Summary
在该协议中，仿生微流体测定法可用于研究炎症性疾病中的白细胞 - 内皮细胞相互作用，该测定可以再现生理相关的微血管环境并重现整个白细胞粘附/迁移级联反应。
Abstract
白细胞 - 内皮细胞相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起重要作用。在炎症期间，活化的白细胞通过血管内皮过度迁移到关键器官可导致器官衰竭。已经使用几种实验和计算技术开发和验证了生理相关的仿生微流体测定（bMFA），该技术可以重现整个白细胞滚动/粘附/迁移级联反应，以研究白细胞 - 内皮细胞相互作用。使用地理信息系统（GIS）方法对从啮齿动物 体内 图像获得的微血管网络进行数字化，并在显微镜载玻片上用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行微加工。为了研究剪切速率和血管拓扑结构对白细胞 - 内皮细胞相互作用的影响，开发了计算流体动力学（CFD）模型以生成整个网络的剪切速率和速度的相应图。bMFA能够量化白细胞 - 内皮细胞相互作用，包括滚动速度，响应于不同剪切速率的粘附白细胞数量，迁移白细胞数量，内皮细胞通透性，粘附分子表达和其他重要变量。此外，通过使用人相关样品，如人内皮细胞和白细胞，bMFA为快速筛选潜在疗法提供了一种工具，以提高其临床转化性。
Introduction
炎症是宿主对感染和损伤的反应，内皮在炎症反应中起重要作用1，2，3。炎症失调是许多疾病病理学的根本原因，例如败血症，心血管疾病，哮喘，炎症性肠病，癌症和COVID-19。白细胞 - 内皮细胞相互作用在这些炎症性疾病中起核心作用。在炎症过程中，从病原体释放的PAMPS（病原体相关分子模式）或从受损组织中释放的DAMPS（损伤相关分子模式）激活免疫细胞释放细胞因子/趋化因子和其他促炎介质，导致内皮激活，导致血管内皮屏障功能改变和通透性增加3，4.炎症期间内皮细胞的活化增加导致白细胞 - 内皮细胞相互作用增强，导致活化的白细胞过度迁移穿过血管内皮进入关键器官1，5，6，7。
白细胞的募集是由由生物活性脂质，细胞因子，趋化因子和补体组分8，9组成的化学多样性化学吸引剂引起的。白细胞募集是一个多步骤的过程，包括五个独立的步骤：1）白细胞切缘和捕获/附着，2）滚动，3）牢固的阻止，4）扩散和爬行以及5）外渗/迁移（图1）。该过程的每一步都需要白细胞和内皮细胞之间的串扰来协调这种动态现象1，9。最终，停滞的白细胞通过由并发的化学吸引剂依赖性信号，粘附事件和血流动力学剪切力1，9，10，11，12控制的多步骤过程外渗到内皮的发炎组织。
鉴于剪切应力在调节内皮细胞功能中的核心作用以及白细胞 - 内皮细胞相互作用的重要性13，在过去的几十年中已经开发了几种 体外 模型来研究白细胞迁移级联的各个方面在更可控的环境中14。研究白细胞- 内皮细胞相互作用的传统流体装置可分为两大类14：a）用于研究白细胞滚动，粘附和粘附分子表达的装置，例如平行板流室和b）用于研究在静态条件下的白细胞迁移的装置，例如透孔室。平行板流室等系统已被用于研究粘附分子及其配体在剪切力15下粘附级联中的作用。然而，一个显著的缺点是这些简单化、理想化的装置（例如，直通道）不能再现 体内 微脉管系统的规模和几何形状（例如，连续的血管分岔、血管形态）和由此产生的流动条件（例如，分岔处的汇聚或发散流动）。因此，这些设备只能模拟粘附，而不能模拟迁移。透孔室只能研究静态条件下的迁移，而不考虑 体内 几何特征和流动条件。因此，这些传统模型不模仿活组织的微环境或在单个测定6中解析粘附和迁移级联反应。
为了解决这一限制，我们开发并广泛验证了一种新的3D仿生微流体测定（bMFA）（图2），该测定在芯片16，17，18上实际再现体内微血管网络。该器件的微加工协议先前已于17发布，此处仅简要介绍。使用改进的地理信息系统（GIS）方法对小鼠cremaster肌肉的微血管系统进行数字化19。然后，使用基于数字化微血管网络14，17，20，21，22的软光刻工艺在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上生成合成的微血管网络。简而言之，将数字化的网络图像打印在Mylar胶片上，然后将其用作掩模，在硅晶圆上图案SU-8正光刻胶，以创建用于制造的母带。微加工柱（直径10μm，高3μm）用于创建3μm高，100μm宽的孔，白细胞迁移的最佳尺寸23，24，25，连接血管通道和组织室。PDMS是根据制造商的说明准备的，并浇注在开发的母版上。此外，PDMS脱气并允许在烘箱（65°C）中固化过夜，以在PDMS中产生互补的微通道。随后，固化的PDMS从SU-8主站剥离，然后是入口/出口的冲孔端口。然后，PMDS等离子体粘合到载玻片上。微流体装置的表面包括天然玻璃和PDMS。为了促进细胞附着，扩散和增殖，需要细胞外基质（ECM）包衣。bMFA包括一个微血管网络和一个通过3μm高和100μm宽的孔连接的组织室（图2）。该微流体系统在具有相互连接的血管和分叉的完整微血管网络的生理相关3D环境中再现整个白细胞粘附/迁移级联反应，包括循环，边缘化，滚动，粘附和白细胞在单个系统14，16，17，21，26中进入血管外组织室。
需要注意的是，即使bMFA入口处的流速是固定的，网络中的流动条件在不同位置也不同，无法通过简单的数学公式计算。开发了一个基于计算流体动力学（CFD）的模型来计算网络中不同位置的不同流动参数（例如，剪切应力，剪切速率，速度）。该CFD模型用于模拟bMFA中的染料灌注模式和流动参数。与实验结果的交叉验证表明，计算模型可以很好地预测整个网络的流动阻力（图3）17。然后使用该CFD模型来估计bMFA每个容器中的速度和剪切速率曲线（图4），从而可以分析剪切流和几何形状对白细胞滚动，粘附和迁移的影响16。白细胞优先粘附在分岔附近和体内低剪切区域，并且使用嗜中性粒细胞在bMFA中成功证明了白细胞粘附的空间模式（图5）16。本文描述了制备bMFA以使用人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）和人嗜中性粒细胞在炎症条件下研究白细胞 - 内皮细胞相互作用的方案。微生理系统，如bMFA，可用于研究内皮细胞与不同类型的细胞如嗜中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和肿瘤细胞18，27，28，29，30的相互作用。bMFA可以接种来自不同器官（例如，肺与脑）和不同物种（例如，人与鼠内皮细胞）的原代内皮细胞，以及内皮细胞系21，27，31，32。bMFA可用于研究多种细胞反应，细胞 - 细胞相互作用，屏障功能，药物递送和药物毒性。
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Protocol
在获得肝素化人血，用于从健康的成年供体（男性和女性，年龄在21至60岁之间）中分离中性粒细胞，经天普大学机构审查委员会批准（美国宾夕法尼亚州费城）批准的知情同意。
1. 用人纤连蛋白启动和涂覆设备
注意：bMFA有两个入口端口和两个连接到血管室的出口端口。它还具有一个连接到组织室的端口（图2）。
- 将卡套管（外径为 0.06“，内径为 0.02”）（材料表s）插入所有端口，但一个带细尖镊子的入口端口除外。用钳口夹紧两个出口端口和组织室端口。确保每个管子的长度约为 1 英寸。
- 用来自纤连蛋白储备溶液（1mg / mL）的PBS将人纤连蛋白稀释至100μg/ mL。用准备好的纤连蛋白溶液加载1mL注射器。将注射器连接到 24 G 钝针和约 4 英寸长的管子上。
注意：为防止交联，请勿过度混合/移液人纤连蛋白。其他细胞外基质（ECM）如胶原蛋白可用于不同的细胞类型。 - 将管子插入开放的入口端口，推动柱塞，直到人纤连蛋白从另一个入口端口出来，然后夹紧它。对其余端口重复此过程，直到所有通道，组织室和管道都充满人纤连蛋白溶液。取下针头，但保持4英寸长的管子插入并未夹紧。
注意：在夹紧管道之前，请确保管子装满了纤连蛋白。 - 对于脱气，通过气动底漆将未夹紧的管道连接到压缩氮气罐，将压力调节至~5 psi并运行约15分钟。
- 15分钟后，在显微镜下检查以确保设备中没有气泡。如果有气泡被困在通道或组织室中，请将设备重新连接到气动引物上进行脱气，即重复步骤1.4。
注意：倒置显微镜用于该协议中涉及显微镜的所有步骤。 - 从气动底漆中取出设备。将设备在37°C下孵育1小时，然后用预热的HLMVEC培养基冲洗所有通道和组织室（材料表），类似于步骤1.3。bMFA现在已准备好进行细胞接种。
注：在从端口取出/插入管道之前，请先在入口端口管道的底部周围用移液管滴一滴水，以防止空气进入设备。
2. 用HLMVEC播种bMFA
- 在 T-25 烧瓶中，根据供应商的方案将 HLMVEC 培养至 60%-80% 汇合。
- 从细胞培养瓶中抽吸HLMVEC培养基。用PBS清洗两次。
- 在T-25烧瓶中加入2mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（37°C）。在培养箱（37°C，5%CO2）中孵育3-5分钟，直到大多数细胞从烧瓶中分离出来。
注意：孵育时间可能因不同的细胞类型和胰蛋白酶-EDTA浓度而异。 - 向烧瓶中加入2mL胰蛋白酶中和溶液（TNS，37°C）以中和胰蛋白酶- EDTA。
- 轻轻敲击烧瓶以帮助解离细胞。然后，将细胞悬浮液溶液转移到15mL锥形管中。
- 以150× g 离心5分钟以沉淀内皮细胞。除去上清液并将细胞重悬于3 mL细胞培养基中。用血细胞计数器计数细胞的数量。
- 再次以150× g 离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液并将细胞重悬至所需的20 x 106 / mL的接种密度。
注意：根据细胞类型和汇合度，可以从两个T-25烧瓶中收集约2 x 106 个内皮细胞，并且接种密度为20 x 106 / mL，100μL细胞悬浮液（2 x 106 内皮细胞），足以接种5个设备。 - 将 1 mL 注射器安装在可编程注射器泵中，将管子连接到钝针上。
- 将〜20μL细胞悬浮液吸入管中，确保细胞悬浮液仅在管中，而不在注射器桶中。
- 从设备的出口端口取下夹具。将管道连接到设备的一个入口。确保没有气泡进入通道。
- 以 4-8 μL/min 的流速启动泵。在显微镜下观察设备。
- 当通道充满电池时，停止泵，夹紧出口，并切断入口管。
注意：注意不要将气泡引入设备。 - 将设备在5%CO2 和37°C下在培养箱中培养4小时。
- 孵育4小时后，准备另一个装有新鲜细胞培养基的注射器。将注射器安装在注射器泵上，将注射器连接到入口端口，然后从出口口取下夹具。
- 以4-8μL / min通过设备运行新鲜培养基约5分钟，以洗出漂浮/未连接的细胞。
3. 流动细胞培养48小时
- 准备一个装满新鲜细胞培养基的注射器。将注射器安装在注射泵中，将注射器连接到一个入口端口并保持出口打开。将设备放入培养箱（5%CO2，37°C）。
- 使用 表1中提到的以下说明对注射器泵进行编程，用于在流动下培养内皮细胞。
- 在流动下培养48小时后，在显微镜下检查bMFA。HLMVEC应覆盖形成完整管腔的血管通道（图6）。
注意：不同的细胞类型可能需要其他流动状态。
4. 细胞因子和/或治疗
注意：作为一个例子，本节描述了使用bMFA研究用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和新型抗炎抑制剂（蛋白激酶Cδ-TAT肽抑制剂，PKCδ-i）治疗细胞的影响18，27，32，33，34，35，36。
- 使用上述协议准备三种不同的 bMFA 设备（第 1-3 节）。
- 分别将三个1 mL注射器与细胞培养基（TNF-α）（10ng / mL），TNF-α（10ng / mL）+ PKCδ-i（5μM）一起加载。
注意：细胞因子在细胞培养基中重构。 - 将三个注射器连接到三个 bMFA 设备。用缓冲液TNF-α或TNF-α+抑制剂以0.1μL / min处理HLMVEC 4小时。
注意：根据特定的研究要求，其他细胞因子或细胞因子混合物（例如，TNF-α + 白细胞介素 1 β （IL1-β） + 干扰素-γ （IFN-γ））可用于治疗内皮细胞。
5. 人嗜中性粒细胞分离
- 在室温 （RT） 下使用所有试剂。试剂包括白细胞分离培养基，1x含Ca2 + / Mg2 + 的HEPES缓冲液（表2），6%的葡聚糖在生理盐水中（0.9%NaCl），3.6%NaCl溶液和去离子水（DI）水。
- 将20 mL白细胞分离培养基移入50 mL锥形管中，并在白细胞分离培养基上小心地将25mL血液层叠。在室温下以427× g 离心40分钟。
注意：缓慢而小心地执行此步骤，以避免混合血液和白细胞分离培养基。 - 吸气至红细胞 （RBC） 层以上约 5 mL。红细胞顶部的白色白细胞层主要是嗜中性粒细胞。
- 添加 HEPES 缓冲液使当前体积加倍（现有体积：HEPES 缓冲液 = 1：1）。
- 加入6%的葡聚糖，这将是最终体积的20%。（当前体积/4 = 添加的 6% 葡聚糖的体积）。
- 轻轻倒置试管几次以充分混合，让红细胞沉淀（约25分钟）。
- 小心地移液上层（富含中性粒细胞的层）并转移到新的50 mL管中，注意不要被沉淀的红细胞污染。
- 在室温下以315× g 离心10分钟，除去上清液并将沉淀重悬于8mLHEPES缓冲液中。
- 要裂解残留的红细胞，加入24 mL去离子水，轻轻混合50秒。立即加入8mL3.6%NaCl溶液，混合并在室温下以315× g 离心10分钟。
- 除去上清液，用15mLHEPES缓冲液洗涤细胞沉淀，并以315×g离心5分钟 。 将沉淀重悬于HEPES缓冲液中。
6. 使用bMFA进行中性粒细胞粘附和迁移实验
- 将分离的人嗜中性粒细胞（1500万）重悬于999μLHEPES缓冲液中。
- 将1μL CFDA-SE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）染料储备溶液（10mM）加入中性粒细胞悬浮液中，以获得10μM CFDA-SE的工作浓度，并在室温下孵育10分钟。用HEPES缓冲液洗涤细胞两次，在315× g下离心5分钟。
- 使用血细胞计数器计数中性粒细胞，并分别用细胞培养基，TNF-α（10ng / mL）和TNF-α（10ng / mL）+ PKCδ-i（5μM）重悬于200万中性粒细胞/ mL;在实验开始之前在室温下孵育15分钟。
- 在细胞培养基中制备充满1μM N-甲酰基-met-leu-phe（fMLP）的注射器，用于研究的化学取巧剂。取 bMFA 并打开一个入口端口和一个出口。
注意：这些实验条件用于模拟脓毒症的病症，包括具有高水平循环细胞因子/趋化因子的全身炎症反应。此外，fMLP，一种革兰氏阴性细菌衍生的肽，用于模拟肺部（即组织室）中细菌的存在。 - 取下组织室端口管，然后插入fMLP管。将约20μLfMLP注射到组织室中以用于所有bMFA，但单独用细胞培养基处理的bMFA除外。然后切割管子并夹紧它。
- 用〜200μL中性粒细胞悬浮液填充注射器，并将注射器安装在注射器泵上。
- 将设备放在倒置显微镜载物台上（材料表）。
- 以1μL/min的流速启动泵，并等待，直到一小滴嗜中性粒细胞悬浮液从管中流出。将管路插入进气口。有关设置，请参见 图 7 。
7. 获取图像
- 在开始实验10分钟后，使用显微镜图像分析软件（材料表）中的扫描大图像功能获得bMFA中的附着力图（图8）。大多数中性粒细胞在前10分钟内进入bMFA。
注意：不拍摄图像时，请关闭荧光灯，以减少光漂白。 - 在接下来的一小时内，拍摄组织室的延时图像（每5分钟1张图像）（图8B，C）进行迁移分析，以获得迁移图。
8. 数字图像分析
- 对于粘附图，计算每个血管中粘附的中性粒细胞的数量。对于每个分岔，创建一个直径等于血管直径两倍的圆形感兴趣区域（ROI），并计算粘附的嗜中性粒细胞的数量。
- 使用手动计数或自动 对象计数 功能来量化每个血管和分叉区域中粘附的嗜中性粒细胞的数量。
- 使用CFD仿真17 生成的网络的剪切速率图来确定每个容器中的剪切速率。然后绘制给定血管中粘附的嗜中性粒细胞数量与该血管中的剪切速率，以创建bMFA中的剪切速率图，如图 9A所示。
- 如果中性粒细胞已穿过内皮进入组织室，则将其计为迁移。在10分钟，15分钟，30分钟和60分钟计数迁移的嗜中性粒细胞的数量。绘制迁移的嗜中性粒细胞数量与时间的关系图 ，如图9B所示。
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Representative Results
在bMFA中剪切流下培养48小时后，内皮细胞覆盖bMFA中血管通道的表面并沿流动方向排列（图6）。共聚焦显微镜表明血管通道的所有表面都被内皮细胞覆盖，在bMFA18中形成完整的3D管腔。
使用该协议，可以获得中性粒细胞粘附图，表明bMFA中嗜中性粒细胞与内皮细胞的粘附显着（图8）。将该粘附图中嗜中性粒细胞的空间分布与CFD模型生成的剪切速率图相关联表明，中性粒细胞粘附是剪切依赖性的，中性粒细胞优先粘附在低剪切速率和分岔区域（图9A）。嗜中性粒细胞对TNF-α活化的内皮细胞的粘附显著增加。分析延时图像表明，TNF-α内皮细胞的活化增加了中性粒细胞迁移，以响应化学吸引剂fMLP（图9B）。如上所述，bMFA可用于快速测试治疗炎症性疾病的新型疗法的疗效。例如，用PKCδ-i治疗内皮细胞和嗜中性粒细胞显着降低中性粒细胞粘附和迁移（图9A，B）27。
（A）在正常情况下，血管内皮被糖萼覆盖，形成调节屏障通透性，白细胞迁移和抗炎防御的紧密屏障。（B）在炎症过程中，白细胞和内皮细胞被PAMPS和DAMPS激活，产生细胞因子和化学吸引剂，导致白细胞和内皮细胞上表面分子的表达升高，增强白细胞 - 内皮相互作用。E/P-选择素对内皮细胞及其配体（例如PSGL-1）在白细胞上的相互作用参与滚动，这减慢了嗜中性粒细胞的速度。牢固的粘附由内皮表达的粘附分子调节，包括ICAM-1，ICAM-2和VCAM-1，以及它们的配体β2整合素。响应于化学吸引剂梯度，粘附的白细胞通过由PECAM-1和JAMs调节的内皮连接迁移。活化的白细胞迁移到组织中，在那里它们释放细胞因子，活性氧/氮物种和蛋白酶以对抗感染。然而，失调的白细胞迁移会损害器官组织，导致器官衰竭。在炎症过程中，糖菀被降解，内皮细胞紧密连接受损，内皮细胞凋亡增加，导致屏障功能受损和通透性增加。这个数字是从Yang等人2修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
（A）使用GIS系统获得小鼠肌的图形，并使用GIS系统进行数字化，以在PDMS上构建网络。（C）bMFA网络的明场图像显示，在bMFA中，血管通道通过3μm屏障连接到组织室（图C中的示意图插入）。指示血管通道的流动方向。（D）由粘合到显微镜载玻片上的PDMS层组成的bMFA芯片位于显微镜载物台上。管路插入两个入口端口、两个出口端口和一个组织室端口。（C：比例尺 = 500 μm）请点击此处查看此图的大图。
图 3：bMFA 中比较实验和模拟结果的瞬态灌注研究。 （A） bMFA 网络显示入口、出口和流动方向。（B） 顶板：CFD 灌注曲线。底板：实验灌注曲线。图像是伪彩色的，以显示渐变。刻度用蓝色（无灌注;0）和洋红色（完全灌注;1）归一化。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：CFD 仿真中 bMFA 中的速度和剪切速率分布。 （A） 整个网络中速度大小 （Vmag） 的分布。（B）剪切速率分布表示网络中的非均质剪切速率。 请点击此处查看此图的大图。
图5：bMFA中的中性粒细胞粘附模式与 体内中性粒细胞粘附模式相似。 体内粘附的中性粒细胞数量和bMFA 中 嗜中性粒细胞数量的分布均向左偏斜，表明嗜中性粒细胞优先粘附在分岔附近，峰值出现在最近的分岔处的一个血管或通道直径处（平均±SEM;N = 3）。粘附的嗜中性粒细胞到最近分岔的距离通过以下方式归一化：归一化距离=到通道最近分叉/直径中心的距离。这个数字是从Lamberti等人16 修改而来的（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716，与摘录的材料相关的进一步许可应直接提交给美国化学学会）。请点击此处查看此图的大图。
图6：内皮细胞在bMFA中形成完整的3D管腔， （A）相差图像显示内皮细胞沿流动方向排列。（B）荧光图像显示内皮细胞覆盖血管通道;F-肌动蛋白使用鬼蛛网蛋白标记为绿色，使用Draq5将细胞核标记为红色。（A：比例尺 = 100 μm，B：比例尺 = 50 μm）。 请点击此处查看此图的大图。
图7：计算机控制的倒置荧光显微镜用于研究bMFA中的中性粒细胞 - 内皮相互作用。 使用带有加热器的计算机控制载物台将bMFA保持在37°C。 bMFA通过管道连接到可编程注射泵。倒置荧光显微镜配有摄像机，可拍摄图像/视频，以便在计算机上进行进一步的离线分析。 请点击此处查看此图的大图。
图8：中性粒细胞粘附和迁移图谱的代表性图像。 （A）bMFA中的中性粒细胞粘附图。该图像是在实验开始后10分钟使用尼康软件的“扫描大地图”功能拍摄的。图中的白点是用CFDA-SE荧光标记的嗜中性粒细胞。血管通道边界以数字方式标记（比例尺 = 100 μm）。（B）bMFA中的中性粒细胞迁移图谱，没有TNF-α激活。图像是在实验开始后60分钟拍摄的。（C）bMFA中的中性粒细胞迁移图谱与TNF-α激活。图像是在实验开始后60分钟拍摄的。 请点击此处查看此图的大图。
图9：炎症期间bMFA中嗜中性粒细胞粘附和迁移的模式。 （A）TNF-α治疗显著增加人嗜中性粒细胞对人肺微血管内皮细胞的粘附，用PKCδ抑制剂治疗后受到抑制。中性粒细胞粘附优先发生在剪切速率低且在bMFA中接近分岔的血管中。（B）作为对fMLP的反应，与未处理的细胞相比，人嗜中性粒细胞在TNF-α活化的内皮细胞中的迁移显着增加。用PKCδ抑制剂治疗将迁移降低到未处理的水平。n = 4，SEM±平均值，单因子方差分析，** p < 0.01，*** p < 0.001）。该数字已从Soroush等人27修改而来。 请点击此处查看此图的大图。
| 第 1 步：恒定速率 | 评论 | |
| 模式 | 注入 | |
| 流量 | 1 微升/分钟 | |
| 时间 | 10 分钟 | |
| 第2步：延迟（无流量） | ||
| 模式 | 延迟 | |
| 时间 | 4 小时 | |
| 步骤3：重复 | 步骤 1 和步骤 2 将在进入步骤 4 之前重复 6 次。 | |
| 模式 | 重复 | |
| 重复从 | 步骤1 | |
| 重复 | 6 次 | |
| 第4步：恒定流速 | ||
| 模式 | 注入 | |
| 流量 | 0.1 微升/分钟 | |
| 时间 | 48 小时 |
表1：注射泵方案
| 公式 | 名字 | 兆瓦 | 加 | 浓度 | 10 倍氦氧混合缓冲液 （加入去离子水至1000 mL，并将pH调节至7.3。使用前稀释至1倍） |
| 氯化钠 | 氯化钠 | 58.44 | 87.66克 | 1.5 米 | |
| 许志 | 氢氧化钾 | 56.11 | 2.81克 | 50 毫米 | |
| 赫皮斯 | 赫皮斯 | 238.3 | 23.83克 | 100 毫米 | |
| 氯化镁2 | 氯化镁 | 203.31 | 2.44克 | 12 毫米 | |
| 氯化钙2 | 氯化钙 | 147.62 | 1.90克 | 12.9 毫米 |
表2：HEPES缓冲液组成。
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Discussion
bMFA再现体内微血管网络的形貌和流动条件，可用于 在 生理现实条件下研究白细胞 - 内皮细胞相互作用和 体外 内皮功能。在小鼠或人类的微血管系统中，微血管网络的几何形状是自相似和分形的，雷诺数<<1，表明血管几何形状不会显着影响流动模式。因此，bFMA可用于研究包括人类在内的不同物种的白细胞 - 内皮相互作用，尽管小鼠cremaster肌肉的微脉管系统被映射以制造bMFA。
bMFA允许在单个测定中实时评估嗜中性粒细胞迁移级联的单个步骤，包括滚动，牢固粘附，中性粒细胞扩散和迁移到组织室。原代人类细胞和临床相关样品可用于bMFA，以提高可转化性并快速筛选潜在的治疗方法。与传统的流体系统（如平行板流动室）相比，bMFA具有使用少于95%的试剂37 的优点，因为它的容器尺寸小，并且可以在一次测定中研究整个嗜中性粒细胞迁移级联。然而，这种小尺寸也要求用户使用非常小体积的试剂，这可能具有挑战性，并且需要大量的练习。该协议最常见的问题是bMFA中存在气泡，这可以阻塞通道并改变流动模式。因此，在将管道移除或插入端口时应格外小心，并且必须在端口的管道底部放置一滴水，以防止从bMFA中取出管道时空气进入通道。
除了应用bMFA研究中性粒细胞 - 内皮相互作用外，bMFA还用于通过测量通透性和经内皮内皮阻力（TEER）等变量来研究炎症期间内皮的完整性27。此外，通过用特异性抗体功能化微粒，bMFA可用于研究粘附分子在内皮细胞上的表达27。已经证明，炎症反应也可以被bMFA中的其他刺激（例如电离辐射）上调，并且bMFA已被用于研究辐射诱导的内皮细胞损伤和中性粒细胞 - 内皮相互作用29。该装置的另一个优点是可以从微血管通道和/或组织室中分离出内皮细胞，嗜中性粒细胞和/或其他血细胞或携带药物的颗粒以进行进一步分析。此外，不与设备中的内皮细胞相互作用的细胞/颗粒可以从离开设备的流出物中分离出来。周细胞和相应的组织类型也可以在设备中培养，以更好地代表 体内 条件。总之，这里提出的方案在bMFA中提供了一个生理相关的环境，用于研究炎症过程中的白细胞 - 内皮细胞相互作用。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持，拨款号：GM114359和GM134701（M.F.K.和L.E.K.），1F31AI164870-01（J.C.L.）和国防威胁减少局，拨款号：HDTRA11910012（M.F.K.和L.E.K.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
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