपकने वाली घटनाओं और हेमोडायनामिक कतरनी बलों द्वारा नियंत्रित एक बहु-चरणीय प्रक्रिया के माध्यम से 1,9,10,11,12 के माध्यम से extravasate करते हैं।

एंडोथेलियल सेल फ़ंक्शन को विनियमित करने में कतरनी तनाव की केंद्रीय भूमिका और ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियम सेल इंटरैक्शन13 के महत्व को देखते हुए, पिछले कुछ दशकों के दौरान अधिक नियंत्रित वातावरण में ल्यूकोसाइट माइग्रेशन कैस्केड के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए कई इन विट्रो मॉडल विकसित किए गएहैं। ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक तरल उपकरणों को दो व्यापक श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकताहै 14: ए) ल्यूकोसाइट रोलिंग, आसंजन और आसंजन अणु अभिव्यक्ति जैसे समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों और बी) ट्रांसवेल कक्षों जैसे स्थिर परिस्थितियों में ल्यूकोसाइट माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए उपकरण। समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों जैसी प्रणालियों का उपयोग कतरनी बलों के तहत आसंजन कैस्केड में आसंजन अणुओं और उनके लिगेंड की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। हालांकि, एक महत्वपूर्ण दोष यह है कि ये सरलीकृत, आदर्शीकृत उपकरण (उदाहरण के लिए, सीधे चैनल) विवो माइक्रोवैस्कुलचर (जैसे, क्रमिक संवहनी विभाजन, संवहनी आकृति विज्ञान) और परिणामी प्रवाह स्थितियों (जैसे, विभाजन पर अभिसरण या विचलन प्रवाह) के पैमाने और ज्यामिति को पुन: उत्पन्न करने में सक्षम नहीं हैं। नतीजतन, ये उपकरण केवल आसंजन को मॉडल कर सकते हैं लेकिन ट्रांसमाइग्रेशन नहीं। Transwell कक्षों में विवो ज्यामितीय सुविधाओं और प्रवाह की स्थिति पर विचार किए बिना स्थिर परिस्थितियों के तहत transmigration का अध्ययन कर सकते हैं। इस प्रकार, ये पारंपरिक मॉडल जीवित ऊतकों के माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल नहीं करते हैं या एक ही परख 6 में आसंजन और माइग्रेशन कैस्केड को हल करतेहैं।

इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने विकसित किया है और बड़े पैमाने पर एक उपन्यास 3 डी बायोमिमेटिक माइक्रोफ्लुइडिक परख (बीएमएफए) (चित्रा 2) को मान्य किया है, जो वास्तविक रूप से एक चिप16,17,18 पर विवो माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क में पुन: पेश करता है। इस डिवाइस के microfabrication के लिए प्रोटोकॉल पहले17 प्रकाशित किया गया है और केवल संक्षेप में यहाँ वर्णित है. माउस क्रेमास्टर मांसपेशी के माइक्रोवैस्कुलचर को एक संशोधित भौगोलिक सूचना प्रणाली (जीआईएस) दृष्टिकोण19 का उपयोग करके डिजिटाइज़ किया गया था। फिर, सिंथेटिक माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) पर डिजिटलीकृत माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क 14,17,20,21,22 के आधार पर नरम-लिथोग्राफी प्रक्रियाओं का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। संक्षेप में, डिजिटाइज्ड नेटवर्क छवियों को माइलर फिल्म पर मुद्रित किया गया था, जिसे तब निर्माण के लिए स्वामी बनाने के लिए एक सिलिकॉन वेफर के शीर्ष पर एक एसयू -8 सकारात्मक फोटोरेसिस्ट को पैटर्न करने के लिए एक मुखौटा के रूप में उपयोग किया गया था। माइक्रोफैब्रिकेटेड स्तंभों (10 μm व्यास, 3 μm लंबा) का उपयोग 3 μm उच्च और 100 μm चौड़े छिद्रों को बनाने के लिए किया गया था, जो ल्यूकोसाइट माइग्रेशन23,24,25 के लिए एक इष्टतम आकार है, जो संवहनी चैनलों और ऊतक डिब्बों को जोड़ता है। पीडीएमएस को निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया गया था और विकसित स्वामी पर डाला गया था। इसके अलावा, पीडीएमएस को डीगैस किया गया था और पीडीएमएस में पूरक माइक्रोचैनल बनाने के लिए ओवन (65 डिग्री सेल्सियस) में रात भर इलाज करने की अनुमति दी गई थी। बाद में, ठीक पीडीएमएस को एसयू -8 मास्टर से छील दिया गया था, इसके बाद इनलेट्स / आउटलेट्स के लिए बंदरगाहों को छिद्रित किया गया था। फिर, पीएमडीएस प्लाज्मा एक ग्लास स्लाइड से बंधा हुआ था। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की सतह में देशी ग्लास और पीडीएमएस शामिल हैं। सेल अनुलग्नक, प्रसार और प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, एक्स्ट्रासेल्यूर मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटिंग की आवश्यकता होती है। बीएमएफए में एक माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क और 3 μm उच्च और 100 μm चौड़े छिद्रों (चित्रा 2) के माध्यम से जुड़ा एक ऊतक डिब्बा शामिल है। यह माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली पूरे ल्यूकोसाइट आसंजन / माइग्रेशन कैस्केड को एक पूर्ण माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क के शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी वातावरण में इंटरकनेक्टिंग जहाजों और विभाजनों के साथ पुन: पेश करती है, जिसमें परिसंचरण, मार्जिनेशन, रोलिंग, आसंजन और एक ही प्रणाली में अतिरिक्त-संवहनी ऊतक डिब्बे में ल्यूकोसाइट्स का प्रवास शामिल है 14,16,17,21,26।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां तक कि जब बीएमएफए के इनलेट पर प्रवाह दर तय की जाती है, तो नेटवर्क में प्रवाह की स्थिति अलग-अलग स्थानों पर भिन्न होती है और एक साधारण गणितीय सूत्र द्वारा गणना नहीं की जा सकती है। एक कम्प्यूटेशनल द्रव गतिशीलता (सीएफडी) -आधारित मॉडल नेटवर्क में विभिन्न स्थानों पर विभिन्न प्रवाह मापदंडों (जैसे, कतरनी तनाव, कतरनी दर, वेग) की गणना करने के लिए विकसित किया गया था। इस CFD मॉडल का उपयोग bMFA में डाई परफ्यूजन पैटर्न और प्रवाह पैरामीटर का अनुकरण करने के लिए किया गया था। प्रयोगात्मक परिणामों के साथ क्रॉस-सत्यापन ने सुझाव दिया कि नेटवर्क भर में प्रवाह प्रतिरोधों को कम्प्यूटेशनल मॉडल (चित्रा 3) 17 द्वारा अच्छी तरह से भविष्यवाणी की गई है। इस CFD मॉडल का उपयोग तब bMFA (चित्रा 4) के प्रत्येक पोत में वेग और कतरनी दर प्रोफ़ाइल का अनुमान लगाने के लिए किया गया था, जिससे ल्यूकोसाइट रोलिंग, आसंजन और माइग्रेशन 16 पर कतरनी प्रवाह और ज्यामिति के प्रभावों का विश्लेषण कियाजा सकता है। ल्यूकोसाइट्स अधिमानतः विभाजन के पास और विवो में कम कतरनी क्षेत्रों में पालन करते हैं, और ल्यूकोसाइट आसंजन के इन स्थानिक पैटर्न को न्यूट्रोफिल (चित्रा 5) 16 का उपयोग करके बीएमएफए में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया था। यह पेपर मानव फेफड़े के माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएलएमवीईसी) और मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करके भड़काऊ परिस्थितियों में ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बीएमएफए तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम, जैसे कि बीएमएफए, का उपयोग विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं जैसे कि न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स, लिम्फोसाइट्स और ट्यूमर कोशिकाओं 18,27,28,29,30 के साथ एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। बीएमएफए को विभिन्न अंगों (जैसे, फेफड़े बनाम मस्तिष्क) और विभिन्न प्रजातियों (जैसे, मानव बनाम मुरीन एंडोथेलियल कोशिकाओं) से प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ जोड़ा जा सकता है, साथ ही साथ एंडोथेलियल सेललाइनों 21,27,31,32। बीएमएफए का उपयोग कई सेलुलर प्रतिक्रियाओं, सेल-सेल इंटरैक्शन, बाधा समारोह, दवा वितरण और दवा विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

हेपरिनाइज्ड मानव रक्त स्वस्थ वयस्क दाताओं (पुरुषों और महिलाओं, 21 और 60 वर्ष की आयु के बीच की आयु के बीच) से न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए प्राप्त किया जाता है, मंदिर विश्वविद्यालय (फिलाडेल्फिया, पीए, यूएसए) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित सूचित सहमति के बाद।

1. भड़काना और मानव फाइब्रोनेक्टिन के साथ डिवाइस कोटिंग

नोट:: bMFA दो इनलेट पोर्ट और संवहनी डिब्बे से जुड़े दो आउटलेट पोर्ट है। इसमें ऊतक डिब्बे से जुड़ा एक बंदरगाह भी है (चित्र2)।

  1. टयूबिंग (0.06 का O.D. और 0.02"का ID) (सामग्री की तालिका) को सभी बंदरगाहों पर डालें, सिवाय ठीक-बिंदु संदंश के साथ एक इनलेट पोर्ट के लिए। जबड़े clamps के साथ दो आउटलेट बंदरगाहों और ऊतक कम्पार्टमेंट बंदरगाह क्लैंप. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक टयूबिंग लंबाई में ~ 1 इंच है।
  2. फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान (1mg / mL) से PBS के साथ मानव फाइब्रोनेक्टिन को 100 μg / mL तक पतला करें। तैयार फाइब्रोनेक्टिन समाधान के साथ एक 1 एमएल सिरिंज लोड करें। सिरिंज को 24 जी कुंद सुई और एक ~ 4 इंच लंबी टयूबिंग से कनेक्ट करें।
    नोट: क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए, मिश्रण / पिपेट मानव फाइब्रोनेक्टिन पर न करें। कोलेजन जैसे अन्य बाह्य कोशिकीय आव्यूहों (ईसीएम) का उपयोग विभिन्न सेल प्रकारों के लिए किया जा सकता है।
  3. खुले इनलेट पोर्ट में टयूबिंग डालें, प्लंजर को तब तक धक्का दें जब तक कि मानव फाइब्रोनेक्टिन अन्य इनलेट पोर्ट से बाहर न आ जाए, फिर इसे क्लैंप करें। बंदरगाहों के बाकी हिस्सों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि सभी चैनल, ऊतक डिब्बे और टयूबिंग मानव फाइब्रोनेक्टिन समाधान से भरे न हों। सुई को हटा दें लेकिन 4-इंच लंबी टयूबिंग को डाला और अनक्लैम्प्ड रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि टयूबिंग फाइब्रोनेक्टिन से भरा हुआ है इससे पहले कि यह clamped है।
  4. degassing के लिए, वायवीय प्राइमर के माध्यम से एक संपीड़ित नाइट्रोजन टैंक के लिए unclamped टयूबिंग कनेक्ट, ~ 5 साई के लिए दबाव को समायोजित करें और ~ 15 मिनट के लिए चलाने के लिए।
  5. 15 मिनट के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि डिवाइस में कोई हवा के बुलबुले नहीं फंसे हैं। यदि चैनल या ऊतक डिब्बे में फंसे हुए हवा के बुलबुले हैं, तो डिवाइस को फिर से डीगैसिंग के लिए वायवीय प्राइमर से फिर से कनेक्ट करें, यानी, चरण 1.4 को दोहराएं।
    नोट: उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग इस प्रोटोकॉल में माइक्रोस्कोपी को शामिल करने वाले सभी चरणों में किया जाता है।
  6. वायवीय प्राइमर से डिवाइस निकालें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस को इनक्यूबेट करें, फिर सभी चैनलों और ऊतक डिब्बे को पूर्व-गर्म एचएलएमवीईसी संस्कृति मीडिया (सामग्री की तालिका) के साथ फ्लश करें, जो चरण 1.3 के समान है। बीएमएफए अब सेल सीडिंग के लिए तैयार है।
    नोट: पोर्ट से टयूबिंग को हटाने / डालने से पहले, पहले इनलेट पोर्ट ट्यूबिंग के आधार के चारों ओर एक पिपेट के साथ पानी की एक बूंद रखें ताकि हवा को डिवाइस में प्रवेश करने से रोका जा सके।

2. HLMVEC के साथ bMFA सीडिंग

  1. संस्कृति HLMVEC करने के लिए 60% - एक T-25 फ्लास्क में विक्रेता के प्रोटोकॉल के अनुसार 80% confluency.
  2. सेल संस्कृति फ्लास्क से Aspirate HLMVEC संस्कृति मीडिया। पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  3. टी -25 फ्लास्क में पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (37 डिग्री सेल्सियस) के 2 एमएल जोड़ें। एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि अधिकांश कोशिकाएं फ्लास्क से अलग न हो जाएं।
    नोट:: इनक्यूबेशन समय विभिन्न सेल प्रकार और ट्रिप्सिन-EDTA एकाग्रता के लिए भिन्न हो सकता है।
  4. ट्रिप्सिन-ईडीटीए को बेअसर करने के लिए फ्लास्क में ट्रिप्सिन न्यूट्रलाइजेशन सॉल्यूशन (टीएनएस, 37 डिग्री सेल्सियस) के 2 एमएल जोड़ें।
  5. कोशिकाओं को अलग करने में मदद करने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें। फिर, सेल निलंबन समाधान को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. एंडोथेलियल कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 150 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सेल संस्कृति मीडिया के 3 mL में supernatant और resuspend कोशिकाओं को निकालें। हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  7. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 150 x g पर 5 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें और 20 x 106 / mL के वांछित सीडिंग घनत्व के लिए कोशिकाओं resuspend.
    नोट: सेल प्रकार और confluency के आधार पर, लगभग 2 x 106 एंडोथेलियल कोशिकाओं को दो टी -25 फ्लास्क से एकत्र किया जा सकता है, और 20 x 106 / एमएल के सीडिंग घनत्व के साथ, सेल निलंबन के 100 μL (2 x 106 एंडोथेलियल कोशिकाएं), बीज 5 उपकरणों के लिए पर्याप्त है।
  8. प्रोग्राम योग्य सिरिंज पंप में एक 1 एमएल सिरिंज माउंट, कुंद सुई के लिए टयूबिंग संलग्न।
  9. टयूबिंग में सेल निलंबन के ~ 20 μL ड्रा, सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन केवल टयूबिंग में है, सिरिंज बैरल में नहीं है।
  10. डिवाइस के आउटलेट पोर्ट से क्लैंप लें। टयूबिंग को डिवाइस के एक इनलेट से कनेक्ट करें. सुनिश्चित करें कि चैनल में कोई हवा के बुलबुले पेश नहीं किए जाते हैं।
  11. 4-8 μL / मिनट की प्रवाह दर के साथ पंप शुरू करें। माइक्रोस्कोप के तहत डिवाइस का निरीक्षण करें।
  12. जब चैनल कोशिकाओं से भरे होते हैं, तो पंप को रोकें, आउटलेट को क्लैंप करें, और इनलेट टयूबिंग को काट दें।
    नोट: ध्यान रखें कि डिवाइस में हवा के बुलबुले पेश न करें।
  13. डिवाइस को इनक्यूबेटर में 5% CO2 और 37 °C पर 4 घंटे के लिए रखें।
  14. 4 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, ताजा सेल संस्कृति मीडिया से भरा एक और सिरिंज तैयार करें। एक सिरिंज पंप पर सिरिंज माउंट, इनलेट बंदरगाह के लिए सिरिंज कनेक्ट और एक आउटलेट बंदरगाह से क्लैंप को हटाने.
  15. फ्लोटिंग / असंबद्ध कोशिकाओं को धोने के लिए 4-8 μL / मिनट पर लगभग 5 मिनट के लिए डिवाइस के माध्यम से ताजा मीडिया चलाएं।

3. 48 ज के लिए प्रवाह के तहत सेल संस्कृति

  1. ताजा सेल संस्कृति मीडिया से भरा एक सिरिंज तैयार करें। एक सिरिंज पंप में सिरिंज माउंट, सिरिंज एक इनलेट बंदरगाह से सिरिंज कनेक्ट और एक आउटलेट खुला रखें। इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस) में डिवाइस रखो।
  2. सारणी 1 में उल्लिखित निम्नलिखित निर्देशों का उपयोग करके प्रवाह के तहत एंडोथेलियल कोशिकाओं को संवर्धित करने के लिए सिरिंज पंप को प्रोग्राम करें।
  3. प्रवाह के तहत संस्कृति के 48 ज के बाद एक माइक्रोस्कोप के तहत bMFA की जाँच करें। एचएलएमवीईसी को एक पूर्ण लुमेन बनाने वाले संवहनी चैनलों को कवर करना चाहिए (चित्रा 6)।
    नोट:: अन्य प्रवाह regimes विभिन्न सेल प्रकार के लिए आवश्यक हो सकता है।

4. साइटोकाइन और / या चिकित्सीय उपचार

नोट: एक उदाहरण के रूप में, यह खंड ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α) और एक उपन्यास विरोधी भड़काऊ अवरोधक (प्रोटीन किनेज सी डेल्टा-टीएटी पेप्टाइड इनहिबिटर, पीकेसी-आई) 18,27,32,33,34,35,36 के साथ कोशिकाओं के इलाज के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बीएमएफए का उपयोग करने का वर्णन करता है।

  1. उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके तीन अलग-अलग बीएमएफए डिवाइस तैयार करें (अनुभाग 1-3)।
  2. सेल कल्चर मीडिया के साथ तीन 1 एमएल सिरिंज लोड करें, (टीएनएफ-α) (10 एनजी / एमएल), टीएनएफ-α (10 एनजी / एमएल) + पीकेसी -आई (5 μM), क्रमशः।
    नोट: साइटोकिन्स सेल संस्कृति मीडिया में पुनर्गठित कर रहे हैं।
  3. तीन सिरिंज को तीन bMFA उपकरणों से कनेक्ट करें। बफर TNF-α या TNF-α + अवरोधक के साथ HLMVEC का इलाज 0.1 μL / मिनट पर 4 घंटे के लिए।
    नोट: विशिष्ट अध्ययन आवश्यकताओं के आधार पर, अन्य साइटोकिन्स या साइटोकाइन कॉकटेल (उदाहरण के लिए, टीएनएफ-α + इंटरल्यूकिन 1 बीटा (आईएल 1-β) + इंटरफेरॉन-गामा (आईएफएन-γ)) का उपयोग एंडोथेलियल कोशिकाओं के इलाज के लिए किया जा सकता है।

5. मानव न्यूट्रोफिल अलगाव

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर सभी अभिकर्मकों का उपयोग करें। अभिकर्मकों में ल्यूकोसाइट अलगाव मीडिया, Ca2+ / Mg 2+ (तालिका 2) के साथ 1x HEPES बफर, सामान्य खारा (0.9% NaCl) में 6% Dextran, 3.6% NaCl समाधान और डी-आयनीकृत पानी (DI) पानी शामिल हैं।
  2. पिपेट 20 मिलीलीटर ल्यूकोसाइट अलगाव मीडिया को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में और ल्यूकोसाइट अलगाव मीडिया पर ध्यान से 25 मिलीलीटर रक्त की परत। आरटी पर 427 x g पर 40 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: रक्त और ल्यूकोसाइट अलगाव मीडिया के मिश्रण से बचने के लिए इस चरण को धीरे-धीरे और सावधानी से निष्पादित करें।
  3. लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) परत के ऊपर ~ 5 मिलीलीटर तक एस्पिरेट करें। आरबीसी के शीर्ष पर सफेद बफी परत मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल है।
  4. वर्तमान वॉल्यूम (मौजूदा वॉल्यूम: HEPES बफ़र = 1:1) को दोगुना करने के लिए HEPES बफ़र जोड़ें।
  5. 6% Dextran की राशि जोड़ें, जो अंतिम मात्रा का 20% होगा। (वर्तमान आयतन/4 = जोड़ा गया 6% Dextran का आयतन)।
  6. अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे कुछ बार उलटें और आरबीसी तलछट (~ 25 मिनट) को जाने दें।
  7. ऊपरी परत (न्यूट्रोफिल-समृद्ध परत) को ध्यान से पिपेट करें और एक नई 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, तलछट आरबीसी के साथ दूषित न होने के लिए सावधान रहें।
  8. RT पर 315 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। supernatant निकालें और HEPES बफर के 8 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. अवशिष्ट आरबीसी को लाइस करने के लिए, डीआई पानी के 24 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से 50 सेकंड के लिए मिलाएं। तुरंत, 3.6% NaCl समाधान के 8 mL जोड़ें, मिश्रण और RT पर 315 x g पर 10 मिनट के लिए centrifuge.
  10. supernatant निकालें, HEPES बफर के 15 mL के साथ सेल गोली धोएं और 315 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज . HEPES बफर में गोली resuspend.

6. न्यूट्रोफिल आसंजन और bMFA के साथ प्रवास प्रयोग

  1. HEPES बफर के 999 μL में अलग-थलग मानव न्यूट्रोफिल (15 मिलियन) को फिर से निलंबित कर दिया।
  2. 10 μM CFDA-SE की कार्यशील सांद्रता प्राप्त करने के लिए न्यूट्रोफिल सस्पेंशन में 1 μL CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) डाई स्टॉक समाधान (10 mM) जोड़ें और RT पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 315 x g पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा HEPES बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  3. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके न्यूट्रोफिल की गणना करें और सेल कल्चर मीडिया, टीएनएफ-α (10 एनजी / एमएल) और टीएनएफ-α (10 एनजी / एमएल) + पीकेसी -आई (5 μM) के साथ क्रमशः 2 मिलियन न्यूट्रोफिल / एमएल पर पुन: निलंबित करें; प्रयोग की शुरुआत से पहले आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. सेल कल्चर मीडिया में 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), अध्ययन के लिए chemoattractant से भरा एक सिरिंज तैयार करें। बीएमएफए लें और एक इनलेट पोर्ट और एक आउटलेट पोर्ट खोलें।
    नोट: इन प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग सेप्सिस की स्थितियों की नकल करने के लिए किया जाता है जिसमें साइटोकाइन / केमोकिन्स के उच्च स्तर के साथ एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया शामिल होती है। इसके अलावा, एफएमएलपी, एक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया-व्युत्पन्न पेप्टाइड, का उपयोग फेफड़ों में बैक्टीरिया की उपस्थिति (यानी, ऊतक डिब्बे) को मॉडल करने के लिए किया जाता है।
  5. ऊतक कम्पार्टमेंट पोर्ट टयूबिंग निकालें और fMLP टयूबिंग डालें। सभी bMFA के लिए ऊतक डिब्बे में fMLP के ~ 20 μL इंजेक्ट करें, अकेले सेल संस्कृति मीडिया के साथ इलाज किए गए को छोड़कर। फिर टयूबिंग को काट लें और इसे क्लैंप करें।
  6. न्यूट्रोफिल निलंबन के ~ 200 μL के साथ सिरिंज भरें और सिरिंज पंप पर सिरिंज माउंट।
  7. डिवाइस को उल्टे माइक्रोस्कोप चरण (सामग्री की तालिका) पर रखें।
  8. एक प्रवाह दर पर पंप शुरू करें 1 μL / मिनट है और जब तक कि न्यूट्रोफिल निलंबन की एक छोटी सी बूंद ट्यूबिंग से बाहर नहीं आती है तब तक प्रतीक्षा करें। इनलेट पोर्ट में टयूबिंग डालें। सेटअप के लिए चित्र 7 देखें.

7. छवियों का अधिग्रहण

  1. प्रयोग शुरू करने के 10 मिनट बाद bMFA (चित्रा 8) में आसंजन मानचित्र प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) में स्कैन बड़ी छवि फ़ंक्शन का उपयोग करें। अधिकांश न्यूट्रोफिल पहले 10 मिनट के दौरान बीएमएफए में प्रवेश करते हैं।
    नोट: प्रतिदीप्ति प्रकाश बंद रखें जब photobleaching को कम करने के लिए छवियों को नहीं ले जा रहा है।
  2. अगले घंटे के दौरान, माइग्रेशन मानचित्र प्राप्त करने के लिए माइग्रेशन विश्लेषण के लिए ऊतक डिब्बे (चित्रा 8B, C) के टाइमलैप्स छवियों (हर 5 मिनट में 1 छवि) लें।

8. डिजिटल छवि विश्लेषण

  1. आसंजन मानचित्र के लिए, प्रत्येक पोत में चिपके हुए न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना करें। प्रत्येक विभाजन के लिए, पोत व्यास के दो गुना के बराबर व्यास के साथ ब्याज का एक परिपत्र क्षेत्र (आरओआई) बनाएं और चिपके हुए न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना करें।
  2. प्रत्येक पोत और विभाजन क्षेत्र में पालन न्युट्रोफिल की संख्या निर्धारित करने के लिए मैन्युअल गणना या स्वचालित ऑब्जेक्ट काउंट फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  3. प्रत्येक पोत में कतरनी दर निर्धारित करने के लिए CFD सिमुलेशन17 का उपयोग करके उत्पन्न नेटवर्क के कतरनी दर मानचित्र का उपयोग करें। फिर उस पोत में कतरनी दर के खिलाफ किसी दिए गए पोत में चिपके हुए न्यूट्रोफिल की संख्या को प्लॉट करें ताकि बीएमएफए में एक कतरनी दर मानचित्र बनाया जा सके जैसा कि चित्र 9 ए में दिखाया गया है।
  4. न्यूट्रोफिल को माइग्रेटेड के रूप में गिना जाता है यदि वे एंडोथेलियम के माध्यम से ऊतक डिब्बे में पार कर गए हैं। 10 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट और 60 मिनट पर माइग्रेटेड न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना करें। माइग्रेटेड न्यूट्रोफिल बनाम समय की संख्या को प्लॉट करें जैसा कि चित्र 9 बी में दिखाया गया है।

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Representative Results

बीएमएफए में कतरनी प्रवाह के तहत संस्कृति के 48 घंटे के बाद, एंडोथेलियल कोशिकाओं ने बीएमएफए में संवहनी चैनलों की सतह को कवर किया और प्रवाह की दिशा में संरेखित किया (चित्रा 6)। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने संकेत दिया कि संवहनी चैनलों की सभी सतहों को एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा कवर किया गया था, जिससे बीएमएफए18 में एक पूर्ण 3 डी लुमेन बनता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक न्यूट्रोफिल आसंजन मानचित्र का अधिग्रहण किया जा सकता है, यह दिखाते हुए कि बीएमएफए (चित्रा 8) में एंडोथेलियल सेल के लिए न्यूट्रोफिल का महत्वपूर्ण आसंजन है। CFD मॉडल से उत्पन्न कतरनी दर मानचित्र के साथ इस आसंजन मानचित्र में न्यूट्रोफिल के स्थानिक वितरण को correlating से पता चलता है कि न्यूट्रोफिल आसंजन कतरनी निर्भर है, और न्यूट्रोफिल अधिमानतः कम कतरनी दर और विभाजन क्षेत्रों (चित्रा 9 ए) में पालन करते हैं। टीएनएफ-α-सक्रिय एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए न्यूट्रोफिल के आसंजन में काफी वृद्धि हुई है। टाइमलैप्स छवियों का विश्लेषण करने से संकेत मिलता है कि एंडोथेलियल कोशिकाओं के टीएनएफ-α सक्रियण से कीमोएट्रेक्टेंट एफएमएलपी (चित्रा 9 बी) के जवाब में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन बढ़ जाता है। जैसा कि ऊपर कहा गया है, बीएमएफए का उपयोग सूजन की बीमारी के इलाज के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय की प्रभावकारिता का तेजी से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, PKCπ-i के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल के उपचार ने न्यूट्रोफिल आसंजन और माइग्रेशन को काफी कम कर दिया (चित्रा 9ए, बी)27।

Figure 1
चित्रा 1: सूजन के दौरान एंडोथेलियल सेल सक्रियण। (ए) सामान्य परिस्थितियों में, संवहनी एंडोथेलियम ग्लाइकोकैलिक्स द्वारा कवर किया जाता है और एक तंग बाधा बनाता है जो बाधा पारगम्यता, ल्यूकोसाइट माइग्रेशन और विरोधी भड़काऊ बचाव को नियंत्रित करता है। (बी) सूजन के दौरान, ल्यूकोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं को पीएएमपीएस और डीएएमपीएस द्वारा साइटोकिन्स और कीमोएट्रेक्टेंट का उत्पादन करने के लिए सक्रिय किया जाता है, जिससे ल्यूकोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों पर सतह के अणुओं की उच्च अभिव्यक्ति होती है, जिससे ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन बढ़ जाता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं और ल्यूकोसाइट्स पर उनके लिगेंड (जैसे, पीएसजीएल -1) पर ई / पी-सेलेक्टिन की बातचीत रोलिंग में शामिल होती है, जो न्यूट्रोफिल को धीमा कर देती है। फर्म आसंजन को एंडोथेलियम-व्यक्त आसंजन अणुओं द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसमें आईसीएएम -1, आईसीएएम -2 और वीसीएएम -1 शामिल हैं, और उनके लिगेंड, π2 इंटीग्रिन्स। chemoattractant gradients के जवाब में, पालन ल्यूकोसाइट्स PECAM-1 और JAMs द्वारा विनियमित एंडोथेलियल जंक्शनों के माध्यम से प्रवास करते हैं। सक्रिय ल्यूकोसाइट्स ऊतक में प्रवास करते हैं, जहां वे साइटोकिन्स, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन / नाइट्रोजन प्रजातियों और संक्रमण के खिलाफ लड़ने के लिए प्रोटीज जारी करते हैं। हालांकि, डिस्रेगुलेटेड ल्यूकोसाइट माइग्रेशन अंग ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंग विफलता हो सकती है। सूजन के दौरान, ग्लाइकोकैलिक्स को नीचा दिखाया जाता है, एंडोथेलियल सेल तंग जंक्शन क्षतिग्रस्त हो जाते हैं और एंडोथेलियल सेल एपोप्टोसिस में वृद्धि होती है, जिससे क्षतिग्रस्त बाधा समारोह और पारगम्यता में वृद्धि होती है। इस आंकड़े को यांग एट अल.2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: bMFA का अवलोकन. (A) माउस क्रेमास्टर मांसपेशी की छवियां प्राप्त की जाती हैं और (B) PDMS पर नेटवर्क बनाने के लिए GIS प्रणाली का उपयोग करके डिजिटाइज़ की जाती हैं। (सी) बीएमएफए नेटवर्क की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि से पता चलता है कि बीएमएफए में, संवहनी चैनल एक 3 μm बाधा (पैनल सी में योजनाबद्ध सम्मिलित) के माध्यम से ऊतक डिब्बे से जुड़े होते हैं। संवहनी चैनलों के प्रवाह की दिशा को इंगित किया गया है। (डी) एक बीएमएफए चिप, जिसमें एक माइक्रोस्कोप स्लाइड से बंधी एक पीडीएमएस परत होती है, माइक्रोस्कोप चरण पर होती है। टयूबिंग को दो इनलेट पोर्ट, दो आउटलेट पोर्ट और एक टिश्यू कम्पार्टमेंट पोर्ट में डाला जाता है। (C: स्केल बार = 500 μm) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्षणिक परफ्यूजन अध्ययन bMFA में प्रयोगात्मक और सिमुलेशन परिणामों की तुलना में। (A) BMFA का नेटवर्क इनलेट, आउटलेट और प्रवाह दिशा को दर्शाता है। (बी) शीर्ष पैनल: CFD परफ्यूजन प्रोफाइल। नीचे पैनल: प्रयोगात्मक परफ्यूजन प्रोफाइल. छवियों को ग्रेडिएंट दिखाने के लिए छद्म रंग के होते हैं। पैमाने को नीले रंग (कोई परफ्यूजन; 0) और मैजेंटा (पूर्ण परफ्यूजन; 1) के साथ सामान्यीकृत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: CFD सिमुलेशन से bMFA में वेग और कतरनी दर प्रोफ़ाइल. (A) नेटवर्क भर में वेग परिमाण (Vmag) का वितरण। (बी) कतरनी दर का वितरण नेटवर्क में विषम कतरनी दरों को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बीएमएफए में न्यूट्रोफिल आसंजन पैटर्न विवो में न्यूट्रोफिल आसंजन पैटर्न के समान है। विवो में चिपके हुए न्यूट्रोफिल की संख्या और बीएमएफए में न्यूट्रोफिल की संख्या के वितरण दोनों बाईं ओर तिरछे होते हैं, यह दर्शाता है कि न्यूट्रोफिल निकटतम विभाजन (मतलब ± SEM) से एक पोत या चैनल व्यास पर होने वाली चोटी के साथ विभाजन के पास प्राथमिकता से पालन करते हैं; N = 3)। निकटतम विभाजन के लिए चिपके हुए न्यूट्रोफिल की दूरी को निम्नलिखित द्वारा सामान्यीकृत किया गया था: सामान्यीकृत दूरी = चैनल के निकटतम विभाजन / व्यास के केंद्र की दूरी। इस आंकड़े को लैम्बर्टी एट अल.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716 से संशोधित किया गया है, सामग्री से संबंधित आगे की अनुमतियों को अमेरिकन केमिकल सोसाइटी को निर्देशित किया जाना चाहिए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एंडोथेलियल कोशिकाएं बीएमएफए में एक पूर्ण 3 डी लुमेन बनाती हैं। (ए) चरण-विपरीत छवियों से पता चलता है कि एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रवाह की दिशा में पंक्तिबद्ध किया जाता है। (बी) प्रतिदीप्ति छवियों से पता चलता है कि एंडोथेलियल कोशिकाएं संवहनी चैनल को कवर करती हैं; F-actin को phalloidin का उपयोग करके हरे रंग का लेबल दिया जाता है और नाभिक को Draq5 का उपयोग करके लाल लेबल किया जाता है। (ए: स्केल बार = 100 μm, बी: स्केल बार = 50 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एक कंप्यूटर-नियंत्रित उलटा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग बीएमएफए में न्यूट्रोफिल-एंडोथेलियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। एक गर्म के साथ एक कंप्यूटर-नियंत्रित चरण का उपयोग बीएमएफए को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए किया जाता है। bMFA टयूबिंग के माध्यम से एक प्रोग्राम योग्य सिरिंज पंप से जुड़ा हुआ है। उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप कंप्यूटर पर आगे ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए छवियों / वीडियो लेने के लिए एक वीडियो कैमरे से सुसज्जित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: न्यूट्रोफिल आसंजन और माइग्रेशन मानचित्र की प्रतिनिधि छवियां। (ए) बीएमएफए में न्यूट्रोफिल आसंजन मानचित्र। छवि Nikon सॉफ्टवेयर के "स्कैन बड़े नक्शे" समारोह का उपयोग कर प्रयोग की शुरुआत के बाद 10 मिनट लिया गया था. मानचित्र में सफेद डॉट्स को CFDA-SE के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए न्यूट्रोफिल हैं। संवहनी चैनल सीमा को डिजिटल रूप से लेबल किया गया है (स्केल बार = 100 μm)। (बी) टीएनएफ-α सक्रियण के बिना बीएमएफए में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन मानचित्र। छवि को प्रयोग की शुरुआत के 60 मिनट बाद लिया गया था। (सी) टीएनएफ-α सक्रियण के साथ बीएमएफए में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन मानचित्र। छवि को प्रयोग की शुरुआत के 60 मिनट बाद लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: सूजन के दौरान बीएमएफए में न्यूट्रोफिल आसंजन और प्रवास के पैटर्न। (ए) टीएनएफ-α उपचार ने मानव फुफ्फुसीय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए मानव न्यूट्रोफिल आसंजन में काफी वृद्धि की, जिसे पीकेसी अवरोधक के साथ उपचार के बाद बाधित किया गया था। न्यूट्रोफिल आसंजन कम कतरनी दर के साथ जहाजों में अधिमानतः हुआ और बीएमएफए में विभाजन के पास। (बी) एफएमएलपी के जवाब में, टीएनएफ-α सक्रिय एंडोथेलियल कोशिकाओं में मानव न्यूट्रोफिल माइग्रेशन अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में काफी बढ़ गया था। PKCπ अवरोधक के साथ उपचार अनुपचारित स्तरों के लिए प्रवास को कम कर दिया। n = 4, मतलब ± SEM, एक तरफा ANOVA, ** पी < 0.01, और *** पी < 0.001). इस आंकड़े को Soroush et al.27 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चरण 1: स्थिर दर टिप्पणियाँ
मोड पैदा कर
प्रवाह दर 1 μL/min
समय 10 मिनट
चरण 2: देरी (कोई प्रवाह नहीं)
मोड देरी
समय 4 घंटे
चरण 3: दोहराएँ चरण 1 और चरण 2 को चरण 4 पर जाने से पहले 6 बार दोहराया जाएगा।
मोड दोहराना
से दोहराएँ चरण 1
दोहराना 6 बार
चरण 4: निरंतर प्रवाह दर
मोड पैदा कर
प्रवाह दर 0.1 μL/मिनट
समय 48 घंटे

तालिका 1: सिरिंज पंप कार्यक्रम

नियम नाम मेगावाट जोड़ना एकाग्रता 10x HEPES बफ़र
(1000 मिलीलीटर में डीआई पानी जोड़ें और पीएच को 7.3 पर समायोजित करें। उपयोग करने से पहले 1x तक पतला करें)
NaCl सोडियम क्लोराइड 58.44 87.66 ग्राम 1.5 मीटर
KOH पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड 56.11 2.81 ग्राम 50 mM
हेप्स हेप्स 238.3 23.83 ग्राम 100 mM
MgCl2 मैग्नीशियम क्लोराइड 203.31 2.44 ग्राम 12 mM
CaCl2 कैल्शियम क्लोराइड 147.62 1.90 ग्राम 12.9 mM

तालिका 2: HEPES बफर संरचना.

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Discussion

बीएमएफए इन विवो माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क की स्थलाकृति और प्रवाह स्थितियों को पुन: पेश करता है और इसका उपयोग शारीरिक रूप से यथार्थवादी परिस्थितियों के तहत ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन और विट्रो में एंडोथेलियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। माउस या मानव के माइक्रोवैस्कुलचर में, माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क की ज्यामिति आत्म-समान और भग्न होती है, और रेनॉल्ड्स संख्या 1 <<, यह दर्शाती है कि संवहनी ज्यामिति प्रवाह पैटर्न को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है। इसलिए, बीएफएमए का उपयोग मनुष्यों सहित विभिन्न प्रजातियों के लिए ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि माउस क्रेमास्टर मांसपेशी के माइक्रोवैस्कुलचर को बीएमएफए के निर्माण के लिए मैप किया गया था।

bMFA रोलिंग, फर्म आसंजन, प्रसार और ऊतक डिब्बे में neutrophils के प्रवासन के प्रवास सहित एक ही परख में न्यूट्रोफिल माइग्रेशन कैस्केड के व्यक्तिगत चरणों के वास्तविक समय के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। प्राथमिक मानव कोशिकाओं और नैदानिक रूप से प्रासंगिक नमूनों का उपयोग बीएमएफए में अनुवादक्षमता बढ़ाने और तेजी से संभावित चिकित्सीय को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। पारंपरिक तरल प्रणालियों जैसे समानांतर प्लेट प्रवाह कक्षों की तुलना में, बीएमएफए को अपने छोटे पोत के आकार के कारण अभिकर्मकों के37 के 95% से कम का उपयोग करने का लाभ है और तथ्य यह है कि यह एक ही परख में पूरे न्यूट्रोफिल माइग्रेशन कैस्केड का अध्ययन कर सकता है। हालांकि, इस छोटे आकार के लिए उपयोगकर्ताओं को अभिकर्मकों की बहुत कम मात्रा के साथ काम करने की भी आवश्यकता होती है, जो चुनौतीपूर्ण हो सकता है और व्यापक अभ्यास की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ सबसे आम समस्या बीएमएफए में हवा के बुलबुले की उपस्थिति है, जो चैनल को अवरुद्ध कर सकती है और प्रवाह पैटर्न को बदल सकती है। इसलिए, बंदरगाहों में टयूबिंग को हटाने या डालने के दौरान बहुत सावधानी बरतनी चाहिए, और जब भी ट्यूबिंग को बीएमएफए से हटा दिया जाता है तो चैनल में प्रवेश करने से हवा को रोकने के लिए बंदरगाहों पर ट्यूबिंग के आधार पर पानी की एक बूंद रखी जानी चाहिए।

न्यूट्रोफिल-एंडोथेलियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बीएमएफए के आवेदन के अलावा, बीएमएफए का उपयोग पारगम्यता और ट्रांसएंडोथेलियल एंडोथेलियल प्रतिरोध (टीईईआर) 27 जैसे चर को मापकर सूजन के दौरान एंडोथेलियम की अखंडता का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है। इसके अलावा, विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सूक्ष्म कणों को कार्यात्मक बनाकर, बीएमएफए का उपयोग एंडोथेलियल कोशिकाओं पर आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए किया जा सकताहै। यह प्रदर्शित किया गया था कि भड़काऊ प्रतिक्रिया को बीएमएफए में अन्य उत्तेजनाओं द्वारा भी नियंत्रित किया जा सकता है, जैसे कि आयनीकरण विकिरण, और बीएमएफए का उपयोग विकिरण-प्रेरित एंडोथेलियल सेल क्षति और न्यूट्रोफिल-एंडोथेलियल इंटरैक्शन29 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस उपकरण का एक और लाभ यह है कि एंडोथेलियल कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल और / या अन्य रक्त कोशिकाओं या दवा ले जाने वाले कणों को आगे के विश्लेषण के लिए माइक्रोवैस्कुलर चैनलों और / या ऊतक डिब्बे से अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं / कणों ने डिवाइस में एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ बातचीत नहीं की थी, उन्हें डिवाइस से बाहर निकलने वाले बहिस्त्राव से अलग किया जा सकता है। पेरिसाइट्स और संबंधित ऊतक प्रकारों को भी डिवाइस में सुसंस्कृत किया जा सकता है ताकि विवो स्थितियों में बेहतर प्रतिनिधित्व किया जा सके। अंत में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सूजन के दौरान ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बीएमएफए में एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक वातावरण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, अनुदान संख्या: GM114359 और GM134701 (M.F.K. और L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), और रक्षा खतरे में कमी एजेंसी, अनुदान संख्या: HDTRA11910012 (M.F.K. और L.E.K.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Fisher Scientific 14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) SynVivo SMN1-C001 Exclusive at SynVivo
Blunt needle Jensen Global JG24-0.5
Calcium Chloride Fisher Scientific C70-500
CFDA, SE ThermoFisher C1157
Dextran, 250,000, Powder Spectrum Chemical Mfg. Corp DE-130
Ficoll-Paque Premium GE Health Care 17-5442-02 Leukocyte isolation media
fMLP Sigma-Aldrich F3506
Hepes Fisher Scientific AAJ1692630
Human fibronectin Fisher Scientific 33-016-015 use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza cc-3202 Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells Lonza cc-2527 use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride Fisher Scientific BP214-500
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments Inc. Microscope
NIS-elements, 5.20.01 Nikon Instruments Inc. Imaging software
PBS Fisher Scientific MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3007 Syringe Pump
Potassium Hydroxide Fisher Scientific 02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha R&D Systems 210-TA
Slide clamp SynVivo
Sodium Chloride Fisher Scientific S640-500
Synvivo Pneumatic Primer SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) Lonza cc-5034
Tygon tubing Fisher Scientific 50-206-8921 Tubing

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सूजन के दौरान ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम
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