Summary
이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.
Abstract
백혈구-내피 세포 상호작용은 패혈증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 염증 동안, 활성화된 백혈구가 혈관 내피를 가로질러 주요 기관으로 과도하게 이동하면 장기 부전이 발생할 수 있습니다. 생리학적으로 관련된 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)은 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 전체 백혈구 롤링/부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 몇 가지 실험 및 계산 기술을 사용하여 개발 및 검증되었습니다. 설치류 의 생체내 이미지로부터 얻은 미세혈관 네트워크는 지리 정보 시스템(GIS) 접근법을 사용하여 디지털화되고 현미경 슬라이드 상에서 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 미세제작되었다. 전단 속도와 혈관 토폴로지가 백혈구-내피 세포 상호작용에 미치는 영향을 연구하기 위해, 전산 유체 역학(CFD) 모델이 개발되어 네트워크 전반에 걸친 전단 속도 및 속도의 상응하는 지도를 생성하였다. bMFA는 롤링 속도, 상이한 전단 속도에 반응하는 부착된 백혈구의 수, 이동된 백혈구의 수, 내피 세포 투과성, 부착 분자 발현 및 기타 중요한 변수를 포함하는 백혈구-내피 세포 상호작용의 정량화를 가능하게 한다. 더욱이, 인간 내피 세포 및 백혈구와 같은 인간 관련 샘플을 사용함으로써, bMFA는 그들의 임상 번역성을 증가시키기 위해 잠재적인 치료제의 신속한 스크리닝을 위한 도구를 제공한다.
Introduction
염증은 감염 및 손상에 대한 숙주 반응이고, 내피는 염증 반응 1,2,3에서 중요한 역할을 한다. 염증성 조절 장애는 패혈증, 심혈관 질환, 천식, 염증성 장 질환, 암 및 COVID-19와 같은 다수의 질병 병리의 근본 원인이다. 백혈구-내피 세포 상호작용은 이러한 염증성 질환에서 중심적인 역할을 한다. 염증 동안, 손상된 조직으로부터 병원균 또는 DAMPS (손상 관련 분자 패턴)로부터의 PAMPS (병원체 관련 분자 패턴)의 방출은 면역 세포를 활성화시켜 내피의 활성화로 이어지는 사이토카인 / 케모카인 및 기타 전염증성 매개체를 방출하여 혈관 내피 장벽 기능의 변화와 투과성 증가를 초래합니다 3,4 . 염증 동안 내피 세포의 활성화가 증가하면 백혈구와 내피 세포 상호 작용이 향상되어 혈관 내피를 가로 질러 활성화 된 백혈구가 주요 기관 1,5,6,7로 과도하게 이동하게됩니다.
백혈구의 모집은 생리활성 지질, 사이토카인, 케모카인 및 보체 성분 8,9로 구성된 화학적으로 다양한 화학유인제에 의해 개시된다. 백혈구 모집은 1) 백혈구 소엽 및 포획/부착, 2) 롤링, 3) 확고한 정지, 4) 확산 및 크롤링, 5) 혈관외유출/이동(그림 1)의 다섯 가지 개별 단계를 포함하는 다단계 과정입니다. 이 과정의 각 단계는이 역동적 인 현상을 조율하기 위해 백혈구와 내피 세포 사이의 누화를 필요로합니다 1,9. 궁극적으로, 체포 된 백혈구는 동시 화학 유인 물질 의존성 신호, 접착 사건 및 혈역학적 전단력 1,9,10,11,12에 의해 제어되는 다단계 과정을 통해 내피를 가로 질러 염증 조직으로 혈관을 확장합니다.
내피 세포 기능을 조절하는 전단 스트레스의 중심 역할과 백혈구-내피 세포 상호작용의 중요성을 감안할 때(13), 보다 조절된 환경에서 백혈구 이동 캐스케이드의 다양한 측면을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 몇몇 시험관내 모델이 개발되었다(14). 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위한 전통적인 유체 장치는 두 가지광범위한 범주로 분류될 수 있다: a) 백혈구 롤링, 부착 및 부착 분자 발현을 연구하기 위한 장치, 예컨대 병렬 플레이트 유동 챔버 및 b) 트랜스웰 챔버와 같은 정적 조건 하에서 백혈구 이동을 연구하기 위한 장치. 평행 플레이트 유동 챔버와 같은 시스템은 전단력(15) 하에서의 접착 캐스케이드에서 접착 분자 및 이들의 리간드의 역할을 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 상당한 결점은 이들 단순한, 이상화된 디바이스들(예를 들어, 직선 채널)이 생체내 미세혈관구조(예를 들어, 연속적인 혈관 분기, 혈관 형태학) 및 결과적인 유동 조건(예를 들어, 분기점에서의 수렴 또는 발산 흐름)의 스케일 및 기하학적 구조를 재현할 수 없다는 것이다. 결과적으로 이러한 장치는 접착 만 모델링 할 수 있지만 트랜스 마이그레이션은 모델링 할 수 없습니다. 트랜스웰 챔버는 생체내 기하학적 특징과 유동 조건을 고려하지 않고 정적 조건하에서만 트랜스마이그레이션을 연구할 수 있다. 따라서, 이들 전통적인 모델은 살아있는 조직의 미세환경을 모방하거나 단일 분석(6)에서 부착 및 이동 캐스케이드를 해결하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 새로운 3D 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)(그림 2)을 개발하고 광범위하게 검증했으며, 이는 칩16,17,18에서 생체내 미세혈관 네트워크를 현실적으로 재현한다. 이 장치의 미세 제작을위한 프로토콜은 이전에17 년에 발표되었으며 여기에 간략하게 설명되어 있습니다. 마우스 크레마스터 근육의 미세혈관구조를 변형된 지리 정보 시스템(GIS) 접근법(19)을 사용하여 디지털화하였다. 이어서, 합성 미세혈관 네트워크는 디지털화된 미세혈관 네트워크(14,17,20,21,22)에 기초한 소프트 리소그래피 공정을 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 상에서 생성되었다. 간단히 말해서, 디지털화 된 네트워크 이미지가 Mylar 필름에 인쇄 된 다음 실리콘 웨이퍼 위에 SU-8 포지티브 포토레지스트를 패턴화하여 제작을위한 마스터를 만드는 마스크로 사용되었습니다. 미세제작된 기둥(직경 10 μm, 높이 3 μm)을 사용하여 높이 3 μm, 폭 100 μm의 기공을 만들고, 백혈구 이동을 위한 최적 크기 23,24,25를 혈관 채널과 조직 구획을 연결하였다. PDMS는 제조업체의 지시에 따라 제조되고 개발 된 마스터 위에 쏟아졌습니다. 또한, PDMS를 탈기시키고 오븐(65°C)에서 밤새 경화시켜 PDMS에 상보성 마이크로채널을 생성하였다. 그 후, 경화 된 PDMS를 SU-8 마스터에서 벗겨 낸 다음 입구 / 출구 용 펀칭 포트를 펀칭했습니다. 이어서, PMDS를 유리 슬라이드에 플라즈마 접합시켰다. 미세유체 장치의 표면은 천연 유리 및 PDMS를 포함한다. 세포 부착, 확산 및 증식을 촉진하기 위해, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅이 요구된다. bMFA는 3 μm 높이 및 100 μm 폭 기공을 통해 연결된 미세혈관 네트워크 및 조직 구획을 포함한다(도 2). 이 미세 유체 시스템은 단일 시스템 14,16,17,21,26에서 백혈구의 순환, 마진, 롤링, 부착 및 백혈구의 순환, 마진, 롤링, 부착 및 이동을 포함하여 상호 연결된 혈관 및 분기와 함께 완전한 미세 혈관 네트워크의 생리 학적으로 관련된 3D 환경에서 전체 백혈구 부착 / 이동 캐스케이드를 재현합니다14,16,17,21,26.
bMFA 입구의 유속이 고정되어있는 경우에도 네트워크의 흐름 조건은 다른 위치에서 다양하며 간단한 수학 공식으로 계산할 수 없다는 점에 유의해야합니다. 전산 유체 역학 (CFD) 기반 모델은 네트워크의 다른 위치에서 다른 흐름 매개 변수 (예 : 전단 응력, 전단 속도, 속도)를 계산하기 위해 개발되었습니다. 이 CFD 모델은 bMFA에서 염료 관류 패턴 및 유동 파라미터를 시뮬레이션하는데 사용되었다. 실험 결과와의 교차 검증은 네트워크를 통한 흐름 저항이 계산 모델에 의해 잘 예측된다는 것을 시사했습니다(그림 3)17. 이 CFD 모델은 bMFA의 모든 용기에서 속도 및 전단 속도 프로파일을 추정하는 데 사용되었으며(그림 4), 백혈구 롤링, 부착 및 이동에 대한 전단 흐름 및 기하학적 구조의 영향을 분석할 수 있습니다(16). 백혈구는 생체내에서 분기 근처 및 낮은 전단 영역에서 우선적으로 부착되며, 백혈구 부착의 이러한 공간적 패턴은 호중구를 사용하는 bMFA에서 성공적으로 입증되었다(도 5)16. 이 논문은 인간 폐 미세혈관 내피 세포 (HLMVEC) 및 인간 호중구를 사용하는 염증 조건 하에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 bMFA를 제조하기 위한 프로토콜을 기술한다. bMFA와 같은 미세 생리학적 시스템은 호중구, 단핵구, 림프구 및 종양 세포 18,27,28,29,30과 같은 상이한 유형의 세포와의 내피 세포 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. bMFA는 상이한 기관 (예를 들어, 폐 대 뇌) 및 상이한 종 (예를 들어, 인간 대 뮤린 내피 세포) 뿐만 아니라 내 피 세포주 21,27,31,32로부터의 일차 내피 세포와 함께 시딩될 수 있다. bMFA는 다중 세포 반응, 세포-세포 상호작용, 장벽 기능, 약물 전달 및 약물 독성을 연구하는데 사용될 수 있다.
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Protocol
Heparinized 인간의 혈액은 템플 대학 (필라델피아, PA, 미국)의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board of Temple University, PA, USA)의 승인에 따라 정보에 입각 한 동의에 따라 건강한 성인 기증자 (남성과 여성, 21 세에서 60 세 사이)로부터의 호중구 분리를 위해 얻어집니다.
1. 인간 피브로넥틴으로 장치를 프라이밍하고 코팅합니다.
참고: bMFA에는 두 개의 입구 포트와 두 개의 출구 포트가 혈관 구획에 연결되어 있습니다. 또한 조직 구획에 연결된 하나의 포트가 있습니다(그림 2).
- 튜브(0.06"의 O.D. 및 0.02"의 I.D.)(재료 표s)를 미세점 포셉이 있는 하나의 입구 포트를 제외한 모든 포트에 삽입합니다. 턱 클램프로 두 개의 출구 포트와 조직 구획 포트를 클램프로 고정하십시오. 각 튜브의 길이가 ~ 1 인치인지 확인하십시오.
- 피브로넥틴 원액(1mg/mL)에서 PBS로 인간 피브로넥틴을 100μg/mL로 희석한다. 준비된 피브로넥틴 용액으로 1 mL 주사기를 로딩한다. 주사기를 24G 무딘 바늘과 ~ 4 인치 길이의 튜브에 연결하십시오.
참고: 가교를 방지하려면 인간 피브로넥틴을 과도하게 혼합/피펫하지 마십시오. 콜라겐과 같은 다른 세포외 매트릭스(ECM)가 상이한 세포 유형에 대해 사용될 수 있다. - 튜브를 열린 입구 포트에 삽입하고 인간 피브로넥틴이 다른 입구 포트에서 나올 때까지 플런저를 밀어 넣은 다음 클램프하십시오. 모든 채널, 조직 구획 및 튜빙이 인간 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 나머지 포트에 대해 이 과정을 반복한다. 바늘을 제거하되 4인치 길이의 튜브를 삽입하고 고정하지 않은 상태로 유지하십시오.
참고: 튜브가 고정되기 전에 피브로넥틴이 채워져 있는지 확인하십시오. - 탈기를 위해 공압 프라이머를 통해 클램핑되지 않은 튜브를 압축 질소 탱크에 연결하고 압력을 ~ 5 psi로 조정하고 ~ 15 분 동안 실행하십시오.
- 15 분 후에 현미경으로 점검하여 장치에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 채널 또는 조직 구획에 기포가 갇혀 있는 경우, 장치를 공압 프라이머에 다시 연결하여 다시 탈기, 즉 단계 1.4를 반복한다.
참고: 반전된 현미경은 이 프로토콜에서 현미경 검사와 관련된 모든 단계에서 사용됩니다. - 공압 프라이머에서 장치를 분리합니다. 장치를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 단계 1.3과 유사하게 모든 채널 및 조직 구획을 미리 가온된 HLMVEC 배양 배지(표 자료)로 플러시한다. 이제 bMFA가 셀 시드를 수행할 준비가 되었습니다.
주: 포트에서 튜브를 제거/삽입하기 전에 먼저 입구 포트 튜브 바닥 주위에 피펫으로 물 한 방울을 놓아 공기가 장치로 유입되지 않도록 하십시오.
2. HLMVEC로 bMFA 시드
- T-25 플라스크에서 공급 업체의 프로토콜에 따라 HLMVEC를 60 % - 80 % 컨플루언시로 배양하십시오.
- 세포 배양 플라스크로부터의 HLMVEC 배양 배지를 흡인한다. PBS로 두 번 씻으십시오.
- T-25 플라스크에 미리 가온된 트립신-EDTA 용액 2 mL를 첨가한다(37°C). 대부분의 세포가 플라스크로부터 분리될 때까지 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
참고: 배양 시간은 세포 유형 및 트립신-EDTA 농도에 따라 다를 수 있습니다. - 2 mL의 트립신 중화 용액(TNS, 37°C)을 플라스크에 첨가하여 트립신-EDTA를 중화시킨다.
- 플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 해리시킵니다. 이어서, 세포 현탁액 용액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.
- 150 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 내피 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 세포를 3 mL의 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 혈구계로 세포 수를 계산하십시오.
- 세포를 펠릿화하기 위해 다시 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 20 x 106/mL의 원하는 시딩 밀도로 재현탁시킨다.
참고: 세포 유형 및 합류도에 따라, 약 2 x 10 6 내피 세포를 2개의 T-25 플라스크로부터 수집할 수 있으며, 20 x 10 6/mL의 시딩 밀도로, 100 μL의 세포 현탁액(2 x 106 내피 세포)은 5개의 장치를 시드하기에 충분하다. - 1 mL 주사기를 프로그램형 주사기 펌프에 장착하고 튜브를 무딘 바늘에 부착하십시오.
- ~ 20 μL의 세포 현탁액을 튜브에 넣어 세포 현탁액이 주사기 배럴이 아닌 튜브 내에만 있는지 확인하십시오.
- 클램프를 장치의 출구 포트에서 떼어냅니다. 튜브를 장치의 한 입구에 연결합니다. 채널에 기포가 유입되지 않았는지 확인합니다.
- 4-8 μL/min의 유량으로 펌프를 시작하십시오. 현미경으로 장치를 관찰하십시오.
- 채널이 셀로 채워지면 펌프를 멈추고 콘센트를 고정하고 입구 튜브를 자릅니다.
참고: 장치에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. - 장치를 5%CO2 및 37°C에서 4시간 동안 인큐베이터에 넣었다.
- 4시간 배양 후, 신선한 세포 배양 배지로 채워진 또 다른 주사기를 준비한다. 주사기를 시린지 펌프에 장착하고 주사기를 입구 포트에 연결한 다음 출구 포트에서 클램프를 제거합니다.
- 장치를 통해 신선한 배지를 4-8 μL / min에서 약 5 분 동안 실행하여 부유 / 부착되지 않은 세포를 씻어냅니다.
3. 48 시간 동안 유동하에 세포 배양
- 신선한 세포 배양 배지로 채워진 주사기를 준비하십시오. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 주사기를 하나의 입구 포트에 연결하고 콘센트를 열어 두십시오. 장치를 인큐베이터(5%CO2, 37°C)에 넣었다.
- 표 1에 언급된 다음 지시사항을 사용하여 유동 하에 내피 세포를 배양하기 위한 시린지 펌프를 프로그래밍한다.
- bMFA를 유동 하에서 배양 48 h 후에 현미경으로 확인한다. HLMVEC는 완전한 루멘을 형성하는 혈관 채널을 커버해야 한다(도 6).
주: 다른 유동 정권은 상이한 세포 유형에 대해 요구될 수 있다.
4. 사이토카인 및/또는 치료적 치료
참고: 예로서, 이 섹션에서는 bMFA를 사용하여 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 및 신규한 항염증 억제제 (단백질 키나제 C 델타-TAT 펩티드 억제제, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36으로 세포를 치료하는 것의 영향을 연구하는 것에 대해 설명한다.
- 위의 프로토콜을 사용하여 세 개의 서로 다른 bMFA 장치를 준비합니다(섹션 1-3).
- 세포 배양 배지 (TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM)로 각각 세 개의 1 mL 주사기를 로딩한다.
주: 사이토카인은 세포 배양 배지에서 재구성된다. - 세 개의 주사기를 세 개의 bMFA 장치에 연결합니다. HLMVEC를 완충액 TNF-α 또는 TNF-α + 억제제로 0.1 μL/분에서 4시간 동안 처리하십시오.
참고: 특정 연구 요건에 따라, 다른 사이토카인 또는 사이토카인 칵테일(예를 들어, TNF-α + 인터루킨 1 베타(IL1-β) + 인터페론-감마(IFN-γ))가 내피 세포를 치료하는데 사용될 수 있다.
5. 인간 호중구 분리
- 모든 시약을 실온(RT)에서 사용하십시오. 시약은 백혈구 분리 배지, Ca2+/Mg2+를 갖는 1x HEPES 완충액 (표 2), 정상 식염수 중 6% 덱스트란 (0.9% NaCl), 3.6% NaCl 용액 및 탈이온수 (DI) 물을 포함한다.
- 백혈구 분리 배지 20 mL를 피펫 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 25 mL의 혈액을 백혈구 분리 배지 위에 조심스럽게 겹쳐엎는다. RT에서 427 x g 에서 40분 동안 원심분리한다.
참고: 혈액과 백혈구 분리 배지가 혼합되지 않도록 이 단계를 천천히 그리고 조심스럽게 수행하십시오. - 적혈구 (RBC) 층 위의 ~ 5 mL까지 흡인하십시오. RBC 상단의 흰색 버피 층은 주로 호중구입니다.
- HEPES 버퍼를 추가하여 현재 볼륨을 두 배로 늘립니다(기존 볼륨: HEPES 버퍼 = 1:1).
- 최종 볼륨의 20 %가 될 6 % 덱스트란의 양을 추가하십시오. (현재 부피/4 = 6% 덱스트란의 첨가량).
- 튜브를 부드럽게 몇 번 뒤집어 잘 섞고 RBC 침전물 (~ 25 분)을 시키십시오.
- 조심스럽게 상층(호중구 풍부층)을 피펫하고 새로운 50 mL 튜브로 옮기고, 침전된 RBC로 오염되지 않도록 주의한다.
- RT에서 315 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 펠렛을 8 mL의 HEPES 완충액에 재현탁시켰다.
- 잔류 RBC를 용해시키려면 DI 물 24 mL를 넣고 50초 동안 부드럽게 섞는다. 즉시, 8 mL의 3.6% NaCl 용액을 첨가하고, RT에서 315 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 혼합한다.
- 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 15 mL의 HEPES 완충액으로 세척하고, 315 x g .에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 HEPES 완충액에 재현탁시킨다.
6. bMFA를 이용한 호중구 부착 및 이동 실험
- 분리된 인간 호중구(15백만개)를 999 μL의 HEPES 완충액에 재현탁시킨다.
- 호중구 현탁액에 1 μL CFDA-SE (카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르) 염료 원액 (10 mM)을 첨가하여 작업 농도 10 μM의 CFDA-SE를 수득하고 RT에서 10분 동안 인큐베이션한다. 315 x g에서 5분 동안 원심분리하여 HEPES 완충액으로 세포를 두 번 세척한다.
- 혈구분석기를 사용하여 호중구를 계수하고 세포 배양 배지, TNF-α (10 ng/mL) 및 TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM)로 2백만 호중구/mL에서 재현탁; 실험 시작 전에 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 연구를 위한 화학유인제인 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP)로 채워진 주사기를 세포 배양 배지에서 준비한다. bMFA를 사용하여 하나의 입구 포트와 하나의 출구 포트를 엽니다.
참고: 이러한 실험 조건은 높은 수준의 순환 사이토카인/케모카인을 갖는 전신 염증 반응을 포함하는 패혈증의 상태를 모방하는 데 사용됩니다. 또한, 그람 음성 박테리아 유래 펩티드인 fMLP는 폐(즉, 조직 구획) 내의 박테리아의 존재를 모델링하는데 사용된다. - 조직 구획 포트 튜빙을 제거하고 fMLP 튜빙을 삽입하십시오. ∼20 μL의 fMLP를 세포 배양 배지 단독으로 처리한 것을 제외한 모든 bMFA를 조직 구획에 주입한다. 그런 다음 튜브를 자르고 클램프하십시오.
- 주사기를 ~200 μL의 호중구 현탁액으로 채우고 주사기를 시린지 펌프에 장착한다.
- 장치를 거꾸로 된 현미경 단계 (재료 표)에 놓습니다.
- 유속이 1 μL/min인 상태에서 펌프를 시작하고 튜브에서 호중구 현탁액의 작은 방울이 나올 때까지 기다리십시오. 튜브를 입구 포트에 삽입합니다. 설정에 대해서는 그림 7 을 참조하십시오.
7. 이미지 획득
- 현미경 이미지 분석 소프트웨어(Table of Materials)에서 큰 이미지 스캔 기능을 사용하여 실험을 시작한 후 10분 후에 bMFA(그림 8)에서 접착 지도를 얻습니다. 대부분의 호중구는 처음 10분 동안 bMFA에 들어간다.
참고: 광표백을 줄이기 위해 이미지를 촬영하지 않을 때는 형광 빛을 끄십시오. - 다음 시간 동안, 마이그레이션 분석을 위해 조직 구획의 타임랩스 이미지(5분마다 1개의 이미지)를 취하여 마이그레이션 맵을 얻는다.
8. 디지털 이미지 분석
- 접착 지도의 경우, 각 용기에 부착된 호중구의 수를 계산하십시오. 각 분기에 대해 직경의 두 배에 해당하는 직경을 가진 원형 관심 영역(ROI)을 만들고 부착된 호중구의 수를 계산합니다.
- 수동 카운트 또는 자동화된 오브젝트 카운트 함수를 사용하여 각 용기 및 분기 영역에서 부착되는 호중구의 수를 정량화합니다.
- CFD 시뮬레이션(17 )을 사용하여 생성된 네트워크의 전단 속도 맵을 사용하여 각 선박에서 전단 속도를 결정한다. 그런 다음 도 9A에 도시된 바와 같이 bMFA에서 전단 속도 맵을 생성하기 위해 그 용기 내의 전단 속도에 대해 주어진 용기 내의 부착된 호중구의 수를 플롯한다.
- 호중구는 내피를 통해 조직 구획으로 들어간 경우 이동된 것으로 계산됩니다. 10 분, 15 분, 30 분 및 60 분에서 이동 된 호중구의 수를 계산하십시오. 도 9B에 도시된 바와 같이 이동된 호중구의 수 대 시간을 플롯한다.
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Representative Results
bMFA에서 전단 유동 하에서 48시간 배양한 후, 내피 세포는 bMFA에서 혈관 채널의 표면을 덮고 유동 방향으로 정렬하였다(도 6). 공초점 현미경 검사는 혈관 채널의 모든 표면이 내피 세포에 의해 덮여 bMFA18에서 완전한 3D 루멘을 형성한다는 것을 나타냈다.
이 프로토콜을 사용하여, 호중구 부착 지도가 획득될 수 있고, bMFA에서 내피 세포에 대한 호중구의 유의한 부착이 있음을 보여준다(도 8). 이 접착 지도에서 호중구의 공간적 분포를 CFD 모델로부터 생성된 전단 속도 맵과 상관시키는 것은 호중구 부착이 전단 의존적이며, 호중구가 낮은 전단 속도 및 분기 영역에서 우선적으로 부착된다는 것을 보여준다(도 9A). TNF-α-활성화된 내피 세포에 대한 호중구의 부착이 유의적으로 증가하였다. 타임랩스 이미지 분석은 내피 세포의 TNF-α 활성화가 화학유인제 fMLP에 반응하여 호중구 이동을 증가시킨다는 것을 나타내었다(도 9B). 상기 언급된 바와 같이, bMFA는 염증성 질환을 치료하기 위한 신규한 치료제의 효능을 신속하게 시험하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PKCδ-i로 내피 세포 및 호중구를 처리하면 호중구 부착 및 이동이 현저하게 감소하였다(도 9A,B)27.
그림 1: 염증 동안 내피 세포 활성화 . (A) 정상 조건에서 혈관 내피는 글리코칼릭스에 의해 덮여 있으며 장벽 투과성, 백혈구 이동 및 항염증 방어를 조절하는 단단한 장벽을 형성합니다. (B) 염증 동안, 백혈구 및 내피 세포는 PAMPS 및 DAMPS에 의해 활성화되어 사이토카인 및 화학유인제를 생성하여, 백혈구와 내피 세포 모두에서 표면 분자의 상승된 발현을 유도하여, 백혈구-내피 상호작용을 증진시킨다. 내피 세포와 백혈구에서의 리간드 (예를 들어, PSGL-1)에 대한 E / P-셀렉틴의 상호 작용은 롤링에 관여하며, 이는 호중구를 늦추는 것입니다. 확고한 부착은 ICAM-1, ICAM-2 및 VCAM-1, 및 이들의 리간드, β2 인테그린을 포함하는 내피-발현 부착 분자에 의해 조절된다. 화학 유인 구배에 대한 반응으로, 부착 된 백혈구는 PECAM-1 및 JAM에 의해 조절되는 내피 접합을 통해 이동합니다. 활성화 된 백혈구는 조직으로 이동하여 사이토 카인, 반응성 산소 / 질소 종 및 프로테아제를 방출하여 감염과 싸웁니다. 그러나, 조절되지 않는 백혈구 이동은 장기 조직을 손상시켜 장기 부전을 초래할 수 있다. 염증 동안, 글리코칼릭스는 분해되고, 내피 세포 타이트한 접합부는 손상되고, 내피 세포 아폽토시스가 증가하여, 장벽 기능이 손상되고 투과성이 증가한다. 이 수치는 Yang et al.2에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: bMFA의 개요 . (A) 마우스 크레마스터 근육의 이미지를 획득하고 (B) PDMS 상에서 네트워크를 제작하기 위해 GIS 시스템을 사용하여 디지털화한다. (c) bMFA 네트워크의 밝은 필드 이미지는 bMFA에서, 혈관 채널이 3 μm 장벽(패널 C의 개략적인 삽입물)을 통해 조직 구획에 연결된다는 것을 보여준다. 혈관 채널의 유동 방향이 지시된다. (d) 현미경 슬라이드에 결합된 PDMS 층으로 구성된 bMFA 칩이 현미경 스테이지에 있다. 튜브는 두 개의 입구 포트, 두 개의 출구 포트 및 하나의 조직 구획 포트에 삽입됩니다. (C: 스케일 바 = 500 μm) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: bMFA의 실험 결과와 시뮬레이션 결과를 비교한 과도 관류 연구. (A) 입구, 출구 및 유동 방향을 보여주는 bMFA의 네트워크. (B) 상단 패널: CFD 관류 프로파일. 하단 패널: 실험적 관류 프로파일. 이미지는 그라디언트를 표시하기 위해 의사 색상입니다. 눈금은 파란색 (관류 없음, 0) 및 마젠타 (완전 관류; 1)로 정규화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CFD 시뮬레이션에서 bMFA의 속도 및 전단 속도 프로파일 . (A) 네트워크를 통한 속도 크기(Vmag)의 분포. (B) 전단 속도의 분포는 네트워크에서 이종 전단 속도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: bMFA에서의 호중구 부착 패턴은 생체내에서 호중구 부착 패턴과 유사하다. 생체 내에서 부착된 호중구의 수와 bMFA 내의 호중구의 수의 분포는 모두 왼쪽으로 치우쳐져 있으며, 이는 호중구가 가장 가까운 분기로부터 하나의 용기 또는 채널 직경에서 발생하는 피크와 함께 분기 근처에서 우선적으로 부착된다는 것을 나타낸다(평균 ± SEM; N = 3). 가장 가까운 분기에 부착된 호중구의 거리는 다음과 같이 정규화되었다: 정규화된 거리 = 채널의 가장 가까운 분기/직경의 중심까지의 거리. 이 그림은 Lamberti et al.16 에서 수정되었습니다 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, 발췌 된 자료와 관련된 추가 허가는 미국 화학 협회로 보내야합니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 내피 세포는 bMFA에서 완전한 3D 루멘을 형성한다 . (A) 위상차 이미지는 내피 세포가 유동 방향으로 정렬되어 있음을 보여준다. (b) 혈관 채널을 표지하는 내피 세포를 보여주는 형광 이미지; F-액틴은 팔로이드인을 사용하여 녹색으로 표시되고 핵은 Draq5를 사용하여 빨간색으로 표시됩니다. (A: 스케일 바 = 100 μm, B: 스케일 바 = 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: bMFA에서 호중구-내피 상호작용을 연구하기 위해 컴퓨터 제어 반전 형광 현미경이 사용된다. 워머를 갖는 컴퓨터 제어 스테이지는 bMFA를 37°C로 유지하기 위해 사용된다. bMFA는 튜빙을 통해 프로그램가능 시린지 펌프에 연결된다. 반전 형광 현미경에는 컴퓨터에서 추가 오프라인 분석을 위해 이미지 / 비디오를 찍을 수있는 비디오 카메라가 장착되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 호중구 부착 및 이동 지도의 대표적인 이미지. (a) bMFA에서의 호중구 부착지도. 이미지는 Nikon 소프트웨어의 "Scan large map" 기능을 사용하여 실험 시작 10분 후에 촬영되었습니다. 지도의 흰색 점은 CFDA-SE로 형광 표지 된 호중구입니다. 혈관 채널 경계는 디지털 표지된다(스케일 바 = 100 μm). (b) TNF-α 활성화 없이 bMFA에서의 호중구 이동 지도. 이미지는 실험 시작 60분 후에 촬영되었다. (c) TNF-α 활성화를 갖는 bMFA에서의 호중구 이동지도. 이미지는 실험 시작 60분 후에 촬영되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: 염증 동안 bMFA에서의 호중구 부착 및 이동의 패턴. (a) TNF-α 처리는 인간 폐 미세혈관 내피 세포에 대한 인간 호중구 부착을 유의하게 증가시켰고, PKCδ 억제제로 처리한 후 억제하였다. 호중구 접착은 낮은 전단 속도 및 bMFA에서 거의 분기된 혈관에서 우선적으로 발생하였다. (b) fMLP에 반응하여, TNF-α 활성화된 내피 세포를 가로지르는 인간 호중구 이동은 처리되지 않은 세포에 비해 유의하게 증가하였다. PKCδ 억제제를 사용한 치료는 처리되지 않은 수준으로의 이동을 감소시켰다. n = 4, 평균 ± SEM, 단방향 ANOVA, **p < 0.01, 및 *** p < 0.001). 그림은 Soroush et al.27에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1단계: 일정한 속도 | 코멘트 | |
| 모드 | 불어 넣 다 | |
| 유량 | 1 μL/분 | |
| 시간 | 10 분 | |
| 2단계: 지연(흐름 없음) | ||
| 모드 | 지연 | |
| 시간 | 4시간 | |
| 3단계: 반복 | 1 단계와 2 단계는 4 단계로 이동하기 전에 6 번 반복됩니다. | |
| 모드 | 반복하다 | |
| 다음에서 반복 | 1단계 | |
| 반복하다 | 6회 | |
| 4단계: 일정한 유량 | ||
| 모드 | 불어 넣 다 | |
| 유량 | 0.1 μL/분 | |
| 시간 | 48시간 |
표 1: 주사기 펌프 프로그램
| 식 | 이름 | MW | 더하다 | 농도 | 10x 헤페스 버퍼 (DI 물 1000 mL에 첨가하고 pH를 7.3으로 조정한다. 사용 전에 1x로 희석) |
| 나클 | 소금 | 58.44 | 87.66 지 | 1.5 엠 | |
| 코 | 수산화칼륨 | 56.11 | 2.81 지 | 50 밀리지미터 | |
| 헤프 | 헤프 | 238.3 | 23.83 지 | 100 밀리미터 | |
| MgCl2 | 염화마그네슘 | 203.31 | 2.44 지 | 12 밀리지미터 | |
| CaCl2 | 염화칼슘 | 147.62 | 1.90 지 | 12.9 밀리지미터 |
표 2: HEPES 완충액 조성.
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Discussion
bMFA는 생체내 미세혈관 네트워크의 지형 및 유동 조건을 재생하고, 생리학적으로 현실적인 조건 하에서 시험관내에서 백혈구-내피 세포 상호작용 및 내피 기능을 연구하는데 사용될 수 있다. 마우스 또는 인간의 미세 혈관 구조에서 미세 혈관 네트워크의 기하학은 자기 유사하고 프랙탈이며, 레이놀즈 번호<< 1로 혈관 기하학이 흐름 패턴에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 따라서, bFMA는 인간을 포함한 다른 종에 대한 백혈구-내피 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있지만, 마우스 크레마스터 근육의 미세혈관구조는 bMFA를 제조하기 위해 맵핑되었다.
bMFA는 롤링, 확고한 접착, 조직 구획으로의 호중구의 확산 및 이동을 포함하는 단일 분석에서 호중구 이동 캐스케이드의 개별 단계에 대한 실시간 평가를 허용합니다. 일차 인간 세포 및 임상적으로 관련된 샘플은 bMFA에서 번역성을 증가시키고 잠재적인 치료제를 신속하게 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 병렬 플레이트 유동 챔버와 같은 전통적인 유체 시스템과 비교하여, bMFA는 작은 용기 크기 및 하나의 단일 분석에서 전체 호중구 이동 캐스케이드를 연구 할 수 있다는 사실 때문에 시약(37 )의 95 % 미만을 사용하는 이점을 갖는다. 그러나이 작은 크기는 사용자가 매우 적은 양의 시약으로 작업해야하므로 어려울 수 있으며 광범위한 연습이 필요합니다. 이 프로토콜의 가장 일반적인 문제점은 bMFA에 기포가 존재하여 채널을 차단하고 흐름 패턴을 변경할 수 있다는 것입니다. 따라서 튜브를 포트에 제거하거나 삽입할 때는 세심한 주의를 기울여야 하며, bMFA에서 튜브를 제거할 때마다 공기가 채널로 유입되지 않도록 포트의 튜브 바닥에 물 한 방울을 배치해야 합니다.
호중구-내피 상호작용을 연구하기 위한 bMFA의 적용 외에도, bMFA는 또한 투과성 및 경피 내피 내성(TEER)27과 같은 변수들을 측정함으로써 염증 동안 내피의 완전성을 연구하는데 사용되어 왔다. 더욱이, 미세입자를 특정 항체로 기능화함으로써, bMFA는 내피 세포(27) 상의 부착 분자의 발현을 연구하는데 사용될 수 있다. 염증 반응이 또한 이온화 방사선과 같은 bMFA의 다른 자극에 의해 상향조절될 수 있다는 것이 입증되었고, bMFA는 방사선-유도된 내피 세포 손상 및 호중구-내피 상호작용을 연구하는데 사용되어 왔다(29). 이 장치의 또 다른 장점은 내피 세포, 호중구 및/또는 다른 혈액 세포 또는 약물-운반 입자가 추가 분석을 위해 미세혈관 채널 및/또는 조직 구획으로부터 분리될 수 있다는 것이다. 또한, 장치 내의 내피 세포와 상호작용하지 않은 세포/입자는 장치를 빠져나가는 유출물로부터 분리될 수 있다. 혈관주위세포 및 상응하는 조직 유형은 또한 생체내 상태를 더 잘 나타내기 위한 장치에서 배양될 수 있다. 결론적으로, 여기에 제시된 프로토콜은 염증 동안 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 bMFA에서 생리학적으로 관련된 환경을 제공한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health), 보조금 번호 : GM114359 및 GM134701 (M.F.K. 및 L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), 국방 위협 감소 기관, 보조금 번호 : HDTRA11910012 (M.F.K. 및 L.E.K.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
