Summary
I detta protokoll används en biomimetisk mikrofluidanalys, som kan reproducera en fysiologiskt relevant mikrovaskulär miljö och reproducera hela leukocytvidhäftningen / migrationskaskaden, för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner vid inflammatorisk sjukdom.
Abstract
Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en viktig roll i inflammatoriska sjukdomar som sepsis. Under inflammation kan överdriven migration av aktiverade leukocyter över det vaskulära endotelet till nyckelorgan leda till organsvikt. En fysiologiskt relevant biomimetisk mikrofluidisk analys (bMFA) har utvecklats och validerats med hjälp av flera experimentella och beräkningstekniker, som kan reproducera hela leukocytrullningen / vidhäftningen / migrationskaskaden för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner. Mikrovaskulära nätverk erhållna från in vivo-bilder hos gnagare digitaliserades med hjälp av ett geografiskt informationssystem (GIS) -metod och mikrofabricerades med polydimetylsiloxan (PDMS) på en mikroskopbild. För att studera effekten av skjuvhastighet och vaskulär topologi på leukocyt-endotelcellinteraktioner utvecklades en CFD-modell (Computational Fluid Dynamics) för att generera en motsvarande karta över skjuvhastigheter och hastigheter i hela nätverket. bMFA möjliggör kvantifiering av interaktioner mellan leukocyt-endotelceller, inklusive rullande hastighet, antal vidhäftade leukocyter som svar på olika skjuvhastigheter, antal migrerade leukocyter, endotelcellpermeabilitet, vidhäftningsmolekyluttryck och andra viktiga variabler. Dessutom, genom att använda humanrelaterade prover, såsom humana endotelceller och leukocyter, ger bMFA ett verktyg för snabb screening av potentiella terapier för att öka deras kliniska översättningsbarhet.
Introduction
Inflammation är värdens svar på infektion och skada, och endotelet spelar en viktig roll i det inflammatoriska svaret 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering är den bakomliggande orsaken till ett antal sjukdomspatologier som sepsis, hjärt-kärlsjukdomar, astma, inflammatorisk tarmsjukdom, cancer och COVID-19. Leukocyt-endotelcellinteraktioner spelar en central roll i dessa inflammatoriska sjukdomar. Under inflammation aktiverar frisättningen av PAMPS (patogenassocierade molekylära mönster) från patogener eller DAMPS (skadeassocierade molekylära mönster) från skadade vävnader immunceller för att frigöra cytokiner/kemokiner och andra proinflammatoriska mediatorer som leder till aktivering av endotel, vilket resulterar i förändringar i vaskulär endotelbarriärfunktion och ökad permeabilitet 3,4 . Ökad aktivering av endotelceller under inflammation resulterar i förbättrad leukocyt-endotelcellinteraktion som leder till överdriven migration av aktiverade leukocyter över det vaskulära endotelet till nyckelorgan 1,5,6,7.
Rekryteringen av leukocyter initieras av kemiskt olika kemoattractanter bestående av bioaktiva lipider, cytokiner, kemokiner och komplementkomponenter 8,9. Leukocytrekrytering är en flerstegsprocess som inkluderar fem diskreta steg: 1) leukocytmarginalering och fångst / fastsättning, 2) rullande, 3) fast arrestering, 4) spridning och krypning och 5) extravasering / migration (Figur 1). Varje steg i denna process kräver överhörning mellan leukocyter och endotelceller för att orkestrera detta dynamiska fenomen 1,9. I slutändan extravaserar arresterade leukocyter till inflammerade vävnader över endotelet via en flerstegsprocess som styrs av samtidiga kemoattractantberoende signaler, limhändelser och hemodynamiska skjuvkrafter 1,9,10,11,12.
Med tanke på skjuvspänningens centrala roll vid reglering av endotelcellfunktionen och betydelsen av leukocyt-endotelcellinteraktionerna13 har flera in vitro-modeller utvecklats under de senaste decennierna för att studera olika aspekter av leukocytmigrationskaskaden i en mer kontrollerad miljö14. Traditionella fluidiska anordningar för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner kan klassificeras i två breda kategorier14: a) anordningar för att studera leukocytvalsning, vidhäftning och vidhäftningsmolekyluttryck såsom parallella plattflödeskammare och b) anordningar för att studera leukocytmigration under statiska förhållanden såsom transbrunnskammare. System som parallella plattflödeskammare har använts för att studera vidhäftningsmolekylernas roller och deras ligander i vidhäftningskaskaden under skjuvkrafter15. En signifikant nackdel är emellertid att dessa förenklade, idealiserade anordningar (t.ex. rak kanal) inte kan reproducera skalan och geometrin hos in vivo-mikrovaskulaturen (t.ex. successiva vaskulära bifurkationer, vaskulär morfologi) och de resulterande flödesförhållandena (t.ex. konvergerande eller divergerande flöden vid bifurkationer). Som ett resultat kan dessa enheter endast modellera vidhäftning men inte transmigration. Transwellkammare kan endast studera transmigration under statiska förhållanden utan att ta hänsyn till in vivo geometriska egenskaper och flödesförhållanden. Således efterliknar dessa traditionella modeller inte mikromiljön hos levande vävnader eller löser vidhäftning och migrationskaskad i en enda analys6.
För att ta itu med denna begränsning har vi utvecklat och i stor utsträckning validerat en ny 3D-biomimetisk mikrofluidisk analys (bMFA) (Figur 2), som realistiskt reproducerar in vivo mikrovaskulära nätverk på ett chip 16,17,18. Protokollet för mikrotillverkning av denna enhet har publicerats tidigare17 och beskrivs bara kortfattat här. Mikrovaskulaturen av mus cremaster muskel digitaliserades med hjälp av ett modifierat geografiskt informationssystem (GIS) tillvägagångssätt19. Därefter genererades det syntetiska mikrovaskulära nätverket på polydimetylsiloxan (PDMS) med användning av mjuka litografiprocesser baserade på det digitaliserade mikrovaskulära nätverket 14,17,20,21,22. Kortfattat trycktes de digitaliserade nätverksbilderna på Mylar-film, som sedan användes som en mask för att mönstra en SU-8-positiv fotoresist ovanpå en kiselskiva för att skapa mästarna för tillverkning. Mikrofabricerade pelare (10 μm diameter, 3 μm långa) användes för att skapa de 3 μm höga och 100 μm breda porerna, en optimal storlek för leukocytmigration 23,24,25, som förbinder kärlkanalerna och vävnadsfacken. PDMS bereddes enligt tillverkarens instruktioner och hälldes över de utvecklade mästarna. Vidare avgasades PDMS och fick härda över natten i en ugn (65 ° C) för att skapa kompletterande mikrokanaler i PDMS. Därefter skalades den härdade PDMS från SU-8-befälhavaren, följt av stansportar för inlopp / utlopp. Sedan var PMDS plasmabunden till en glasskiva. Ytan på den mikrofluidiska anordningen består av inbyggt glas och PDMS. För att främja cellbindning, spridning och proliferation krävs extracelluar matrix (ECM) beläggning. bMFA innefattar ett mikrovaskulärt nätverk och ett vävnadsfack som är anslutet via 3 μm höga och 100 μm breda porer (figur 2). Detta mikrofluidiska system reproducerar hela leukocytvidhäftnings-/migrationskaskaden i en fysiologiskt relevant 3D-miljö i ett komplett mikrovaskulärt nätverk med sammankopplade kärl och bifurkationer, inklusive cirkulation, marginalisering, valsning, vidhäftning och migration av leukocyter till det extravaskulära vävnadsfacket i ett enda system 14,16,17,21,26.
Det bör noteras att även när flödeshastigheten vid inloppet av bMFA är fixerad varierar flödesförhållandena i nätverket på olika platser och kan inte beräknas med en enkel matematisk formel. En CFD-baserad modell (Computational Fluid Dynamics) utvecklades för att beräkna olika flödesparametrar (t.ex. skjuvspänning, skjuvhastighet, hastighet) på olika platser i nätverket. Denna CFD-modell användes för att simulera färgämnets perfusionsmönster och flödesparametrar i bMFA. Korsvalidering med experimentella resultat föreslog att flödesmotstånden över nätverket är väl förutsagda av beräkningsmodellen (figur 3)17. Denna CFD-modell användes sedan för att uppskatta hastighet och skjuvhastighetsprofil i varje kärl i bMFA (figur 4), vilket möjliggjorde analys av effekterna av skjuvflöde och geometri på leukocytrullning, vidhäftning och migration16. Leukocyter fäster företrädesvis nära bifurkationer och i regioner med låg skjuvning in vivo, och dessa rumsliga mönster av leukocytvidhäftning visades framgångsrikt i bMFA med neutrofiler (figur 5)16. Detta dokument beskriver protokollet för att förbereda bMFA för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion under inflammatoriska förhållanden med användning av humana lungmikrovaskulära endotelceller (HLMVEC) och humana neutrofiler. Mikrofysiologiska system, såsom bMFA, kan användas för att studera endotelcellinteraktioner med olika typer av celler såsom neutrofiler, monocyter, lymfocyter och tumörceller 18,27,28,29,30. BMFA kan fröas med primära endotelceller från olika organ (t.ex. lunga kontra hjärna) och olika arter (t.ex. humana kontra murina endotelceller), liksom endotelcellinjer 21,27,31,32. BMFA kan användas för att studera flera cellulära svar, cell-cellinteraktioner, barriärfunktion, läkemedelsleverans och läkemedelstoxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hepariniserat humant blod erhålls för neutrofilisolering från friska vuxna donatorer (män och kvinnor, mellan 21 och 60 år), efter informerat samtycke som godkänts av Institutional Review Board of Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Grundning och beläggning av enheten med humant fibronektin
OBS: bMFA har två inloppsportar och två utloppsportar anslutna till kärlfacket. Den har också en port ansluten till vävnadsfacket (figur 2).
- Sätt i slangar (O.D. på 0,06" och I.D. på 0,02") (Materialtabells) i alla portar utom en inloppsport med finspetstång. Kläm fast de två utloppsportarna och vävnadsfacksporten med käftklämmor. Se till att varje slang är ~ 1 tum lång.
- Späd humant fibronektin till 100 μg/ml med PBS från fibronektinsallösning (1 mg/ml). Ladda en 1 ml spruta med beredd fibronektinlösning. Anslut sprutan till en 24 G trubbig nål och en ~ 4-tums lång slang.
OBS: För att förhindra tvärbindning, blanda inte över mixa / pipettera humant fibronektin. Andra extracellulära matriser (ECM) såsom kollagen kan användas för olika celltyper. - Sätt in slangen i den öppna inloppsporten, tryck på kolven tills humant fibronektin kommer ut ur den andra inloppsporten och kläm sedan fast den. Upprepa denna process för resten av portarna tills alla kanaler, vävnadsfack och slangar är fyllda med den humana fibronektinlösningen. Ta bort nålen men håll den 4 tum långa slangen isatt och oansenlig.
OBS: Se till att slangen är fylld med fibronektin innan den kläms fast. - För avgasning, anslut den oampade slangen till en komprimerad kvävetank genom den pneumatiska primern, justera trycket till ~ 5 psi och kör i ~ 15 min.
- Efter 15 minuter, kontrollera under mikroskopet för att se till att det inte finns några luftbubblor fångade i enheten. Om det finns luftbubblor fångade i kanalen eller vävnadsfacket, anslut enheten igen till den pneumatiska primern för avgasning igen, dvs upprepa steg 1.4.
OBS: Inverterat mikroskop används i alla steg som involverar mikroskopi i detta protokoll. - Ta bort enheten från den pneumatiska primern. Inkubera enheten vid 37 °C i 1 timme och spola sedan alla kanaler och vävnadsfack med förvärmda HLMVEC-odlingsmedier (Materialtabell), liknande steg 1.3. bMFA är nu redo för cellsädning.
OBS: Innan du tar bort / sätter i ett rör från porten, placera först en droppe vatten med en pipett runt basen av inloppsportens slang för att förhindra att luft kommer in i enheten.
2. Sådd bMFA med HLMVEC
- Kultur HLMVEC till 60% - 80% sammanflöde enligt leverantörens protokoll i en T-25-kolv.
- Aspirera HLMVEC-odlingsmedier från cellodlingskolv. Tvätta två gånger med PBS.
- Tillsätt 2 ml förvärmd trypsin-EDTA-lösning (37 °C) i T-25-kolven. Inkubera i 3-5 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) tills de flesta celler lossnar från kolven.
OBS: Inkubationstiden kan variera för olika celltyper och trypsin-EDTA-koncentration. - Tillsätt 2 ml trypsinneutraliseringslösning (TNS, 37 °C) till kolven för att neutralisera trypsin-EDTA.
- Tryck försiktigt på kolven för att hjälpa till att dissociera cellerna. Överför sedan cellsuspensionslösningen till ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifug i 5 min vid 150 x g för att pelletera endotelcellerna. Ta bort supernatant- och resuspendcellerna i 3 ml cellodlingsmedier. Räkna antalet celler med en hemocytometer.
- Centrifugera igen i 5 min vid 150 x g för att pelletera cellerna. Ta bort supernatanten och resuspendera cellerna till önskad sådddensitet på 20 x 106 / ml.
OBS: Beroende på celltyper och sammanflöde kan cirka 2 x 106 endotelceller samlas in från två T-25-kolvar, och med sådddensiteten 20 x 106 / ml är 100 μL av cellsuspensionen (2 x 106 endotelceller) tillräcklig för att frö 5 enheter. - Montera en 1 ml spruta i den programmerbara sprutpumpen, fäst slangen på den trubbiga nålen.
- Dra ~ 20 μL av cellsuspensionen i slangen, se till att cellsuspensionen bara finns i slangen, inte i sprutröret.
- Ta bort klämman från en utloppsport på enheten. Anslut slangen till enhetens ena inlopp. Se till att inga luftbubblor införs i kanalen.
- Starta pumpen med ett flöde på 4-8 μL/min. Observera enheten under ett mikroskop.
- När kanalerna är fyllda med celler, stoppa pumpen, kläm fast utloppet och skär inloppsslangen.
OBS: Var försiktig så att du inte inför luftbubblor i enheten. - Sätt enheten i inkubatorn i 4 timmar vid 5% CO2 och 37 ° C.
- Efter 4 timmars inkubation, förbered en annan spruta fylld med färska cellodlingsmedier. Montera sprutan på en sprutpump, anslut sprutan till inloppsporten och ta bort klämman från en utloppsport.
- Kör färska medier genom enheten i ca 5 min vid 4-8 μL / min för att tvätta bort flytande / obundna celler.
3. Cellodling under flöde i 48 timmar
- Förbered en spruta fylld med färska cellodlingsmedier. Montera sprutan i en sprutpump, anslut sprutan till en inloppsport och håll ett utlopp öppet. Sätt enheten i inkubatorn (5% CO2, 37 °C).
- Programmera sprutpumpen för odling av endotelceller under flöde med hjälp av följande instruktioner som nämns i tabell 1.
- Kontrollera bMFA under ett mikroskop efter 48 timmars odling under flöde. HLMVEC bör täcka vaskulära kanaler som bildar en fullständig lumen (figur 6).
OBS: Andra flödesregimer kan krävas för olika celltyper.
4. Cytokin och/eller terapeutisk behandling
OBS: Som ett exempel beskriver detta avsnitt att använda bMFA för att studera effekten av att behandla cellerna med tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) och en ny antiinflammatorisk hämmare (proteinkinas C delta-TAT-peptidhämmare, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.
- Förbered tre olika bMFA-enheter med hjälp av protokollet ovan (avsnitt 1–3).
- Ladda tre 1 ml spruta med cellodlingsmedier, (TNF-α) (10 ng / ml), TNF-α (10 ng / ml) + PKCδ-i (5 μM), respektive.
OBS: Cytokiner rekonstitueras i cellodlingsmedier. - Anslut de tre sprutorna till tre bMFA-enheter. Behandla HLMVEC med buffert TNF-α eller TNF-α + hämmare i 4 timmar vid 0,1 μL/min.
OBS: Baserat på specifika studiekrav kan andra cytokiner eller cytokincocktails (t.ex. TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)), användas för att behandla endotelceller.
5. Mänsklig neutrofilisolering
- Använd alla reagenser vid rumstemperatur (RT). Reagenser inkluderar leukocytisoleringsmedier, 1x HEPES-buffert med Ca2+/Mg2+ (tabell 2), 6% Dextran i normal saltlösning (0,9% NaCl), 3,6% NaCl-lösning och avjoniserat vatten (DI) vatten.
- Pipettera 20 ml leukocytisoleringsmedier i ett 50 ml koniskt rör och försiktigt skikta 25 ml blod över leukocytisoleringsmediet. Centrifug i 40 min vid 427 x g vid RT.
OBS: Utför detta steg långsamt och noggrant för att undvika att blanda blod- och leukocytisoleringsmediet. - Aspirera ner till ~ 5 ml över röda blodkroppar (RBC) lager. Det vita buffyskiktet ovanpå RBC är övervägande neutrofiler.
- Lägg till HEPES-buffert för att fördubbla den aktuella volymen (befintlig volym: HEPES-buffert = 1:1).
- Lägg till en mängd på 6% Dextran, vilket kommer att vara 20% av den slutliga volymen. (nuvarande volym/4 = volym tillsatt 6% Dextran).
- Invertera röret försiktigt några gånger för att blanda väl och låt RBC sediment (~ 25 min).
- Pipettera försiktigt det övre lagret (neutrofilrikt lager) och överför till ett nytt 50 ml rör, var försiktig så att du inte förorenar med sedimenterad RBC.
- Centrifug i 10 min vid 315 x g vid RT. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 8 ml HEPES-buffert.
- För att lysera den återstående RBC, tillsätt 24 ml DI-vatten och blanda försiktigt i 50 s. Tillsätt omedelbart 8 ml 3,6% NaCl-lösning, blanda och centrifugera i 10 min vid 315 x g vid RT.
- Ta bort supernatanten, tvätta cellpelleten med 15 ml HEPES-buffert och centrifug i 5 min vid 315 x g. Återutspendera pelletsen i HEPES-bufferten.
6. Neutrofil vidhäftning och migrationsexperiment med bMFA
- Resuspendera de isolerade humana neutrofilerna (15 miljoner) i 999 μL HEPES-buffert.
- Tillsätt 1 μL CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) färgämnesstamlösning (10 mM) till neutrofilsuspension för att erhålla en arbetskoncentration på 10 μM CFDA-SE och inkubera i 10 min vid RT. Tvätta cellerna två gånger med HEPES-buffert genom centrifugering i 5 min vid 315 x g. Tvätta cellerna två gånger med HEPES-buffert genom centrifugering i 5 min vid 315 x g. Tvätta cellerna två gånger med HEPES-buffert genom centrifugering i 5 min vid 315 x g.
- Räkna neutrofilerna med hjälp av en hemocytometer och återsuspendera vid 2 miljoner neutrofiler/ml med cellodlingsmedier, TNF-α (10 ng/ml) respektive TNF-α (10 ng/ml) +PKCδ-i (5 μM). inkubera i 15 min vid RT innan experimentet påbörjas.
- Förbered en spruta fylld med 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), kemoattractanten för studien, i cellodlingsmedier. Ta bMFA och öppna en inloppsport och en utloppsport.
OBS: Dessa experimentella förhållanden används för att efterlikna villkoren för sepsis som inkluderar ett systemiskt inflammatoriskt svar med höga nivåer av cirkulerande cytokin / kemokiner. Vidare används fMLP, en gramnegativ bakterie-härledd peptid, för att modellera närvaron av bakterier i lungan (dvs vävnadsfack). - Ta bort portslangen för vävnadsfacket och sätt i fMLP-slangen. Injicera ~ 20 μL fMLP i vävnadsfacket för alla bMFA, utom den som behandlas med enbart cellodlingsmedier. Skär sedan slangen och kläm fast den.
- Fyll sprutan med ~ 200 μL av neutrofila suspensionen och montera sprutan på sprutpumpen.
- Sätt enheten på det inverterade mikroskopsteget (Materialtabell).
- Starta pumpen med en flödeshastighet på 1 μL/min och vänta tills en liten droppe av neutrofila suspensionen kommer ut ur slangen. Sätt i slangen i inloppsporten. Se figur 7 för installationen.
7. Skaffa bilder
- Använd funktionen Scan Large Image i mikroskopets bildanalysprogramvara (Table of Materials) för att få vidhäftningskartan i bMFA (Figur 8) 10 minuter efter att experimentet startats. De flesta neutrofilerna kommer in i bMFA under de första 10 min.
OBS: Håll fluorescensljuset släckt när du inte tar bilder för att minska fotoblekningen. - Under nästa timme, ta timelapse-bilder (1 bild var 5: e minut) av vävnadsfacket (figur 8B, C) för migrationsanalys för att få migrationskartan.
8. Digital bildanalys
- För vidhäftningskartan räknar du antalet vidhäftade neutrofiler i varje kärl. För varje bifurkation, skapa en cirkulär region av intresse (ROI) med en diameter som är lika med två gånger kärldiametern och räkna antalet vidhäftade neutrofiler.
- Använd manuell räkning eller den automatiserade funktionen Objekträkning för att kvantifiera antalet vidhäftande neutrofiler i varje kärl och bifurkationsregion.
- Använd skjuvhastighetskartan för nätverket som genereras med CFD-simulering17 för att bestämma skjuvhastigheten i varje fartyg. Plotta sedan antalet vidhäftade neutrofiler i ett givet kärl mot skjuvhastigheten i det kärlet för att skapa en skjuvhastighetskarta i bMFA som visas i figur 9A.
- Neutrofiler räknas som migrerade om de har passerat genom endotelet in i vävnadsfacket. Räkna antalet migrerade neutrofiler vid 10 min, 15 min, 30 min och 60 min. Plotta antalet migrerade neutrofiler kontra tiden som visas i figur 9B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 48 timmars odling under skjuvflöde i bMFA täckte endotelceller ytan av kärlkanalerna i bMFA och inriktades i flödesriktningen (figur 6). Konfokalmikroskopi indikerade att alla ytor av kärlkanalerna täcktes av endotelceller och bildade en komplett 3D-lumen i bMFA18.
Med hjälp av detta protokoll kan en neutrofil vidhäftningskarta förvärvas, vilket visar att det finns signifikant vidhäftning av neutrofiler till endotelceller i bMFA (Figur 8). Att korrelera den rumsliga fördelningen av neutrofiler i denna vidhäftningskarta med skjuvhastighetskartan som genereras från CFD-modellen visar att neutrofil vidhäftning är skjuvberoende, och neutrofiler fäster företrädesvis i regioner med låg skjuvhastighet och bifurkation (Figur 9A). Vidhäftningen av neutrofiler till TNF-α endotelceller ökade signifikant. Analys av timelapse-bilder indikerade att TNF-α aktivering av endotelceller ökar neutrofilmigrationen som svar på kemoattractant fMLP (Figur 9B). Som nämnts ovan kan bMFA användas för att snabbt testa effekten av en ny terapeutisk behandling för behandling av inflammatorisk sjukdom. Till exempel minskade behandling av endotelceller och neutrofiler med PKCδ-i signifikant neutrofil vidhäftning och migration (figur 9A,B)27.
Figur 1: Endotelcellsaktivering under inflammation. (A) Under normala förhållanden täcks det vaskulära endotelet av glykokalyxen och bildar en tät barriär som reglerar barriärpermeabilitet, leukocytmigration och antiinflammatoriskt försvar. (B) Under inflammation aktiveras leukocyter och endotelceller av PAMPS och DAMPS för att producera cytokiner och kemoattractanter, vilket leder till förhöjt uttryck av ytmolekyler på både leukocyter och endotelceller, vilket förbättrar leukocyt-endotelinteraktioner. Interaktioner av E/P-selektivin på endotelceller och deras ligander (t.ex. PSGL-1) på leukocyter är involverade i rullning, vilket saktar ner neutrofilen. Fast vidhäftning regleras av endoteluttryckta vidhäftningsmolekyler, inklusive ICAM-1, ICAM-2 och VCAM-1, och deras ligander, β2-integriner. Som svar på kemoattractantgradienter migrerar vidhäftade leukocyter genom endotelkorsningar som regleras av PECAM-1 och JAMs. Aktiverade leukocyter migrerar till vävnad, där de frigör cytokiner, reaktiva syre / kvävearter och proteaser för att bekämpa infektion. Dysreglerad leukocytmigration kan dock skada organvävnad, vilket resulterar i organsvikt. Under inflammation bryts glykokalyxen ned, endotelcellstäta korsningar skadas och det finns ökad endotelcellsapoptos, vilket leder till skadad barriärfunktion och ökad permeabilitet. Denna siffra har modifierats från Yang et al.2. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Översikt över bMFA. (A) Bilder av muscremastermuskeln erhålls och (B) digitaliseras med hjälp av GIS-systemet för att tillverka nätverket på PDMS. (C) Ljusfältsbild av bMFA-nätverket visar att i bMFA är vaskulära kanaler anslutna till vävnadsfacket genom en 3 μm barriär (den schematiska insatsen i panel C). Flödesriktningen för de vaskulära kanalerna indikeras. (D) Ett bMFA-chip, bestående av ett PDMS-skikt bundet till en mikroskopbild, befinns på mikroskopstadiet. Slangar sätts in i två inloppsportar, två utloppsportar och en vävnadsfackport. (C: skalstång = 500 μm) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Övergående perfusionsstudier som jämför experimentella och simuleringsresultat i bMFA. (A) Nätverket av bMFA som visar inlopp, utlopp och flödesriktning. (B) Topppanel: CFD-perfusionsprofiler. Nedre panelen: Experimentella perfusionsprofiler. Bilderna är pseudofärgade för att visa övertoningar. Skalan normaliseras med blått (ingen perfusion; 0) och magenta (fullständig perfusion; 1). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hastighets- och skjuvhastighetsprofil i bMFA från CFD-simuleringar. (A) Fördelning av hastighetsmagituder (Vmag) över nätverket. (B) Fördelningen av skjuvhastigheten indikerar heterogena skjuvhastigheter i nätet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Neutrofila vidhäftningsmönster i bMFA liknar neutrofila vidhäftningsmönster in vivo. Fördelningarna av antalet vidhäftade neutrofiler in vivo och antalet neutrofiler i bMFA är båda snedställda till vänster, vilket indikerar att neutrofiler företrädesvis fäster nära bifurkationer med toppen som inträffar vid ett kärl eller kanaldiameter från närmaste bifurcation (medelvärde ± SEM; N = 3). Avståndet mellan vidhäftade neutrofiler till närmaste bifurkation normaliserades med följande: normaliserat avstånd = avstånd till mitten av närmaste bifurcation/diameter på kanalen. Denna siffra har modifierats från Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716 bör ytterligare tillstånd relaterade till det utdragna materialet riktas till American Chemical Society). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Endotelceller bildar en komplett 3D-lumen i bMFA. (A) Faskontrastbilder visar att endotelceller är uppradade i flödesriktningen. (B) Fluorescensbilder visar endotelceller som täcker kärlkanalen; F-aktin är märkt grönt med falloidin och kärnor är märkta röda med Draq5. (A: skalstång = 100 μm, B: skalstång = 50 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Ett datorstyrt inverterat fluorescensmikroskop används för att studera neutrofil-endotelinteraktioner i bMFA. Ett datorstyrt steg med en varmare används för att hålla bMFA vid 37 ° C. bMFA är ansluten till en programmerbar sprutpump genom slangen. Det inverterade fluorescensmikroskopet är utrustat med en videokamera för att ta bilder / video för ytterligare offlineanalys på datorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Representativa bilder av neutrofil vidhäftning och migrationskarta. (A) Neutrofil vidhäftningskarta i bMFA. Bilden togs 10 minuter efter experimentets start med funktionen "Skanna stor karta" i Nikon-programvaran. De vita prickarna på kartan är fluorescerande märkta neutrofiler med CFDA-SE. Vaskulär kanalgräns är digitalt märkt (skalstång = 100 μm). (B) Neutrofil migrationskarta i bMFA utan TNF-α aktivering. Bilden togs 60 minuter efter experimentets start. (C) Neutrofil migrationskarta i bMFA med TNF-α aktivering. Bilden togs 60 minuter efter experimentets start. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Mönster av neutrofil vidhäftning och migration i bMFA under inflammation. (A) TNF-α behandling ökade signifikant human neutrofil vidhäftning till humana pulmonella mikrovaskulära endotelceller, vilket hämmades efter behandling med en PKCδ-hämmare. Neutrofil vidhäftning förekom företrädesvis i kärl med låg skjuvhastighet och nära bifurkationer i bMFA. (B) Som svar på fMLP ökade den humana neutrofila migrationen över TNF-α aktiverade endotelceller signifikant jämfört med obehandlade celler. Behandling med PKCδ-hämmaren minskade migrationen till obehandlade nivåer. n = 4, medelvärde ± SEM, enkelriktad ANOVA, ** p < 0,01 och *** p < 0,001). Siffran har modifierats från Soroush et al.27. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Steg 1: Konstant hastighet | Kommentarer | |
| Läge | Ingjuta | |
| Flöde | 1 μL/min | |
| Tid | 10 minuter | |
| Steg 2: Fördröjning (inget flöde) | ||
| Läge | Försening | |
| Tid | 4 timmar | |
| Steg 3: Upprepa | Steg 1 och steg 2 upprepas 6 gånger innan du går till steg 4. | |
| Läge | Upprepa | |
| Upprepa från | steg 1 | |
| Upprepa | 6 gånger | |
| Steg 4: Konstant flödeshastighet | ||
| Läge | Ingjuta | |
| Flöde | 0,1 μL/min | |
| Tid | 48 timmar |
Tabell 1: Sprutpumpsprogram
| Formel | Namn | MW | Addera | Koncentration | 10x HEPES-buffert (Tillsätt DI-vatten till 1000 ml och justera pH till 7,3. Späd till 1x före användning) |
| NaCl | Koksalt | 58.44 | 87,66 g | 1,5 M | |
| KOH | Kaliumhydroxid | 56.11 | 2,81 g | 50 mM | |
| Hepes | Hepes | 238.3 | 23,83 g | 100 mM | |
| MgCl2 | Magnesiumklorid | 203.31 | 2,44 g | 12 mM | |
| CaCl2 | Kalciumklorid | 147.62 | 1,90 g | 12,9 mM |
Tabell 2: HEPES buffertsammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bMFA reproducerar topografin och flödesförhållandena för de mikrovaskulära nätverken in vivo och kan användas för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion och endotelfunktion in vitro under fysiologiskt realistiska förhållanden. I mikrovaskulaturen hos antingen mus eller människa är geometrin hos de mikrovaskulära nätverken självliknande och fraktal, och Reynolds-talet << 1, vilket indikerar att vaskulär geometri inte signifikant påverkar flödesmönster. Därför kan bFMA användas för att studera leukocyt-endotelinteraktioner för olika arter, inklusive människor, även om mikrovaskulaturen hos muskremastermuskeln kartlades för att tillverka bMFA.
bMFA möjliggör realtidsbedömning av enskilda steg i neutrofila migrationskaskaden i en enda analys, inklusive rullande, fast vidhäftning, spridning och migration av neutrofiler till vävnadsfacket. Primära humana celler och kliniskt relevanta prover kan användas i bMFA för att öka översättningsbarheten och för att snabbt screena potentiella terapier. Jämfört med traditionella fluidiska system som parallella plattflödeskammare har bMFA fördelen att använda mindre än 95% av reagenserna37 på grund av dess små kärlstorlekar och det faktum att den kan studera hela neutrofila migrationskaskaden i en enda analys. Men denna lilla storlek kräver också att användarna arbetar med en mycket liten volym reagenser, vilket kan vara utmanande och kräver omfattande övning. Det vanligaste problemet med detta protokoll är närvaron av luftbubblor i bMFA, som kan blockera kanalen och förändra flödesmönstren. Därför bör stor försiktighet iakttas när du tar bort eller sätter in slangar i portarna, och en droppe vatten måste placeras vid botten av slangen vid portarna för att förhindra att luft kommer in i kanalen när slangar tas bort från bMFA.
Förutom tillämpningen av bMFA för att studera neutrofil-endotelinteraktioner har bMFA också använts för att studera endotelets integritet under inflammation genom att mäta variabler såsom permeabilitet och transendotelial endotelresistens (TEER)27. Vidare kan bMFA genom att funktionalisera mikropartiklar med specifika antikroppar användas för att studera uttrycket av vidhäftningsmolekyler på endotelceller27. Det visades att det inflammatoriska svaret också kunde uppregleras av andra stimuli i bMFA, såsom joniserande strålning, och bMFA har använts för att studera strålningsinducerad endotelcellskada och neutrofil-endotelinteraktioner29. En annan fördel med denna anordning är att endotelceller, neutrofiler och / eller andra blodkroppar eller läkemedelsbärande partiklar kan isoleras från mikrovaskulära kanaler och / eller vävnadsfack för vidare analys. Dessutom kan celler / partiklar som inte interagerade med endotelcellerna i enheten isoleras från utflödet som lämnar enheten. Pericyter och motsvarande vävnadstyper kan också odlas i anordningen för att bättre representera in vivo-förhållandena . Sammanfattningsvis ger protokollet som presenteras här en fysiologiskt relevant miljö i bMFA för att studera leukocyt-endotelcellinteraktioner under inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health, grant number: GM114359 och GM134701 (M.F.K. och L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), och Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. och L.E.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
